PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

I. TITULO: DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTAGÓNICA DE

BIOPRODUCTOS NATURALES AMAZÓNICOS FRENTE A CEPAS
DROGORRESISTENTES DE Pseudomonas aeruginosa Y Staphylococcus
aureus.

AREA DE INVESTIGACIÓN EN LA QUE SE INSERTA EL PROYECTO: SALUD.

DURACIÓN DEL PROYECTO:

Inicio: 01 de Junio de 2015.

Término: 31 de Mayo de 2017.

COSTO TOTAL DEL PROYECTO: S/ 59 850.00

Primer año: S/ 30 000.00

Segundo año: S/ 28 850.00

NOMBRES Y APELLIDOS COMPLETOS DE LOS INVESTIGADORES:

INVESTIGADOR RESPONSABLE: * Mblgo. Dr. ÁLVARO TRESIERRA AYALA

965823344, atresierraayala@hotmail.com

OTROS INVESTIGADORES: * Ing. Dr. WILFREDO RUIZ MESÍA

975597466, wirume@hotmail.com
* Méd. Mg. GREGORIO HEREDIA QUEZADA
942857580, gregorio.herediaquezada@outlook.com
* Q.F. Mg. LUIS ALBERTO VILCHEZ ALCALA
965936437, lvilchezalcala@hotmail.com
* Lic. Dr. LUIS IRIGOIN SANCHEZ
969308728, lirigoin@hotmail.com
* Blga. Mg. MILDRED GARCIA DAVILA
959546888, mimagda2109@hotmail.com
* Blga. M.Sc. MARIA E. BENDAYAN ACOSTA
965934558, meba14@hotmail.com
* Blga. M. Sc. JULIA BARDALES GARCIA
965614276, julybardales@hotmail.com
* Blga. M.Sc. TERESA MORI DEL AGUILA
965769189, tmoridelaguila@hotmail.com

TESISTAS: * Bach. BETSABETH TRINIDAD GUZMAN

* Bach. EMPERATRIZ MORALES AMARINGO
* Bach. KATIA MANZANARES VILLANUEVA
* Est. MELVA PAREDES PEREZ
* Est. CAROLINA REATEGUI REATEGUI
* Est. LAYNE GUERRA VARGAS

PRACTICANTES: * Est. GREYCI PÉREZ PADILLA

* Est. TACKESHY PINEDO VASQUEZ

1
INSTITUCIONES COMPROMETIDAS:

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONIA PERUANA

HOSPITAL III de ESSALUD, IQUITOS

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II. ÍNDICE
Pág.
I- Título ------------------------------------------------------------------------------ 1
II- Índice ------------------------------------------------------------------------------ 3
III- Resumen del Proyecto ---------------------------------------------------------- 4
IV- Justificación y Planteamiento del Problema ----------------------------- 5
V- Antecedentes de la Investigación --------------------------------------- 6
VI- Hipótesis -------------------------------------------------------------------- 9
VII- Objetivos de la Investigación ------------------------------------------------- 10
VIII- Metodología del proyecto--------------------------------------------------------- 11
8.1. Area de estudio ----------------------------------------------------- 11
8.2. Población y muestra ------------------------------------------------ 11
8.3. Diseño muestral --------------------------------------------------------- 11
8.4. Definiciones Operacionales de las Variables -------------------- 12
8.5. Procedimiento para la Recolección de la Información --------- 12
8.6. Análisis de los Datos ------------------------------------------------ 16
IX- Metas por componentes ---------------------------------------------------------- 17
X- Resultados esperados ---------------------------------------------------------- 18
XI- Estrategias a utilizar para la transferencia y ------------------------------ 19
comunicación de los resultados
XII- Impactos esperados ---------------------------------------------------------- 20
XIII- Infraestructura y Equipos a utilizarse ----------------------------------------- 21
XIV- Cronograma de actividades por componentes men- -------------------- 22
sualizado
XV- Presupuesto por rubros, por partidas genéricas y por componentes-- 23
XVI- La matriz del marco lógico --------------------------------------------------- 25
XVII- Referencias bibliográficas --------------------------------------------------- 27
XVIII- Anexos -------------------------------------------------------------------------------- 29

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III. RESUMEN DEL PROYECTO:

El hallazgo, cada vez más frecuente, de cepas bacterianas drogorresistentes

constituye una grave amenaza a la salud pública; de allí que muchos grupos de
investigación están abocados a la búsqueda de alternativas que puedan suplir a los
antibióticos en su rol para controlar las infecciones causadas por estos agentes
microbianos, entre los que destacan cepas de Pseudomonas aeruginosa y de
Staphylococcus aureus. En la Amazonía peruana existe una diversidad de productos
biológicos que podrían poseer actividad antagónica frente a estos agentes; por ello, en
este trabajo se pretende evaluar la capacidad antagónica de bioproductos naturales
amazónicos frente a cepas drogorresistentes de P. aeruginosa y S. aureus.
Empleando técnicas microbiológicas convencionales se aislarán e identificarán cepas
de estas especies bacterianas, a partir de fomites del Hospital III de Essalud, Iquitos, a
fin de facilitar que sean drogorresistentes, característica que se determinará mediante
el proceso de resistotipificación, con el método de difusión en agar (técnica de Kirby-
Bauer). De igual modo, la capacidad antagónica de los bioproductos seleccionados
frente a las cepas drogorresistentes de P. aeruginosa y S. aureus, se realizará
empleando la misma técnica, con algunas modificaciones. De ser posible, se
determinarán los valores de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y de la
concentración mínima bactericida (CBM).
La información que se obtendría sería de gran utilidad para la institución hospitalaria
considerada en este estudio y para la población en general, a fin que se tomen las
medidas adecuadas para evitar riesgos laborales y salvaguardar la salud del trabajador
o personas que entren en contacto con las instalaciones o personal de dichas
instituciones. El hallazgo de bioproductos con gran capacidad antagónica posibilitaría
incorporarlos en la formulación de cremas de uso tópìco como alternativa para
controlar las infecciones causadas en la piel por estas cepas bacterianas
drogorresistentes.

Palabras claves: antagonismo, bioproductos, drogorresistencia.

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IV. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Hoy en día, es frecuente escuchar la existencia de infecciones causadas por agentes
drogorresistentes, las cuales mayormente son adquiridas en centros hospitalarios
porque es allí, donde al estar en constante contacto con los antibióticos, los
microorganismos llegan a desarrollar resistencia y por ende, son difíciles de ser
combatidos y eliminados. Entre estos agentes destacan cepas de Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus, entre otras, las cuales son reconocidas
mayormente como causantes de infecciones intrahospitalarias y cuya diseminación
constituye un problema de salud pública, no solo para los pacientes que concurren a
los nosocomios, sino también para la sociedad en general y para el estado.
La creciente tendencia de resistencia bacteriana a los antibióticos constituye un
fenómeno agravante, puesto que se corre el riesgo de llegar a situaciones similares a
las de la era pre-antibiótica, cuando simplemente no había nada que ofrecer a los
pacientes. Por ello, se considera necesario buscar alternativas que posibiliten combatir
a las bacterias de importancia clínica, especialmente a las denominadas
drogorresistentes.
Una de estas alternativas es el empleo de bioproductos naturales de origen animal,
vegetal o microbiano, algunos de los cuales vienen siendo utilizados tradicionalmente,
de forma empírica, en el tratamiento de muchas enfermedades. Debido a esto se está
formulando este trabajo de investigación.
La Amazonía siempre ha sido caracterizada por poseer una gran biodiversidad, de la
cual se pueden obtener bioproductos naturales con capacidad antagónica frente a
bacterias patógenas. Por ello, al desarrollar el presente trabajo de investigación se
pretende dar respuesta a: ¿poseerán actividad antagónica los bioproductos naturales
amazónicos ensayados frente a cepas drogorresistentes de P aeruginosa y S. aureus,
aisladas de fomites del Hospital III de Essalud, Iquitos?.

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V. ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN:

 Huapaya et al. (2003), de la Facultad de Medicina Humana de la Universidad

de San Martín de Porres (Lima), evaluaron la actividad antibacteriana de
Croton lechleri “sangre de grado” de 50 muestras provenientes de los
departamentos de Lima, San Martín, Huánuco y Ucayali, determinando una
marcada actividad frente a S. aureus en extractos provenientes de Ucayali, en
diluciones del 50% y 100%.
 Shu et al. (2003), determinaron el grado de contaminación bacteriana de las
computadoras empleadas en un hospital en China y encontraron que el 30.5 %
estaban contaminadas por Staphylococcus aureus, concluyendo que estos
equipos pueden ser fuentes potenciales de almacenamiento de
microorganismos patógenos, por lo tanto recomiendan poner mayor atención a
su desinfección.
 Tamariz et al. (2003), determinaron la actividad antibacteriana de la sangre de
grado (Croton lechleri) frente a Helicobacter pylori. Registraron que la sangre
de grado inhibe el crecimiento de Helicobacter pylori en concentraciones
elevadas, también se determinó el efecto bactericida del producto concentrado
 Silva y Sedlak (2003), afirmaron que Ganoderma lucidum posee algunas
propiedades antitumorales, inmunomodulares e inmunoterapéuticas,
gracias a sus polisacáridos, terpenos y otros compuestos bioactivos
aislados del micelio y cuerpos fructíferos. También le atribuyeron
bondades en el tratamiento de alergias, hipertensión, debido a la
presencia de triterpenos, actividad antiflamatoria, antiviral, antiparasitaria
y fungicida.
 Waghorn et al. (2005), analizaron los teclados y ratones de 48 computadoras
de diferentes áreas clínicas y reportaron que todos los teclados estuvieron
contaminados, el 4% estuvieron colonizados con bacterias patógenas
conocidas y los demás poseían organismos oportunistas, algunos
multidrogorresistentes, capaces de causar infecciones nosocomiales.
 Suffredini et al. (2006) y Rojas y Rodríguez (2008), determinaron que extractos
de Caraipa grandifolia y Cedrela odorata L. “cedro”, mostraban actividad contra
E. coli, P. aeruginosa y S. aureus.
 Engelhart et al. (2008), evaluaron el nivel de contaminación microbiana
existentes en los teclados y ratones de computadoras del Hospital de la

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 Universidad de Boon - Alemania. Un total de 300 muestras fueron colectadas
de 100 computadoras, de las cuales, 296 (98.7 %) mostraron la presencia de
uno a más microorganismos, de estas, 32 % resultaron positivas para
microorganismo potencialmente patógenos (Staphylococcus aureus 12 %,
Streptococcus viridans 11 %, enterococos 8 % y microorganismos Gram
negativos 14 %). Los porcentajes de contaminación más altos fueron
registrados cuando las muestras se colectaron después que las computadoras
habían sido utilizadas por sus usuarios (47 %) que antes de su uso (25 %).
 Valencia et al. (2008), evaluaron la actividad antibacteriana en extractos
hexánicos de carpóforos de cuatro cepas de Pleurotus djamor (variedades
blanca y rosa), contra las bacterias Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus,
Enterobacter agglomerans, Shigella dysenteriae, Yersinia enterocolitica,
Klebsiella rhinoescleromatis y K. pneumoniae. Dicha actividad se determinó
por la técnica de difusión en disco de Kirby Bauer, con una concentración de
1.5 x 108 UFC/mL. Después de 16 a 18 h de incubación, las cepas variedad
blanca (IE200 e IE2001) presentaron mayor actividad bacteriana que los
basidiomas de la variedad rosa (ECS127R y RP), desarrollando halos de
inhibición con diámetros de 12±0.5 a 25.6 ±1.2 mm y de 8.3±0.3 a
22.6±1.4 mm, respectivamente.
 Wellman et al. (2008), expresaron que la albúmina de huevo de aves, posee
capacidad antibacteriana contra algunos microorganismos Gram positivos y
Gram negativos.
 López-Hurtado et al. (2010), determinaron la actividad bactericida de la
clara del huevo de la tortuga marina (Lepidochelys olivacea) contra algunas
bacterias Gram positivas y Gram negativas. Los resultados mostraron la
existencia de actividad antibacteriana sobre Staphylococcus aureus, S.
saprophyticus y Micrococcus luteus, y Klebsiella pneumoniae).
 Pathak et al. (2010) y Vieira et al. (2010), evaluaron el efecto antibacteriano de
extractos de hojas de Annona muricata “guanábana” y registraron actividad
frente a S. aureus, B. subtilis, K. pneumoniae y P. vulgaris, sugiriendo que
podría emplearse en el tratamiento de enfermedades causadas por estos
microorganismos.
 Jung et al. (2011) manifestó que algunos componentes antimicrobianos de
Ganoderma lucidum fueron descubiertos hace una década, pero su uso como
té amargo medicinal tiene probablemente más de 10 000 años y le atribuyeron
los valores medicinales siguientes; activa el sistema inmunológico, poder

7
 antimicrobiano, antiparasitario y antiinflamatorio, inhibe el crecimiento de
tumores, etc.
 Tresierra-Ayala et al. (2014), determinaron que extractos de Cedrela odorata L.
“cedro”, mostraban gran actividad contra P. aeruginosa y S. aureus.

8
VI. HIPÓTESIS
La gran biodiversidad propia de la región amazónica posibilita la existencia de
bioproductos naturales poseedores de actividad antagónica frente a cepas
bacterianas drogorresistentes.

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VII. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN:

GENERAL:
Determinar la capacidad antagónica de bioproductos naturales amazónicos frente a
cepas drogorresistentes de P. aeruginosa y S. aureus, aisladas de fomites del
Hospital III – ESSALUD, Iquitos, 2015.

ESPECIFICOS:
 Aislar e identificar cepas de P. aeruginosa y S. aureus a partir de
componentes del hardware de computadoras del Hospital III – ESSALUD,
Iquitos.
 Determinar el resistotipo antibiótico de las cepas bacterianas
identificadas.
 Evaluar la actividad antagónica de los bioproductos naturales amazónicos
estudiados, especialmente aquellos que resultaran ser drogorresistentes,
 Determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) y la concentración
mínima bactericida (CMB) de los bioproductos que muestren actividad
antagónica sobre las cepas bacterianas analizadas.

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VIII. METODOLOGÍA DEL PROYECTO

8.1 Area de estudio.

Las cepas bacterianas de P. aeruginosa y S. aureus se obtendrán de fomites,
especialmente de componentes del hardware de las computadoras del Hospital
III-ESSALUD, Iquitos, ubicado en la Av. La Marina S/N, distrito de Punchana,
región Loreto, cuyas coordenadas geográficas son: 3º45´ LS y 73º14´ LO.
Los bioproductos naturales amazónicos serán obtenidos preferentemente a
partir de sectores circundantes a la carretera Iquitos-Nauta.
El trabajo experimental del proyecto se desarrollará en el Area Especializada
de Microbiología del Centro de Investigación de Recursos Naturales
Amazónicos de la UNAP (CIRNA-UNAP), ubicado en el Psje. Los Paujiles S/N,
San Lorenzo, distrito de San Juan Bautista.

8.2 Población y muestra.

Población: Conformada por todos los bioproductos naturales amazónicos.
Muestra: Corresponderá a 10 bioproductos naturales amazónicos: 5
secreciones laticíferas (Croton lechleri “sangre de grado”, Ficus insipida “ojé”,
Couma macrocarpa “leche caspi”, Artocarpus altilis “pan de árbol” y Maquira
coriacea “capinurí”), 2 extractos etanólicos de basidiomicetos (Ganoderma
applanatum y Pleurotus ostreatus), 3 productos animales (ova de Pomacea
maculata “churo”, secreción paratiroidea de Rhinella marina “sapo común”,
clara de huevo de Podocnemis expansa “charapa”).

8.3 Diseño muestral.

Se aplicará un diseño muestral aleatorio simple con afijación proporcional, a fin
de lograr posteriormente extrapolar los resultados obtenidos a lo largo de la
investigación.

11
8.4 Definiciones operacionales de las variables, indicadores e índices.

Variables Indicadores Índices

Antibióticos (VI) Concentración del antibiótico Según lo especificado por la
en los discos de sensibilidad casa comercial

Bioproductos (V.I.) Concentración del bioproducto 500 mg/ml

250 mg /ml
125 mg /ml
62.5 mg/ml
31.25 mg/ml
Susceptibilidad de bacterias Halo de inhibición -Presente: bactería
susceptible:
patógenas (V.D.)
-Ausente: bacteria resistente

Concentración Mínima Inhi-

Crecimiento bacteriano:
bitoria y Mínima Bactericida
- Presente o Ausente

8.5 Procedimiento para la recolección y análisis del material biológico

8.5.1 Toma de muestras para el aislamiento e identificación de las cepas

bacterianas
Se utilizará la técnica del hisopado, por ser la más apropiada para superficies
inertes, para lo cual se humedecerán por cada muestra, dos hisopos estériles
en caldo tripticasa de soya (CTS). Con el hisopo inclinado, se frotará la
superficie del teclado, en sentido horizontal, vertical y diagonal y, serán
depositados en un tubo con 10 ml de CTS. De igual modo se procederá para la
toma de muestra de ratones. Luego, los tubos se colocarán en una caja térmica
fría, para ser transportados al laboratorio, donde se incubarán a 37 °C durante
24 h.

8.5.2 Análisis microbiológico

El aislamiento e identificación de las cepas bacterianas se realizará mediante

técnicas y procedimientos estandarizados que se describen a continuación:

Determinación de la presencia de Staphylococcus aureus

Uno de los hisopos que se encontraba en el tubo con CTS, será transferido a
un tubo con 10 ml de Caldo Salado, el cual al contener 6.5 % de NaCl, facilita
el crecimiento de bacterias halófilas como es el caso de S. aureus. Los tubos
serán incubados a 37 ºC durante 24 h. Aquellos que presenten crecimiento,

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 serán resembrados en placas con agar Chapman, que serán incubadas a 37 °C
durante 24 a 48 h. Las colonias amarillas brillantes, serán resembradas en
tubos con agar soya Tripticasa (TSA), a las que se les realizará: coloración
Gram, prueba de la catalasa, coagulasa y termonucleasa. Las cepas
conformadas por estafilococos Gram (+), catalasa (+), coagulasa (+) y
termonucleasa (+), corresponderán a S. aureus.

Determinación de la presencia de Pseudomonas aeruginosa.

El otro hisopo del tubo con CTS, será transferido a otro tubo con 10 ml de caldo
peptona con 0.02% de cristal violeta e incubará a 37°C durante 24 h. Los tubos
que muestren crecimiento, se repicarán en placas con Agar Cetrimide e
incubarán a 37°C durante 24 – 48 h. A las colonias redondas, con una zona
azul o verde, se les realizará las siguientes pruebas: coloración Gram, prueba
de la oxidasa, OX-FER con glucosa y maltosa, movilidad, producción de H2S,
producción de indol, formación de pigmento verdoso y crecimiento a 42 °C.
Las cepas conformadas por bacilos Gram (-), oxidasa (+), que metabolizan
oxidativamente a la glucosa y no metabolizan la maltosa, móviles, H2S (-) e
indol (-), pero producen pigmentación verdosa y crecen a 42 °C,
corresponderán a P. aeruginosa.

8.5.3 Determinación del resistotipo antibiótico de las cepas

Se empleará el método de difusión en agar Mueller-Hinton, según Kirby-Bauer

(citado por Panghal et al.,2011), para lo cual se seleccionarán seis antibióticos
a probar, según el tipo de bacteria a analizar (INS, 2002)*. Se preparará una
suspensión bacteriana en suero fisiológico equivalente al 0,5 en la escala de
Mac Farland. Se introducirá un hisopo estéril en la suspensión, escurriendo el
exceso de líquido y se aplicará la siembra en superficie; se emplearán como
control, cepas bacterianas de referencia. Se dispensarán los sensidiscos e
incubará la placa a 37°C durante 18-24 h, realizando la lectura mediante la
determinación del diámetro de los halos de inhibición, interpretándose dichos
resultados según la tabla de estándares.
*S. aureus: oxacilina, vancomicina, gentamicina, ciprofloxacina, penicilina y clindamicina.
Opcionales: eritromicina, cotrimoxazol (trimetoprima-sulfametoxazol), amikacina, rifampicina,
cloramfenicol, ampicilina, cefalosporina de 1ª. generación (cefalotina), cefalosporina de 3ª.
generación (cefotaxima), tetraciclina.

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 P. aeruginosa: ceftazidima, gentamicina, amikacina, norfloxacina, aztreonam, ciprofloxacina.
Opcionales: cefepima, imipenem, cefoperazona (sulbactam), ofloxacina, piperacilina, ticarcilina,
azlocilina, fosfomicina, tobramicina.

- Como cepas control se utilizarán S. aureus ATCC 25923, P. aeruginosa ATCC 58446.
- Se definirá como drogorresistente a la cepa que presente resistencia a tres o más familias de
antimicrobianos.

8.5.4 Evaluación de la capacidad antagónica de bioproductos

Los bioproductos se seleccionaron en función a sus antecedentes o el de sus

análogos, como agentes antimicrobianos: 5 secreciones laticíferas (Croton
lechleri “sangre de grado”, Ficus insípida “ojé”, Couma macrocarpa “leche
caspi”, Artocarpus altilis “pan de árbol” y Maquira coriacea “capinurí”), las que
serán recolectadas con la ayuda de un botánico en las áreas circundantes a la
carretera Iquitos-Nauta, 2 extractos etanólicos de basidiomicetos (Ganoderma
applanatum y Pleurotus ostreatus) y 3 productos animales (ova de Pomacea
maculata “churo”, secreción paratíroidea de Rhinella marina “sapo común”,
clara de huevo de Podocnemis expansa “charapa”).

Preparación de los discos de sensibilidad con los extractos de hongos.

a) Preparación de los pulverizados y extractos fúngicos.

Las muestras serán pesadas y se cortarán en pequeños fragmentos, se
envolverán en papel y se secarán en una estufa a 45 °C durante 72 h. Se
volverán a pesar y se procederá a pulverizarlas, usando un molinillo manual
de acero inoxidable. Los pulverizados se guardarán en frascos oscuros para
su utilización posterior.
Se prepararán extractos etanólicos de los basidiomicetos Ganoderma
applanatum y Pleurotus ostreatus, para lo cual se extraerán con etanol, con
renovación de solvente cada 48 horas, hasta agotamiento. El solvente se
eliminará a presión reducida y a la temperatura de 56 ºC. El extracto seco, se
pesará, envasará en frascos de vidrio y almacenará a -10 ºC.
Los bioproductos laticíferos serán empleados directamente, sin preparación
de extractos, mientras que los de origen animal serán pesados y luego
secados en una estufa a 45 °C durante 72 h. Se volverán a pesar y se
procederá a pulverizarlas, usando un mortero estéril. Los pulverizados se
guardarán en frascos oscuros para su utilización posterior.

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 Tanto los extractos fúngicos como los bioproductos animales serán
resuspendidos empleando volúmenes conocidos de agua destilada estéril
(soluciones stock).

b) Preparación de los discos de sensibilidad

Se prepararán utilizando papel Whatman Nº 3 y un perforador convencional.
Los discos serán autoclavados y se procederá a agregar a cada uno de ellos
15 µl de las soluciones stock de los extractos fúngicos o demás bioproductos,
los que se dejarán secar por espacio de 24 h. Por triplicado, se aplicará el
método de difusión en agar, según Kirby-Bauer (citado por Panghal et al.,
2011), empleando como control, cepas bacterianas de referencia.

El criterio utilizado para determinar la actividad antibacteriana será la

presencia o ausencia de halos de inhibición producidos por los bioproductos
frente a los microorganismos, sin considerar el tamaño de los mismos, como
indicador de grado de sensibilidad (Toribio et al. 2007, 2009); Aquellos
extractos que presentaran actividad antibacteriana se les determinará la
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida
(CMB), descritos en los siguientes puntos.

8.5.5 Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima (CMI) de los

bioproductos antagónicos
Se realizará por el método de macrodilución en caldo, para lo cual se
preparará cultivos de 18 h, de las bacterias en estudio, en agar tripticasa de
soya. Luego se preparará una suspensión bacteriana en solución salina
estéril a una turbidez equivalente al estándar 0.5 de la escala de McFarland
(aproximadamente 1.5 x 108 UFC/ml). A continuación, se hará una dilución al
1/100 (aproximadamente 1.5 x 106 UFC/ml) transfiriendo 100 µL (0.1 ml) de
la suspensión bacteriana a 9.9 ml de caldo tripticasa de soya.
Se tendrán listos 10 tubos con 1 ml de caldo tripticasa de soya para cada
prueba (tubo N°1 al tubo N°10). Por otro lado, se preparará una solución
madre del extracto vegetal a una concentración de 500 mg/ml. Se añadirá 1ml
de la solución madre del bioproducto al tubo N° 1 que contenía 1ml de caldo
tripticasa de soya (concentración del extracto en este tubo es 250 mg/ml), se
mezclará bien con la ayuda de un vórtex. A partir de este tubo, se prepararán
diluciones dobles seriadas, para lo cual se tomará 1 ml y se transferirá al tubo

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 N°2 (concentración del extracto = 125 mg/ml), después de mezclar bien el
contenido, se transferirá 1 ml al tercer tubo, del cual la concentración de
extracto será 62.5 mg/ml y así sucesivamente hasta el tubo N° 10, del cual se
tomará y descartará 1 ml. De este modo, se obtendrán diluciones dobles de
cada extracto desde 250 mg/ml hasta 0.49mg/ml.
A continuación, se añadirá a cada tubo con el bioproducto antagónico (Tubo
N° 1 al 10), 1 ml del inóculo preparado de la cepa que contendrá
aproximadamente 1.5 x 106 UFC/ml, esto supone un inóculo final aproximado
de 7.5 x 105UFC/ml y las concentraciones finales de los extractos serán
desde 125 mg/ml hasta 0.24mg/ml. Los tubos serán incubados a 37 °C
durante 18 horas y luego se procederá a calcular la CMI, considerándola
como la concentración correspondiente al tubo con menor concentración del
bioproducto donde no habrá desarrollo bacteriano, demostrado por la
ausencia de turbidez. Para aquellas pruebas donde habría turbidez a la
concentración más elevada (125 mg/ml), se prepararán tubos adicionales con
concentraciones de 250 mg/ml y 500 mg/ml del extracto (incluyendo el
inóculo).

8.5.6 Determinación de la Concentración Mínima Bactericida (CMB) de los

bioproductos antagónicos
A partir de cada uno de los tubos sin desarrollo bacteriano, se inoculará 0.1
ml en placas con agar tripticasa de soya y con una asa bacteriológica se
estriarán en toda la superficie del agar en tres direcciones, las que se
incubarán a 37 °C durante 18 horas. Finalmente, para determinar la CMB se
contará el número de UFC en las placas, considerándose dicha CMB como la
menor concentración del extracto cuyo subcultivo producirá un número de
UFC menor al 0.1% del inóculo original (7.5 x 105UFC/ml), es decir, un
número menor a 750 UFC/ml, y como se inoculó la décima parte de 1 ml (0.1
ml), entonces se considerará la CMB al subcultivo que producirá menos de 75
colonias.

8.6 Análisis de los Datos.

Los resultados se evaluarán mediante estadística descriptiva, y además se
hará un análisis de varianza y la prueba de Tukey para ver diferencias y
similitudes entre los halos de inhibición de los extractos que presentaran
actividad antagónica. Se usarán los programas MS Excel, Past v.2.09 y el
software R 3.0.1.

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IX. METAS POR COMPONENTES

COMPONENTES DEL
PROYECTO/METAS LOCALIZACION INICIO TERMINO
1. AISLAMIENTO E
IDENTIFICACIÓN
BACTERIANA
Aislamiento de 10 cepas CIRNA Jun 2015 Mar 2016
sospechosas de P. aeruginosa y 10 0% 100%
cepas sospechosas de S. aureus
Identificación de 10 cepas de P. CIRNA Jun 2015 Mar 2016
aeruginosa y 10 cepas de S. aureus 0% 100%
2. DETERMINACIÓN DEL
RESISTOTIPO DE LAS CEPAS
Aplicación de 20 antibiogramas: CIRNA Ene May 2016
*10 antibiogramas P. aeruginosa 2016 100%
*10 antibiogramas S. aureus 0%
3. COLECCIÓN E
IDENTIFICACIÓN DE
BIOPRODUCTOS
Colección e identificación de 5 Sectores peri- Jun 2016 Ago 2016
muestras vegetales y de 3 animales féricos carrete- 0% 100%
Colección e identificación de 2 ra Iquit/Nauta. Nov2016 Dic 2016
muestras fúngicas Herbario, 0% 100%
Dpto.
Microbiología
4. OBTENCION DE EXTRACTOS
Preparación de 2 extractos etanólicos CIRNA Dic 2016 Ene 2017
fúngicos 0% 100%
5. CAPACIDAD ANTAGÓNICA DE
BIOPRODUCTOS
5 secreciones laticíferas y 3 CIRNA Ago2016 Nov 2016
bioproductos animales 0% 100%
2 extractos fúngicos CIRNA Ene2017 Feb 2017
0% 100%
6. CONCENTRACION MINIMA
Determinación de CMI y CMB CIRNA Feb2017 Abr 2017
0% 100%
7. PRESENTACION EN EVENTO Ene
2017
100%
8. ELABORACION DE INFORMES CIRNA Dic 2015 Jun 2016
25% 25%
Dic 2016 Jun 2017
25% 25%

17
X. RESULTADOS ESPERADOS
Se espera aislar 10 cepas de cada una de las especies bacterianas
seleccionadas, las cuales mostrarán un determinado perfil de resistencia
antibiótica y en caso de encontrar la existencia de cepas drogorresistentes,
algunas de ellas podrían ser susceptibles a los bioproductos ensayados, lo cual
posibilitaría emplearlos en la elaboración de fármacos capaces de contrarrestar
las infecciones producidas por S. aureus o P. aeruginosa.

18
XI. ESTRATEGIAS A UTILIZAR PARA LA TRANSFERENCIA Y COMUNICACIÓN
DE LOS RESULTADOS

La transferencia y comunicación de los resultados en primer término se hará a

través de la presentación de comunicaciones orales o pósters que serán
difundidos a la comunidad científica mediante eventos de la especialidad y
también se publicarán en revistas científicas, así como en diarios, revistas
locales y página web de la UNAP, para el conocimiento de la comunidad en
general.

19
XII. IMPACTOS ESPERADOS

La información que se obtendrá en el presente estudio contribuirá a

incrementar los conocimientos que se tienen acerca del rol que cumplen
algunos bioproductos naturales como alternativas para combatir las
infecciones causadas por estas bacterias drogorresistentes oportunistas, esto
conllevaría a incrementar la valía de estos recursos biológicos como fármacos
empleados en la terapia de infecciones bacterianas, planteándose de este
modo la posibilidad de substituir el empleo de los antibióticos por este tipo de
sustancias, que podrían ser más económicas.
Por otro lado, la ejecución de este proyecto multidisciplinario cuenta con buen
número de investigadores que garantizarían una mejora de las capacidades
técnicas, lo cual posibilitará que un buen número de estudiantes de la
Facultad de Ciencias Biológicas o afines, puedan realizar su trabajo de tesis,
así como prácticas preprofesionales, considerándolos como potenciales
recursos humanos que podrían formarse como jóvenes investigadores, de
este modo, nuestro laboratorio asumiría el rol de un semillero de científicos
que estarían a la espera de una oportunidad, mientras tanto se posibilitará su
participación en eventos científicos como expositores de los resultados de sus
investigaciones.

20
XIII. INFRAESTRUCTURA Y EQUIPOS A UTILIZARSE
La parte experimental del proyecto se desarrollará en el laboratorio del área de
Microbiología del Centro de Investigaciones de Recursos Naturales de la
UNAP (CIRNA-UNAP), el cual cuenta con dos ambientes con los equipos
necesarios que se utilizarán durante la realización de las actividades
programadas en el proyecto, toda vez que este trabajo de investigación guarda
una cercana relación con el desarrollado durante los dos años anteriores.

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 XIV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES POR COMPONENTES MENSUALIZADO

PRIMER AÑO (JUNIO 2015-MAYO 2016)

MESES
COMPONENTES/ACTIVIDAD/RESPONSABLE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
BACTERIANA
Aislamiento de 10 cepas sospechosas de X X X X X X X X X X
P. aeruginosa y 10 cepas sospechosas
de S. aureus. Tresierra, Heredia, Vilchez
Identificación de 10 cepas de P. X X X X X X X X X X
aeruginosa y 10 cepas de S. aureus.
Bardales, Bendayán, García
DETERMINACIÓN DEL RESISTOTIPO DE
LAS CEPAS
Aplicación de 20 antibiogramas: X X X X X
*10 antibiogramas P. aeruginosa
*10 antibiogramas S. aureus
Mori, Tresierra, Irigoín
ELABORACIÓN DE INFORME (semestral y X X
anual) Tresierra, Ruiz, Heredia

SEGUNDO AÑO (JUNIO 2016-MAYO 2017)

MESES
ACTIVIDAD/RESPONSABLE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
COLECCIÓN E IDENTIFICACIÓN
DE BIOPRODUCTOS
Colección e identificación de X 5 X X
muestras vegetales y de 3 animales
García, Bardales, Tresierra
Colección e identificación de 2 X X
muestras fúngicas. Bendayán, Mori
OBTENCIÓN DE EXTRACTOS
Preparación de 2 extractos etanólicos X X
fúngicos. Ruiz, Vilchez
CAPACIDAD ANTAGÓNICA DE
BIOPRODUCTOS
5 secreciones laticíferas y 3 X X X X
bioproductos animales. García, Bardales,
Tresierra
2 extractos fúngicos. Bendayán, Mori X X
CONCENTRACION MINIMA
Determinación de CMI X X
Determinación de CMB X X
PRESENTACION EN EVENTO/ A. X
Tresierra
ELABORACIÓN DE INFORMES X X
.Tresierra, Irigoín, Ruiz

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XV. PRESUPUESTO POR RUBROS

RUBRO MONTO
(S/.) %
Alimentos y bebidas como refrigerio, monto que no debe ser 1,200.00 2%
superior al 5% del costo total del proyecto.
Desarrollo de los componentes y actividades directamente
relacionadas con el proyecto. Monto estimado mayor o igual a 50
% para ciencias Naturales y 40% para ciencias sociales. (Sin 33,350.00 57 %
considerar rubros siguientes)
Movilidad local para el equipo de investigadores, monto que no 11,800.00 20 %
debe superar el 20%.del costo total del proyecto.
Pasajes y viáticos, máximo para dos integrantes del equipo de
investigación siempre y cuando que su participación sea como
ponentes en eventos científicos relacionados con el proyecto, 3,000.00 5%
monto que no debe superar el 5% del costo total del proyecto
Adquisición y renovación de equipos menores, monto que no debe 2,200.00 4%
superar el 30% del costo total del proyecto
Servicios de terceros vinculados a las actividades del proyecto, 3,050.00 5%
costo que no debe superar el 10% del costo total del proyecto.
Gastos Operativos del Proyecto (materiales de escritorios, 4,250.00 7%
limpieza, Vestuario, accesorios y prendas diversas, repuestos y
accesorios de computo, otros 10%.

TOTAL S/ 58,850.00 100 %

PRESUPUESTO POR PARTIDAS GENÉRICAS

PARTIDAS MONTO
(S/.)
2.3.1 1.1 1 Alimentos y bebidas para consumo humano 1200.00
2.3.1 2.1 1 Vestuarios, accesorios y prendas diversas 500.00
2.3.1 5.1 2 Papelería en general, útiles y mat. de oficina 2,000.00
2.3.1 5.3 1 Aseo, limpieza y tocador 1,750.00
2.3.1 8.2 1 Material, insumos, instrumental,… y de laboratorio 33,350.00
2.3.2 1.2 1 Pasajes y gastos de transporte 1,100.00
2.3.2 1.2 2 Viáticos y asignaciones por comisión de servicio 1,900.00
2.3.2 1.2 99 Otros gastos (movilidad local) 11,800.00
2.3.2.4.15 De maquinarias y equipos 1,500.00
2.3.2 7.11 99 Servicios diversos 1,550.00
2.6.3 2.9 1 Aire acondicionado y refrigeración 2,200.00

TOTAL S/. 58,850.00

23
 PRESUPUESTO POR COMPONENTES DEL PROYECTO

Unidad de
Componente Medida Cantidad Monto (S/)
Aislamiento e identificación Cepa 20 20,000.00
bacteriana
Determinación del resistotipoAntibiograma 20 9,000.00
de las cepas
Elaboración de informes Informe 2 1,000.00
(primer año)
Colección e identificación deBioproducto 10 1,000.00
bioproductos
Obtención de extractos Extracto 2 3,000.00
Capacidad antagónica de Bioensayo 200 18,000.00
bioproductos
Bioensayo Según el número de 1850.00
Concentracion minima bioproductos con
capacidad
antagónica
Presentacion en evento Trabajo 2 3,000.00
Elaboración de informes Informe 2 2,000.00
.(segundo año)

TOTAL: S/. 58,850.00

24
XVI. MONITOREO Y EVALUACIÓN : MATRIZ DEL MARCO LÓGICO

OBJETIVOS INDICADORES MEDIOS DE SUPUESTOS DE

VERIFICABLES VERIFICACIÓN IMPORTANCIA
FIN Aislamiento de las
Encontrar uno o Bioproductos con Fotografías, especies bacterianas
más bioproductos capacidad antagónica tablas, cuadros, de importancia clínica
frente a bacterias de seleccionadas.
naturales con cepario.
importancia clínica. Presencia de cepas
capacidad Artículo multidrogorresistentes.
antagónica para publicado. Susceptibilidad de las
combatir bacterias Trabajo cepas frente a los
drogorresistentes. presentado en bioproductos.
evento científico.
PROPÓSITO
Brindar una Al finalizar el proyecto Informes técnicos Presupuesto oportuno
alternativa que se determina la exis- de avance y suficiente.
tencia de por lo semestrales y Productos y equipos
posibilite combatir
menos un final. de laboratorio
infecciones
bioproducto natural disponibles.
causadas por
amazónico activo Cepas bacterianas
bacterias multidro- contra cepas via-bles y
gorresistentes. multidrogorresistentes debidamente
Además, el de las especies preservadas.
proyecto constituye bacte-rianas en Bioproductos
una buena estudio. amazónicos
alternativa para disponibles en
realizar trabajos de cantidad suficiente
tesis.
RESULTADOS /
PRODUCTOS
Haber aislado cepas Al finalizar el proyecto -Cepas viables Presupuesto oportuno
de las dos especies se determina la exis- preservadas. y suficiente.
bacterianas de tencia de por lo -Fotografías o Productos y equipos
importancia clínica, menos un diapositivas. de laboratorio
algunas de ellas, bioproducto activo - Tablas. disponibles.
resistentes a los contra cepas - Cuadros Cepas bacterianas
antibióticos pero sen- multidrogorresistentes viables y debidamente
sibles a algún de las especies preservadas.
bioproducto natural bacterianas en Bioproductos
amazónico (10 cepas estudio. amazónicos
de P. aeruginosa y disponibles en
10 de S. aureus). cantidad suficiente.

ACTIVIDADES
Componentes:
-Aislamiento e identi- 10 cepas de S. Informes técnicos Financiamiento opor-
ficación de cepas aureus y 10 de P. y económicos tuno y suficiente.
bacterianas aeruginosa, Productos y equipos
de laboratorio
disponibles.
Acceso a laboratorios

25
-Determinación del 200 antibiogramas de Informes técnicos Financiamiento opor-
resistotipo de las ce- las cepas bacterianas de avance, foto- tuno y suficiente.
pas bacterianas ais- aisladas grafías, diapositi-
ladas vas,tablas,cuadros

-Colección e identi- 10 bioproductos Informe técnico Accesibilidad a

ficación de muestras colectados e iden- fuentes de
de bioproductos
tificados. bioproductos
amazónicos vegetales. seleccionadas.
Recurso humano
calificado.
Material biológico
disponible y en
cantidad suficiente.

-Obtención de extrac- 2 extractos fúngicos Productos Productos y equipos

tos fúngicos preservados. preservados. de laboratorio
disponibles.
Acceso a laboratorios

-Capacidad antagónica 20
d cepas analizadas Informes técnicos Bioproductos
de bioproducto natural frente a los 10 de avance disponibles en
bioproductos Fotografías, cantidad suficiente.
amazónicos. diapositivas, Cepas bacterianas
tablas o cuadros viables y debidamente
preservadas.
Financiamiento opor-
tuno y suficiente
Productos y equipos
de laboratorio
disponibles.

-Determinación de la 100% de ensayos Informes técnicos Acceso a laboratorios

CMI y de la CMB de los requeridos de avance Cepas bacterianas
extractos con actividad. Fotografías, viables y debidamente
diapositivas, preservadas.
tablas o cuadros Bioproductos
disponibles en
cantidad suficiente.
Financiamiento opor-
tuno y suficiente
. Productos, equipos y
acceso al laboratorio
disponibles

26
 XVII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Engelhart S., Fischnaller E., Simon A. 2008. Microbial contamination of computer user
interfaces (keyboard, mouse) in a tertiary care centre under conditions of practice.
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el 17/05/2015)
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antibacteriana de la clara de huevo de la tortuga marina Lepidochelys olivacea.
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13, Disponible en: <http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1028-
47962008000400005&lng=es& nrm=iso>. ISSN 1028-4796.

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27
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Wellman L, Picman J & Hincke M. 2008. Comparative antibacterial activity of avian egg
white protein extracts. British Poultry Science 49: 125-132.

28
XVIII. ANEXOS

CARTA N°279-CMTE INVESTIGACION-GRALO-ESSALUD-2915, mediante el cual

el Dr. RICARDO CHAVEZ CHACALTANA, en su calidad de P residente del Comité
de Investigación del HOSPITAL III – IQUITOS, RED ASISTENCIAL LORETO,
solicita al Dr. JIMMY ESTEVES PICON, Gerente Red Asistencial Loreto, se nos
otorguen las facilidades del caso a fin de lograr los objetivos trazados en el
proyecto.

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TESIS DE PREGRADO:

- Actividad antibacteriana de extractos fúngicos de Ganoderma applanatum

sobre cepas hospitalarias de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcua
aureus.
Bach. Betsabeth Trinidad Guzmán
Bach. Emperatriz Morales Amaringo,

- Influencia del pH sobre la actividad antimicrobiana de la corteza de Cedrela

odorata “cedro” frente a cepas de Staphylococcus aureus y Pseudomonas
aeruginosa.
Est. Carolina Reátegui Reátegui
Est. Layne Guerra Vargas.

- Antibiosis de secreciones laticíferas de plantas nativas de la Amazonia peruana

frente a cepas de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus.
Bach. Katia Manzanares Villanueva
Est. Melva Paredes Pérez.

PRACTICANTES:
- Determinación de la actividad antibacteriana de la secreción parotídea de Rhinella
marina “sapo común” sobre cepas de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus
aureus.
Est. GREYCI PÉREZ PADILLA
Est. TACKESHY PINEDO VASQUEZ

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