-Diagnóstico Molecular-

Tarea 1: Protocolos de extracción de ácidos nucleicos (ADN y ARN).

Alumno: Teresa Guadalupe Quintero Puerta.
Asesor: Dra. Indira Rojo Báez.
Grupo: 402.

Extracción de ácidos nucleicos (ADN y ARN)

Los ácidos nucleicos son moléculas que poseen todos los organismos, dirigen y controlan la síntesis
de proteínas, proporcionando la información que determina su especificidad y características
biológicas y contienen las instrucciones necesarias para realizar los procesos vitales y son los
responsables de todas las funciones básicas de los seres vivos. Son grandes polímeros formados por
la repetición de monómeros denominados nucleótidos. Cada nucleótido consta de tres partes: un
azúcar de cinco carbonos o pentosa (Desoxirribosa para el DNA o Ribosa para el RNA), uno o más
grupos fosfato y una base nitrogenada.
 El diagnóstico molecular comienza con la extracción de ácidos nucleicos, la cual consiste en
una lisis celular para liberar las moléculas en una fase acuosa que es separada de los restos
celulares por centrifugación. Las proteínas son removidas de la fase acuosa con solventes
orgánicas (como fenol o cloroformo). El ácido nucleico, que permanece en la fase acuosa,
precipita con etanol y posteriormente es purificado y suspendido en el eluyente adecuado. El
material genético resultante se podrá utilizar para hacer el diagnóstico mediante la técnica
molecular adecuada.

Extracción de ADN por precipitación mediante sales y alcoholes

Tras la lisis celular y la eliminación de las proteínas de la muestra, se precipitan los ácidos nucleicos
añadiendo isopropanol o etanol. Este método permite la obtención de ADN de gran pureza y presenta
la ventaja de que las soluciones utilizadas son muy seguras para la salud del personal técnico que
realiza la extracción, siendo el caso contrario el método de extracción por medio de solventes
orgánicos que pueden ser tóxicos para la salud de quien los maneja y la muestra puede estar
contaminada por restos de los solventes orgánicos, sin embargo, es de alto rendimiento.
 Protocolo general:
1. Obtención de la muestra, esta puede ser: sangre periférica, células mononucleares de sangre,
saliva o tejidos y/o plantas.
 Especificaciones de para diferentes muestras
o Muestras de sangre total: para este tipo de muestras es necesaria la realización previa de una
lisis selectiva de glóbulos rojos. Para ello se añaden tres volúmenes de una solución de lisis de
glóbulos rojos al volumen inicial de sangre total a lisar. La muestra se mezcla por inversión y se
deja actuar durante 5 minutos invirtiendo el tubo con suavidad varias veces durante la
incubación. Si la muestra se ha lisado completamente se observará un cambio de color hacia
una tonalidad bastante más oscura. Posteriormente se procede a una centrifugación para
precipitar los leucocitos de la muestra que quedan pegados en el fondo del tubo mientras que el
 sobrenadante que contiene los glóbulos rojos lisados se elimina por decantación. Es conveniente
dejar un pequeño volumen de líquido residual de 200-400 µl para resuspender los leucocitos
mediante un vigoroso vórtex de aproximadamente 20 segundos.
o Muestras de saliva: previamente al procesamiento de las muestras de saliva recogidas en un
recipiente con preservante Oragene® se recomienda una incubación de la muestra a 50ºC
durante 1-2 horas con objeto de optimizar el rendimiento final de ADN obtenido. Este tiempo de
incubación puede incrementarse si se considera necesario para aumentar el rendimiento final
de muestra.
o Muestras de tejido: las muestras de tejido deben ser homogeneizadas para que las células
queden más expuestas a la acción de los reactivos. Existe una gran variedad de métodos de
disrupción de tejido desde sonicación, hasta trituradores mecánicos, utilización de mortero,
adición de esferas de vidrio y fuerte agitación entre otros métodos. En algunos protocolos de
extracción de ADN la solución de lisis celular se añade una vez homogeneizada la muestra,
mientras que en otros la homogeneización de la muestra se lleva a cabo en la propia solución
de lisis

2. Se añade solución de lisis a la muestra. En este paso es necesario asegurar una lisis celular
eficiente, por lo que si la muestra se observa homogénea se puede continuar con el paso
siguiente del protocolo; por el contrario, si se observa la presencia de cuerpos celulares en la
solución se recomienda una incubación a 37ºC o 65ºC hasta una homogeneización completa
de la muestra.

3. Si se pretende obtener una muestra libre de ARN se procede a la adición de RNAsa con una
incubación a 37ºC de entre 15- 45 min. Este paso no es necesario en muestras de sangre
periférica en las que la contaminación por ARN es prácticamente indetectable.

4. Se añade una solución salina que permite la precipitación de las proteínas citoplasmáticas y
nucleares de la muestra. Se procede a una agitación vigorosa de la muestra (con vórtex) durante
20-30 segundos. A continuación, se lleva a cabo una centrifugación a la velocidad y tiempo
necesarios para asegurar la precipitación total de las proteínas. Las proteínas precipitadas se
observarán en el fondo del tubo como un botón de color marrón. El sobrenadante debe
observarse sin turbidez o presencia de partículas o trazas de color marrón.

5. El sobrenadante que contiene el ADN en solución se transfiere a un nuevo tubo con isopropanol.
La muestra se mezcla con el isopropanol invirtiendo el tubo suavemente aproximadamente 50
veces. En este paso se puede observar la aparición de la hebra de ADN. No obstante, la
observación de esta hebra va a depender de la cantidad de muestra de ADN procesada.

6. Se procede a la centrifugación de la muestra para precipitar el ADN en el fondo del tubo. El

ADN se observará como un precipitado de color blanquecino. Con mucho cuidado, se elimina
el sobrenadante por decantación y el tubo con el precipitado de ADN se coloca invertido sobre
una hoja limpia de papel absorbente para eliminar al máximo el remanente de isopropanol.

7. Se añade Etanol al 70%, se tapa el tubo y se invierte con suavidad varias veces para lavar el
precipitado de ADN. La muestra se centrifuga y el etanol se elimina por decantación o extracción
mediante punta de pipeta (con mucho cuidado puesto que el ADN puede despegarse del fondo
 del tubo). Debemos asegurarnos de que el precipitado de ADN sigue observándose en el fondo
o en las paredes del tubo.

8. El exceso de etanol se elimina mediante inversión del tubo sobre una hoja limpia de papel
absorbente o dejando secar el tubo al aire durante unos minutos hasta que no se observen
restos de etanol.

9. Se procede a la hidratación del ADN con una solución tamponada adecuada, o bien con tampón
TE (Tris HCl 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM) o agua estéril.

Extracción de ARN total por Trizol

La solubilización y extracción con Trizol es un método general desarrollado recientemente para
desproteinizar el ARN. Este método es particularmente ventajoso en situaciones en las que las células
o los tejidos están enriquecidos por RNasas endógenas o cuando la separación del ARN citoplásmico
del ARN nuclear es impráctica. Trizol es una solución monofásica de fenol e isotiocianato de guanidinio
que a la vez solubiliza material biológico y desnaturaliza la proteína. Después de la solubilización, la
adición de cloroformo causa la separación de fases (muy similar a la extracción con fenol: cloroformo:
alcohol isoamílico), donde la proteína se extrae a la fase orgánica, el ADN se resuelve en la interfaz y
el ARN permanece en la fase acuosa. Por lo tanto, el ARN, el ADN y la proteína se pueden purificar a
partir de una sola muestra (de ahí el nombre Trizol). La extracción con Trizol también es un método
eficaz para aislar pequeños ARN, como los microARN, los ARN endógenos de pequeña interferencia.
Sin embargo, el Trizol es caro y los pellets de ARN pueden ser difíciles de resuspender.
 Protocolo general:
Reactivos:
Trizol, PCI, cloroformo, etanol absoluto, isopropanol, tubos eppendorf de 1.5 y 2 ml, y tubos de 5 ml
para homogenización, agua tratada con DEPC, DNAsa, agua libre de RNAsas o SDS AL 0.5.%,
GlycoBlue, acetato de sodio y tubos de gel de bloqueo de fase.
1. Preparación de la muestra:
Homogenizar la muestra al agregar 1 ml de trizol a la misma.
o En caso de tejido el tamaño de la muestra es de 50-100mg en general el volumen de la muestra
no debe exceder del 10% del volumen de trizol, puede auxiliarse de un homogeneizador
de embolo y tubo o algún otro aparato homogeneizador con resultados equivalentes.}
o Para células en suspensión, homogenice mediante pipeteo repetidas veces, utilice 1ml
de trizol para cada 5-10*10^6 células animales para células en monocapa el volumen del
trizol está en función del tamaño del área de cultivo y no del número de células, agregue 1ml
para diámetros de 3.5cm y homogenice mediante pipeteo repetidas veces.

2. Separación de fases:
o Repose el homogenizado durante 5 minutos y temperatura ambiente para permitir la
disociación completa de proteínas.
o Agregue al homogenizado 0.2ml de cloroformo por cada 1ml de trizol utilizado.
o Agite vigorosamente a mano durante 15 segundos o utilice un vortex
o Encube el homogenizado durante 2-3 minutos y temperatura de 15 a 30 ºC
 o Centrifugue la muestra a 12 000 rpm durante 15 minutos y 2-8ºC, después de centrifugar la
muestra deberá estar separada en dos fases, una roja que corresponde a la fase fenol-
cloroformo y una fase incolora que corresponde a la fase acuosa, el RNA permanece
exclusivamente en esta última fase.

3. Precipitación:
o Transfiera la fase acuosa a un nuevo tubo, guarde la fase orgánica si se desea una posterior
extracción del DNA.
o Precipite el RNA de la fase acuosa utilizando alcohol isopropílico, agregue 0.5ml por cada
1ml de trizol usado en la fase de homogenización.
o Encube las muestras a temperatura de 10-30ºC durante 10 minutos.
o Centrifugue la muestra a 12 000 rpm durante 10 minutos y 2-8ºc, después de centrifugar la
muestra, el RNA precipitado a menudo es visible formando un botón al fondo del tubo.

4. Lavado del ARN:

o Retire el sobrenadante y lave una vez el botón de RNA con 1ml de etanol al 75% por cada
1ml de trizol utilizado en la homogenización, lave dando pequeños golpecillos con el dedo
en la punta del tubo.
o Mezcle la muestra mediante un vortex y centrifugue a 7500 rpm durante 5 minutos y
temperatura de 2 a 8ºC.
o Por último resuspender la muestra de RNA en agua libre de RNAsa o solución al 0.5% de
SDS.

Bibliografía consultada
http://redbiobancos.es/Pages/Docs/PNT_Acidos_Nucleicos.pdf
http://cshprotocols.cshlp.org/content/2010/6/pdb.prot5439.abstract
https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/tri-reagent.html

17/Ene/2019.