8/26/14

Isola-on  of  nucleic  acids  and  

gel  electrophoresis  

Isola-on  of  nucleic  acids  

1.  Cell  lysis    
 Detergent  
 Mechanical  disrup-on  
 
2.  Separa-on  from  proteins  
 Proteinase  (Proteinase  K)  
 
3.  Removal  of  DNA  or  RNA  depending  on  what  you  want  to  have  
 
4.  Purifica-on  nucleic  acid  
 Phenol-­‐Chloroform  clean  up.    
 Ethanol  or  isopropanol  precipita-on  
 Column  purifica-on  (silica,  ion  exchange)  

1  
 8/26/14  

Purifica-on  methods  depends  on  the  downstream  usage  

Simple                  Labor  intensive  

Expensive              Economic  
Dirty          vs.      Clean  
Fragmented              Intact  

1.  Popula-on  gene-cs  using  short  PCR  fragments  (oSen  mitochondrial  DNA)  

 Chelex  extrac-on:  mul-ple  samples  can  be  processed  for  large  number  of  samples  
 
2.  Use  of  commercial  kits  
 Use  of  silica  or  anion  exchange  or  silica  gel  column    
 
3.  Phenol-­‐chloroform  extrac-on  
 Ceicium  chloride  centrifuga-on  
 The  most  intact  DNA  can  be  obtained  
   
 
 
Images  from  Wikipedia  

Isola-on  of  nucleic  acids  by  using  a  

kit  (Qiagen  Dneasy  kit)  

1.  Cell  lysis    
2.  Separa-on  from  proteins  
3.  Removal  of  RNA    
4.  Purifica-on  nucleic  acid  

hZp://www.qiagen.com/products/catalog/sample-­‐
technologies/dna-­‐sample-­‐technologies/genomic-­‐
dna/dneasy-­‐blood-­‐and-­‐-ssue-­‐kit#resources  

2  
 8/26/14  

DNA  isola-on  kits  usually  provide  ~<100ng/μL  conc.  

If  you  want  to  have  high  concentra-on  for  downstream  work  

There  are  small  volume  elu-on  kits  for  high  

concentra-on  
 
Size  filtra-on  for  removal  of  excessive  liquid  
 
Evapora-on  
 
DNA  precipita-on  
 NaOAc-­‐ethanol  precipita-on  
 NH3OAce-­‐isopropanol  precipita-on  

DNA  quality  and  yield  

The  most  frequently  used  method  is  spectrophotometric  analysis  for  op-cal  density  
 1  A260  unit  dsDNA  =  50  µg  
 1  A260  unit  ssDNA  =  37  µg  
 1  A260  unit  ssRNA  =  40  µg  
The  purity  is  calculated  by  A260/A280  >1.5  

Using  fluorescent  dye  specific  to  DNA  or  RNA  (SYBR  Green)  
 Higher  sensi-vity  and  specificity  (more  reliable)  
 You  need  a  fluorescent  reader  

Gel  electrophoresis  and  staining  with  molecular  weigh  marker  with  known  amount    

3  
 8/26/14  

DNA  quality  and  yield  

Nanodrop  
spectrophotometer  

DTT  contamina-on  

Phenol  contamina-on   Sodium  acetate  contamina-on  

DNA  electrophoresis  

4  
 8/26/14  

Remember!  

You  are  working  with  a  large  number  of  molecules  that  could  be  
iden-cal  (clone  or  clones)  or  several  different  subpopula-ons.    
 
You  will  learn  the  ways  to  analyze  nucleic  acid.  
 Detec-on  of  polymorphism  
   Size  
   Restric-on  site  
   Sequence  
 Quan-fica-ons  (for  RNA)  
   Q-­‐RT-­‐PCR  

Various  ways  of  electrophoresis  and  alike  techniques  are  

frequently  used  method  for  studying  the  varia-ons/  
polymorphisms  of  nucleic  acids.  

Why  gel  electrophoreses  ?  

Es-ma-on  of  the  size  of  DNA  molecules    

 
 Restric-on  enzyme  cuong  site  
 Restric-on  fragment  length  polymorphism  
 PCR  product  size  
 
Separa-on  of  DNA  fragments  for  extrac-on  and  
purifica-on  
 
Separa-on  of  restricted  genomic  DNA  prior  to  
Southern  or  Northern  bloong  

5  
 8/26/14  

Different  kinds  of  gel  electrophoreses  for  nucleic  acids  

1.  Polyacrylamide  gel  
Generally  for  higher  resolu-on,  but  for  smaller  sizes  (up  to  ~500bp)  
Low  amount  of  samples  
Other  variable  methods  for  more  accurate  analyses  
 Denaturing  gel  for  single  stranded  nucleic  acids  
 DGGE  (denaturing  gradient  gel  electrophoresis),  and  others  

2.  Agarose  gel  

Lower  resolu-on,  but  for  larger  sizes  (up  to  ~10kb)  
Easy  to  handle  and  non-­‐toxic  
Adjustable  agarose  percentage  for  your  need  
   0.5%    1,000–25,000bp    
   0.7%    800–12,000bp    
   1.0%    500–10,000bp    
   1.2%    400–7,000bp    
   1.5%    200–3,000bp    
   2.0%    50–2,000bp    
 Different  types  of  agarose  (low  mel-ng,  high  strength,…)  

Others  are  capillary  electrophoresis,  robo-c  gel  equipment,  and  so  on…  

Different  kinds  of  gel  electrophoreses  buffers  

Most  popular  types  are,  
 
 
TAE  (Tris,  Ace-c  acid,  EDTA)     TBE  (Tris,  Boric  acid,  EDTA)  
           
 Weaker  buffer  power       Stronger  
             
 Higher  resolu-on       Lower  resolu-on  
             
 Runs  slightly  faster       No  
             
 Easy  to  purify  the  nucleic  acid  from  a  band   No      
 

We  will  use  TAE  0.5x  for  our  gel.  

6  
 8/26/14  

Details  in  DNA  electrophoresis  

Loading  DNA:    Usually,  ~50  ng  per  band  (in  a  small  gel)  is  sufficiently  
visible  and  sharp.    ~  10  μL  or  less  is  usually  recommended.  
 
Loading  dye:  contains  heavy  solu-on  (sucrose,  ficoll,  or  glycerol)  and    
   Bromophenol  blue  (~300bp),    Xylen  cyanol  (~4kb)  
 
Voltage:  ~5V/cm,  usually  un-l  when  the  first  dye  (Bromophenol  blue)  
reaches  to  the  ¾  of  the  gel,  ~30  min  to  1  hr  depending  on  the  length  of  
the  gel.  
 
You  will  use  GelStar  (Lonza)  for  visualizing  the  bands.  
 
We  will  use  TAE  1x  
 
 

Band  paZerns  for  isolated  gDNA    

Degrada-on  of  genomic  DNA  can  be  easily  dis-nguished  by  

smeared  band  
 
Remaining  RNA  is  also  visible  as  lower  molecular  weight.  

7  
 8/26/14  

FAQ  
Why  people  run  polyacrylamide  gel?  
 
What  makes  DNA  yield  higher?  
 

What  do  we  do  today  

Genomic  DNA  isola-on  by  using  Qiagen  kit  

 
Gel  loading  
 
Quan-fica-on  of  nucleic  acids  
 
Gel  picture  

8