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GUIA DE ESTUDIO:
TECNICAS HISTOLOGICAS
AUTOR
M.V.M Sc. RICARDO ALZOLA
PROF. ADJUNTO
AÑO 2001
Se llama técnica histológica a la serie de pasos que han de darse para obtener un preparado
observable con el microscopio óptico. Es un proceso largo que abarca desde el momento en que se
toma el material hasta que el preparado puede observarse.
PASOS:
Las proteínas y ácidos nucleicos “pequeños” como el ARN de transferencia en general se pierden
durante la preparación de la muestra de tejido. Además pueden perderse moléculas grandes, por ej.
estas pueden ser hidrolizadas por un pH desfavorable en las soluciones fijadoras. Son ej. de
moléculas grandes, que desaparecen durante la fijación de rutina en fijadores acuosos: el glucógeno,
proteoglucanos y glucosaminoglucanos. También suelen perderse los lípidos neutros.
Al preparar muestras para su inclusión en parafina también se pierden moléculas pequeñas solubles
o iones.
Además y con el mismo propósito, la fijación debe hacerse muy cuidadosamente antes de proceder
a la deshidratación.
Muestreo:
En cuanto la sangre deja de llevar oxígeno a los tejidos y de extraerles el anhídrido carbónico,
las enzimas de las células que componen los tejidos comienzan a actuar y se produce la autólisis,
las propias estructuras moleculares son deformadas, que es lo que precisamente se ha de evitar. Los
tejidos y órganos se han de extraer considerando las siguientes prioridades:
Material de necropsia:
El examen necrópsico debe ser realizado lo más rápidamente posible después de la muerte,
si esto no es posible el animal debe ser colocado a 4° C. o sometido a embalsamamiento por vía
arterial.
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Procedimientos generales:
Si se extraen varios órganos se debe tener cuidado en registrar cada trozo de órgano
envolviéndolo en una gasa o bien pasando un hilo directamente por un extremo del órgano, mientras
quede el extremo opuesto se coloca un trozo de cartulina resistente donde se escribe con lápiz las
indicaciones (órgano, porción, etc.) del caso, todo esto es necesario si las muestras a extraerse son
muchas pues luego se verá dificultado el reconocimiento.
La cantidad de líquido fijador en microscopia óptica debe ser aproximadamente 10 a 20 veces el
volumen de la muestra.
Los fragmentos de órganos no deben ser mayores de 1 cm de espesor; deben ser tomados en
ángulos rectos a la superficie de los órganos y deben ser suficientemente profundos para
comprender los constituyentes anatómicos normales como por ej. cápsula, corteza, médula, etc. A
veces pueden cortarse trozos de órganos de mayor tamaño, 2 o 3 cm y luego de algunas horas en
fijador en que las piezas están más fáciles de manejar, se realizan cortes más pequeños de los
mismos.
2.- Fijación:
Concepto:
La fijación es una operación destinada a “matar” las células, conservándolas, cuanto sea
posible en el estado en que están durante la vida.
Introducción:
Una buen a fijación debe:
- inmovilizar la célula
- conservar exactamente todas las partes constitutivas.
- no hacer aparecer artificialmente otros detalles en la estructura.
Una acción rápida y enérgica del reactivo impide bien las alteraciones espontáneas postmortem,
pero este modifica también la estructura celular.
Los mejores fijadores son los que además de actuar rápidamente producen el menor numero
posible de reacciones (modificaciones) secundarias o artificios, capaces de darnos una idea muy
falseada de la morfología interna de la célula.
Un tejido bien fijado mostrará células plenas, no vacuolizadas, ni hinchadas, ni arrugadas, sino
presentando muchos detalles de estructura fina.
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El verdadero papel de la fijación es el de producir una coagulación o una precipitación lo más
completa posible de todos los albuminoides celulares, conservando la configuración corres-
pondiente a su naturaleza amorfa (citoplasma), granulosa (gránulos de secreción), filamentosa (con -
drioma), etc.
- La pieza cae al fondo, en este caso el fijador es hipotónico, y la fijación tiene bastantes
probabilidades de ser incompleta e irregular.
- La pieza permanece flotando en la superficie, el fijador es hipertónico, muy denso y las células
se contraerán.
- La pieza se sumerge, pero queda por encima del fondo del recipiente, hay equilibrio físico y la
fijación será buena si los ingredientes del fijador fueron bien elegidos.
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La rapidez de acción de un fijador debe tener por objeto el de “matar” lo más pronto posible las
células. La precipitación total, por el contrario, debe producirse adecuadamente de modo que no se
produzcan contracciones.
“La muerte de la célula debe ser inmediata y su coagulación debe ser mediata”.
Agentes fijadores:
Los agentes fijadores pueden ser de orden físico o de orden químico.
Agentes Físicos:
- Frío:
No puede ejercer ninguna acción fijadora a temperaturas que no pasen de 0° C. Endurece los
tejidos y suspende las alteraciones celulares debidas a la necrosis y a la autodigestión. Este
agente no sería más que una ayuda.
La congelación de los tejidos frescos parece ser a priori, un detestable procedimiento
histológico. El aumento de volumen de los líquidos que los llenan y la formación de agujas de
cristales no puede evitar la producción de verdaderos deterioros. Su única ventaja es la de no
precipitar los albuminoides y de no alterarlos.
- Calor:
Ejerce una acción muy diferente según se aplique a objetos secos o húmedos. La fijación por
agua hirviendo o por diversos fijadores en ebullición presta servicios para invertebrados y
búsquedas histoquímicas.
Agentes químicos:
- Ácido acético:
Incoloro, cristalizable por debajo de 17° C. Aumenta el contraste entre núcleo y citoplasma.
Forma parte de la mayoría de las mezclas fijadoras como fijador de la cromatina.
- Ácido ósmico:
Se presenta bajo la forma de cristales amarillentos. Se obtiene comercialmente en pequeños
tubitos de vidrio sellados, contienen cantidades que varían de 0.1 a 1 g.
El manejo de este cuerpo presenta dificultades, es muy volátil y emite sin cesar vapores
extremadamente irritantes.
Es un enérgico oxidante por lo cual es reducido rápidamente por trazas de materia orgánica, por
lo que se debe tener especial precaución para preparar las soluciones. El título habitual es de 1
a 2 %, puede prepararse en agua destilada o en ácido crómico.
Desde el punto de vista morfológico, fija sin precipitar, impidiendo además la precipitación por
el alcohol durante la deshidratación. Mata rápidamente las células y fija bien el citoplasma y el
condrioma pero no muy bien el núcleo. El osmio es un buen fijador de sustancias grasas y de la
mielina. Es poco difusible y por consiguiente poco penetrante de manera que las capas
superficiales de las piezas están superfijadas mucho antes que el reactivo haya llegado al
interior.
- Ácido pícrico:
Pequeños cristales amarillentos que se emplean en soluciones acuosas saturadas o en soluciones
alcohólicas. Solubles en frío en agua, mayor solubilidad con temperatura.
Es un reactivo muy penetrante que no se lo emplea solo, sino formando parte de mezclas, como
en el líquido de Bouin. El ácido pícrico es un excelente fijador, sobre todo desde el punto de
vista tintorial. Se fija con intensidad sobre los citoplasmas, facilita todas las coloraciones.
Contrae pero endurece poco.
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- Alcohol metílico:
Reactivo importante en la técnica de frotis desecados.
- Alcohol etílico:
Puede servir como fijador el alcohol absoluto o el de 96 °.
El alcohol 100, puede dar excelentes fijaciones, por ej. para el sistema nervioso o frotis
desecados.
Disuelve los lípidos, precipita el glucógeno sin fijarlo y da con los nucleoprótidos un
precipitado hidrosoluble. Es poco penetrante, fija mal los núcleos y poco los citoplasmas.
- Bicloruro de Mercurio:
Pequeños cristales blancos muy venenosos, solubles en agua, en frío (7%) en ebullición (54%),
muy soluble en alcohol (32%). En solución acuosa precipita enérgicamente los albuminoides,
principalmente los del núcleo. Estas propiedades se exaltan por la adición de ácido acético, que
vuelve más penetrante el fijador. Una vez terminada la fijación es necesario eliminarlo de los
tejidos para evitar la formación de cristales.
- Bicromatos:
Los bicromatos alcalinos, (Potasio, sodio, Magnesio, Estroncio, Zinc) fijan bien los citoplasmas
pero destruyen los núcleos. Los bicromatos de Bario, Calcio, Cobre, fijan bien las mitosis pero
no los citoplasmas. El más empleado de los bicromatos es el de Potasio, gruesos cristales de
color rojo anaranjado, fácilmente solubles en agua (12.4%).
- Formaldehído:
Este cuerpo es un gas cuya solución acuosa lleva el nombre de formalina o de formol. Toda vez
que hablemos de formol puro tendremos en vista la solución comercial al 40%.
El formol es el fijador más utilizado, a causa de su bajo precio y la facilidad de su empleo.
Es un fijador importante a causa de su poder coagulante y su notable capacidad de penetración.
El formol comercial es un líquido incoloro, que emite vapores irritantes. A veces los vapores
del formol pueden producir accidentes febriles, bronquitis, queratitis.
Resulta muy desagradable manejar piezas embebidas en formol a causa de las violentas
punzadas que no se tarda en sentir en los ojos, la acción sobre la mucosa olfatoria, es tal vez
menos sensible, pero más durable y la olfación puede terminar por quedar notablemente
disminuída.
Conviene no poner los dedos en contacto con las soluciones que contienen formol porque la
epidermis se fija rápidamente y endurece de manera poco agradable, además de poder
ocasionar dermatitis alérgicas por contacto.
Para manejar piezas que han permanecido en formol sin sufrir los inconvenientes mencionados,
se las lava con agua y luego se las introduce en agua ligeramente amoniacal, así se suprime
todo olor.
El formol de comercio casi siempre contiene una cantidad más o menos considerable de ácido
fórmico. Esta impureza daña muchas veces la fijación, produce precipitación en los tejidos,
destruye las células mucosas y daña seriamente los citoplasmas por lo que es necesario
emplear siempre formol neutro.
Es conveniente adoptar una convención para formular el título de las diluciones:
El porcentaje mirará siempre la solució n comercial de 40%, para preparar una solución al 5%
se mezcla 5 cc. de formol con 95 cc. de agua. La solución comercial presenta a veces una
alteración particular que se manifiesta por un aspecto lechoso y por la formación de
precipitado blando más o menos abundante, el frío interviene mucho en este fenómeno.
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Estas transformaciones se explican por la existencia de tres isómeros:
a.- El formol con una molécula de formaldehído,
b.-el paraformol con dos moléculas,
c.- el trioximetileno con tres moléculas.
El formol y el paraformol coexisten en las soluciones límpidas, bajo la influencia del frío o por
otras causas, se polimerizan y dan trioximetileno, insoluble, que forma un precipitado blanco.
Mezclas Fijadoras:
Las mezclas fijadoras se utilizan para técnicas de rutina o para técnicas especiales.
Las mezclas fijadoras son combinaciones de agentes fijadores, cada uno de los cuales es por si solo
insuficiente para dar una fijación que respondaa todas las exigencias.
q de von Tellyesniczki:
A base de bicromato de potasio ácido acético y agua destilada (3 g, 5 cc, 100cc). el bicromato
conserva bien el citoplasma. El ácido acético conserva bien los núcleos. Las muestras no deben
ser mayores de 0.5 cm de diámetro. El tiempo de fijación no debe superar los dos días, al
término del mismo debe hacerse un lavado en agua corriente de 24 h.
q de Bouin:
Para hacer esta mezcla es conveniente tener una solución saturada de ácido pícrico.
Componentes: solución saturada de ácido pícrico 15 cc, formol 40% 5 cc, ácido acético 1 cc.
Es uno de los mejores fijadores para el estudio del glucógeno; penetra rápidamente a los
tejidos, es un buen fijador general, salvo para el riñón. Es muy adecuado para las coloraciones
de Masson y Mallory. Produce poco encogimiento. Según el tamaño de la pieza la fijación
requiere de 1 a 24 h. El líquido completo es una solución estable. Este fijador produce lisis de
los glóbulos rojos y disminuye la cantidad de hierro férrico demostrable. Los tejidos no deben
permanecer por más de 12 a 24 h. pues sino se vuelven duros y quebradizos. Una vez terminada
la fijación se debe pasar directamente a la deshidratación con alcohol 80°.
q De Carnoy:
Los componentes de esta mezcla son los siguientes: alcohol etílico, cloroformo, ácido acético
glacial (60 ml, 30 ml, 10 ml ).
Este fijador es muy adecuado para pequeños fragmentos tisulares, por ej. obtenidos por
raspado, que se fijan bien en 30 min. a 2 h. También inicia la deshidratación, es un bu en fijador
para el glucógeno, los núcleos se tiñen bien. Como inconvenientes podemos citar que produce
lisis y encogimiento importante. Disuelve los lípidos y la mielina. Fija bien el glucógeno.
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3.- Deshidratación:
Concepto:
Los tejidos contienen grand es cantidades de agua, tanto intracelular como extracelular, que
debe ser eliminada y reemplazada por parafina.
Detención de la fijación:
Una vez transcurrido el tiempo de fijación deseado es preciso detenerlo rápidamente.
El fijador que rodea la pieza p uede ser eliminado por lavado en:
a.- agua
b.- alcohol
a.- Es imprescindible hacerlo después de la fijación con ácido crómico, bicromato de potasio y
ácido ósmico.
Se hace en agua corriente de 2 a 24 h.
b.- Piezas que han estado en alcohol, ácido pícrico o formol, se llevan directamente al alcohol 70 o
80%, llevándose así a cabo el lavado y el inicio de la deshidratación.
La deshidratación se realiza por medio de un reactivo anhidro pero ávido de agua. Puede utilizarse
la acetona o el alcohol etílico (es el más utilizado).
La deshidratación se hace en forma progresiva con sucesivos baños de alcohol, cada vez menos
hidratados 70° – 80° – 90° – 96° – 100°.
Tiempos de permanencia en cada líquido:
Alcohol 70 las piezas pueden perman ecer varios días.
Alcohol 96 2 baños en un lapso de 24 h.
Alcohol 100 3 baños de una hora c/u.
Solventes:
Benceno – xileno – tolueno – cloroformo – fenol en alcohol – carbolxilol – etc.
La palabra aclarar proviene de que además de eliminar el alcohol muchas de estas sustancias tienen
la propiedad de trasparentar los tejidos.
Xileno: es un excelente agente aclarante pero tiende a hacer que los tejidos sean excesivamente
duros y quebradizos y esto nunca deben dejarse en este líquido más de 3 horas.
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El xileno es inadecuado para el encéfalo y los ganglios linfáticos, pues los hace demasiado
quebradizos, para estos órganos es mejor utilizar cloroformo.
Tolueno: tiene las mismas propiedades generales que el xileno pero resulta mejor porque endurece
mucho menos los tejidos.
Cloroformo: resulta excelente para el tejido nervioso, ganglios linfáticos y emb riones pues
produce poco encogimiento y no endurece mucho los tejidos.
5.- Inclusión:
La parafina es un hidrocarburo no cíclico. A la temperatura ambiente es sólido. La
temperatura suave la disuelve por completo. Una temperatura mayor de 65° llega a disolverla,
produciéndose vapores de olor desagradable, inflamables y también tóxicos. Hay parafinas que
funden a distintas temperaturas, para la mayoría de los trabajos pueden utilizarse las que lo hacen a
56-58°. En la estufa debe haber cuatro vasijas con parafina ya disuelta. En cada vasija ha de haber
un volumen suficiente como para cubrir por completo las piezas que se han de colocar. Es
conveniente que cada vasija posea su número de orden 1, 2, 3 y 4.
El recipiente número 1 debe tener parafina ya fundida a la que se mezclará una pequeña cantidad de
solvente, el 2 y 3 deben contener parafina pura, que poco a poco ira adquiriendo algo de solvente
cuando las piezas vayan pasando por ellas.
El 4 debe tener parafina completamente pura.
Pasos de la inclusión:
Se ha de preparar tantos moldes cuantas piezas han de incluirse.
Se extrae una pieza, se la libera de la envoltura de gasa, se la ubica en el fondo del molde,
orientándola para saber luego por donde ha de ser cortada.
Sobre la pieza puesta en el molde se vierte parafina fundida, pura de la cuarta vasija. Se deja el
molde sobre una superficie plana y fría, se espera que la falta de calor solidifique toda la parafina,
formándose así un bloque. Mientras se trabaja en una pieza las demás deben estar en la estufa.
Los moldes:
Los hay de varias clases: barras de Leukart, cajas de papel, hormas de metal.
Barras de Leukart:
Consisten en un par de barras de metal, dobladas en ángulo recto a manera de escuadras. A su vez
cada rama de la escuadra tiene un ángulo recto en el extremo. Esta disposición permite que una
barra se aplique contra la otra, como permite deslizamiento es posible agrandar o achicar el molde
conforme las neces idades.
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Las cajas de papel :
Se construyen con una tira de cartulina delgada o con papel resistente. Son muy económicas con
respecto a las barras dado que aquellas son sumamente caras.
Hormas de metal:
Se pueden hacer de dos maneras circulares o cuadradas . Las circulares se hacen cortando
transversalmente “rodajas” de caños de metal o de plástico, las cuadradas se hacen cortando láminas
de aluminio o de hojalata que se doblan sobre un molde de madera, los extremos libres pueden
soldarse.
Ambos tipos de hormas carecen de piso, por lo que es necesario colocarlas al hacer la inclusión
sobre una superficie lisa (ej. un azulejo)
Catalogación:
Cada pieza lleva un hilo con una tarjeta donde se indica de qué órgano o porción del mismo
se trata. Esta medida es la base para catalogar los bloques. La catalogación puede hacerse de
diferentes maneras de acuerdo a las necesidades particulares.
Siempre se tendrá en cuenta que en la misma conste, animal, fijador, fecha, código, bloques, etc.
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¿Como se regula el espesor de los cortes?
Se hace mediante un tornillo micrométrico, sus pasos de rosca son muy estrechos. Al
avanzar, empuja el bloque portamaterial por una rampa oblicua al plano de deslizamiento de la
cuchilla. Para hacerlo avanzar hay una palanca lateral, una especie de brazo y un tope.
Elegido el espesor que se desea dar a los cortes, se desliza la cuchilla. Se hace el primer corte. Este
si ha salido entero, se recoge con un pincel húmedo y se deposita en la superficie del agua contenida
en una bandeja o cubeta. Es mejor que sea agua fría. Los cortes que naturalmente salen ondulados
se extienden y alisan por completo mediante el agregado a la bandeja de agua tibia.
Teoría de la coloración:
Se sabe que las imágenes producidas por absorción, en preparaciones coloreadas, son mucho
más fáciles de interpretar que las imágenes de difracciones dada por preparaciones no coloreadas,
además los diversos elementos de los tejidos poseen poco más o menos el mismo índice de
refracción lo que hace que el reconocimiento sea una tarea difícil.
Estos dos argumentos hacen comprender la necesidad de las coloraciones para el estudio
morfológico de células y tejidos.
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Un colorante es un cuerpo coloreado que puede comunicar su color a otro cuerpo.
La mayor parte de los colorantes artificiales (y aún los naturales como la hematoxilina), derivan de
cuerpos incoloros, por ej. de carburos aromáticos.
La coloración es la propiedad que tienen ciertos cuerpos de ejercer una absorción selectiva sobre la
luz. Dicho de otra manera un cuerpo se ve de tal color porque trasmite por trasparencia o por
difusión las radiaciones complementarias de las que él absorbe.
Tipos de coloraciones:
Directas: se producen por inmersión en el baño colorante.
Indirectas: en este tipo de coloración, el colorante no puede actuar directamente, el objeto que ha
de colorearse debe ser tratado de antemano por otra sustancia que lo prepare para admitir el
colorante, esta se llama mordiente.
Colorantes naturales:
En todos ellos hay un principio colorante producido por la naturaleza que luego la técnica
del hombre ha sabido extraer, componer y hacerlo efectivo.
Orceína: Es un principio colorante extraído de ciertos líquenes. Es un ácido débil. Utilizando una
mezcla en que el ácido acético actúa como mordiente se utiliza para colorear cromosomas. También
colorea las fibras elásticas.
Colorantes artificales:
Algunos son colorantes del núcleo y otros del citoplasma.
Son sales producidas de la unión de una base y un ácido.
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Colorantes para el núcleo: su base es la que se combina con los ácidos nucleicos, por lo tanto
ésta es la coloreada. El ácido es el incoloro.
Colorantes para el citoplasma: el ácido del colorante es el que se combina con el citoplasma.
La base es la incolora.
Colorantes artificiales más comunes: vesubina, tionina, azul de toluidina, azul de metileno, fucsina
básica, violeta de metilo, verde de metilo, anaranjado de acridina.
Se ha dividido a los colorantes según su afinidad que presentan con el núcleo o con el citoplasma:
• colorantes nucleares o básicos su componente colorante activo es una base coloreada.
• Colorantes citoplasmáticos o ácidos: su componente activo es un ácido coloreado.
• Colorantes neutros.
Los componentes que se tiñen con colorantes ácidos se dicen que son acidófilos (filamentos
citoplasmáticos, la mayor parte del citoplasma no especializado, y las fibras extracelulares).
Cualquier componente de los tejidos que reaccione con un colorante básico se dice que es basófilo
(heterocromatina, nucleolos, ergastoplasma, matriz del cartílago).
Proceso de coloración:
Tomaremos como base para la descripción de este proceso a la coloración de hematoxilina y eosina
considerada como la “coloración de rutina”.
Coloración de hematoxilina y eosina:
Desparafinar los cortes: realizar dos baños de xileno de 10 a 15 min. c/u.
Eliminamos el solvente por sucesivos baños en: alcohol de 100°, 96°, 70° de 1 a 2 min. c/u.
Hidratación de los cortes: en agua destilada durante 1 a 2 min.
Tinción nuclear: en hematoxilina durante 2 a 12 min. de acuerdo a la formula utilizada.
Viraje de la hematoxilina: en agua corriente hasta desprendimiento total del color (3 a 5 min.).
Lavado en agua destilada o corriente.
Coloración citoplasmática: eosina al 0.5% o en una mezcla de eosina/floxina al 0.5% durante 15
a 30 seg.
Lavado en agua destilada.
Deshidratar, aclarar y montar.
Los pasos de la deshidratación pueden ser suplidos dejando secar el corte en estufa a 37° por 15
a 20 min.
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Coloraciones especiales:
Las coloraciones especiales comprenden un conjunto de tinciones o impregnaciones utilizadas para
poner de manifiesto o resaltar determinadas estructuras de los tejidos.
Fibras Elásticas:
Método de Gomori: las fibras elásticas se tiñen de púrpura oscuro.
Orceína: se tiñen de púrpura.
Fibras reticulares:
Método de Gomori para la impregnación argentica de la reticulina: las fibras reticulares se
observan negras.
Tejido adiposo:
Sudan black: el tejido adiposo se observa de color negro.
Sudan IV-rojo Escarlata:
- grasas neutras: se observan de color rojo vino.
- lipoides: rojo anaranjado
- fosfolípidos: se tiñen poco o nada.
Carbohidratos y mucopolisacáridos:
Acido Peryódico de Schiff (PAS): los mucopolisacáridos básicos o neutros se observan de color
rojo.
Azul alcian: los mucopolisacáridos ácidos se observan de color azul.
BIBLIOGRAFÍA
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