Amplificación del gen superóxido dismutasa (SOD-2) mediante la Reacción en

Cadena de la Polimerasa cuantitativa con transcripción reversa (qRT-PCR) a partir

de ARN de la línea celular A549.
Tipás Daniela, Zambrano Gabriel
Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE
Sangolquí, Ecuador
jdtipas@espe.edu.ec; gazambrano5@espe.edu.ec

Resumen— La transcripción inversa y un análisis cuantitativo de la reacción en cada de la polimerasa es un

método altamente sensible, que permite cuantificar cantidades muy pequeñas de secuencias específicas de ácidos
nucleicos. En esta práctica se empleó transcripción inversa para sintetizar ADNc a partir de ARN de la línea
celular A549 con la finalidad de amplificar el gen SOD-2. La concentración de ARN obtenido fue de 496,02
ug/Ml, mientras que la relación de absorbancias A260/A280 fue de 2,081 y para A260/A230 fue de 1,295. Para la
detección y evaluación rápida de los niveles de expresión del gen, se empleó el sistema de SYBR Green
detectándose los valores de Ct ó cico umbral, con el cual se procedió a calcular el valor de la eficiencia de la
amplificación el cual fue del 89,69%.
Palabras clave: ADNc, ARN, gen superóxido dismutasa (SOD-2), Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR),
transcripción inversa

Abstract— Reverse transcription and a quantitative analysis of the reaction in each of the polymerase is a highly
sensitive method, which allows to quantify very small amounts of specific sequences of nucleic acids. In this
practice, reverse transcription was used to synthesize cDNA from RNA of the A549 cell line in order to amplify
the SOD-2 gene. The RNA concentration obtained was 496.02 ug / Ml, while the absorbance ratio A260 / A280
was 2.081 and for A260 / A230 it was 1.295. For the detection and rapid evaluation of gene expression levels, the
SYBR Green system was used, detecting the values of Ct or cyclic threshold, which was used to calculate the
amplification efficiency value which was 89,69%.
Keywords: cDNA, RNA, superoxide dismutase gene (SOD-2), Polymerase Chain Reaction (PCR), reverse
transcription

I. INTRODUCCIÓN uno de los reporteros más ampliamente utilizados, pero

La herramienta qRT-PCR permite cuantificar la
expresión génica, al combinar mejoras de sensibilidad
y especificidad con técnicas que permiten detectar
señales (Bustin, Benes, Nolan, & Pfaffl, 2005). En la
técnica se emplea un volumen constante de ADNc, los
datos generados reciben el nombre de umbrales de
cruce, o puntos de cruce, y nos indican los números de
ciclos requeridos para alcanzar una intensidad de
fluorescencia definida, al medirse dicha intensidad en
tiempo real, nos indica la cantidad de ADN producido
durante la PCR, la intensidad se origina a partir de un
colorante como SYBR Green, el cual emite
fluorescencia al unirse al ADN de doble cadena
(Guénin , Mauriat , Pelloux , Wuytswinkel , Bellini , &
Gutierrez, 2009).
SYBR Green es una molécula con carga positiva,
mientras no se dé su unión con el ADN, no emitirá
fluorescencia, por el contrario, al existir la interacción
esta provocará un incremento de hasta 1000 veces su
fluorescencia. Debido a su bajo costo SYBR Green es
una de sus desventajas es que es inespecífico, es decir
que se une a cualquier molécula de ADN de doble
cadena, e incluso a dímeros de primers, teniendo esto
en mente, para la optimización de sus reacciones se
emplean curvas de melting o curvas de disociación al
final de la reacción, para que se evalúe la formación de
un producto único o de dímeros de primers (Tamay ,
Ibarra , & Velasquillo, 2013).
Las SOD pertenecen al grupo de metaloenzimas y se
dividen en dos familias: cobre-zinc superóxido
dismutasas (Cu/Zn-SOD) y hierro-manganeso
superóxido dismutasas (Fe/Mn-SOD). Constituyen las
únicas enzimas que actúan sobre un radical, en cuanto a
la dismutación del O2 cada grupo lo realiza con una
similar eficiencia. Cabe mencionar que aunque su
dismutación puede darse espontáneamente la enzima
incrementa su velocidad, garantizando la eliminación
del radical (Castillo & Riverón, 2014).
El gen SOD-2 o Mn-SOD está ubicado en el
cromosoma 6, consta de 5 exonas y 4 intrones y es
sintetizada en el citosol para luego ser transportada a la
mitocondria, se encuentra asociada a la dismutación de El pellet fue resuspendido en 20 µL de agua libre de
los aniones superóxido que se producen en la matriz RNasas mediante pipeteo, posteriormente se incubó la
mitocondrial, la protección del organelo y el DNA muestra en un termobloque a 55ºC durante 10 minutos
mitocondrial por la peroxidación y la regulación de la y se almacenó las muestras de ARN a -80ºC.
apoptosis vía mitocondria y citocromo C (Riera, 2015).
SOD2 es sintetizado como respuesta al estrés Preparación de gel de agarosa
Se preparó un gel de agarosa con una concentración de
oxidativo, a la presencia del interferón gamma o de
0.8% y se prosiguió a cargar las muestras y un
citoquinas proinflomatorias. SOD2 transforma los
marcador en el gel.
aniones superóxido en peróxido de hidrógeno y
oxígeno diatómico (Hermida, 2016). Preparación de las reacciones para qPCR
El objetivo de esta práctica fue extraer el ARN de Antes de comenzar con la práctica se realizó el
protocolo de limpieza de cabinas de flujo laminar y se
células McCOY utilizando el método TRIzol y
calculó los volúmenes de reactivos a utilizar para una
posteriormente realizar la amplificación del gen SOD-2 reacción y para un total de 12 reacciones (Tabla 1),
mediante la técnica de Reacción en Cadena de la posteriormente se preparó un master mix y se
Polimerasa cuantitativa con transcripción reversa RT- distribuyó los volúmenes en cada reacción. Se eliminó
qPCR, para finalmente verificar la amplificación del las burbujas presentes en los tubos y se los colocó en el
gen se analizó las curvas de melting generadas por el equipo de qPCR, en el cual previamente se introdujo el
reportero SYBR Green. programa (Tabla 2), finalmente se concluyó con el
protocolo de limpieza de cabinas de flujo laminar.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
La muestra de ARN que se empleó fue una muestra de
Lisis de la muestra y separación de fases
línea celular A549, la cual presentaba una
Se colocó 750 µL de TRIzol LS Reagent en 250 µL de
concentración de 211,8 ng/ 𝜇𝐿 y una absorbancia
muestra de la línea celular McCoy, y se homogenizó la
muestra por pipeteo. Posteriormente se incubo durante A260/280 de 1,96. Con el fin de conocer el volúmen de
cinco minutos a temperatura ambiente, permitiendo una esta muestra que se empleará para 100 𝜇𝐿, se realizaron
completa disociación de las nucleoproteínas, una vez los siguientes cálculos:
transcurrido este tiempo, se añadió 200 µL de
𝐶1𝑉1 = 𝐶2𝑉2
cloroformo y se incubó durante tres minutos. Las
muestras se centrifugaron durante 15 minutos a 14500 𝑛𝑔 𝑛𝑔
rpm a una temperatura de 4°. Tras la centrifugación la 211.8 ∗ 𝑉1 = 5 ∗ 100 𝜇𝐿
𝜇𝐿 𝜇𝐿
muestra se separó en tres fases: fase inferior
fenol/cloroformo de color rojo; interfase; fase superior 𝑉1 = 2.36 𝜇𝐿
acuosa incolora. Cuidadosamente se transfirió
únicamente la fase acuosa que contiene el ARN a un Por lo tanto por cada 97.63 de H20 tendremos 2.36 𝜇𝐿
nuevo tubo de 1,5 mL. de ARN. Se realizaron diluciones seriadas partiendo de
1 ng/ 𝜇𝐿 hasta llegar a 0.001 ng/ 𝜇𝐿.
Precipitación de ARN
A la fase acuosa se añadió 500 µL de isopropanol y se Tabla 1. Master Mix de reacción para los ensayos de
incubo durante 10 minutos, transcurrido este tiempo, RT-qPCR con SYBR Green
las muestras se centrifugaron por 10 minutos a 14500 Componente Cstock Cfinal 1X(µL) 12X
rpm a una temperatura de 4°C, en este punto se pudo
Power SYBR 2X 1X 5 60
visualizar el ARN precipitado en forma de pellet
Green
gelatinoso de color blanco en la base del tubo, el
RT-PCR Mix
sobrenadante fue descartado con la ayuda de una
Primer 10µM 0.2µM 0.20 2.4
micropipeta.
Forward
Primer 10µM 0.2µM 0.20 2.4
Lavado de ARN
Se resuspendió el pellet en 1 mL de etanol al 75% y se Reverse
homogenizó las muestras en un vórtex, posteriormente RT Enzyme 125X 1X 0.08 0.96
se centrifugo durante 5 minutos a 14000 rpm a una Mix
temperatura de 4°C, finalizada esta etapa se descartó el ARN* 5ng/µL 1ng/µL 2 24
sobrenadante con una pipeta y se dejó secar el pellet Agua DEPC 2.52 30.24
por un tiempo de 5 minutos. Volumen 10 120
total (µL)
Solubilización del ARN
Tabla 2. Master Mix de reacción para los ensayos de Tras la programacióndel ABI 7300 para los ensayos
RT-qPCR con SYBR Green RT-qPCR como se especifica en la Tabla 2, el
reportero SYBR Green nos permitió identificar las
Proceso Temperatura Tiempo Ciclos siguientes curvas de melting (Figura 2.)
Sintesis de 48ºC 30 min 1
ADNc
Denaturación 95ºC 10 min 1
inicial
Denaturación 95ºC 15 seg 35
Annealing 55ºC 30 seg
Extensión 60ºC 30 seg
Fase de 95ºC 15 seg 1
disociación 60ºC 60 seg
(Curvas de
95ºC 15 seg
melting)
60ºC 15 seg

III. RESULTADOS
Se partió de una muestra de línea celular McCoy, tras
la extracción del ARN, se realizó una electroforesis en
gel de agarosa al 0.8%. Sin embargo la revelación del
gel muestra una inadecuada separación de los
fragmentos.
Figura 2.Curvas de melting
Utilizando la herramienta de ncbi se obtuvo la
secuencia del gen superoxido dismutasa SOD-2, se
ingresó dicha secuencia junto con la del primer
forward: 5'- TGGACAAACCTCAGCCCTAA -3' y
primer reverse: 5'- TTGAAACCAAGCCAACCC -3'
en el software PRIMER BLAST y se determinó que el
tamaño del fragmento flanqueado por los primers fue
de 155pb como se observa en la Figura 3.

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa de fragmentos de ARN

obtenidos de la línea celular A549 M: Marcador 100pb; G1:
Muestra del grupo 1; G2: Muestra del grupo 2
Figura 3. Primer Blast generado por la herramienta ncbi.

Después de realizar la electroforesis, se cuantifico la Para el cálculo de la eficiencia de la amplificación del

concentración y pureza del ARN en un NanoDrop, PCR, se necesito los valores del ciclo umbral o Ct y el
obteniéndose los resultados presentados en la tabla 3. logaritmo de entrada del ácido nucleico (Tabla 4.)

Tabla 3. Datos de concentración y pureza de ARN de Tabla 4. Valores del ciclo umbral y logaritmos de
línea celular A549 entrada del ARN
Dilución Ct Log10 (dilución)
D1 20,378 0
Muestra Concentración A260/A280 A260/A230
ARN (µg/mL)
Muestra 596,02 2,014 0.595 D1 19,215 0
1
D2 21,384 -1

D2 No determinado -1
 De igual manera se realizó el cálcula de la eficiencia de
D3 28,207 -2 amplificación, obteniendose un valor de 89,69%
D3 No determinado -2
1
D4 31,738 -3
𝐸 = (10−−3.5963 − 1) ∗ 100
D4 30,321 -3
D5 3,049 -4 𝐸 = 89.69
D5 32,823 -4
Control negativo 25,769 IV. DISCUSIÓN

Extracción de ARN de la línea celular A549 y

En base a los datos presentados en la tabla 4 se
procedió a realizar la curva de PCR en tiempo real
como se observa en la Figura 4.
Figura 4. Curva de PCR en tiempo real
Para el cálculo de la la eficiencia de la PCR empleamos
la fórmula:
1 mantenerlo entre 2-8°C (Miller, 2007), lo cual influirá
−
𝐸 = (10 𝑆𝑙𝑜𝑝𝑒 − 1) ∗ 100
1 visibles en el otro grupo de trabajo.
𝐸 = (10−−0.5215 − 1) ∗ 100
𝐸 = 8170
Al observarse un dato incongruente con los resultados
obtenidos en la dilución 5, se procedió a eliminar dicho
dato, obteniendose el siguiente gráfico.
Figura 5. Cruva de PCR en tiempo real corregida
electroforesis en gel de Agarosa
La extracción de RNA por el método fenol-cloroformo
es una de las técnicas más implementadas a nivel de
laboratorios, a tal punto de que se le considera como la
técnica Gold Standard para extracción de ARN.
(Vomelova, Vaničkova & Šedo, 2009). El primer paso
consiste en la homogenización de la muestra, y para
esto, se implementó el reactivo de TRIzol®, el cual es
una solución monofásica de fenol e isotiocianato de
guanidina, cuya función es desestabilizar los
componentes celulares, mientras mantiene la integridad
del RNA que se desea extraer, inhibiendo la acción de
las RNasas endógenas de la célula (Invitrogen, 2016).
Sin embargo, esto no se evidenció en la corrida
electroforética del ARN extraído (Figura 1), viendo en
su lugar, bandas poco visibles en el caso de la muestra
correspondiente para G1 y manchas difusas en el caso
de G2 y M. El TRIzol® puede ser conservado a
temperatura ambiente, pero es recomendado
considerablemente en la obtención de RNA de buena
calidad, sin embargo, se puede considerar que esta fue
la causa del resultado obtenido, ya que el protocolo se
realizó por duplicado y tampoco se obtuvieron bandas
Cuantificación y pureza de ARN
La manipulación incorrecta de los instrumentos y las
muestras dentro de la cámara de flujo puede ser
factores de contaminación así también, se dio una
prolongada exposición del RNA con el aire, tiempo en
el cual pudo existir una contaminación por RNasas, las
cuales se encuentran en todas las células de organismos
eucariotas y procariotas, son capaces de soportar
condiciones ambientales (Sambrook, Fritsch &
Maniatis, 1989), resultando en la degradación de la
muestra de RNA extraída, y la visualización de bandas
difusas en la corrida electroforética. Otro de los
factores que afecta el rendimiento durante la extracción
de ARN es el exceso de manipulación en alguna de los
pasos de la metodología, ya sea esta durante la
extracción con fenol-cloroformo, durante
centrifugación, lavado, se puede degradar y perder
parte de la muestra (Sandoval, 2017)
El ARN se obtuvo de la línea celular A549, y se realizó
diluciones seriadas para determinar la eficiencia de
amplificación de un fragmento del gen de referencia
SOD-2. En la Tabla 3 se puede observar el rendimiento
con relación al volumen, la relación 260/280 es
comparable con una muestra libre de contaminación
con proteínas (ARN de pureza óptima) que esta en un
radio entre 2,0-2,2 obteniéndose un valor de 2,014;
como se menciono previamente el TRIzol solubiliza el
material biológico y simultáneamente desnaturaliza
proteínas, para luego de la solubilización, mantener al
RNA en la fase acuosa. Es un método efectivo para el
aislamiento de RNA cortos como microRNAs (Rio,
Ares, & Hannon, 2010). La relación A260/230, aún no
posee una interpretación uniforme, sin embargo, se
considera que una muestra con radio < 1,5 posee
contaminación con sales, carbohidratos y fenoles
(Banco Nacional de ADN Carlos III).
Comparando con el radio de 0,595 obtenido se
evidencia la contaminación y la baja calidad del ARN
tanto en Tabla 3 como en la Figura 1. Las bandas
borrosas y extendidas significan varias cosas, entre
ellas que el material nucleico se ha degradado, que se
cargó demasiada cantidad, que el material tenía
demasiadas sales, contaminación con proteínas o
desnaturalización del material nucleico (Herráez,
2014), degradación por mala conservación o
manipulación. Herráez (2014) recomienda en ambos
casos evitar la contaminación con nucleasas, tratar a la
muestra con etanol antes de la electroforesis para evitar
sales, y pre tratamiento con fenol para evitar proteínas.
Características de los primers utilizados para RT-
qPCR
Los primers oligonucleotídicos, específicos para SOD-
2, se seleccionaron en función de los datos publicados
y haciendo un primer Blast (Figura 3). Para SOD-2 se
puede emplear un primer Forward:
5′CTGATTTGGACAAGCAGCAA-3′ y un Reverse:
5′-CTGGACAAACCTCAGCCCTA-3′ con una
Longitud de amplicon de 199 81 (pb) (Strzalka, 2013).
Comparando con el resultado obtenido de 155 (pb) se
puede trabajar con los primers para la RT-qPCR.
Pueden existir fallas durante la RT-qPCR y esto
incluye el diseño deficiente primers. Para el diseño más
eficiente de los conjuntos de primers de PCR para qRT-
PCR en tiempo real, se recomienda el uso del software
de diseño de primers. La mayoría de los programas
incluyen parámetros ajustables para un diseño óptimo
de primers, considerando la Tm del primer, la
complementariedad y la estructura secundaria, así
como el tamaño del amplicón y otros factores
importantes (Fisher, 2015)
RT-qPCR para el gen SOD-2
La Q-PCR permite, empleando un fluorocromo de
unión inespecífica a la doble hebra de ADN, en este
caso SYBR Green, identificar fragmentos amplificados
de ADN concretos a partir de la temperatura de fusión
(también denominado valor Tm, melting temperature),
que es específica para el fragmento amplificado que se
está buscando; y cuyos resultados son obtenidos a
partir de la observación de la curva de disociación de
las muestras de ARN analizadas. El hecho de usar
SYBRgreen puede dificultar el análisis, ya que es más
probable que se amplifique productos inespecíficos o
dímeros de primers, por lo que es necesaria la curva de
melting que ayude a discriminar el resultado. Si el
patrón de melting se asemeja al control (+) la muestra
es positiva. Por el contrario, si se asemeja al patrón del
control (-) la muestra es negativa. Esto solo se aplica
para sondas reversibles como el SYBRgreen, SYTO9,
EvaGreen, etc. (Hernández & Guzmán, 2013)
Para la cuantificación del gen SOD-2 realizada por
PCR en tiempo real, se realizó diluciones seriadas (10;
1; 0.1; 0.01; y 0.001 ug/uL), donde la eficiencia de
amplificación fue de 89,69%. La eficiencia de la
reacción es generalmente constante durante todo el
proceso exceptuando los últimos ciclos, la eficiencia
puede disminuir cuando más dura la reacción
(Rebrikov & Trofimov, 2005). La eficiencia de una
PCR en tiempo real está entre 95% y 120% (Rebrikov,
2005). El resultado obtenido en la práctica la eficiencia
de reacción no se encuentra dentro del rango indicado y
se infiere que la amplificación no fue correcta.
Una curva típica de PCR en tiempo real se parece a una
curva de crecimiento microbiano. Es decir de forma
sigmoidea. La cuantificación se llevó a cabo en base al
valor del ciclo umbral (Ct) y el logaritmo para la
dilución (Tabla 4). El Ct está determinado en la fase
exponencial y además es inversamente proporcional al
número de copias del target que se tiene en la muestra.
Los resultados no muestran curvas de melting ideales y
algunos valores de Ct indican que no se detectaron
amplicones en el caso de D2 y D3 (Tabla 4).
Según Chavan (2016) existen factores que pueden
influir en Ct. Muchos factores impactan el valor
absoluto de Ct además de la concentración del objetivo.
El efecto de los componentes del master mix, tinte de
referencia pasivo ROX, la eficiencia de la PCR. Se
podría comprobar si la reacción requiere ROX o no y,
en consecuencia, si los ajustes se han realizado durante
la programación, tambien se puede considerar que se
pruebe con una cantidad de template más alta para
comprender si la concentración baja de la plantilla es
limitante o si algo está mal con otros componentes /
parámetros de reacción.
Menciona (Espinosa, 2013), que como las otras
repeticiones amplificaron el error se encuentra en el
operador, y puede deberse por un mal manejo de las
micropipetas, u olvido colocar algún reactivo en el
pocillo. También se debe tener en cuenta que para tener
una recolección adecuada y fiable de datos se debe
realizar de tres a cuatro repeticiones (Barrera et al.,
2016).
 V. CONCLUSIONES
La extracción de ARN a partir de células de McCOY
no mostró bandas claras, sin embargo los radios
indicaron contaminación de la muestra por compuestos
aromáticos, cales, carbohidratos, fenoles y otros en
comparación con bibliografía.
El proceso de RT-qPCR mostró un valor de eficiencia
de amplificación inicialmente incongruente, sin
embargo tras la eliminación de un valor atípico pudo
determinarse una eficiencia de amplificación de
89,69%, considerando este valor como poco eficiente
ya que no se encuentra dentro del intervalo establecido
para una buena eficiencia (95-120%), las temperaturas
de melting variaron, sin embargo no se puede
evidenciar una curva totalmente exacta debido a la baja
eficiencia y mal manejo del operador durante el
proceso.
VI. RECOMENDACIONES
Se debe trabajar con cuidado en el momento de
manipulación de pipetas y de reactivos dentro de la
cámara, teniendo cuidado en el proceso de diluciones y
de lavados. También es recomendable trabajar con
mandiles que tengan puño cerrado para evitar el
contacto y contaminación con RNAsas.
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