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PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

1. INTRODUCCION

Los medios de cultivo son mezclas de sustancias que se usan para el aislamiento y desarrollo de
hongos, bacterias y otros microorganismos. Cabe señalar que la mayoría de los hongos
fitopatógenos se pueden cultivar de manera relativamente sencilla en medios adecuados. Sin
embargo existen grupos de patógenos denominados parásitos obligados cuyo cultivo aún no se a
logrado a menos que se inoculen en plantas vivas.
Para el cultivo in Vitro de fitobacterias se requiere de la elaboración de un medio que proporcione
todos los requerimientos nutricionales que permitan su reproducción, los cuales se les conoce como
medios de cultivo.
Los medios de cultivo contienen cuatro componentes esenciales: fuentes de carbono y nitrógeno,
minerales y vitaminas.
Existe una gran variedad de de fuentes de carbono que se pueden emplear en los medios de cultivo
como son: alcoholes, pentosas, hexosas, disacáridos, trisacáridos, polisacáridos, ácidos e
hidroxiácidos ya sean solos o en combinación.

La preparación de medios de cultivo presenta distinto grado de complejidad, pero en general se


tarda una o dos horas para la elaboración de las más comunes.

2. OBJETIVOS
 Aprender a elaborar los medios de cultivo usados en el aislamiento de hongos
fitopatógenos.
 Conocer y aprender la manera para la preparación del PDA

3. BIBLIOGRAFIA

Los medios de cultivo requieren de ciertas características mínimas para lograr exitosamente el
desarrollo de los hongos y entre los más importantes se encuentran:

1. El medio deberá contener elementos nutritivos tales como: fuentes de carbono, nitrógeno,
fósforo, potasio, magnesio, cobre y molibdeno. También pueden ser necesarias algunas
vitaminas y otras sustancias que se hallan presentes en los materiales naturales o
artificiales que componen los medios.
2. El medio no deberá deshidratarse fácilmente, por que se evita manejándolo en recipientes
adecuados que además permitan su manejo en condiciones estériles es decir, evitando
contaminaciones. El oxigeno es necesario en todos los casos por lo que deberá permitirse la
aireación. Ya sea en las cajas de Petri o en tubos de cultivo.
3. La mayoría de los medios de cultivo para hongos requieren esterilización antes de usarse, lo
que generalmente se logra mediante calor húmedo usando autoclave u olla express.
4. La mayoría de los hongos crecen bien a temperatura de 20 a 32 oC, pero existe mucha
variación entre grupos o especies. La temperatura óptima para el desarrollo de la
enfermedad que causen puede servir como punto de referencia para la temperatura de
incubación del hongo en el medio de cultivo.
5. La mayoría de los hongos crecen bien a Ph de 5 a 6, pero hay excepciones. La temperatura
y/o Ph óptimo para la esporulación puede ser distinto que para el crecimiento del micelio.
En ocasiones es conveniente agregar pequeñas cantidades de ácido láctico para eliminar
bacterias contaminantes en el medio, pues estas generalmente no toleran la acidez,
permitiendo el crecimiento fungoso.
6. El crecimiento del micelio y sobre todo la esporulación de los hongos en el medio, esta muy
influido por la luz. Muchos hongos esporulan fácilmente sin necesidad de luz artificial o
aun en plena oscuridad, pero otros requieren condiciones especiales de calidad y
confiabilidad de luz. Este factor puede ser clave cuando se requieren altas cantidades de
esporas con fines de investigación o para identificar alguna especie en particular.

El medio de cultivo sustituye parcialmente las propiedades nutricionales del hospedante


o sustrato natural del hongo por cultivar. La utilidad del medio es proporcionar energía al
microorganismo, para que desarrolle en la forma más normal posible.

Por su composición nutritiva los medios de cultivo pueden ser:

1. Medios naturales. Están compuestos por materiales enteramente naturales, tales como
partes de plantas, malta, levadura etc… se requieren en forma de extractos o decocciones o
simplemente esterilizando las partes vegetales con calor u otro método. Aunque se usan
poco, pueden ser superiores a otros medios sobre todo en el caso de hongos de difícil
esporulación. Por ejemplo se pueden conseguir altas cantidades de esporas de Stemphylium,
sembrando a este hongo en tallos de cartamo esterilizados en autoclave.
2. Medios semisintéticos. Están compuestos parcialmente por materiales naturales y
sintéticos, el ejemplo mas común es el de papa dextrosa y agar, V8 agar, harina de maíz,
agar etc… son los más usados.
3. Medios sintéticos. Se conoce perfectamente su composición, ejemplo medio de Komada o
de Awuah y Lorbeer, para Fusarium oxisporum, por su consistencia los medios de cultivo
pueden ser:
a) Sólidos. Contienen agentes solidificantes principalmente el agar, proporción de 1 a 3%, el
agar esta compuesto por una mezcla de carbohidratos complejos y se obtiene a partir de
algas.
b) Semisólidos. Aunque generalmente se usan poco en micología, estos se obtienen bajando
la concentración del agar o usando gelatina como agente solidificante.
c) Líquidos. Se preparan sin agente solidificante. Se usan principalmente para obtener altas
concentraciones de esporas, ejemplo: papa- dextrosa.

A continuación se describe la forma de preparar el medio papa dextrosa agar, jugo V8 agar, agua
agar, por ser los más comunes n la mayoría de los laboratorios de fitopatología en el mundo.

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

a) Elaboración de papa dextrosa agar (PDA).

Crecen la mayoría de hongos y bacterias.


Papa partida 200 gr
Dextrosa (glucosa) 13 gr
Agar 18-16 gr
Agua destilada 1000 ml

1. Hierva las papas partidas en 500 ml de agua.


2. En otro recipiente disuelva el agar, calentando para ayudar a disolver.
3. Cuele el caldo de papa a través de la manta de cielo o algodón. Mezcle ambos
líquidos, agregue la dextrosa y homogenice.
4. Divida el líquido en recipientes adecuados (matraces o tubos). Tapar los matraces
con tapón de algodón. En caso de requerir el medio en tubos de cultivo, se vacía a
estos cuidadosamente, procurando no derramar medio en la boca de los tubos. Los
tubos también se tapan con algodón (al igual que los matraces); en caso de ser
tubos con tapa de rosca, esta deberá quedar ligeramente floja durante la
esterilización.
5. Esterilizar matraces y/o tubos en el autoclave u olla de presión de 15-20
libras/pulgada2 (± 120 oC durante 15-20 minutos) contados a partir del momento en
que se alcance la presión ya mencionada.
6. Abra la olla o autoclave hasta que la presión baje a cero. Deje enfriar el medio al
contacto con el aire, cuando este se encuentre tibio se vacía a cajas de Petri en
condiciones asépticas, es decir en la cámara de transferencia o al manos
desinfectando una mesa y auxiliándose de mecheros de gas. Las corrientes de aire
deberán evitarse al máximo. Los tubos de ensayo se colocan en posición inclinada
hasta que el medio solidifique, apretando los tapones de rosca o algodón, según se
trate.
7. En ocasiones se agregan 2 o 3 gotas de ácido láctico (antes de vaciar) para prevenir
el desarrollo de bacterias. en otros casos se agregan pequeñas cantidades (50-200
ppm) de antibióticos tales como la estreptomicina, penicilina, etc., también antes de
vaciar, el cloranfenicol tolera la esterilización en las condiciones antes señaladas. A
ciertos medios selectivos también se le pueden incorporar PCNB, Benomyl u otros
fungicidas pero en dosis bajas (mg/lt).

b). Elaboración de V8-agar.

Para Phycomycetes y otros


Jugo V8 200 ml
Carbonato de calcio 3 gr
Agar 16-18 gr
Agua destilada 800 ml

Agregue 200 ml de jugo V8 a 800 ml de agua tibia, agregue el carbonato de calcio y el


agar agitando la mezcla, caliente en baño Maria hasta disolver el agar. Una vez que el
agar este disuelto, lleve el volumen a 1000 ml con agua destilada. Vacíe el medio en
recipientes adecuados y esterilice en el autoclave a 15 libras de presión durante 20
minutos.

c). Elaboración de agua-agar.

Phycomycetes y otros. No crecen bacterias.


Agar 16 gr
Agua destilada hasta completar 1000 ml

Disuelva el agar en 800 ml de agua utilizando un baño Maria, una vez disuelto, lleve el
volumen con agua a 1000 ml, vacíe el medio en recipientes apropiados y esterilice en el
autoclave a 15 libras de presión.

4 MATERIALES

Autoclave
 Bagueta
 Alcohol
 Agar
 Pipetas
 Recipientes de pyrex
 Vasos de precipitados
 Papa ojo azul
 Botellas
 Azúcar
 Balanza de precisión
 Baño
 Microondas
 Algodón

5 METODOS

 Pesar azúcar 15 gr
 Pesar 17 gr de agar agar
Procedimiento de papa ojo azul pelar la papa para evitar los glicoalcaloides y luego pesar los 200grs
hervir por media hora , mover con la bagueta
Licuar y agregar agua destilada hasta que llegue a un litro todo esto dentro de un vaso precipitado
Agregar 15 gr de azúcar (glucosa cuando se degrada se convierte en carbohidratos).

Hacer hervir la papa en medio litro de agua y mover con la vagueta por media hora
Adicionar un litro de agua destilada al licuado enrazamos ah un titro mas azucar 15 a 20 gr.

Luego lo llevamos por media hora al horno y el contenido las echamos en botellas para luego llevar
al autoclave.
Llevar ah autoclave Autoclave para matar todos lo microorganismos contaminantes a 15 bars
nececitamos agua por encima dela resistencia por ½ hora Es el mecanismo de destrucción
microbiana más efectivo, y bien utilizado asegura esterilización.(Destruye la forma de vida

Conclusiones
 Se pudo elaborar medios de cultivo con el fin de ser utilizados para el aislamiento de
hongos
 Se logro aprender todos los pasos que involucran los procedimientos para la preparación de
agar