UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS -UFAM

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO-USP

CURSO
ENZIMAS MICROBIANAS COMO FERRAMENTAS DE
SUSTENTABILIDADE

ANA LÚCIA F. PORTO

LUCIANA LEOMIL
MARIA FRANCISCA S. TEIXEIRA
MICHELE VITOLO
TAKESHI MATSUURA

Apostila
2009
Manaus – Amazonas
 ÍNDICE

pg

Capítulo 1. Biotecnologia, Enzimas e Alimentos (Prof. Dr. Michele Vitolo)........................ 2

Capítulo 2. Fundamentos de cinética enzimática (Prof. Dr. Michele Vitolo)........................ 18

Capítulo 3. Fontes e produção de enzimas: fundamentos (Prof. Dr. Michele Vitolo)........... 33

Capítulo 4. Fontes, produção e aplicação de amilases (Profa. Dra. Luciana Leomil)............ 46

Capítulo 5. Fontes, produção e aplicação de proteases (Profa. Dra. Ana Lúcia F. Porto)..... 52

Capítulo 6. Actinomicetos como fontes de bioprodutos (Prof. Dr. Takeshi Matsuura)......... 57

Capítulo 7. Fundamentos da técnica de imobilização (Prof. Dr. Michele Vitolo)................. 61

Capítulo 8. Enzimas na modificação de materiais amiláceos e protéicos (Prof. Dr. Michele

Vitolo).................................................................................................................................... 84

Capítulo 9. Enzimas em bebidas alcoólicas e não alcoólicas (Prof. Dr. Michele Vitolo)...... 109

Capítulo 10. Aplicação de pectinases na clarificação de sucos regionais (Profa. Dra. Maria
Francisca S. Teixeira)............................................................................................................. 127
 2

CAPÍTULO 1
BIOTECNOLOGIA, ENZIMAS E ALIMENTOS
Doutor Michele Vitolo

1. BIOTECNOLOGIA: CONCEITO E VISÃO GERAL

1.1. Definição
A biotecnologia é o conjunto de técnicas que permitem gerar produtos de interesse
econômico e/ou social a partir de organismos vivos e/ou de seus componentes.

1.2. Breve histórico

A biotecnologia, tão decantada nos últimos vinte anos, vem sendo usada pelo homem
há milênios através da fabricação de cerveja (produzida pelos Sumérios e Babilônios desde
6000 AC), pão (produzido pelos egípcios desde 4000 AC), vinho e queijo – há registro sobre
a fabricação destes produtos desde 3000 AC –, dentre outros.
Sucede que estes produtos biotecnológicos eram produzidos por meio de técnicas
artesanais desenvolvidas de modo completamente empírico, desconhecendo-se os
mecanismos envolvidos nos processos de fabricação. Porém, no século XVII foi inventado o
microscópio óptico por Antonie van Leeuwenhoek, com o qual foi possível reconhecer formas
de vida invisíveis ao olho humano. Os conhecimentos acumulados sobre os microrganismos
levaram Pasteur (1857-1876) à conclusão de que eles eram os agentes responsáveis pela
ocorrência dos processos fermentativos.
Uma vez elucidado o mecanismo da fermentação, foi possível desenvolver novos
processos fermentativos para a fabricação de outros produtos de interesse comercial, tais
como etanol, ácido acético, butanol e acetona. Todos estes processos eram executados em
condições não assépticas. O tratamento anaeróbico do lixo urbano, amplamente usado na
atualidade, pode ser enquadrado dentro deste contexto.
A partir de 1940 foram desenvolvidos processos fermentativos realizados em
condições assépticas, nos quais eram empregadas culturas de cepas microbianas puras. Em
decorrência, foi possível produzir antibióticos, esteróides, amino ácidos, vacinas, enzimas,
dentre inúmeros outros produtos.
O grande avanço na tecnologia de fermentação deveu-se à obtenção de cepas
microbianas puras altamente produtivas nos produtos específicos desejados. Isto foi
conseguido através do melhoramento genético das cepas selvagens. A técnica amplamente

Apoio:
 3

empregada para este fim – a partir de 1940 - foi a seleção de mutantes com as características
desejadas. As mutações eram provocadas com agentes físicos (por exemplo, luz UV) ou
químicos, os quais causavam modificações aleatórias no DNA da célula, sendo os mutantes
selecionados a partir de meios de cultura desprovidos de nutrientes específicos. O cruzamento
seletivo entre cepas aparentadas, sobretudo da mesma espécie, também foi muito usado para o
melhoramento celular. No entanto, a grande reviravolta – ocorrida em 1972 - no
melhoramento da capacidade produtiva das células (microbianas ou não) foi o
desenvolvimento das tecnologias do DNA-recombinante e da fusão de células (hibridoma) –
as quais constituem a chamada engenharia genética - que possibilitaram a introdução de
mudanças específicas e planejadas diretamente no DNA celular (Tabela 1).

TABELA 1. Cruzamento seletivo/mutação versus engenharia genética (1).

Parâmetros Cruzamento seletivo/mutação Engenharia genética
Nível Todo o organismo Célula ou molécula
Precisão Conjunto de genes Um só gene
Certeza Mudança genética fracamente caracterizada Gene bem caracterizado
Taxonômico Possível apenas dentro ou entre espécies, raramente Sem limitação
entre gêneros

1.3. O contexto biotecnológico

O contexto biotecnológico pode ser visto como um conjunto de técnicas, que
permitem modificação pontual e específica do DNA celular (procarióticos e eucarióticos,
indistintamente), centrado nas enzimas, proteínas catalisadoras não só responsáveis pela
existência da vida tal qual a conhecemos, mas também responsáveis pela existência das
próprias técnicas biotecnológicas fundamentais (fusão celular e DNA recombinante) e dos
processos biotecnológicos básicos (fermentação e cultura de células não microbianas). Na
Figura 1, dá-se uma idéia pictórica da posição das enzimas dentro da biotecnologia.

Apoio:
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SÍNTESE DO ADN FISIOLOGIA, GENÉTICA e

(Kornberg, 1967) BIOQUÍMICA CELULAR

ADN-RECOMBINANTE HIBRIDOMA
(Bayer, 1927) (MILSTEINE, 1975)

ENZIMAS

FERMENTAÇÃO CULTURA DE TECIDOS

NOVOS PRODUTOS E/OU NOVOS PROCESSOS

Figura 1. As enzimas e o contexto biotecnológico.

1.4. Produtos obtidos por fermentação

Há uma ampla gama de produtos resultantes de processos fermentativos, citando-se,
como exemplos, antibióticos (penicilina, eritromicina, tetraciclina, etc.), proteínas de ação
reguladora (insulina, interferon, linfoquinas, etc.), esteróides, vacinas, enzimas, ácidos
orgânicos (ácido acético, ácido cítrico, ácido glicônico, etc.), aminoácidos (lisina,
fenilalanina), vitaminas (complexo B), anticorpos monoclonais, dentre muitos outros.

1.5. Mercado biotecnológico

A grande variedade de produtos biotecnológicos (ou simplesmente bioprodutos)
podem ser divididos em três categorias, caso seja levado em conta a quantidade
comercializada e o valor de mercado, a saber, aqueles vendidos em grande quantidade e a
preço baixo (metano, biocombustíveis, etc.), em grande quantidade e a preço intermediário
(aminoácidos, levedura, enzimas para alimentos, polímeros, etc.) e os vendidos em pequenas
quantidades mas a preços elevados (produtos farmacêuticos em geral).

Apoio:
 5

Os bioprodutos podem ser associados aos diferentes segmentos industriais, a saber,

químico orgânico (metanol, enzimas, ácido cítrico, etc.), farmacêutico (vacinas, anticoropos
monoclonais, antibióticos, eritropoietina, insulina, hormônios, etc.), alimentício (leveduras,
enzimas, aminoácidos, etc.), agrícola (micorrizas) e de serviços (tratamento de efluentes;
equipamentos analíticos, dentre outros).
O lançamento comercial de um bioproduto leva no mínimo cinco anos entre a sua
concepção e a introdução no mercado. Por exemplo, a produção da insulina de 1978 a 1983,
do hormônio humano de crescimento de 1980 a 1990 e da vacina anti-malárica em estudos
desde 1990.
Apesar das dificuldades do desenvolvimento de bioprodutos, a biotecnologia é uma
das áreas que mais cresce na atualidade, puxada pelas perspectivas do mercado mundial, que
hoje seria da ordem de US$ 600 bilhões, considerando somente o mercado farmacêutico
global.
Na Figura 2 mostra-se em termos pictóricos a inter-relação entre as enzimas, a
biotecnologia e as ciências farmacêuticas.

CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

BIOTECNOLOGIA

ENZIMAS

Figura 2. Ciências Farmacêuticas, Biotecnologia e Enzimas.

Apoio:
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2. BIOTECNOLOGIA, ALIMENTOS E ENZIMAS

Focando na tecnologia de alimentos, pode-se dizer que o sucesso desta área medido
pela enorme variedade de produtos oferecidos nos supermercados - repousa no casamento
perfeito dos aspectos formulação, processamento e embalagem.
O tecnólogo seleciona as matérias-primas a ser misturadas, mistura-as nas quantidades
preconizadas na formulação, submete-as a um pré-processamento (lavagem, maceração,
cozimento, etc.), obtendo, em seguida, uma massa, à qual adiciona os coadjuvantes
necessários (acidulante, corante, aromatizante, etc.). Após o processamento final (cozimento,
extrusão, secagem, controle analítico, etc.) resulta o produto almejado, o qual é embalado e
enviado ao mercado.
A princípio, o setor agro-pecuário – fonte das matérias-primas alimentícias – recebeu
muita atenção no sentido do aumento da produtividade agronômica em detrimento da
melhoria das características da matéria-prima, visando simplificar o processamento industrial
da matéria-prima. Por exemplo, seja o caso do tomateiro, que requer estacas para poder se
desenvolver e produzir o tomate, o qual só pode ser colhido manualmente. Para aumentar a
produtividade e diminuir o custo da plantação, desenvolveu-se uma variedade de tomateiro
baixo, de tal sorte a prescindir do estaqueamento, propiciando colheita mecanizada. Somente
nos últimos anos, esforços têm sido direcionados no sentido de obter-se um tomate com maior
teor de sólidos solúveis (menos água), visando a economia de energia no processo de
produção da massa de tomate para molho.
De um modo geral, pode-se dizer que a biotecnologia vem contribuindo com o
desenvolvimento da tecnologia de alimentos através de quatro vertentes, a saber,
melhoramento das fontes de matérias-primas, produção de ingredientes específicos para a
indústria alimentícia, satisfação de demandas específicas de mercado e melhoramento de
processos.

2.1. Melhoramento das Fontes de Matérias-Primas

Neste caso, tem-se o aumento da produtividade do cultivar (caso do tomateiro rasteiro)
e a melhoria dos atributos funcionais da matéria-prima. Para este último caso, lembram-se,
por exemplo, os híbridos do milho e do trigo, os quais, respectivamente, possuem menos
lipoxigenase (a operação unitária de branqueamento é abolida) e melhor distribuição da
amilose no grânulo de amido (diminuição do “amanhecimento” do produto final).

Apoio:
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2.2. Produção de Ingredientes Específicos para a Indústria Alimentícia

Na fabricação de alimentos são necessários inúmeros ingredientes, que devem estar
sempre disponíveis no mercado e em grandes quantidades, geralmente. Por exemplo,
aminoácidos (ácido glutâmico, ácido aspártico, fenilalanina, lisina, metionina), vitaminas
(complexo B, tocoferol), enzimas (proteases, carboidrases, pectinases, etc.), dentre outros.
Para esta situação, a biotecnologia colabora possibilitando o aperfeiçoamento genético de
microrganismos – sobretudo através da técnica do DNA recombinante – que produzem os
compostos citados nas quantidades exigidas pelo mercado. Em outros termos, o processo
fermentativo é otimizado.

2.3. Satisfação de Demandas Específicas de Mercado

Atualmente os consumidores exigem que os ingredientes dos alimentos sejam os mais
naturais possíveis e o valor calórico não seja exagerado. A indústria alimentícia respondeu a
estas demandas incluindo nas formulações ingredientes naturais (extrato de vanila, destilado
de cacau, mentol, jasmim, shikonina, manteiga de cacau, conchinilha do Peru, por exemplo) e
reduzindo o teor de açúcares (cerveja de baixa caloria produzida adicionando-se na dorna de
fermentação a glicoamilase, que hidrolisa os oligossacarídeos residuais em glicose, a qual é
totalmente metabolizada pela levedura. Em outros alimentos, pelo acréscimo de adoçantes não
açucarados como taumatina, esteviosídeos, aspartame).
Sucede que muitos ingredientes naturais são caros (por ex., os preços do quilo do
extrato de vanila, mentol, jasmim e shikonina são US$ 100, US$ 30, US$ 4,600 e US$ 4,000,
respectivamente), podendo a versão sintética existir (por ex., extrato de vanila e mentol aos
preços de US$ 10/Kg cada um) ou não (por ex., jasmim, shikonina, conchinilha do Peru, etc.).
A biotecnologia, portanto, deve criar meios que possibilitem a obtenção de
ingredientes naturais em quantidade e a preços módicos, assim como produtos com baixo
valor calórico. No caso da cerveja com baixa caloria, estão sendo desenvolvidas leveduras
geneticamente modificadas (através da técnica do DNA recombinante), capazes de produzir
glicoamilase (uma enzima fúngica), que durante a fermentação possibilita a conversão total da
glicose em etanol. Nesta condição, evita-se a adição de glicoamilase exógena, reduzindo
sobremaneira o perigo de contaminação da dorna, além de baratear o processo. No caso dos
ingredientes naturais, merece lembrança a obtenção da shikonina a partir da planta shikon
encontrada na China. A variedade natural do shikon produz a cada sete anos 0,02g de
shikonina/planta, o que explicava o alto custo deste corante. Através da técnica biotecnológica

Apoio:
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da fusão celular, resultou uma variedade de shikon que produz a cada 23 dias a mesma
quantidade de corante por planta. O preço da shikonina caiu vertiginosamente, tornando-se
um dos corantes vermelhos mais utilizados na formulação de alimentos. O mercado atual de
shikonina é da ordem de US$ 1 milhão/ano.

2.4. Melhoramento de Processos

Os processos da indústria de alimentos podem ser melhorados tanto pelo
aperfeiçoamento dos equipamentos (assunto não abordado) quanto pelo uso de enzimas.

2.4.1. Enzimas
Na atualidade as enzimas são catalisadores muito utilizados na indústria (alimentícia,
farmacêutica, têxtil, papel e celulose, químico-farmacêutica), em métodos analíticos
(químicos e de diagnóstico), em medicamentos (por exemplo, auxiliares digestivos) e como
alvos naturais de fármacos inibidores específicos (por exemplo, o omeprazol, fármaco usado
para diminuir a quantidade de suco gástrico na luz do estômago, é um inibidor da enzima que
catalisa a saída do ácido clorídrico das células acinares). Na Figura 3 apresenta-se a
multiplicidade de usos das enzimas.

2.4.1.1. Fontes de enzimas

As fontes das enzimas industriais encontram-se nos três reinos, a saber, animal,
vegetal e microbiano. Alguns exemplos são apresentados a seguir:

2.4.1.1.1. Origem animal

As mais importantes são: amilase pancreática, lípase pancreática, pepsina, quimosina e
pancreatina. São produzidas tanto na forma pura quanto de grau industrial. Há uma forte
tendência em substituí-las pelas de origem microbiana, pois sua disponibilidade depende
muito não só da política pecuária adotada (por ex., matar o bezerro lactente para produzir a
quimosina), mas dos controles de zoonoses realizados pelos diferentes países (evitar que
doenças se disseminem de uma região para outra, de um país para outro, como por exemplo, a
síndrome encefálica espongiforme) que obrigam, praticamente, a obter uma licença para cada
lote comercializado, a menos que a fazenda da qual as reses provieram seja previamente
certificada pelo comprador.

Apoio:
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2.4.1.1.2. Origem vegetal

As mais usadas são: α-amilase, β-amilase, bromelina (abacaxi), ficina (figo) e papaína
(mamão). São encontradas na forma de extratos brutos, ou na forma purificada, sendo que sua
disponibilidade depende de vários fatores, tais como condições de cultivo do vegetal, ciclo de
crescimento da planta, clima, política agrícola adotada pelo país onde se encontra o cultivar e
a disponibilidade do vegetal, quando ele próprio é um produto comercial (por ex., mamão,
abacaxi, alcachofra, etc.).

2.4.1.1.3. Origem microbiana

A princípio podem substituir quaisquer enzimas de origem animal e vegetal. São
fontes abundantes na natureza, podendo-se, inclusive, dizer que no momento a maioria das
enzimas comercializadas são de fontes microbianas. Apenas para citar alguns exemplos,
temos as enzimas amilolíticas – atuam na hidrólise do amido; fontes: Bacillus subtilis,
Aspergillus oryzae, A.niger, A.flavus e A.awamori -, glicose oxidase – oxida a glicose em
ácido glicônico; fontes: A.niger, Penicillium amagasakiense e P.notatum -, lactase – hidrolisa
a lactose do leite; fontes: Saccharomyces fragilis, Zygosaccharomyces lactis -, lípase –
hidrolisa triglicérides; fontes: A.niger e Rhysopus sp -, proteases – hidrolisam proteínas;
fontes: B.subtilis, A.oryzae, A.flavus, Endothia parasítica e Mucor pusillus.
Com o advento da biotecnologia moderna (a partir de 1972 com a invenção das
técnicas biotecnológicas básicas denominadas de fusão celular e DNA-recombinante) o
fabricante de enzimas passou a dispor de cepas “engenheiradas”, isto é, microrganismos com
o genoma modificado por uma das técnicas biotecnológicas básicas, as quais são bem mais
produtivas na enzima de interesse que as cepas originais. Neste caso, porém, o usuário
(tecnólogo de alimentos) deve ser comunicado pelo fabricante, a fim de evitar problemas
legais com as agências fiscalizadoras (ANVISA, por exemplo), já que a legislação sobre
alimentos é bastante rigorosa. Há situações em que a legislação exige que o fabricante deve
obter nova licença para comercializar o produto, ou, na pior hipótese, requerer uma nova
aprovação do produto, caso seja classificado como “produto novo”.
Para o produtor da enzima microbiana, o controle da quantidade produzida é uma
questão fundamental, pois regular a fermentação no intuito de aumentar ou diminuir a
quantidade de enzima obtida não é muito problemático. O que dificulta esta operação é a fase
de purificação (“downstream”), porque é comum obter-se várias enzimas a partir de um

Apoio:
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mesmo processo fermentativo. Como resultado final pode ocorrer um desiquilíbrio nas
quantidades das enzimas obtidas. Um procedimento geral usado pelo fabricante é o de obter
suas enzimas com grau alimentício, mesmo que sejam usadas em outro setor.

USO ANALÍTICO
DISPOSITIVOS
REAGENTES
ANALÍTICOS

Diagnóstico/análises químicas
MEDICAMENTOS

ENZIMAS
TERAPÊUTICA

REAÇÕES INTRACELULARES
FÁRMACOS

INIBIDORES
PROCESSOS INDUSTRIAIS

INDÚSTRIA QUÍMICO-
INDÚSTRIA DE ALIMENTOS
FARMACÊUTICA

TEXTIL
OUTROS

TRATAMENTO DE EFLUENTES PAPEL E CELULOSE

Figura 3. Enzimas: as proteínas catalisadoras.

2.4.1.2. Composição do Preparado Enzimático Comercial

Antes de mais nada é preciso dizer que a composição exata do preparado enzimático
comercial é segredo do fabricante. Contudo, uma formulação base constituir-se-ia de proteína
e aminoácidos (10-15%), enzima (1-5%), carboidratos (5-12%), açúcares/açúcares álcoois (2-
40%), sais inorgânicos (3-40%) e conservante (0-0,3%).
Em linhas gerais, pode-se dizer que a composição do preparado enzimático depende:
da forma de apresentação (pó ou solução), das unidades de atividade do preparado, da fonte
(as enzimas de origem animal e vegetal são bem menos definidas do que as de origem

Apoio:
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microbiana), da finalidade do preparado (aqueles para fins de diagnóstico e analítico devem

possuir alto grau de pureza), do tipo de substância inerte adicionada para
estabilizar/padronizar o preparado, e do tipo de conservante adicionado (este deverá levar em
conta o tipo de processo no qual a enzima será usada, bem como as legislações dos países
produtor e comprador). Em um processo industrial a quantidade de preparado enzimático
utilizada representa algo entre 0,1 a 2% da massa total de substrato a ser transformada.

2.4.1.3. Condições de Armazenamento dos Preparados Enzimáticos

As condições de armazenamento irão depender das características particulares dos
preparados enzimáticos, sobretudo a forma de apresentação. Preparados em pó e secos a 25ºC
duram 6 meses, mas entre 4-10ºC duram mais de 12 meses. Porém, os preparados líquidos a
25ºC duram 6 meses e entre 4-10ºC em torno de 9 meses.

2.4.1.4. Fatores para a Escolha de um Preparado Enzimático Industrial

Condições operacionais de processo a considerar por ocasião da escolha da enzima a
ser empregada: a) Tipo do substrato: influi no grau de especificidade da enzima a ser
selecionada em função do produto final desejado. Por ex., seja a modificação enzimática da
proteína da soja. Caso o objetivo seja o de obter o chamado leite de soja – hidrólise total da
proteína – emprega-se uma protease inespecífica e de alta atividade. Mas, se o objetivo é obter
uma proteína de soja funcionalizada (ou seja, proteína com baixo grau de hidrólise para ser
usada como, digamos, emulsificante) então a protease a ser usada deve ter um alto grau de
especificidade; b) pH: o ideal seria usar um pH adequado tanto para a reação enzimática
quanto para a primeira operação unitária do protocolo de “downstream”. Há casos, no entanto,
em que o pH do processo não pode ser alterado, daí a enzima a ser selecionada deverá possuir
boa atividade catalítica à concentração hidrogeniônica pré-estabelecida. Lembra-se que o
desempenho catalítico da enzima poderá ou não ser significativamente afetado pelo pH do
meio reacional. Testes de estabilidade devem ser efetuados previamente; c) Temperatura: a
temperatura de processo deverá ser ajustada de tal sorte a equilibrar a ativação e a inativação
térmica da enzima. Quanto mais alta a temperatura, as velocidades de ativação e de inativação
serão mais elevadas. Para favorecer a catálise basta trabalhar por um tempo suficiente para a
conversão desejada do substrato. Caso se deseje empregar enzima termoestável, deve-se levar
em conta que ela poderá continuar ativa no produto final, e que, conforme o caso, poderá ou
não ser desejável; d) Ativadores e Inibidores: a necessidade destas substâncias para executar

Apoio:
 12

a reação depende do tipo de enzima escolhida. Há casos em que a presença ou ausência deles
afeta a performance catalítica da enzima, podendo, inclusive, interferir em parâmetros como
pH e temperatura. Por exemplo, no caso da glicoseisomerase – enzima usada na fabricação de
xaropes de frutose, muito usados como adoçantes em formulações alimentícias e
farmacêuticas – o íon magnésio atua como ativador, ao passo que o íon cálcio age como
inativador. Em geral, bloqueadores da atividade enzimática devem ser evitados, sobretudo na
área de alimentos.
Além dos fatores mencionados, estritamente ligados ao processo em si, devem ser
lembrados, também, os métodos de análise – devem ser simples e de fácil execução. São
importantes para controlar a atividade do preparado enzimático adquirido, assim como
durante o processo e detectar sua presença no produto final. Lembra-se que cada produtor de
enzima tem seu método de análise preferencial e unidades de atividade criadas a seu bel
prazer. Isto dificulta a comparação direta entre os vários fornecedores de enzimas. Por isso, o
usuário consciente deve ter um método analítico-padrão, deixando o do fabricante, apenas,
para fins de controle de seu produto específico (já que o usuário resolveu escolher um dado
fornecedor) -; disponibilidade – o usuário deve certificar-se de que a enzima esteja sempre
disponível no mercado, sobretudo na quantidade, atividade e qualidade desejadas. Isto é vital
quando se operam processos com extratos enzimáticos líquidos ou imobilizados, porque
constituem-se em situações em que a reprodutibilidade e o desempenho catalítico constante e
previsível são exigências para conduzir o processo de modo otimizado -; suporte técnico e
prestação de serviço – o fabricante da enzima deve fornecer informações precisas e
atualizadas ao usuário. Qualquer modificação no processo de fabricação da enzima obriga o
produtor a avaliar os eventuais efeitos no processo do usuário -; e, custo (geralmente a enzima
corresponde a uma fração pequena do custo global do processo [algo em torno a 5%, no
máximo]. A tendência de se usar a enzima mais barata é uma regra comum. Mas o usuário
deve ficar atento para a pureza e a atividade do preparado enzimático, as quais devem ser
compatíveis com o processo. Inclusive, as eventuais atividades colaterais do preparado
enzimático comercial devem ser avaliadas com critério).

Apoio:
 13

2.4.1.5 Enzimas em alimentos

A relação das enzimas com o setor alimentício se dá de quatro maneiras, a saber, na
deterioração dos alimentos – devido às enzimas naturalmente presentes na constituição do
alimento, geralmente pertencentes ao grupo das oxidases; são estudadas na disciplina de
Bromatologia e Bioquímica de Alimentos -, no controle de qualidade dos alimentos – feito na
matéria-prima não processada, durante o processamento e no produto final; neste caso as
enzimas são usadas como reagentes analíticos -, no controle de operações unitárias industriais
– por exemplo, o tratamento térmico (branqueamento) de vegetais só é adequado, quando não
se detecta a enzima peroxidase no alimento branqueado; a pasteurização do leite (processo
térmico em que a matéria-prima é mantida em torno de 65ºC por 30-40min) só pode ser
considerada eficiente, quando a atividade da fosfatase alcalina no leite pasteurizado for nula -,
e, finalmente, no processamento do alimento, que é efetuado em reatores enzimáticos (Tabela
2).

TABELA 2. Exemplos de enzimas usadas na indústria de alimentos.

ENZIMAS APLICAÇÕES
Amilases Panificação, xaropes, cervejaria, sucos
Proteases Panificação, cervejaria, laticínios
Lactase Deslactosação do leite integral ou do soro
Fosfatase Alimentos infantis
Catalase Desglicosação de ovos
Glicose oxidase Desglicosação de ovos
Tanase Cervejaria
Naringinase Sucos de fruta
Pectinases Vinhos e sucos de fruta

A posição destacada das enzimas na área de alimentos deve-se à: a) atoxicidade e

serem substâncias naturais; b) especificidade em relação ao substrato e à estereoespecificidade
de ação; c) atuação em condições brandas de temperatura e pH; d) eficiência catalítica a baixa
concentração; e) fácil inativação.

Apoio:
 14

2.4.1.6. Limitações na Variedade de Enzimas Comercializadas

É notório o descompasso entre o número de enzimas atualmente conhecidas, sendo
muitas já bem caracterizadas tanto em termos estruturais quanto cinéticos, e a quantidade de
enzimas realmente usadas em processos industriais.
A razões prováveis para explicar este fato seriam: a) dificuldade de se obter a maioria
das enzimas conhecidas em quantidades industriais e a custo compatível com o do produto
final; b) atuação inadequada de muitas enzimas nas condições reais de processo; c) origem
intracelular da maioria das enzimas conhecidas, as quais normalmente são de custo elevado;
d) exigência de cofatores caros pela maioria das enzimas conhecidas (oxidorredutases, liases,
etc.).
A solução de boa parte dos problemas mencionados serão, provavelmente, oferecidos
pela biotecnologia. Por exemplo, o barateamento das enzimas poderia advir do emprego de
microrganismos geneticamente modificados que as excretariam para o meio de cultivo
(produção de quimosina por Eschericchia coli e/ou Saccharomyces cerevisiae portadores em
seus genomas do gene codificador desta enzima transferido a partir de bezerros), e/ou através
da reutilização do catalisador imobilizado em material inerte (produção de xaropes de frutose
usando a glicoseisomerase imobilizada). Salienta-se que o processo enzimático em si poderia,
também, ser melhorado através do uso de biorreatores mais adequados, como por exemplo o
reator com membrana (reator continuamente agitado acoplado a membrana de ultrafiltração
através do qual consegue-se associar a reação catalisada e a separação do produto
simultaneamente).

2.4.1.7. Fatores que Impelem a Produção de Enzimas Industriais

Atualmente o fabricante de enzimas deve suprir o mercado com catalisadores de alta
qualidade para usos em processos cada vez mais específicos a preços módicos. Daí resulta que
o desenvolvimento de enzimas aplicáveis em processos industriais é estimulado por vários
fatores, a saber, potencialidade do mercado, custo de processamento, qualidade requerida e
disponibilidade tecnológica.
Apesar da limitações apontadas no item 2.4.1.6 – que fazem com que 10% do total de
três mil enzimas conhecidas, sejam efetivamente usadas -, as enzimas passaram a estar
disponíveis no mercado em meados do século XX, podendo a disponibilidade delas ao longo
das décadas ser elencada como segue: (1900-1910): α-amilase; (1911-1920): invertase;

Apoio:
 15

(1921-1930): nenhuma enzima nova surgiu no mercado; (1931-1940): proteases; (1941-

1950): celulases e pectinases; (1951-1960): catalase, glicose oxidase; (1961.......): lípases,
lactases, coalhos, aminoacilase imobilizada, uroquinase, asparaginase, estreptoquinase,
glicoseisomerase imobilizada,.........
Finalmente, a importância econômica das enzimas pode ser intuída a partir das cifras
crescentes envolvidas na sua comercialização. Assim, o mercado mundial de enzimas nos
anos de 1983, 1995 e 2007 movimentou montantes da ordem de US$ 400 milhões, US$ 1
bilhão e US$ 2 bilhões, respectivamente.

3. BIOTECNOLOGIA: INTERESSE EMPRESARIAL E P&D

3.1. Características Gerais das Empresas Biotecnológicas
As empresas biotecnológicas em linhas gerais apresentam várias características
notórias, a saber, mão de obra não intensiva, diversificada e intelectualizada, manipulação de
materiais renováveis e recicláveis, empresas de porte pequeno ou médio, uso de processos que
requerem pouca energia, gerenciamento específico (deve considerar obrigatoriamente: as leis
particulares que regem o setor, a reação do consumidor, (bio)segurança [riscos à saúde e ao
meio ambiente]), risco financeiro alto, produtos de vida média de mercado curta, P&D
continuado e capital inicial elevado com perspectivas de retorno a médio ou longo prazo.

3.2. Exemplos de Setores Altamente Impactados pela Biotecnologia

Dentre os inúmeros setores de atividade industrial, aqueles que mais impacto vêm
sofrendo com o advento e desenvolvimento da biotecnologia são: a produção de alimentos, a
substituição de derivados de petróleo, geração de fontes de energia alternativa, reciclagem do
lixo, controle da poluição, silvicultura, síntese de fármacos e setores médico e veterinário.
A título de exemplo, comparam-se o comportamento dos setores químico-
farmacêutico e o de alimentos frente às inovações da biotecnologia. O setor de alimentos
enxerga a biotecnologia como oportunidade para reduzir custos – aliás como já enfatizado – ,
melhorar processos, não se ater às questões de patenteamento e investir no máximo 1% do
lucro no desenvolvimento de bioprodutos. Neste último caso, preferem investir em empresas
biotecnológicas emergentes e, somente quando um bioproduto apresentar viabilidade
econômica segura, elas se envolvem efetivamente na sua produção, venda e/ou utilização. A
indústria químico-farmacêutica, por sua vez, se compromete mais intensamente com os
avanços da biotecnologia, despendendo em P&D, no mínimo, 10% das vendas. O

Apoio:
 16

desenvolvimento de tecnologia, a ênfase extremada nas propriedades e qualidades do

bioproduto a ser produzido e o grande interesse na valorização e respeito ao patenteamento
dos bioprodutos constituem-se, também, em objetivos prioritários para este setor.

3.3. Fatores que Afetam as Aplicações da Biotecnologia

Caso fosse possível fazer um levantamento global completo dos produtos e processos
possíveis de serem comercializados, provavelmente concluir-se-ia que nas gavetas dos
grandes laboratórios e empresas de biotecnologia existem muito mais produtos do que aqueles
realmente lançados no mercado. As razões para este freio na biotecnologia comercial proviria
de uma série de fatores, a saber: o elevado montante de investimento para desenvolver o
bioproduto por parte do setor produtivo, a existência de uma lei de patentes adequada e a
seriedade em seu cumprimento (sobretudo em países emergentes), elaboração de estratégias
específicas de marketing e comercialização (estritamente dependentes do tipo de bioproduto a
ser comercializado), aceitação dos bioprodutos pelos consumidores e, finalmente, o custo de
produção do bioproduto deve ser competitivo frente ao custo de um produto análogo obtido
por via não biotecnológica.

3.4. Sensibilização do Consumidor frente aos Avanços da Biotecnologia

Nos últimos 40 anos a biotecnologia tem se desenvolvido a passos largos, gerando
situações tanto benfazejas quanto alarmantes. Muitas pesquisas de opinião têm sido feitas
sobre as grandes questões resultantes do desenvolvimento biotecnológico, a saber,
mapeamento do DNA humano, testes genéticos, policiamento através da identificação
genética, bio-medicamentos e eugenia. Concluiu-se que serão necessários muitos e muitos
anos para que as opiniões sobre cada uma destas questões atinjam um grau significativo de
consenso.
Apenas pinçando um exemplo atual de exploração dos conhecimentos oriundos do
mapeamento do genoma humano, tomemos a chamada nutrigenética.
A nutrigenética pretende através da análise do DNA individual prognosticar eventuais
problemas de saúde e sugerir procedimentos dietéticos para evitar ou, na pior das hipóteses,
mitigá-los. Por exemplo, encontra-se no mercado um produto chamado “CELLF” – produzido
por uma empresa chamada SCIONA e vendido por US$ 269 -, que se baseia na análise da
seqüência de bases do gene codificador da metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR)
localizado no cromossomo 1. A MTHFR decompõe a homocisteína, que segundo alguns

Apoio:
 17

médicos estaria relacionada a problemas coronarianos e aos derrames. A SCIONA faz o

mapeamento deste gene e se encontrar alguma discrepância frente ao mapa original,
recomenda à pessoa comprar e tomar o CELLF.
Na atualidade, tanto o FDA como os centros para Controle e Prevenção de Doenças
enfatizam a ausência de provas científicas cabais para que testes genéticos sejam usados “com
segurança ou efetivamente” na hora de nortear as escolhas nutricionais. Nos EUA, o FDA
regulamenta pouco os cerca de mil testes genéticos disponíveis no mercado, quanto à
segurança e eficácia. Pela lei, o FDA deve aprovar apenas os testes vendidos como kits
médicos aos laboratórios clínicos para o diagnóstico, tratamento e prevenção de enfermidades.
Os demais testes genéticos, incluindo aqueles produzidos por empresas nutrigenéticas são
desenvolvidos por laboratórios para uso caseiro e, portanto, dispensam regulamentação
oficial. Eles escapam, também, pela razão de que esses testes não fazem diagnósticos.

4. BIBLIOGRAFIA

KREUZER, h., MASSEY, A. Engenharia genética e biotecnologia. 2ª Edição, Artmed Editora S.A., Porto
Alegre, 2002. 434p.

SCHMIDELL, W., LIMA, U.A., AQUARONE, E., BORZANI, W. Biotecnologia industrial: Engenharia
bioquímica. São Paulo, SP, Ed. Edgard Blucher LTDA, 2001. vol.2. 593p.

TOMOTANI, E.J., NEVES, L.C.M., VITOLO, M. Oxidation of glucose to gluconic acid by glucose oxidase in a
membrane bioreactor. Applied Biochemistry and Biotechnology, v.121-124, p.149-162, 2005.

SAID, S., PIETRO, R.C.L.R. Enzimas como agentes biotecnológicos. Ribeirão Preto, Leggis Summa, 2004.

NAGODAWITHANA, T., REED, G. Enzymes in food processing. 3rd Ed., San Diego, Academic Press, 1993.

WOLFBERG, A. Genes on the web – direct-to-consumer marketing of genetics testing. New England Journal
of Medicine, v. 355, n.6, p.543-545, 2006.
CASTLE, D. Science, society and the supermarket: the opportunities and challenges of nutrigenomics. Wiley
Interscience, 2007.

Apoio:
 18

CAPÍTULO 2
FUNDAMENTOS DE CINÉTICA ENZIMÁTICA
Doutor Michele Vitolo

1. INTRODUÇÃO
A evolução da enzimologia pode ser dividida em quatro fases, a saber, totalmente
empírica, descritiva, quantitativa e aplicativa com planejamento. A fase empírica –
transcorrida entre 4000-3000AC e início do século XIX - compreende o uso de enzimas em
processos feitos em grande escala – curtume, coagulação do leite para fazer queijo, por
exemplo – sem a mínima noção do tipo de agente responsável pela conversão. A fase
descritiva – ocorrida ao longo do século XIX – correspondeu ao período em que a atividade
enzimática começou a ser observada com mais atenção e método. Assim por exemplo,
observou-se que extratos aquosos de estômagos de aves tinham a capacidade de digerir a
carne animal; extratos aquosos de cereais digeriam materiais amiláceos, como a ptialina da
saliva agia sobre um pedaço de pão; extrato aquoso de levedura de panificação era capaz de
hidrolisar a sacarose, dando o açúcar invertido como produto final. A fase quantitativa, que
se refere ao estabelecimento de modelos matemáticos para quantificar a atividade enzimática,
iniciou-se no final do século XIX, sendo o primeiro modelo quantitativo – conhecido como
modelo de Michaelis-Menten – estabelecido em 1913 e aperfeiçoado por Briggs e Haldane em
1926. Neste mesmo ano, Sumner cristalizou a urease e identificou-a como uma proteína. A
característica protéica das enzimas foi ficando cada vez mais clara, à medida que novas
enzimas eram descobertas, caracterizadas quimicamente e descritas ao longo de todo o século
XX. A fase de aplicação planejada, apesar de ter começado na primeira década do século
passado – uso da amilase e da invertase na hidrólise do amido e da sacarose, respectivamente
– acelerou-se a partir dos anos quarenta, quando novas enzimas apareceram no mercado e os
conhecimentos básicos sobre elas foram se ampliando e aperfeiçoando.
Lembra-se que todas as enzimas conhecidas até agora são de natureza protéica, mas
que nem toda a proteína tem a capacidade de atuar como catalisador. Recentemente,
descobriu-se que algumas moléculas de ácido ribonucléico têm propriedades catalíticas, sendo
chamadas de ribozimas. Suas funções restringem-se na modificação de algumas moléculas de
RNAm antes de sua tradução em proteína no ribossomo. As ribozimas poderão ser
empregadas na terapia gênica (SAID e PIETRO, 2004).

Apoio:
 19

As enzimas, por serem proteínas, são polímeros de aminoácidos concatenados através

da ligação péptica. Devido às interações entre os grupos químicos presentes nas cadeias
laterais de seus aminoácidos constituintes, a molécula adquire conformações tridimensionais
de tal sorte que lhe permite interagir com determinadas substâncias, as quais acabam tendo
sua estrutura molecular modificada de alguma forma.

2. ESPECIFICIDADE
As enzimas catalisam especificamente uma reação, aceitando, em geral, somente uma
substância como substrato. Mesmo quando a enzima catalisa a conversão de mais de um
substrato ela o faz com velocidades diferentes (Tabela 1).
A especificidade decorre das características particulares de uma região da
macromolécula enzimática, denominada sítio ativo. Então, o substrato – reagente a ser
modificado pela enzima – se encaixa no sítio ativo, onde é transformado em outro composto
(produto). Existem duas teorias que procuram explicar o modo como se dá a interação
enzima-substrato. Uma delas – a teoria da chave-fechadura, proposta por Fisher no início do
século XX – preconiza que o substrato se encaixa no sítio ativo da enzima de modo análogo
ao encaixe de uma chave (seria o substrato) na correspondente fechadura (seria a enzima).
Para tal devem ser satisfeitas duas condições, a saber, complementaridade estrutural entre o
sítio ativo e o substrato; o substrato e o sítio ativo terem polaridade e tamanho compatíveis. A
outra teoria – proposta por Koshland nos anos sessenta do século XX, chamada de teoria do
encaixe induzido – propõe que o sítio ativo seria uma região da molécula enzimática
susceptível de sofrer ligeiras modificações conformacionais, quando o substrato se aproxima
dela, de tal sorte a facilitar a interação enzima-substrato. Na essência, as duas teorias diferem
na característica estrutural atribuída ao sítio ativo, ou seja, rígida (segundo Fischer) ou
flexível (segundo Koshland). Em todo o caso, ambas fornecem uma idéia bem clara sobre o
mecanismo da interação substrato/enzima.
Atualmente, considera-se que o sítio ativo seja constituído por duas sub-regiões. Em
uma delas se dá o encaixe do substrato (denominada sítio de ligação) e na outra se dá a
transformação química do substrato (denominada sítio catalítico).

Apoio:
 20

TABELA 1. Ação da glicoamilase sobre dissacarídeos.

DISSACARÍDEO LIGAÇÃO OSÍDICA ATIVIDADE RELATIVA

Maltose α-1,4 100
Nigerose α-1,3 7
Isomaltose α-1,6 4

Da Tabela 1 observa-se que a glicoamilase (também conhecida pelo nome de

amiloglicosidase) pode atuar sobre os dissacarídeos isômeros indicados, porém o substrato de
preferência é a maltose. Ou seja, este dissacarídeo tem afinidade maior pelo sítio de ligação da
glicoamilase do que os demais isômeros.

3. ATIVIDADE ENZIMÁTICA
3.1. Introdução
O conhecimento e a quantificação da atividade enzimática é importante, quando se
deseja utilizar as enzimas quer em processos industriais quer em quaisquer métodos
analíticos.
Centrando a atenção nos processos industriais, algumas considerações devem ser feitas
com o intuito de avaliar a propriedade ou não de se empregar enzimas como catalisadores de
reações específicas. Os questionamentos básicos seriam: a) Quanto da enzima será
necessária? b) Qual a duração da reação? c) Qual a concentração de substrato a ser
transformada? d) Quais as condições de reação? e) Quais os custos envolvidos?
Uma vez tomada a decisão em favor do processo enzimático, e sabendo que a enzima
per si tem um custo – ela deve ser adquirida no mercado -, deve-se avaliar o impacto que este
custo exerce sobre o processo como um todo. Em linhas gerais, o custo efetivo de um
processo catalisado por enzima deriva da razão entre o custo adicional da enzima e o aumento
do rendimento e/ou do valor agregado do produto final, ou, ainda, à economia global
conseguida no processo.
Do exposto, decorre que o sucesso no uso da enzima implica na otimização do
trinômio quantidade de enzima necessária/condições operacionais/rendimento da reação.
Teoricamente, sendo as enzimas catalisadores – portanto regeneráveis ao fim de cada
ciclo de reação – uma pequena quantidade de enzima pode transformar qualquer quantidade
de substrato. Contudo, deve existir uma correlação ótima e finita entre a quantidade de
catalisador, sua atividade inicial e a quantidade de substrato a ser transformada. Além disso,

Apoio:
 21

lembra-se que os processos enzimáticos industriais duram desde minutos (por exemplo, ação
de proteases sobre as proteínas da cevada maltada – visando o aumento do teor de nitrogênio
no mosto a ser usado na fabricação de cerveja – dura menos de 60 min) até algumas horas
(por exemplo, a sacarificação do amido liquefeito pela glicoamilase dura cerca de 3h,
enquanto que a hidrólise da lactose do soro de leite pela β-galactosidase – também chamada
de lactase – dura cerca de 20h) (GODFREY e WEST, 1996). Obviamente a tecnologia
enzimática visa à ocorrência de reações rápidas, sem no entanto perder de vista as restrições
impostas pelas condições de processamento e de escala, que devem ser justificadas do ponto
de vista econômico.

3.2. Quantificação da Atividade Enzimática

Seja a reação catalisada por uma enzima:
k1
E + S
ES → E + P
k2 k3

onde: E = concentração de enzima; S = concentração de substrato; ES = concentração do

complexo enzima substrato; P = concentração de produto; k1 = constante de velocidade de
primeira ordem (t-1); k2 = constante de velocidade de segunda ordem (M-1.t-1) e k3 =
constante de velocidade de primeira ordem (t-1).

Da equação proposta observa-se que antes do substrato ser convertido em produto a

enzima e o substrato se ligam, formando o chamado complexo enzima-substrato (ES). A
formação do ES é uma etapa obrigatória em qualquer reação catalisada por uma
enzima. Nota-se, também, que ES – dependendo das condições operacionais – pode se
decompor quer formando o produto final (P) – etapa controlada pela constante k3 na qual a
reação ocorre efetivamente – quer liberando o substrato (S), etapa controlada pela constante
k2 e situação em que a reação não ocorre efetivamente.
Em linhas gerais, pode-se considerar que uma reação enzimática ocorre em três etapas
distintas (Figura 1). Na 1ª etapa – verificada tão logo a enzima (E) e o substrato (S) entram
em contato no meio reacional – ocorre a formação e o acúmulo do complexo enzima substrato
(ES). Nesta fase não há formação de produto. A existência de ES foi prevista por Brown em
1892 e reforçada em 1902 por Henry. A idéia foi usada por Michaelis-Menten para em 1913
estabelecerem o primeiro modelo matemático útil para quantificar a atividade enzimática, o

Apoio:
 22

qual seria modificado e complementado por Briggs e Haldane em 1926. A identificação

experimental de ES ocorreu em 1936. Na 2ª etapa – período durante o qual a concentração de
ES no meio reacional permanece constante – a concentração de substrato diminui e a de
produto aumenta rapidamente. Na 3ª etapa – quando a concentração de ES no meio reacional
não é mais constante – o consumo de substrato e a formação de produto ocorrem mais
lentamente.

(P)
(g/L)

(S) (P)

(E)

(ES)

Tempo

Figura 1. Variação das concentrações de enzima (E), substrato (S) e produto (P) em função do
tempo. 1ª fase; 2ª fase e 3ª fase.

A abordagem quantitativa da atividade enzimática é feita considerando-se os eventos

da 2ª e 3ª fases.
Primeiramente, vamos considerar a 2ª fase.
O ponto de partida será a avaliação da maneira de como as concentrações iniciais de
substrato (S) variam com o tempo na presença de uma quantidade fixa de enzima (E0). Isto é
feito no laboratório, medindo-se a quantidade de substrato consumida durante um período
total de reação e lançando-se em um gráfico do tipo (S) = f(t) (Figura 2).
A partir dos trechos lineares das curvas do gráfico (S) = f(t), calculam-se as
inclinações correspondentes, as quais representam as velocidades da reação catalisada pela
enzima (v1, v2, v3,.....vn) frente às correspondentes concentrações iniciais de substrato (S1, S2,
S3,.....Sn) (Tabela 2).
A seguir, os dados constantes da Tabela 2 são lançados em um gráfico v = f(S), cujo
perfil representa geralmente uma hipérbole retangular (Figura 3).

Apoio:
 23

t
(Sn)

Quantidade de S (S3)

Consumida (g/L)

(S2)

(S1)

0 5 10 15 20 25
Tempo (min)
Figura 2. Variação do consumo de substrato em função do tempo de reação. A quantidade de
enzima presente no meio reacional foi suposta constante (E0). No intervalo de tempo
0→t tem-se que o consumo de substrato varia linearmente com o tempo, ou seja, a
velocidade de consumo de substrato (v = - dS/dt) permanece constante, indicando que a
concentração inicial de substrato (S1, S2, S3,.....Sn) é suficiente para saturar toda a
quantidade de enzima presente (E0). Acima do tempo t a correlação de consumo frente
ao tempo de reação para S1 deixa de ser linear, neste caso, então, a quantidade de
substrato presente no meio reacional já não é mais suficiente para saturar toda a enzima
presente. Por conseguinte, no trecho linear de cada curva tem-se representada a
condição em que a concentração de (ES) permanece constante, ou seja, o intervalo 0→t
corresponde à 2ª fase referida na Figura 1. Lembra-se que as curvas indicadas
correspondem às concentrações iniciais crescentes de substrato (S1 < S2 <S3...< Sn).
tendo-se em decorrência v1 < v2 < v3 .... < vn.

TABELA 2. Correlação entre as concentrações iniciais de substrato e as velocidades de

reação no intervalo de tempo 0 → t.

Concentração inicial de substrato (g/L) Velocidade da reação (g/L.min)

S1 v1
S2 v2
S3 v3
Sn vn

Conforme já referido, lançando-se os pares de valores (v, S) em um sistema de

coordenadas cartesianas resulta um gráfico do tipo apresentado na Figura 3, ou seja, v e S
correlacionam-se por uma função hiperbólica, cuja assíntota tende a um valor máximo de v (a
chamada Vmax, uma das constantes cinéticas fundamentais, que ajuda a descrever

Apoio:
 24

quantitativamente a catálise enzimática). O trecho assintótico da curva representado pela

invariância de v com o aumento de S – o qual se estabelece a partir de um dado valor de S –
seria a representação gráfica da condição em que a quantidade de substrato presente no meio
reacional é suficiente para saturar completamente as moléculas de enzima. Em outras
palavras, todas as moléculas de enzimas presentes no meio de reação acham-se ligadas ao
substrato, ou seja, no sistema predomina a espécie ES (complexo enzima-substrato, outro
ente fundamental da catálise enzimática).

v = (-

v3

v2

(S)
0
0 S1 Km S2 S3 S4 ……. Sn
Figura 3. Gráfico da velocidade (v = - dS/dt) da reação enzimática em função da concentração
inicial de substrato. A curva – identificada matematicamente como hipérbole retangular
– mostra que a partir da concentração inicial de substrato S2 a velocidade da reação
passa a não aumentar na mesma proporção que a concentração inicial de substrato, até
que a partir de S4 torna-se invariante em relação ao aumento da concentração inicial de
substrato. A reação, portanto, passa a ocorrer com a velocidade máxima (Vmax),
lembrando que nesta condição a enzima encontra-se saturada com substrato, ou seja, o
complexo ES é a forma dominante da enzima nesta fase da catálise (2ª fase). Indica-se,
também, nesta figura a constante cinética Km – que corresponde à concentração inicial
de substrato na qual a velocidade da reação é a metade da velocidade máxima – a qual
junto com a Vmax e sob condições definidas de reação caracterizam a atividade catalítica
da enzima.

Considerando a decomposição (ES → E + P) como a etapa determinante da reação,

pode-se escrever que:
(- dS/dt) = v = k3.(ES) (Eq. 1)
Em qualquer instante da reação, tem-se que:
E0 = (E) + (ES) (Eq.2)

Apoio:
 25

Em presença de excesso de S (substrato), a reação estará deslocada totalmente para a

direita (ou seja, no sentido da formação de produto) e, por conseguinte, toda a enzima estará
ligada ao substrato (ou seja, a cada instante da reação não existe molécula de enzima no meio
reacional que não esteja ligada a uma molécula de substrato). Logo, (E) = 0.

Desta forma, a equação 2 pode ser escrita:

E0 = (ES) (Eq. 3)
Substituindo a Eq. 3 na Eq. 1, temos:
v = k3.E0 (Eq. 4)

Pela equação 4, pode-se concluir que na condição de saturação da enzima a reação

procede segundo uma cinética de “pseudo-ordem zero”, ou seja, aparentemente a cinética não
é afetada pela concentração de substrato. Realmente, observando a Eq. 4, vê-se que a
velocidade da reação é diretamente proporcional à concentração total de enzima presente no
meio reacional.
Nesta condição de saturação da enzima, a constante de velocidade (k3) é chamada de
“turnover number” e simbolizada por kcat. O “turnover number” significa o número de vezes
que uma molécula de enzima participa do ciclo catalítico em um dado intervalo de tempo, ou
seja:

E
S
P

ES

Na condição de saturação, o produto kcat.E0 corresponde à velocidade máxima da

reação catalisada pela enzima (Vmax). Então,
v = Vmax (Eq. 5)
Lembrando que a Eq. 5 pode, também, ser escrita como:
- dS/dt = Vmax (Eq. 6)
Rearranjando a Eq.6, e integrando em seguida tem-se:
(S) = (S0) – Vmax.t (Eq. 7)
Portanto, quando a enzima está saturada de substrato, a concentração de substrato
presente no meio reacional diminui linearmente com o tempo. Este fato é o reflexo da reação

Apoio:
 26

transcorrer a uma velocidade constante e, ao mesmo tempo, máxima. É nesta condição em

que a enzima tem sua atividade catalítica padronizada.
Na presença de baixa concentração de substrato, nota-se da figura 3 (trecho 0→S1)
que v varia linearmente com S , podendo-se, então, escrever que:
v = (- dS/dt) = k’.S (Eq.8)
Onde k’ é uma constante de velocidade de primeira ordem.

Rearranjando a Eq.8 e, a seguir, integrando, tem-se:

Ln S = Ln S0 – k’.t (Eq.9)
Pela Eq.9 tem-se que a concentração de substrato presente no meio reacional – na
condição de não saturação e baixa concentração de substrato – diminui exponencialmente
com o tempo.
Retornando à Figura 3, observa-se que a reação vai gradualmente passando de uma
cinética de 1ª ordem (concentração de substrato < S1) para uma de “pseudo-ordem zero” (
concentração de substrato > S4). Para poder quantificar o trecho S1→S4 , temos que considerar
que na 2ª fase (ver Figura 1) a (ES) permanece constante. Isto significa que
d(ES)/dt =0 (Eq.10)
A Eq. 10 pode ser interpretada como segue:
Velocidade de formação do complexo = velocidade de decomposição do complexo
Ou em linguagem literal:
k1.(E).(S) = k2.(ES) + k3.(ES) (Eq. 11)
rearranjando a Eq. 11, temos
(E) = [(k2 + k3)/k1] x (ES)/(S) (Eq. 12)
Chamando a relação de constantes de velocidade [(k2 + k3)/k1] = KM, então a Eq. 12 pode ser
escrita como:
(E) = [ KM . (ES)] ÷ (S) (Eq. 13)
Substituindo a Eq. 13 na Eq. 2 (isto é possível desde que as condições de reação preservem
a plena capacidade catalítica da enzima) temos
E0 = {[KM . (ES)/(S)] + (ES)} ou seja,
(ES) = {[S.E0 ] ÷ [S + KM]} (Eq. 14)
Substituindo a Eq. 14 na Eq. 1, tem-se
v = [k3.E0.(S)] ÷ [(S) + KM] ou finalmente,
v = Vmax.(S)/[(S) + KM] (Eq. 15)
A equação 15 descreve completamente a curva hiperbólica mostrada na Figura 3. Ou
seja, durante a 2ª fase da reação catalisada pela enzima (figura 1) pode-se dispor a cada
instante da velocidade da reação frente a uma determinada concentração de substrato.
Na equação 15 aparecem Vmax e KM – as chamadas constantes cinéticas – que
caracterizam uma enzima, quando a catálise é conduzida sob condições definidas de reação

Apoio:
 27

(pH, temperatura, agitação, concentrações dos reagentes, etc.). Estas constantes devem ser
calculadas a partir de um quadro (Tabela 2) aonde se dispõe a velocidade da reação medida
experimentalmente frente às correspondentes concentrações iniciais de substrato.
A Eq.15 pode ser escrita da seguinte forma:
1/v = (1/Vmax) + (1/S).(KM/Vmax) (Eq. 16)
A partir de um gráfico (1/v) versus (1/S) calculam-se as constantes cinéticas referidas.
A respeito do KM deve-se lembrar de três aspectos importantes: a) Quando KM = (S),
ou seja, numericamente igual à concentração de substrato, a Eq. 15 se transforma em v
= Vmax/2; b) KM serve de referencial para fixar a concentração inicial de substrato –
Quando (S) for pelo menos 100 vezes maior que o KM a reação transcorre em condição
de saturação; quando (S) for pelo menos 100 vezes menor que o KM a reação se dá em
condição não saturante -; c) KM é uma característica da enzima sob condições definidas
de reação.
Vamos analisar a 3ª fase da reação catalisada por uma enzima. Esta é a fase em que a
concentração de (ES) deixa de ser constante (Figura 1).
Para equacionar esta fase, vamos reescrever a Eq. 15 da seguinte maneira:
v = -(dS/dt) = Vmax/[1 + (KM/S)] (Eq. 17)
rearranjando,
- dS .[1 + (KM/S)] = Vmax.dt (Eq. 18)
Integrando,
t = [(S0 – S) – KM.Ln (S/S0)] ÷ Vmax (Eq. 19)
A Eq. 19 correlaciona o consumo de substrato com o tempo durante todo o período de
duração da reação.
A Eq. 19 pode ser modificada como segue:
Definindo a conversão (Y) como :

Y = (S0 – S)/S0 (Eq. 20)

Rearranjando a Eq. 20, temos
S = S0.(1 – Y) (Eq. 21)
Substituindo a Eq. 21 na Eq. 19, tem-se finalmente
t = [Y.S0 – KM . Ln (1 – Y)] ÷ Vmax (Eq. 22)
A importância prática da Eq. 22 reside no fato de que uma dada conversão
pode ser estimada a partir de um tempo previamente estabelecido.

Apoio:
 28

3.3. Expressão da Atividade Enzimática

A atividade enzimática pode ser expressa de diferentes formas. No entanto, deve-se
dar preferência ao estabelecido pela Comissão Internacional de Bioquímica, que recomendou
as seguintes definições:
a) Uma unidade (U) de qualquer enzima é aquela quantidade que catalisa a transformação de
1 µmol de substrato por minuto sob condições definidas de reação;
b) Um katal (kat) é a quantidade de enzima que promove a conversão de 1 mmol de substrato
por segundo sob condições definidas de reação;
c) A razão U/mg de proteína é chamada de atividade específica;
d) A razão U/µmol de enzima é chamada de atividade molecular.

4. FATORES QUE AFETAM A ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Grosso modo, uma macromolécula de enzima pode ser dividida em duas partes, a
saber, o microambiente do sítio ativo e o resto da molécula. Não é preciso dizer que a
atividade enzimática ótima ocorre quando as condições reacionais não afetam
significativamente a estrutura da molécula. As condições reacionais a serem consideradas
seriam aquelas relacionadas a fatores físico-químicos (pH, temperatura, força iônica, atividade
de água, etc.), químicos (substâncias ativadoras, desativadoras, estabilizantes e inibidores) e
físicos (força de cisalhamento, pressão).

4.1. Fatores Físico-Químicos

4.1.1. pH
Este fator tem uma ação generalizada sobre as reações em geral, influindo na
velocidade de reação, posição do equilíbrio, no grau de ionização, dissociação e/ou
solubilidade dos reagentes. No caso das enzimas acrescentam-se os efeitos sobre a
estabilidade e os valores das constantes cinéticas (Vmax e KM). A atividade enzimática é
afetada pelo pH, porque ele interfere no grau de ionização dos aminoácidos constituintes da
proteína. A forma em “sino” da curva pH versus atividade indica o efeito gradual do pH sobre
a estrutura da macromolécula. Ao se sobrepor as curvas pH versus atividade e pH versus
estabilidade é possível determinar o valor do pH acima do qual ocorre a desnaturação da
proteína.

Apoio:
 29

4.1.2. Temperatura
A temperatura exerce efeito generalizado no andamento de uma reação, influindo na
solubilidade dos reagentes, na velocidade global da reação e, no caso das enzimas, afeta as
constantes cinéticas e a estabilidade. Segundo a lei de Van’t Hoff, frente a um aumento de 10º
C na temperatura a velocidade da reação dobra, porém no caso das enzimas pode ser até mais
que o dobro.
É muito difícil estabelecer uma temperatura ótima para a ação de uma enzima, porque
a macromolécula está submetida aos eventos simultâneos da ativação e da desnaturação.
Devido à coexistência ativação/desnaturação, o tempo durante o qual a enzima é submetida a
uma dada temperatura torna-se um fator importante na sua estabilidade.
O efeito da temperatura na vida de prateleira da enzima, também, é um aspecto
importante a ser considerado, pois um mesmo preparado enzimático mantido a diferentes
temperaturas apresenta perda de atividade diferenciada. Modificações introduzidas na
estrutura molecular da enzima, quer por via química (engenharia de proteínas) quer por
modificação genética da fonte (biologia molecular), com a finalidade de torná-la mais ou
menos termoestável é um objetivo dos fabricantes de enzimas industriais.

4.1.3. Outros
Apenas a título de lembrança, citam-se os efeitos: a) força iônica – relacionada à
concentração de íons presentes no meio reacional – e que pode afetar a solubilidade e a
ionização dos grupos ionizáveis presentes nas cadeias laterais dos aminoácidos constituintes
da enzima; b) Atividade de água, ou seja, o teor de água existente no meio reacional, que
poderá interferir na intensidade e no mecanismo catalítico da enzima. A atividade de uma
enzima pode ser severamente diminuída em ambiente de baixo teor de água ou, caso a enzima
catalise uma hidrólise, o seu mecanismo de ação poderá deixar de ser hidrolítico e passar a ser
transferásico (ao invés de romper uma ligação passa a formá-la).

4.2. Fatores Químicos

Os fatores químicos, ao contrário dos fatores físicos e/ou físico-químicos, atuam sobre
uma região específica da macromolécula, por exemplo, no sítio ativo.

Apoio:
 30

4.2.1. Ativadores/Desativadores
O ativador é uma substância, muitas vezes um íon, que aumenta a atividade da enzima
e que pode ser um elemento integrante da macromolécula (se for de natureza orgânica é
chamado de grupo prostético) ou estar solubilizado no meio reacional e se unir à enzima
somente no momento da catálise (ou seja, na presença do substrato. Neste caso, tem-se a
coenzima, se o composto for orgânico).

4.2.2. Estabizadores
A presença do substrato, em geral, estabiliza a enzima, sobretudo frente à temperatura.
Por exemplo, em preparados enzimáticos líquidos às vezes são acrescentados substratos
modificados. Assim, amilases podem ser estabilizadas com amido hidrolisado, as proteases
com peptídeos. Nos casos em que a enzima pode catalisar a reação P → S, o produto,
também, pode estabilizar a enzima. Só que neste caso se torna um problema a eliminação da
atividade da enzima no final do processo. Há casos em que o íon metálico, além de ativador,
atua como agente estabilizador (por ex., o Ca+2 estabiliza a α-amilase).

4.2.3. Inibidores
Os inibidores são substâncias específicas que, em baixas concentrações, diminuem a
velocidade da reação enzimática. Atuam no nível do sítio ativo ou de sítios auxiliares, sem
prejudicar a estrutura terciária e/ou quaternária da proteína, ao contrário do que fazem os
reagentes químicos inespecíficos (álcali, ácido, sais, uréia, detergentes).
Do ponto de vista industrial é importante ter consciência de que o inibidor reduz a
eficiência catalítica da enzima. Evitá-lo é a maneira correta.
Os principais tipos de inibidores são: a) irreversível: liga-se à molécula da enzima
através de ligação covalente, inutilizando-a por completo; b) reversível: liga-se à molécula da
enzima através de ligações não covalentes, de tal sorte que seu efeito pode ser revertido ao
usar-se uma concentração adequada de substrato. Existem três tipos básicos de inibidores
reversíveis, a saber, competitivo – o substrato e o inibidor disputam o sítio ativo da enzima e
dependendo da concentração relativa entre eles o efeito inibitório pode ser reduzido ou até
eliminado; em outras palavras, eles se excluem mutuamente -, não competitivo – inibidor e
substrato não se excluem mutuamente, porque se ligam em pontos diferentes da molécula da
enzima – e incompetitivo, o inibidor só se liga à enzima após o substrato ter se introduzido
no sítio ativo, ou seja, o inibidor se liga diretamente no complexo enzima-substrato.

Apoio:
 31

4.3. Fatores Físicos

Merecem lembrança os fatores que podem prejudicar de maneira inespecífica a
estrutura da molécula enzimática através de efeitos puramente mecânicos, como as forças de
cisalhamento – resultantes da agitação mecânica do meio de reação – e a pressão interna do
compartimento (reator) dentro do qual a catálise se processa.

5. TERMODINÂMICA DA CATÁLISE ENZIMÁTICA

A enzima - como qualquer outro catalisador - facilita a ocorrência da reação,
diminuindo a energia necessária para as moléculas reagentes atingirem o estado de transição.
No entanto, o mecanismo catalítico de uma enzima envolve sempre a formação do complexo
intermediário enzima-substrato, que é uma forma estável da enzima. Assim sendo, do ponto
de vista da diminuição da barreira energética para alcançar o estado intermediário, a reação
catalisada pela enzima deveria parar no ponto em que o complexo intermediário se formou.
Porém, hodiernamente se verifica que a reação enzimática continua adiante para liberar a
enzima e gerar o produto. Explica-se este resultado, levando em conta o somatório das
instabilidades no seio do complexo intermediário, que surgem em decorrência do íntimo
contato entre as moléculas do substrato e as de enzima. Em conseqüência, incompatibilidades
eletrostáticas, hidrofóbicas, dentre outras, entre grupos químicos do substrato e da enzima
levam à desestabilização do complexo, que ao se desfazer, acaba liberando a enzima e o
produto formado. Acrescenta-se, também, que a entropia do sistema diminui à medida que o
complexo ES vai se acumulando no sistema reacional (lembra-se que o complexo é uma
forma mais estruturada e, por isso, mais organizada do que quando o substrato e a enzima
estão separados). Esta diminuição de entropia, associada às alegadas instabilidades internas do
complexo ES, fazem com que a reação enzimática chegue ao término.

Apoio:
 32

6. EXERCÍCIOS PROPOSTOS
1. O eixo 1/v de um gráfico de recíprocos mostra a legenda v-1: (nmoles/L.min)-1x102. O eixo 1/S
apresenta a legenda (S)-1: (M-1)x10-4. A reta intercepta o eixo das ordenadas (1/v) em “2” e o eixo das
abscissas (1/S) em “-4”. Calcular Vmax e KM.
2. Uma preparação enzimática tem uma atividade específica de 42 U/mg de proteína e contém 12 mg
de proteína por mL. Calcule a velocidade inicial da reação numa mistura padrão de 1 mL contendo 5
µL de preparado enzimático. Se a reação for deixada ocorrer por 10 min, haveria ou não necessidade
de se diluir o preparado enzimático?
DADOS: A velocidade inicial de uma reação enzimática é mantida até que 5% do substrato inicial
seja consumido. Uma unidade de atividade (U) é definida como µmoles de substrato
consumido/min.mL.
3. A atividade de uma enzima foi determinada a uma concentração inicial de substrato de 1x10-5M. O
Km da enzima é 2x10-3M. Ao final de 1min, 2% do substrato foi convertido em produto. Pergunta-se:
(a) Que percentagem de substrato será convertida em produto ao final de 3min? Quais são as
concentrações de produto e substrato após 3 min?
b) Se a concentração inicial de substrato fosse 1x10-6M, que percentagem seria convertida em produto
decorridos 3 min?
(c) Qual a velocidade máxima (Vmax) que pode ser alcançada?
(d) A que concentração mínima de substrato a Vmax será observada?
(e) A esta concentração mínima de substrato, que percentagem de substrato será convertida em
produto em 3 min?

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

GODFREY, T., WEST, S. Industrial Enzymology. 2nd Edition, New York: Stockton Press, 1996. 609p.

AQUARONE, E., BORZANI, W., SCHMIDELL, W., LIMA, U.A. Biotecnologia Industrial. São Paulo, Edgard
blucher Ltda, vols. 1,2,3 e 4. 2001.

SAID, S., PIETRO, R.C.L.R. enzimas como agentes biotecnológicos. Leggis Summa, Ribeirão Preto, SP, 2004.

Apoio:
 33

CAPÍTULO 3
FONTES E PRODUÇÃO DE ENZIMAS: FUNDAMENTOS
Doutor Michele Vitolo

1. FONTES
As enzimas podem ser obtidas de animais, vegetais e microrganismos, conforme
descrito no Capítulo 1 (item 2.4.1.1). Em princípio, todas as enzimas de origem animal e
vegetal têm sua correspondente microbiana. Lembra-se, no entanto, que elas são moléculas
protéicas diferentes, só se assemelhando em dois aspectos, a saber, o de serem proteínas e o
de atuarem sobre o mesmo substrato.

2. OBTENÇÃO E PURIFICAÇÃO
Para a obtenção das enzimas a partir das fontes citadas são empregados diferentes
processos, os quais são selecionados de acordo com o grau de pureza desejado para o
preparado enzimático a ser comercializado.
Em termos genéricos, as etapas para a obtenção de enzimas são: FONTE →
EXTRAÇÃO → FILTRAÇÃO/CENTRIFUGAÇÃO → PRECIPITAÇÃO →
PURIFICAÇÃO → SECAGEM → ESTABILIZAÇÃO → PADRONIZAÇÃO →
EMBALAGEM.
Como a propagação das fontes animal e vegetal se dá em fazendas, as enzimas
provenientes dessas fontes são obtidas através da extração de tecidos animais e vegetais. Ou
seja, a indústria produtora desse tipo de enzima, recebe a fonte já no ponto de partida para a
extração, não tendo que se preocupar com a propagação da mesma. Nas figuras 1, 2, 3 e 4 são
apresentados, apenas como exemplos, os esquemas de obtenção da quimosina (renina),
pancreatina, urease e bromelina, respectivamente.

Apoio:
 34

[FIGURA 1]

ESQUEMA PARA A OBTENÇÃO DA RENINA (QUIMOSINA)

1. LIMPEZA
ESTÔMAGOS pH = 3,6
2. SECAGEM EXTRATO EXTRATO
DE
BEZERROS 3. TRITURAÇÃO TECIDUAL 3º C ATIVADO
4. AGITAÇÃO (NaCl
pH = 5,4
10%, POR 2 DIAS)
K2Al2(SO4)3

DECANTAR; NaHPO4

AGITAR; FILTRAR;
FLÓCULO
FILTRAÇÃO NaCl 26% (pH = 1,5)

SECAGEM

RENINA (COALHO)

[FIGURA 2]

ESQUEMA DE OBTENÇÃO DA PANCREATINA

LIMPEZA PÂNCREAS
PÂNCREAS ÁGUA
MACERAÇÃO MACERADO

PRENSAGEM

ETANOL

FILTRAÇÃO

CENTRIFUGAÇÃO SECAGEM
TAMIZAÇÃO

PANCREATINA

Apoio:
 35

[FIGURA 3]

ESQUEMA DE OBTENÇÃO DE UREASE

MOAGEM FARINHA
SOJA DESENGORDURAMENTO FARELO
INTEGRAL
ACETONA
ÁGUA + MERCAPTOETANOL

FILTRAÇÃO AGITAÇÃO

REPOUSO

CENTRIFUGAÇÃO

SECAGEM
UREASE

[FIGURA 4]

ESQUEMA DE OBTENÇÃO DA BROMELINA

1 VOLUME DE ACETONA

2 VOLUMES DE ACETONA
DESCASCAR
ABACAXI SUCO
PRENSAR

FILTRAR

FILTRAR

SECAR
BROMELINA

Apoio:
 36

Contrariamente ao caso das enzimas de origem animal e vegetal, as fontes das enzimas
microbianas devem ser propagadas pelos fabricantes.
A propagação de micro-organismos é feita através do processo de fermentação, no
qual as células são cultivadas em meio de cultivo asséptico. A Figura 5 ilustra as principais
etapas de um processo fermentativo.

[FIGURA 5] Esquema do processo fermentativo genérico.

AIR CULTURE MEDIUM

INOCULUM
PREPARATION

STERILIZATION PROCESS

LAB SCALE AIR CUTURE MEDIUM

INDUSTRIAL SCALE
FERMENTER CONTROL SYSTEM

FERMENTED MASH

A propagação das células microbianas pode ser feita através de cultivos submerso
(Figura 6) ou em meio semi-sólido (Figura 7).

Apoio:
 37

[FIGURA 6] : Esquema do cultivo submerso.

CULTIVO SUBMERSO

CULTURA PURA inoculação FRASCOS COM MOSTO

incubação
inoculação
TANQUE DE SEMEADURA INÓCULO

FERMENTADOR COM MOSTO ESTÉRIL MOSTO FERMENTADO

desprezar filtração
ENZIMA RESÍDUO
EXTRACELULAR
EXTRATO
ENZIMA
Rompimento
INTRACELULAR
filtração
EMBALAGEM

[FIGURA 7]: Esquema do cultivo semi-sólido.

CULTIVO SEMI-SÓLIDO

CULTURA PURA inoculação MEIO ESTÉRIL crescimento INÓCULO

MEIO SEMI-SÓLIDO
FARELO esterilização BANDEJAS
ESTÉRIL distribuição

Incubação (20-45oC)

FARELO Secagem, Moagem, Tamisação

MEIO SEMI-SÓLIDO
COM
FERMENTADO
ENZIMA

Extração com solvente

EXTRATO

EMBALAGEM RESÍDUO

Apoio:
 38

Na obtenção de enzimas deve-se levar em conta o fato da enzima de interesse ser

extracelular ou intracelular, pois conforme o caso a sequência das operações de
separação/purificação serão diferentes. Em geral admite-se que a única diferença relevante na
marcha de obtenção destes dois tipos de enzimas, está na intercalação de uma etapa de ruptura
celular para o caso da intracelular. No entanto, só para citar duas situações, as enzimas
extracelulares não podem ser armazenadas convenientemente na forma de sobrenadante bruto,
porque elas, em geral, são instáveis, além do volume do sobrenadante ser grande, implicando
na baixa concentração da mesma, exigindo, por isso, a inclusão de uma etapa de concentração
antes de se proceder à separação/purificação . A consequência imediata disto é que o processo
fermentativo e o de recuperação devem ser bem sincronizados na produção de enzimas
extracelulares.
Em termos comparativos, as diferenças nos estágios de separação/purificação, a partir
do caldo fermentado, para as enzimas intracelulares e extracelulares são:

CALDO FERMENTADO

ENZIMA INTRACELULAR
ENZIMA EXTRACELULAR

SEPARAÇÃO
SEPARAÇÃO LÍQUIDO/SÓLIDO
LÍQUIDO/SÓLIDO

ROMPIMENTO CELULAR
CONCENTRAÇÃO

PURIFICAÇÃO SEPARAÇÃO
LÍQUIDO/SÓLIDO

PRECIPITAÇÃO DE
ÁCIDOS NUCLÉICOS

PURIFICAÇÃO

Apoio:
 39

No caso específico das enzimas extracelulares, os tratamentos iniciais a serem

considerados seriam:

1. AS FASES FERMENTATIVA E DE SEPARAÇÃO DEVEM SER

COMPLEMENTARES no que se refere ao tempo de processo (de preferência fazer
coincidir o final da fermentação e o início da separação), à força iônica do caldo fermentado
(de preferência deve ser a menor possível), à composição do meio de fermentação, à presença
de anti-espumante (deve ser a menor possível, a fim de não influir na viscosidade do caldo
fermentado) e evitar a formação de eventuais pigmentos;

2. CONCENTRAÇÃO que pode ser feita de diferentes maneiras, a saber: a) Precipitação:

pode-se usar sulfato de amônio (sal barato e solúvel), solventes orgânicos( acetona, etanol) ou
polímeros carregados (DEAE-dextran, dextran-sulfato); b) Adsorção: neste caso vale a
equação de Langmuir, que pode ser expressa na forma: q = k1.C / (1 + k2C), onde q=
quantidade de soluto adsorvido por unidade de massa do adsorvente, k1 e k2 constantes e C=
concentração de equilíbrio do soluto. Assim, k2C <<1 ⇒ q = k1C ⇒ a quantidade de soluto
adsorvida é proporcional à concentração de substrato, mas para k2C >>1 ⇒ q= k1/k2 ⇒
quantidade máxima de soluto que pode ser adsorvida por unidade de massa adsorvente; c)
Secagem/Evaporação; d) Ultrafiltração/Osmose Reversa.
A título de exemplo, descreve-se a obtenção/purificação da nuclease extracelular de
Staphylococcus aureus (FIGURA 8). Esta enzima apresenta interesse na remoção de ácidos
nucléicos, cuja presença dificulta a purificação de enzimas intracelulares.

Apoio:
 40

[FIGURA 8]: Esquema para a obtenção da nuclease.

ESQUEMA DE OBTENÇÃO DE NUCLEASE EXTRACELULAR (S.aureus)
centrifugação
diluição
FERMENTAÇÃO SOBRENADANTE
pH 8,8; 23000µS Acidificação ( pH 5,2)

PRECIPITADO Adsorção
centrifugação SOBRENADANTE
NUCLEASE- Agitação (1h) DILUÍDO (11000µS)
RESINA
Repouso (2h)
SP-SEPHADEX C25 (750G)
Lavagem com (NH4)Ac 0,3M (pH 6,0)
Ultracentrifugação

1º eluição: (NH4)2SO4 2M Membrana

NUCLEASE-RESINA
(cut off 10kDa)
DIALISADO
LAVADA
2º diálise: com água por 24h

1º Filtração em gel (sephadex

G75); 0,01% HAc + (NH4)Ac 0,1M
LIOFILIZADO ULTRA-FILTRADO
2º liofilização

No caso das enzimas intracelulares, os procedimentos empregados para sua

separação/purificação podem ser sumarizados como segue:

CALDO FERMENTADO

CÉLULAS
CENTRIFUGAÇÃO/RUPTURA
CELULAR
FLOCULAÇÃO
SEPARAÇÃO
CENTRIFUGAÇÃO
SÓLIDO/LÍQUIDO
FILTRAÇÃO

NUCLEASE REMOÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO PRECIPITAÇÃO

RECUPERAÇÃO DA ENZIMA/ PURIFICAÇÃO

CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA
CROMATOGRAFIA
DE ADSORÇÃO DE TROCA IONICA
DE AFINIDADE
C

Apoio:
 41

A ruptura das células pode ser feita através de diferentes métodos, dentre os quais
destacam-se:
1) Cisalhamento sólido: as células são misturadas, por exemplo, com kieselguhr (terra de
diatomácea) e a mistura é submetida a uma dada pressão;
2) Agitação com abrasivos: é um dos métodos mais usados, podendo-se usar esferas de vidro
como agentes de abrasão. Um exemplo de condições seria: diâmetro das esferas: 0,13 a 0,26
mm; agitação: 300 - 500 stokes/min e amplitude: 2,5 polegadas;
3) Cisalhamento líquido: consiste em se passar a suspensão celular através de diminutos
orifícios munidos de válvulas e sob altas pressões. Os equipamentos mais utilizados são a
“French Press” (rompimento descontínuo) e o Manton-Gaulin (rompimento contínuo). A
suspensão celular antes de ser introduzida no aparelho deve estar à 4oC, devido ao
aquecimento resultante do atrito das células com as placas perfuradas. A eficiência da ruptura
depende do grau de homogeneidade da suspensão. Em outros termos, na suspensão não
devem existir filamentos ou grumos celulares. Por isso, agregados miceliais não podem ser
destruídos por este processo.
4) Detergentes: substâncias do tipo dodecilsulfato de sódio, brometo de cetiltrimetilamônio,
Tweens, Triton X100, dentre outras, quando em condições adequadas de pH, força iônica e
temperatura podem romper células com eficiência.
5) Tratamento enzimático: em princípio parece apresentar grande interesse, pois além de ser
suave é seletivo. Porém vários problemas existem: a) alto custo da enzima; b) a enzima lítica
se mistura ao lisado, podendo complicar o posterior processo de extração da enzima de
interesse; c) o número de espécies celulares susceptíveis a este tratamento é pequeno.
6) Tratamento com álcali: é um método barato. Implica em que a enzima resista a pH da
ordem de 12,0 por 20 a 30 min. Uma vantagem adicional é que neste pH, proteases
eventualmente existentes seriam inativadas, ou então substâncias pirogênicas (no caso de
enzimas para fins terapêuticos).
Quando se pensa na ruptura das células para posterior extração da enzima, alguns
pontos de natureza geral devem ser realçados: a) a enzima estará sendo submetida a
sucessivas forças de cisalhamento, à medida que os processos de purificação vão sendo
aplicados (por ex., mistura, centrifugação, ultrafiltração, passagem por bombas, dentre
outras), e por isso poderá ocorrer perda de atividade; b) fatores biológicos do tipo: tamanho da
célula, condições fisiológicas, estrutura da célula, composição da célula e localização da
enzima na estrutura celular, poderão interferir no maior ou menor rendimento do processo de

Apoio:
 42

purificação. Lembrar que, uma vez destruída a célula, a enzima de interesse se torna
susceptível à degradação ou inativação por uma série de fatores, onde se incluem: proteases e
metais pesados. Por isso, a adição de substâncias protetoras, nesta fase, pode ser de grande
utilidade (EDTA, β-mercaptoetanol, etc); c) qualidade da água usada nas várias etapas da
purificação.
Uma vez rompidas as células, procede-se à separação sólido/líquido. Neste caso, os
processos utilizados são a centrifugação, floculação ou filtração. A filtração é muito usada nos
processos de clarificação e de esterilização, sendo raramente usada logo após a etapa de
ruptura das células. Uma das razões consiste no fato de que homogenatos animais e
bacterianos são frequentemente viscosos ou gelatinosos e entopem rapidamente o elemento
filtrante, a menos que se use grandes quantidades de auxiliar de filtração.
A próxima fase consiste da remoção dos ácidos nucléicos dissolvidos através do uso
da nuclease. Contudo, quando o produto final é uma enzima de restrição ou qualquer outra
relacionada à DNA, o emprego da nuclease poderá contaminar o produto final, tornando-o
inútil. Neste caso, substitui-se a nuclease por substâncias catiônicas (sulfato de protamina,
sulfato de estreptomicina e polietileneimina).
Uma vez efetuadas as etapas discutidas acima, passa-se para o estágio de recuperação
da enzima, para o qual utilizam-se: a) precipitação; b) cromatografia de adsorção; c)
cromatografia de troca iônica; d) cromatografia de afinidade; e) separação aquosa bifásica:
sistemas bifásicos podem ser usados para separar enzimas de homogenatos celulares e ao
mesmo tempo obter um certo grau de purificação. Tais sistemas podem ser feitos misturando-
se soluções de polietilenoglicol e dextrana ou polietilenoglicol e K2SO4 ou (NH4)2SO4. As
proteínas se particionam entre as duas fases, sendo a exata localização da enzima função do
seu PM, força iônica, temperatura, da concentração e massa molar do polímero.
Neste ponto devemos destacar que os vários recursos utilizados para a purificação
final da enzima são os mesmos utilizados no estágio de recuperação.
Os métodos de purificação, agrupados de acordo com a característica explorada, são:
a) Diferenças nas propriedades iônicas: precipitação, eletroforese e cromatografia de
troca iônica (Figura 9).

Apoio:
 43

[FIGURA 9]
CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA

PROTEÍNA PROTEÍNA COM CARGA

PROTEÍNA COM CARGA ISOLÉTRICA NEGATIVA (pH > pHi)
POSITIVA (pH < pHi) (EMULSÓIDE) (pHi)

RESINA CATIÔNICA (IRA-120) RESINA ANIÔNICA

(IRA-400)

RESINA CATIÔNICA: O POLÍMERO POSSUI GRUPOS COM CARGA NEGATIVA

RESINA ANIÔNICA: O POLÍMERO POSSUI GRUPOS COM CARGA POSITIVA

b) Diferenças em termos de adsorção: Cromatografias de afinidade (Figura 10) e de

adsorção (Figura 11).

[FIGURA 10]

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE

xx////x//xxx// alimentação
/xxx///x/x////
xxxx//x/x/x// Lavagem

⊗⊗ 0000
0000
⊗⊗ 0000
0000 (B)
(A) ⊗⊗ 0000 (C)
0000
⊗⊗ 0000
0000
⊗⊗
0000

Xxx
xxx

(A): Coluna empacotada com a resina absorvente.

(B): Coluna com a proteína retida na resina (x).
(C): Coluna com a resina absorvente sem a proteína ligada (retorno ao
estágio inicial).

Apoio:
 44

[FIGURA 11]

CROMATOGRAFIA POR ADSORÇÃO

*x***xxx*
x***xx*xx Solução contendo as
x**x*****x proteínas a separar.
xxx*****x
xx**xx**
LÍQUIDO CARREADOR
A proteína (*)

0000000000000
0000000000000
0000000000000
0000000000000
0000000000000
0000000000000
0000000000000
sai primeiro
Coluna com resina de
adsorção

xxxxxxx ********
xxxxxxx ********
Cromatograma xxx ********

Na cromatografia por adsorção define-se o coeficiente de partição (ki):

ki = wi/xi
wi = fração molar da proteína no adsorvente; xi = fração molar da proteína na solução.
Define-se, também, a relação:
vi /v = [1 + ki(1 - ε)/ε]-1
ε = (volume ocupado pelo fluido)/(volume total da coluna)
onde v = fluxo do líquido de arraste; vi = velocidade da proteína ao percorrer a coluna.

Assim, quando wi >>xi então ki é alto, indicando que a velocidade de percurso da

proteína diminui, ou seja, a proteína fica mais tempo retida no material da coluna do que
solubilizada no líquido carreador (na figura 11, seria representada pela substância [x]).
Quando, porém, wi<<xi então ki é pequeno, indicando que a velocidade de percurso da
proteína aumenta, ou seja, a proteína fica menos tempo retida no material da coluna do que
solubilizada no líquido carreador (na figura 11, seria representada pela substância [*]).

Apoio:
 45

c) Diferenças no tamanho molecular: diálise, ultrafiltração, ultracentrifugação e

cromatografia em gel (Figura 12; separa as proteínas de acordo com o tamanho das
mesmas, ou seja da massa molar. Neste caso a coluna é empacotada com partículas de gel,
que possuem poros de tamanhos característicos. Moléculas maiores que estes poros, não
se difundem pelo gel, ao passo que as menores se difundem. Como conseqüência aquelas
passam mais rapidamente pela coluna do que estas, daí ocorrendo a separação).

[FIGURA 12]
Cromatografia em gel

SOLUTO DE SOLUÇÃO A SER

•)
MENOR MM (• CROMATOGRAFADA

LEITO FORMADO POR GEL DE

CORTE MOLECULAR
ADEQUADO (0)

SOLUTO DE MAIOR MM

Para concluir, lembra-se que os recursos de purificação utilizados relacionam-se ao

grau de pureza da enzima desejada e ao seu valor comercial.

2. BIBLIOGRAFIA

PESSOA-Jr, A., KILIKIAN, B.V. Purificação de produtos biotecnológicos. Barueri, SP, Manole Editora, 2005.

LIMA, U.A., AQUARONE, E., BORZANI, W., SCHMIDELL, W. Biotecnologia Industrial. Vol.3, Editora
Edgard Blucher, São Paulo, SP, 2001.

BLANCH, H.W., CLARK, D.S. Biochemical Engineering. Marcel Dekker, Inc., New York, USA, 1996.

GODFREY, T., WEST, S. Industrial enzymology. 2nd Ed., MacMillan Press LTDA, London, UK, 1996.

Apoio:
 46

CAPÍTULO 4
FONTES, PRODUÇÃO E APLICAÇÃO DE AMILASES
Doutora Luciana Leomil

1. AMIDO

O amido é um polímero de glicose de alta massa molecular, sendo juntamente com a

celulose, um dos polímeros de origem vegetal mais amplamente disponível na natureza
(BECK ZIEGLER, 1989). Ele pode ser armazenado em diferentes órgãos e tecidos vegetais,
como em plastídeos de folhas, frutos e no endosperma de cereais em uma estrutura bastante
complexa, formando grânulos que podem variar de 0,1 a 50 µm. Duas diferentes moléculas
podem compor o amido, a amilose e a amilopectina, sendo ambas polímeros da glicose
(BALL e MORELL, 2003). Os grânulos formados pelo amido são estruturas semicristalinas
com diversos tipos polimórficos, e o grau e o tipo da cristalinidade são dependentes,
principalmente, das características estruturais da amilopectina, sendo esta, o principal
componente de amido, embora a retrodegradação da amilose, possa produzir um tipo
específico de estrutura cristalina (ZHANG et al., 2005).
A amilopectina é uma molécula complexa e ramificada, de alto peso molecular, com
grau de polimerização de 105 e 106 unidades de glicose (BALL e MORELL, 2003). A
estrutura da amilose é composta por unidades de glicose em arranjo linear, com grau de
polimerização de 1.000 e 5.000 unidades, onde os monômeros de glicose são ligados por
ligações de α-1,4-glicosídicas, podendo conter ainda, 0,1% de ligações de α-1,6-glicosídicas
(KOSSMANN e LLOYD, 2000).
Ao ser hidrolisado, o amido produz carboidratos de cadeia curta, tais como dextrinas,
maltopentose, maltotretose, maltose e finalmente glicose (CRUEGER e CRUEGER, 1984).
Estes produtos derivados da hidrólise do amido podem ter diversas aplicações biotecnológicas
na indústria, como: xarope de glicose; xarope de maltose oriundo da isomerização ou
processos de liquefação e/ou sacarificação (BHAT, 1998); na indústria de panificação para
atrasar o envelhecimento do pão, melhorar textura, volume e sabor (SAHA e ZEIKUS, 1992);
nas indústrias de bebidas alcoólicas; na produção do álcool combustível, com os seus açúcares
fermentáveis; entre outras aplicações.

Apoio:
 47

2. AMILASES
As amilases são enzimas da família das hidrolases capazes de degradar o amido e seus
produtos de hidrólise e até sacarídeos menores. São amplamente distribuídas na natureza, e
podem ser produzidos por bactérias, fungos, plantas e animais. Estão entre as enzimas mais
importantes empregadas na indústria, devido à grande aplicação do amido e de seus derivados
em processos industriais.
Estas enzimas podem ser classificadas quanto ao seu mecanismo de ação ou a quanto o
tipo de ligação que hidrolizam. Quanto ao mecanismo de ação podem ser classificadas como
endoamilases (clivam ligações glicosídicas ao acaso no interior do polímero), ou exoamilase
(hidrolisam, sucessivamente, ligações glicosídicas a partir da extremidade não-redutora da
molécula) (GUPTA et al., 2003).
As amilases, quanto às ligações hidrolisadas, podem ser agrupadas em: glicoamilases,
α-amilases, β-amilases, isoamilases, pululanases, ciclodextrina glicotranferase e isomaltase.

2.1. α-Amilases
As α-amilases (EC 3.2.1.1 - 1,4-α-D-glucano, 4-glucano-hidrolases;) são endohidrolases
que rompem as ligações α, 1→4 da molécula do amido ao acaso, dando origem a
oligossacarídeos de baixo peso molecular e provocando rápida liquefação do amido (SAHA e
ZEIKUS, 1992). Os açúcares glicose, maltose, maltotriose, maltotetrose, maltopentose e
maltohexose foram identificados como produtos finais da ação α-amilase (CHANG e
SCWARTZ, 1988; CASTRO, 1992).
Estas enzimas são produzidas por uma variedade de organismos, incluindo bactérias,
fungos e leveduras, entretanto as enzimas derivadas de fungos e bactérias são as dominantes,
e dentre estes os principais produtores de α-amilases incluem o gênero Aspergillus e Bacillus
respectivamente (PANDEY et al., 2000).

2.2. β-amilases
As β-amilases (1,4-β-D-glucano malto hidrolase) é uma exohidrolase que cliva ligações
alternadas de -1,4 da porção não redutora da amilose e amilopectina para produzir a b-
maltose (BHAT, 1998). Esta enzima é incapaz de contornar as ligações glicosídicas do tipo β-
1,6, interrompendo sua atividade nos pontos de ramificação. O amido solúvel quando

Apoio:
 48

hidrolisado por esta enzima resulta na produção de 69% de maltose e β-dextrinas (BHAT,
1998).

2.3. Glucoamilase
Esta enzima também é chamada de amiloglucosidase (α-1,4-glucanglucano hidrolase), é
uma enzima sacarificante que produz unicamente glicose através da hidrólise das ligações
glicosídicas α-1,4 e α-1,6 removendo unidades de glicose consecutivamente a partir da
extremidade não redutora da cadeia de amido e de oligossacarídeos deixados pela ação da α-
amilases (OLIVEIRA et al., 1993). Os principais gêneros produtores de glucoamilase são:
Aspergillus e Rhizopus, sendo o Aspergillus niger o melhor produtor desta enzima (SAUER et
al.,2001).

2.4. Pululanase
As Pululanases (α-dextrinas 6-glucohidrolase) clivam as ligações do tipo α-1,6 nos
pontos de ramificação do amido e da amilopectina, fazendo a conversão em molécula de
amilose, que possuem somente ligações do tipo α-1,4. São industrialmente importantes e
geralmente são usadas em combinação com amilases sacarificantes, como: a glucoamilase, α-
amilases e β -amilases para a produção de xaropes, onde a pululanase é adicionada juntamente
com a glucoamilase para aumentar o teor de glicose, reduzindo o tempo de reação (BHAT,
1998).

2.5. α-D-Glucosidase
Esta enzima age nas ligações α-1,4 terminais do amido e libera D-glicose. A enzima
pode ainda clivar ligações terminais α-1,2, α-1,4 e α-1,6 de dissacarídeos e oligossacarídeos
liberando α-D-glicose. É uma enzima muito importante no processo de produção de xarope
com alto teor de glicose (BHAT, 1998).

2.6. EXO-(1-4-α-D)glucanase
Esta enzima libera tipicamente maltoligossacarídeos do amido. Estes
maltoligossacarídeos possuem um alto valor comercial e pode ser usado como suplemento
alimentar para crianças, idosos e pacientes clínicos (BHAT, 1998).

Apoio:
 49

2.7. Isoamilase
As isoamilases (glicogênio 6-glucano hidrolase) são capazes de hidrolisar ligações do
tipo α-1,6-D de amilopectina, glicogênio, dextrinas ramificantes e alguns oligossacarídeos.
Entretanto, tais enzimas não hidrolisam as ligações do tipo α-1,6 da pullulana e de b-dextrina-
limite. Tal característica é atribuída a sua baixa atividade às cadeias laterais curtas da
molécula de amido (ARA e ITO, 1993). As isoamilases são usadas pela indústria para a
produção de maltose e glicose a partir de amido em combinação com outras amilases.

2.8 Ciclodextrinases
As ciclodextrinases são enzimas que hidrolizam o amido formando estruturas circulares
denominadas de cliclodextrinas unidas por ligações glicosídicas do tipo α-1,4. Estes anéis
podem ser constituídos por 6, 7 e 8 unidades de glicose, sendo chamadas de α, β e
γ−cliclodextrinas respectivamente. Geralmente são enzimas extracelulares encontradas
principalmente em bactérias do gênero Bacillus (SAHA e ZEIKUS, 1992).

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ARA, K.S.K.; ITO, S. Purification and characterization of an alkaline isoamilase from alkalophic strain of
Bacillus. J. Gen. Micro., v.139, p. 781- 786, 1993.

BALL, S.G.; MORELL, M.K. From bacterial glycogen to starch: understanding the biogenesis of the plant starch
granule. Annu. Rev. Plant Biol., v. 54, p. 207-233, 2003.

BECK, E.; ZIEGLER, P. Biosynthesis and degradations of starch in higher plants. Ann. Rev. Plant Physiol.
Plant. Mol. Biol., v. 40, p. 95-117, 1989.

BHAT, M.K. Enzymatic processing of starch: presents and potential benefits. Sug. J., v. 100, p. 372-376, 1998.

CASTRO, G.R.; FERRERO, M.A.; ABATE, C.M.; MENDEZ, B.S.; SIFFERIZ, F. Simultaneous production of
alfa e beta amilase by Bacillus subtilis MIR-5 in batch and continuous culture. Biotech. Lett., v. 14, p. 49-54,
1992.

CHANG, P.L.; SCWARTZ, S.J. Characterization of the action of Bacillus subtilis alpha amylase on sweet
potato. Starch, amylose and amylopectin. J. Food Bioch., v. 12, p. 191-203, 1988.

CRUEGER, W.; CRUEGER, A. Biotechnology: a textbook of industrial microbiology. Madison: Science

Technology, Inc. Science Tech, Inc., 1984. 308p.

GUPTA, R.; GIGRAS, P.; MOHAPATRA, H.; GOSWAMI, V.K.; CHAUHAN, B. Microbial α-amylases: a
biotechnological perspective. Process Biochem., v. 38, p. 1599-1616, 2003.

Apoio:
 50

KOSSMANN, J., LLOYD, J. Understanding and influencing starch biochemistry. Crit. Rev. Plant Sci., v. 19, p.
171-226, 2000.

OLIVEIRA, I.M.A.; SILVA, F.T.; MARKES, T.A. Produção de Xarope de Frutose. Monografia da Faculdade
de Engenharia de Alimentos - UNICAMP, Campinas - SP, 80p., 1993.

PANDEY, A.; NIGAM P.; SOCCOL, C.R.; SOCCOL, V.T.; SINGH, D.; MOHAN, R. Advances in microbial
amylases. Biotechnol. Appl. Biochem.v. 31, p. 135-152, 2000

SAHA, B.C.; ZEIKUS, J.G. Cyclodextrin degradum enzymes. Starch, v. 44, p. 312-315, 1992.

SAUER, J.; CHRISTENSEN, T.; FRANDSEN, T.P.; MIRGORODSKAYA, E.; MCGUIRE,K. A.; DRIGUEZ,
H.; ROEPSTORFF, P.; SIGURSKJOLD, B.W.; SVENSSON, B. Stability and function of inter domain linker
variants of glucoamylase 1 from Aspergillus niger. Biochem., v. 40, p. 9336-9346, 2001.

ZHANG, P.Y.; WHISTLER, R.L.; BEMILLER, J.N.; HAMAKER, B.R. Banana starch: production,
physicochernical properties, and digestibility - a review. Carbohydr. Polym., v. 59, p. 443-458, 2005.

Apoio:
 51

ROTEIRO DE ATIVIDADE PRÁTICA

Meio LB 2x – 200 mL
Extrato de levedura 2g
Peptona 4g
NaCl 4g
Ágar Bacteriológico 6g
Amido 1% 2x 2 g para 200 mL de água destilada
Ou
Amido 0,5% 2x 1 g para 200 mL de água destilada

M.F.: fazer estes meios de cultura (LB) e Amido em frascos separados e autoclavar.
Depois, unir estes dois meios em um único frasco de 500 mL, e em seguida, verter os meios
nas placas. Semear as amostras e controles negativo (Escherichia coli ATCC 25922) e
controle-positivo (Bacillus liqueniformis ATCC 6348). Incubar em estufa por mais de 24
horas a 37ºC (LEDERBERG e LEDERBERG, 1951) e, em seguida, adicionar o revelador
(iodo sublimado) para a visualização da formação de halos (indicativo de atividade
enzimática).
A atividade enzimática dos clones serão estimadas semi-quantitativamente usando um
índice enzimático (IE) que expressa a relação do diâmetro médio do halo de degradação e o
diâmetro médio da colônia (HANKIN e ANAGNOSTAKIS, 1975). Ao testar as colônias
produtoras das referidas enzimas, os clones recombinantes escolhidos serão os que
apresentarem melhores índices enzimáticos, perante este ensaio.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

HANKIN, L.; ANAGNOSTAKIS, S.L. The use of solid media for detection of enzyme production by fungi.
Mycologia, v. 67, p. 597-607, 1975.

LEDERBERG, J., LEDERBERG, E.M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. Wisconsin, v.
63, p. 399-406, 1951.

Apoio:
 52

CAPÍTULO 5

FONTES, PRODUÇÃO E APLICAÇÃO DE PROTEASES

Doutora Ana Lúcia Figueiredo Porto

Potencial industrial das enzimas

A crescente necessidade da substituição da catálise pela biocatálise tem impulsionado um
aumento significativo no consumo de enzimas a nível internacional. A tecnologia enzimática vem
sendo utilizada em diversos setores industriais em processos tradicionais da indústria de alimentos,
farmacêutica e da indústria de química fina. A implementação da tecnologia enzimática resulta em
produtos de maior qualidade, obtidos por processos com menor consumo energético e de menor
impacto ambiental. O mercado mundial de enzimas industriais é estimado em US$ 2,3 bilhões,
correspondendo a aproximadamente 60% do mercado total de enzimas e tende a crescer a uma taxa de
5,7% ao ano (www.im.ufrj.br, 2008).
Neste mercado, as proteases constituem o grupo mais importante entre as enzimas industriais,
sendo responsáveis por cerca de 60% do total das enzimas comercializadas em todo mundo (Sana et
al., 2006) para utilização nos setores alimentícios (El-Beltagy et al., 2004), farmacêuticos (Tunga,
2003) e de detergentes (Moreira, 2002).

Proteases
Enzimas proteolíticas, proteases, proteinases ou peptidases são sinônimos utilizados para as
enzimas que catalisam as reações de hidrólise em ligações peptídicas de substratos protéicos
(Lehninger, 2002). As proteases executam uma grande variedade de funções nos organismos vivos,
compreendendo a ativação e a participação de cascatas biológicas, como na digestão, homeostasia e
inflamação em diversos sistemas, sendo imprescindíveis para o perfeito funcionamento celular
(Gavrilescu & Chisti, 2005).
Um tipo particular de proteases são àquelas que apresentam atividade colagenolítica e
que são chamadas de colagenases. Estas enzimas são capazes de degradar tanto moléculas de
colágeno nativo como desnaturado (Tran & Nagano, 2002). Em geral, outras proteases não
digerem a tripla hélice do colágeno, essa degradação só é possível através da ação de enzimas
específicas que requerem íons bivalentes para o desenvolvimento da sua atividade catalítica
sendo, portanto, classificadas como metaloproteases (Goshev et al., 2005).
As enzimas proteolíticas são essenciais em vírus, bactérias, fungos e parasitas para a
sua replicação como também para a propagação das doenças infecciosas (Chou, 2006) e
também estão presentes em vários tecidos de animais, plantas e microrganismos.

Apoio:
 53

Importância das proteases produzidas por microrganismos

A incapacidade das enzimas de origem vegetal e animal em satisfazer a demanda
mundial têm aumentado o interesse por enzimas de origem microbiana. Estes biocatalisadores
são produzidos por processos de baixo custo e apresentam um recurso renovável, pois a
biomassa resultante de determinados processos fermentativos pode ser utilizada como
fertilizante. A utilização destes biocatalisadores tem crescido devido aos avanços no campo da
microbiologia industrial, pelo fato da produção não estar condicionada às questões sazonais e
geográficas e ainda pela possibilidade do uso de matérias-primas pouco dispendiosas
(Rodrigues & Santánna, 2001).
Os microrganismos representam uma fonte atrativa de protease por poderem ser
cultivados em grandes quantidades, em um tempo relativamente curto, por métodos
estabelecidos de fermentação. Além disto, as proteases microbianas têm uma vida mais longa
e podem ser armazenadas sob condições ideais por semanas, sem perda significativa da sua
atividade. Em geral, as proteases microbianas são extracelulares, secretadas diretamente no
meio de cultura pelo produtor, simplificando assim o processo de “dowstream” da enzima
quando comparado com o processo daquelas obtidas de plantas e animais. Existe uma grande
diversidade de microrganismos produtores de proteases, como bactérias, fungos e leveduras,
entretanto somente alguns são considerados como produtores apropriados para a exploração
comercial (Gupta et al., 2002).

Classificação das proteases

De acordo com o Comitê Internacional de Nomenclatura “União de Bioquímica e
Biologia Molecular”, as proteases são hidrolases classificadas no subgrupo 4, do grupo 3 (E.
C. 3. 4). Estas enzimas têm classificação diversificada, não obedecem facilmente às regras da
nomenclatura, devido à diversidade de ação e estrutura. Com base no ponto de clivagem na
cadeia polipeptídica as proteases ou peptidases são grosseiramente subdivididas em dois
grupos: 1) Exoproteases, aquelas que clivam ligações peptídicas próximas às extremidades e;
2) Endoproteases, as que atuam nas regiões internas da cadeia polipeptídica (Monod et al.
2002).
De acordo com o grupo funcional presente no sítio catalítico, as endoproteases podem
ser classificadas como: serina proteases, cisteína proteases, aspárticas proteases e
metaloproteases; enquanto que as exoproteases são divididas com base no seu mecanismo de
ação em aminoproteases e carboxiproteases (Monod et al., 2002).

Apoio:
 54

As aminopeptidases atuam no terminal N livre da cadeia polipeptídica podendo liberar

um único resíduo de aminoácido (aminopeptidase), um dipeptídeo (dipeptídeo-peptidases) ou
um tripeptídeo (tripeptídeo-peptidases). As carboxopeptidases atuam no terminal C da cadeia
peptídica e liberam um único aminoácido ou um dipeptídeo. Baseado na natureza do
aminoácido, no sítio ativo da enzima, as carboxipeptidases podem ser divididas em três
grupos principais: serina carboxipeptidases, metalocarboxipeptidases e cisteína
carboxipeptidase (Rao et al., 1998).
Ainda em relação às endopeptidases, as serina proteases caracterizam-se pela presença
do grupo serina no sítio ativo. São numerosas e comumente encontradas em vírus, bactérias e
eucarióticas, sugerindo que estas enzimas sejam de vital importância para os organismos (Rao
et al., 1998).
As proteases aspárticas, também conhecidas como proteases ácidas, são
endopeptidases que dependem do resíduo ácido aspártico para a realização da atividade
catalítica (Rao et al., 1998).
As cisteína proteases são produzidas tanto por eucariotas como por procariotas, sendo
reconhecidas cerca de 20 famílias. A atividade de todas as cisteínas proteases depende do
centro catalítico que consistem na cisteína e histidina. Geralmente, as cisteína proteases são
ativas apenas na presença de agentes redutores como HCN (Rao et al., 1998).
As metaloproteases têm os mais diversificados tipos catalíticos das proteases. São
caracterizadas pelo requerimento de íons bivalentes para que ocorra atividade. Incluem
enzimas de variadas origens como toxinas hemorrágicas de cobras venenosas, termolisina de
bactérias e as colagenases (Rao et al., 1998).

Importância e aplicação das proteases

As proteases possuem uma grande variedade de aplicações, principalmente nas indústrias
farmacêuticas, de detergentes, alimentos e no desenvolvimento de tecnologias menos agressivas ao
ambiente. As proteases são um dos ingredientes padrão adicionado a todos os detergentes,
principalmente por causa da especificidade para alguns substratos constituintes do material a ser
removido. Na indústria de alimentos são amplamente utilizadas em laticínios, massas e na produção de
hidrolisados protéicos. Na indústria farmacêutica proteases são utilizadas em formulações como
auxiliares digestivos, combinações com antibióticos e para tratamento de lesões. Outras aplicações que
vem despertando bastante interesse é a substituição de compostos químicos na indústria e a utilização

Apoio:
 55

em processos de tratamento de resíduos industriais, além da grande utilização de proteases na pesquisa

científica.
Uma aplicação das proteases quem vem expandindo-se é na indústria do couro onde a protease
é utilizada para depilação e amaciamento da pele em substituição aos atuais processos que utilizam
produtos químicos, adequando-se assim à uma tendência mais recente de desenvolvimento de
tecnologias que não provoquem distúrbios ambientais.
As proteases são um padrão nos ingredientes de todos os tipos de detergentes, a partir destes,
são usados em detergentes domésticos, reagentes de limpeza de lentes de contato ou prótese dentária.
As proteases alcalinas são usadas na maior parte em detergentes em pó contendo
enzimas, e apresentam uso menor em processamento de alimentos, por exemplo,
melhoramento da cerveja e produção de proteínas hidrolisadas. Proteases ácidas têm um papel
importante no amaciamento da carne e na produção de alimentos fermentativos por fungos
encontrados na soja, arroz e outros cereais. Estas enzimas também são usadas na indústria de
fermento para modificação de proteínas do trigo para indústrias do pão e de derivados do leite
visando a melhoria da coagulação do leite para manufaturação do queijo. (Moreira et al.,
2001).
As proteases com atividade colagenolítica têm sido largamente utilizadas na medicina com o
propósito de limpar feridas necrosadas, escaras, cicatrizes pós-operatórias, e no tratamento de psoríase
e pediculoses (Markovich, 2008), em cicatrizes de queimaduras de crianças (Özcan et al., 2002), em
lesões de mamilos de mulheres em aleitamento (Kuşcu et al., 2002) e no tratamento de cicatrizes
hipertróficas (Cheng et al., 1999).

Metodologias aplicadas para a determinação da atividade proteásica

Atividade proteásica inespecífica
O método para determinação da atividade proteásica é realizada segundo Leigton et al. (1973)
modificado, utilizando azocaseína 1% (p/v) como substrato em tampão Tris-HCl 0,1M, pH 7,2. A
mistura do ensaio contendo 0,25 mL do substrato e 0,15 mL da solução contendo a enzima deve ser
incubada por 1 hora à temperatura ambiente (25ºC), sendo a reação interrompida pela adição de 1,2
mL de ácido tricloroacético 10% (p/v). As amostras devem ser centrifugadas por 10 minutos a 8000xg,
a 4ºC. Um volume de 0,8 mL de cada sobrenadante deve ser transferido para tubos de ensaio contendo
1,4 mL de hidróxido de sódio 1M. O ensaio deve ser realizado em duplicata e o branco preparado
substituindo a solução enzimática pelo mesmo volume de tampão Tris-HCl 0,1M pH 7,2. A leitura
deve ser realizada em espectrofotômetro com comprimento de onda de 440 nm.
Uma unidade de atividade da protease é definida como sendo a quantidade de enzima
requerida para produzir uma variação de absorbância igual a 1 durante 1 hora, sendo expressa em

Apoio:
 56

U/mL. A atividade proteásica específica é calculada pela razão entre a atividade proteásica e a
quantidade de proteína contida em 1 mL da amostra (U/mg).

Atividade proteásica específica para colagenases

A determinação da atividade colagenolítica é realizada segundo o método de Chavira
et al. (1984) modificado, utilizando azocoll como substrato. O azocoll deve ser dissolvido em
tampão Tris-HCl 0,1 M acrescido de 1mM de CaCl2, pH 7,2 a uma concentração final de
5mg/ml. Em seguida, 150 µl do extrato enzimático e 150 µl do tampão devem ser misturados
a 270 µl da suspensão do Azocoll e devem ser mantidos em banho-maria a 37 ºC sob agitação
durante 18 horas. Após a incubação as amostras devem ser centrificadas a 10.000 x g durante
10 minutos a 4 ºC e as absrorbâncias do sobrenadantes medidas em espectrofotômetro a 520
nm. A unidade de atividade da colagenase é definida como sendo a quantidade de enzima
requerida para produzir uma variação de absorbância igual a 0,1 durante 18 hora, sendo
expressa em U/mL.

Ação de inibidores
O efeito de substâncias inibidoras da atividade enzimática pode ser realizado
utilizando-se Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 1 mM como inibidor de
metaloproteases, Fenilmetilsulfonil fluoride 1mM (PMSF) para serino-proteases, Pepstatin A
1 mM para Aspartico-protease e Ácido Iodoacético 1 mM que inibe cisteino-protease. Cada
substância inibidora mantida em contato com a enzima por 30 min à temperatura de 37ºC,
promove-se a reação da atividade proteásica, comparando-se os resultados com o controle
contendo o substrato degradado pela enzima sem acréscimo de inibidor.

Apoio:
 57

CAPÍTULO 6
ACTINOMICETOS COMO FONTES DE BIOPRODUTOS
Doutor Takeshi Matsuura

Características Gerais
Actinomicetos é o nome genérico atribuído às bactérias do Domínio Actinobactéria,
cuja característica comum é a formação de micélio aéreo e/ou vegetativo em algum estágio de
seu ciclo de vida (McCarthy & Williams, 1990). Estes microrganismos representam um
grande grupo de bactérias ramificadas filamentosas, que formam uma estrutura micelial
semelhante a dos fungos filamentosos. A diferença básica entre estes microrganismos reside
na sua organização celular, na qual os actinomicetos são seres procarióticos, enquanto que os
fungos filamentosos são seres eucarióticos. As características essenciais da natureza
procariótica dos actinomicetos são a ausência de membrana nuclear, a ausência de organelas
citoplasmáticas e a presença de ribossomos 70S. Uma outra diferença comum, é em relação
ao diâmetro das hifas, onde nos actinomicetos, o diâmetro hifal máximo é de 2 µm, enquanto
que nos fungos filamentosos as hifas têm, ao menos, o dobro desta espessura.
Estas bactérias são na grande maioria aeróbias estritas, Gram-positivas com um alto
conteúdo de Guanina e Citosina (G + C), e formam filamentos ramificados ou hifas que
podem persistir como um micélio estável ou podem quebrar-se em elementos em forma de
bacilos ou em forma de cocos.

Distribuição e Ocorrência
Os actinomicetos ocorrem em uma grande diversidade de habitats naturais e artificiais,
crescendo em uma vasta variedade de substratos. O solo é o habitat mais comum para os
actinomicetos e estima-se que se encontram numa proporção de aproximadamente 1 milhão
de células por grama de solo. Embora a maioria seja saprófita estrito, alguns formam
associações parasíticas ou simbióticas com plantas ou animais.
Apesar do solo ser o principal habitat para os actinomicetos, estes também são
encontrados na água, em tecidos vegetais e em tecidos animais. A ubiqüidade dos
actinomicetos sapróbios em ambientes naturais é devido a dois fatores principais que são: a
diversidade metabólica e a evolução de mecanismos específicos de dispersão.

Apoio:
 58

O fato de que os actinomicetos estão tão bem adaptados para o crescimento sobre
substratos sólidos sugerem que sua ocorrência em ambientes aquáticos é meramente o
resultado de uma “lavagem”, mas para muitos taxa há evidências de crescimento sobre
material suspenso ou sedimentado.
A evidência atual sobre a atividade dos actinomicetos em ambientes naturais mostra
claramente que eles estão envolvidos em importantes processos em vários habitats, que
podem ser assim resumidos:
• degradação de plantas, animais e polímeros microbianos em solo e feno;
• degradação de hidrocarbonetos petrolíferos e outros produtos manufaturados em
ambientes terrestres e aquáticos;
• degradação de compostos, forragens e materiais correlacionados;
• indução de alergias respiratórias, particularmente entre trabalhadores da
agricultura;
• causadores de doenças de plantas;
• controle biológico de patógenos rizofílicos;
• fixação biológica do nitrogênio em nódulos de plantas não leguminosas;
• produção de sabor e odor em águas potáveis naturais.

Considerações Taxonômicas
Filogeneticamente, as bactérias Gram-positivas são divididas em 2 grandes grupos,
com maior ou menor proporção de Guanina + Citosina (G + C). O grupo com maior
proporção, 69-78%, são os actinomicetos e o grupo com menor proporção inclui os gêneros
Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus e
Mycoplasma.
Para a identificação genérica de um actinomiceto, são necessários dois estudos, os
estudos da micromorfologia, através de microscopia ótica e os estudos químicos.
Os melhores meios para a observação da morfologia dos actinomicetos são os meios
que contém nutrientes como hidrolisados de caseína, extrato de levedura ou amido.
As estruturas morfológicas utilizadas para diferenciar os gêneros de actinomicetos são:
presença de micélio aéreo e/ou micélio vegetativo; formação de conídios isolados, aos pares,
em cadeias curtas ou em cadeias longas; presença ou ausência de esporângios contendo

Apoio:
 59

esporos móveis ou não; formação de esporângio multilocular; e presença ou ausência de

esclerócio.
Considerando-se os estudos quimiotaxonômicos, duas partes da informação química
são muito úteis: (a) determinar qual o aminoácido dibásico (DAP)que está presente na parede
celular do desconhecido, a forma meso- ou a forma L-, e (b) determinar qual ou quais os
açúcares que estão presentes na célula hidrolisada.
A variação qualitativa de aminoácidos e açúcares, especialmente a variação na
estrutura primária do peptidoglicano de várias bactérias Gram-positivas, fornece informações
de grande valor taxonômico.

Aplicações biotecnológicas dos actinomicetos

De uma forma sucinta, os actinomicetos podem ser utilizados para a produção de
antibióticos de uso clínico e na obtenção de enzimas de interesse industrial, tais como
amilases, xilanases, fenoloxidades, etc.

Produção de antibióticos e outros metabólitos secundários

A primeira definição sobre antibióticos foi elaborada por Waksman (1945), que
definiu estes como sendo “substâncias químicas produzidas por microrganismos, possuidoras
de capacidade de matar ou inibir o crescimento de bactérias e outros microrganismos”. No
entanto, na busca de novos antibióticos tornou-se evidente que, embora os microrganismos
sejam os principais produtores desses compostos, outros organismos, tais como: algas,
liquens, plantas verdes e mesmo células animais produzem antibióticos. Atualmente, uma
definição plausível sobre antibióticos é a proposta por Lancini, Parenti & Gallo (1993) que
define como metabólitos microbianos de baixo peso molecular (massa molecular em torno de
alguns milhares) que em baixas concentrações (menos de 1 mg/mL) inibe o crescimento de
outros microrganismos.
A produção de 2/3 dos antibióticos de ocorrência natural são de actinomicetos. A
versatilidade biossintética de seu metabolismo pode ser comprovada, uma vez que dos 6.000
antibióticos de origem microbiana caracterizados, cerca de 60% deles são produzidos por
actinomicetos, enquanto que o restante são metabólitos de fungos e/ou bactérias. Vale
ressaltar que o gênero Streptomyces é responsável por 90% destes compostos com grande
aplicação prática na medicina humana e veterinária, na agricultura e na indústria de alimentos.

Apoio:
 60

Dentre os actinomicetos, o que mais desperta interesse científico é o gênero

Streptomyces, sendo a principal fonte de uma enorme variedade de antibióticos sintetizados,
seguido de Micromonospora, Nocardia, Streptosporangium e Actinoplanes. Desta forma,
tornaram-se de extrema relevância ao desenvolvimento de áreas ligadas a saúde, em especial
ao setor farmacêutico. Na tabela 3.1, observa-se os antibióticos utilizados comumente na
clínica médica produzidos pelos actinomicetos.
A produção de antibióticos não é rigorosamente espécie específica: o mesmo
antibiótico pode ser produzido por organismos pertencentes a diferentes espécies ou gêneros
ou até mesmo ordens. E o inverso também é verdadeiro, isto é, linhagens classificadas
taxonomicamente como membros de uma mesma espécie podem produzir diferentes
antibióticos. Entretanto, como regra geral, quanto mais distante os organismos são na escala
taxonômica, menor será a probabilidade que estes venham a produzir o mesmo antibiótico.
Depois dos antibióticos, as enzimas extracelulares são as substâncias mais importantes
produzidas pelos actinomicetos. Atualmente, as enzimas de origem microbiana tem sido
amplamente utilizadas no processamento de alimentos, na fabricação de detergentes, na
indústria têxtil e farmacêutica, substituindo gradualmente os processos químicos, com a
vantagem de não poluir o ambiente.
As enzimas de interesse industrial comumente produzidas pelos actinomicetos são
proteases, amilases, polissacaridases, invertases, celulases, fenoloxidases, lipases e esterases ,
no entanto, as sintetases vem alcançando um local de destaque nas pesquisas das áreas da
agricultura.

BIBLIOGRAFIA

GOODFELLOW, M. &amp; WILLIAMS, S. T. Ecology of actinomycetes. Annual Review of Microbiology, 37:

189-216, 1983.

HOLT, J. G., KRIEG, N. R., SNEATH, P. H. A., STALEY, J. T. &amp; WILLIAMS, S. T. Bergey’s manual of
determinative bacteriology. 9. ed. Baltimore: Williams &amp; Wilkins, 1994.

HALL, M. J. Microbial product discovery in the biotechnology. Bio/Technology, 7: 427-430, 1989.

Apoio:
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CAPÍTULO 7
FUNDAMENTOS DA TÉCNICA DE IMOBILIZAÇÃO
Doutor Michele Vitolo

1. INTRODUÇÃO
Como é do conhecimento geral, o ambiente celular (volume da célula ≈ 10-12mL) é
muito pequeno, obrigando as milhares de substâncias existentes em seu interior a interagirem
entre si.
Lembra-se, também, que das milhares de enzimas conhecidas até agora, a maioria
acha-se ligada a estruturas membranosas intracelulares.
Enfim, em seu habitat natural, que é o interior da célula, e onde apresentam suas
maiores atividades catalíticas, as enzimas atuam como catalisadores heterogêneos, ou seja, na
forma pouco solúvel.
Baseados neste fato, os pesquisadores resolveram mimetizar esta situação, através da
ligação da enzima a um material inerte por meio de métodos físicos e/ou químicos.
A técnica da imobilização, embora já tentada em 1916 por Nelson e Griffin
(imobilização da invertase em carvão ativo), adquiriu impulso a partir dos anos 60. Evoluiu
tanto que várias enzimas imobilizadas são encontradas no comércio atualmente. A glicose
isomerase imobilizada (SweetzymeR) – só para citar um exemplo - é usada na produção do
xarope de frutose a partir da glicose oriunda da hidrólise do amido.
Além das enzimas, imobilizam-se, também, células, organelas e fármacos.

2. TIPOS DE IMOBILIZAÇÃO
2.1. Aprisionamento (bom para imobilizar enzimas de alta massa molecular e células)
O aprisionamento consiste em separar o biocatalizador do meio reacional por meio de
um envoltório semipermeável. O material da película envolvente deve possuir porosidade
adequada para reter o biocatalisador e, ao mesmo tempo, deixar a passagem livre para
moléculas de baixa massa molar.
A imobilização por aprisionamento tem como vantagens principais, a saber, o mesmo
processo pode ser usado para imobilizar enzimas, células ou organelas; facilidade de
preparação da membrana envolvente semipermeável; a disponibilidade no mercado dos
materiais para confeccionar o suporte; o biocatalisador uma vez envolto pela membrana fica
protegido do ataque de hidrolases (sobretudo de proteases) e/ou de inibidores de alta massa

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 62

molar; o procedimento de imobilização não afeta seriamente a estrutura macromolecular do

biocatalisador. Entretanto, apresenta como principais desvantagens a não recuperabilidade do
suporte e de não poder ser usado para aprisionar enzimas que atuam sobre substratos de alta
massa molar.
A imobilização do biocatalisador, em particular da enzima, por este método pode ser
feita de três modos, a saber, enredamento, encapsulamento e microencapsulamento.

2.1.1. Enredamento
Através da polimerização de um monômero adequado em presença da enzima, o
catalisador acaba ficando retido entre as malhas do polímero solidificado. O suporte mais
usado é a poliacrilamida, obtida através da reação entre a acrilamida e a N,N-metileno-
bis(acrilamida). Pode ser considerado um método simples e aplicável para muitas enzimas.
De um modo geral, o procedimento consiste na dissolução da enzima em um tampão
contendo acrilamida (monômero) e a bisacrilamida (agente formador de ligações cruzadas),
sendo a polimerização iniciada por radicais livres gerados pela irradiação de UV na mistura,
após a adição de persulfato de amônio ou uma mistura de água oxigenada e sulfato ferroso.
A polimerização pode causar dois riscos à enzima. Primeiro, os monômeros e os
radicais livres podem reagir com grupos essenciais para a catálise provocando a inativação da
proteína e/ou da enzima. Segundo, a desnaturação pode ser provocada pelo calor gerado
durante a reação. Alfani et al., (1) contornaram o problema do superaquecimento, executando
a polimerização entre duas placas de vidro vedadas com tiras de silicone e mergulhadas em
banho de água a 5oC e irradiadas com UV, adaptando-se a lâmpada bem próxima à superfície
do banho. Um modo alternativo, seria conduzir a reação em sistema emulsionado de água em
solvente orgânico, sendo este último o responsável pela absorção do calor gerado. Neste caso,
o tamanho das gotas de água determinariam o tamanho das partículas de gel formadas (2).
Uma outra forma de reduzir a intensidade do calor gerado durante o aprisionamento
consiste no uso de um oligômero como reagente no lugar do monômero. Uma maneira de se
fazer isto é usar um prepolímero fotopolimerizável por UV como o dimetacrilato de
polietilenoglicol. O gel resultante é estável mecanicamente e inerte do ponto de vista químico.
Grupos funcionais extras podem ser introduzidos nos prepolímeros. Um método baseado na
mesma idéia é o uso de prepolímeros de uretano que se polimerizam em água liberando gás
carbônico, formando-se uma espuma de poliuretano, em cujo reticulado a enzima fica retida.
As propriedades finais do suporte são variadas através da escolha adequada do prepolímero de

Apoio:
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uretano de partida. As principais vantagens do uso de oligômeros seriam: a) o aprisionamento

é simples e se dá sob condições de reação suaves; b) inexistência de monômeros que podem
se unir à enzima, inativando-a; c) a estrutura da rede pode ser regulada através do uso de
oligômeros com cadeias de comprimentos diferentes; d) as propriedades físico-químicas do
gel, tais como a natureza iônica e o equilíbrio hidrófilo-lipófilo, podem ser alteradas através
do uso de prepolímeros sintetizados à parte, ou seja, antes da adição do biocatalizador.

2.1.2. Encapsulamento
Diversos polissacarídeos naturais, tais como alginato, agar e k-caragena, geleificam
sob certas condições e servem para aprisionar biocatalisadores em geral.
O alginato de sódio (copolímero linear dos ácidos D-manurônico e L-gulurônico), que
é solúvel em água, é misturado com uma solução ou suspensão contendo o biocatalisador,
sendo, a seguir, gotejada sobre uma solução de íon bivalente (Ca2+, Ba2+). Tão logo a mistura
contendo alginato entra em contato com a solução de íon bivalente forma-se um gel dentro do
qual o biocatalisador fica retido. O único cuidado, que deve ser tomado ao se usar um sistema
destes, é garantir a inexistência de agentes quelantes (fosfato, EDTA) no meio de reação, pois
na presença deles o gel vai se desarranjando e o biocatalisador acaba por se desprender e se
solubilizar. È um método de imobilização muito usado, por causa da sua simplicidade,
condições brandas de geleificação e a ampla disponibilidade do alginato de sódio no mercado.
A k-caragena é outro polissacarídeo de origem algal, hidrossolúvel e que gelifica ao
entrar em contato com íons K+ e NH4+. Caso na solução de caragenato tenha sido adicionado
um biocatalizador, este ficará retido no interior do gel. O enrijecimento adicional do gel pode
ser conseguido, adicionando-se glutaraldeído e/ou hexametilenodiamina, os quais podem,
também, contribuir na estabilização do biocatalisador.

2.1.3. Microencapsulamento
Enzimas podem ser imobilizadas em microcápsulas formadas por membranas
poliméricas permeáveis a substâncias de baixa massa molar e impermeáveis à enzima.
Basicamente há dois métodos de microencapsulamento. Em um deles o sistema emulsionado
é obtido pela mistura da solução aquosa da enzima com uma solução do polímero (nitrato de
celulose, etilcelulose, poliestireno, acetato de polivinila, por exemplo) em solvente orgânico.
A seguir, adiciona-se à mistura um segundo solvente, que causa a precipitação do polímero na
interface entre a microgota de água (onde a enzima se encontra) e a fase orgânica contendo o

Apoio:
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polímero. O outro método consiste em se emulsionar a enzima em um solvente imiscível com

a água contendo um monômero hidrofílico. Pela adição de um monômero hidrofóbico se dá a
polimerização na interface microgota/solvente imiscível. Por este segundo processo, tem sido
obtidas microcápsulas de nylon, poliéster, poliuréia e poliuretano.
A membrana semipermeável protege a enzima contra anticorpos e enzimas
hidrolíticas. A enzima pode ser estabilizada através da formação de ligações cruzadas com um
reagente bifuncional, antes de ser microencapsulada.
O microencapsulamento é um tipo de imobilização versátil, pois permite a inclusão no
mesmo sistema de várias enzimas, bem como de cofatores desde que estes estejam ligados a
polímeros hidrossolúveis.
No caso particular das microcápsulas serem de natureza hidrolipídica, onde as
camadas lipídica e aquosa estão dispostas alternadamente, recebem o nome de lipossomos. A
camada lipídica, em geral, é composta de lecitina de ovo, colesterol e um lipídeo, enquanto a
enzima está dissolvida na camada aquosa. Devido a sua permeabilidade seletiva, o lipossomo
pode proteger uma enzima contra íons metálicos inibidores, como no caso da β-D-glicosidase
que fica imune ao íon cobre (3). A manipulação da composição da membrana lipídica e a
incorporação de imunoglobulinas específicas para certas células oferecem promissoras
possibilidades de se confeccionar lipossomos que possuam a capacidade de interagir em uma
região específica do corpo.

2.2. Formação de ligações (bom para imobilizar enzimas em geral)

A proteína enzimática apresenta em sua estrutura resíduos de aminoácidos constituídos
por grupos ionizáveis e/ou hidrofóbicos com reatividade química variável. A isto, associa-se a
possível existência de pelo menos uma região da macromolécula – chamada de “domínio” -
com características hidrofóbicas. Estes resíduos de aminoácidos e/ou domínios podem
participar da interação da enzima com o suporte através de ligações fracas (adsorção),
covalentes simples ou covalentes cruzadas.

2.2.1. Adsorção
A adsorção consiste na adesão de um material biológico à superfície de um suporte
não funcionalizado especificamente para formar ligação covalente.

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 65

No planejamento dos experimentos de imobilização, geralmente, a adsorção é o

primeiro método a ser tentado, pois dando resultados, passa a ter preferência frente aos
demais métodos, já que é de baixo custo e fácil execução. Deve ser lembrado que,
historicamente, a primeira proposta efetiva de imobilização de uma enzima foi a adsorção da
mesma em um material inerte. Mais especificamente, a adsorção da invertase em carvão ativo.
As perspectivas inerentes à adsorção ensejaram o desenvolvimento de ampla variedade
de procedimentos aplicativos, dentre eles a produção de glicose a partir da celulose, usando-se
o próprio substrato como suporte para a celulase.
Entretanto, a primeira aplicação industrial de porte de um sistema imobilizado foi o da
aminoacilase adsorvida em DEAE-Sephadex para a separação de racemados de aminoácidos
obtidos por via sintética. O preparo da coluna, reator de leito fixo com alimentação no sentido
da gravidade, era feito introduzindo-se a suspensão aquosa de DEAE-Sephadex. Após a
sedimentação do suporte, fazia-se passar pela coluna uma solução de aminoacilase em tampão
fosfato (pH 7,0). Uma vez retida a enzima no suporte, o sistema era lavado profusamente com
água deionizada. A seguir, era feito passar uma solução racêmica das formas aciladas D e L
do aminoácido, resultando no efluente uma mistura do L-aminoácido e do D-acil-aminoácido,
os quais eram, a seguir, separados por cristalização fracionada. A coluna manteve mais de
60% da atividade enzimática inicial após 32 dias de operação a 50oC e pH 7,0. Neste caso, a
adsorção da enzima foi devida à interação dos amino grupos da superfície do suporte e os
grupos carboxila da proteína. Para restaurar a atividade enzimática, era suficiente adicionar à
coluna uma solução recém preparada de aminoacilase. Em termos econômicos, o processo
apresentou a grande vantagem de permitir o uso da mesma quantidade de suporte por um
período de dois anos, sem que o mesmo perdesse poder adsorvente e nem tivesse desarranjos
estruturais, que conduzissem à perda de enzima durante a reação.
Embora este tipo de imobilização seja fácil de executar, os mecanismos envolvidos na
união suporte/enzima são complexos, pois envolvem vários tipos de ligações não covalentes
atuando simultaneamente, a saber, pontes de hidrogênio, forças de Vander Waals, interações
dipolo-dipolo, forças eletrostáticas, forças hidrofóbicas. Todas estas ligações são rompidas
com facilidade através da variação do pH, da força iônica, temperatura e da natureza do
solvente. A fraqueza da interação suporte/enzima é o fator responsável pela fragilidade
apresentada por este tipo de sistema imobilizado. Para que o mesmo seja estável é
indispensável que as condições de adsorção da enzima ao suporte sejam idênticas às do
sistema reacional no qual se utilizará o sistema imobilizado. Caso a interação suporte/enzima

Apoio:
 66

seja de natureza essencialmente iônica, uma ligeira mudança do pH ou da força iônica do

meio de reação será suficiente para causar a desorção da proteína. Para otimizar a interação
enzima/suporte é necessária a disponibilidade de uma grande área superficial, que pode ser
conseguida escolhendo-se um suporte poroso ou, se utilizado um suporte de baixa porosidade,
que o mesmo seja constituído por grânulos os menores possíveis. Por exemplo, a fosfatase
ácida, ativa em pH 5,0, manteve-se estável em um meio reacional tamponado (2M acetato-
ácido acético, pH 5,0) quando foi adsorvida em CM-celulose. No caso de suportes porosos a
desorção da proteína é dificultada, principalmente se o tamanho médio dos poros é cerca de
duas vezes maior que o diâmetro médio das moléculas de proteína. Lembra-se que em um
suporte poroso, a distribuição das moléculas da proteína adsorvida não é uniforme ao longo de
sua superfície. Em todo o caso, o suporte escolhido deverá ser tal que as moléculas de enzima
fiquem o mais próximo possível da superfície do suporte, mas internalizadas em seu interior o
suficiente para serem preservadas contra os agentes desnaturantes.
As quantidades relativas de enzima e suporte para o máximo de adsorção devem ser
analisadas. Em princípio, seria razoável supor que quanto maior fosse a quantidade de enzima
maior deveria ser a saturação do suporte, se sua quantidade fosse mantida constante. Isto
geralmente se observa. Contudo, se o suporte estiver saturado de enzima, a quantidade do
catalisador disponível para interagir com o substrato pode depender da difusão deste até o
sítio ativo, já que a reação se dá preferencialmente com as moléculas de proteína nas camadas
superficiais. Daí, a eficiência catalítica da enzima diminui.
No que se refere à interação suporte/enzima devem ser considerados, ainda, os
seguintes aspectos: a) a ocorrência de reações colaterais à medida que a enzima se adsorve no
suporte, sobretudo se o catalisador tem estrutura quaternária e/ou um grupo prostético, ou
seja, a porção não protéica e/ou uma das cadeias peptídicas interagem em separado com o
suporte, desarranjando a estrutura conformacional normal da enzima, causando perda
significativa de seu poder de catálise; b) a ligação da enzima ao suporte se dar através de um
aminoácido de seu sítio ativo, indispensável para a catálise; c) a temperatura durante a
adsorção poderá acelerar a união suporte e enzima, devido ao aumento da difusão, e reduzir
perdas de atividade, desde que a mesma seja mantida dentro da faixa de estabilidade ótima.
A adsorção pode ser melhorada tanto pela modificação da enzima quanto do suporte.
Por exemplo, a quitina de krill tratada com CS2 mostrou maior poder adsorvente do que a
quitina não tratada (3). Isto foi explicado pela conversão de 30% dos amino grupos do suporte
em grupos ditiocarbamino, os quais tendo carga negativa, conseguem se ligar a grupos de

Apoio:
 67

resíduos de aminoácidos da proteína, tais como amino, guanidino, indol, imidazol e tiol. Os
amino grupos originais só interagiriam com os grupos carboxila da proteína. Por isso, um
número maior de interações tornou-se disponível na quitina tratada. Dentre os vários
exemplos disponíveis pode ser citada a adsorção da β-amilase da soja sobre fenilborato-
agarose (4).
A interação hidrofóbica pode ser melhorada introduzindo-se na proteína cadeias
laterais de caráter hidrofóbico, como a metil-4-fenil-butirimida.
A estabilidade da enzima adsorvida pode ser melhorada através da criação de ligações
cruzadas adicionais, usando-se um reagente bifuncional, como o glutaraldeído. Rucka e
Turkiewicz (5) estabilizaram a lípase em membrana de politetrafluoroetileno através do
entrelaçamento com glutaraldeído, sendo este, um método barato, atóxico e de fácil execução.
O glioxal e o formaldeído, também, podem ser usados. A atividade antimicrobiana destes
compostos é útil na sanitização do sistema imobilizado durante o uso. Este tipo de processo de
imobilização, pode ser considerado do tipo misto, no qual parte da proteína estaria adsorvida e
parte ligada covalentemente ao suporte.
Finalmente, deve-se lembrar que uma ampla variedade de suportes tem sido usada na
imobilização por adsorção, dentre eles citam-se: alunina arenosa, amberlite CG-50, bentonite,
gel de fosfato de cálcio, carvão ativo, CM-celulose, CM-sephadex, colágeno, DEAE-celulose,
DEAE-Sephadex, vidro com porosidade controlada, sílica gel, quitina, quitosana e agarose.

2.2.2. Ligações Covalentes

O estabelecimento da ligação suporte insolúvel/enzima se dará entre os grupos
reativos existentes no suporte e os grupos dos resíduos de aminoácidos localizados na
estrutura protéica, de preferência, em posições não estratégicas para a catálise.
Os principais grupos dos resíduos de aminoácidos são o ε-amino da lisina, a sulfidrila
da cisteína, a β-carboxila do ácido aspártico, o γ-carbonil do ácido glutâmico, a hidroxila da
tirosina e as hidroxilas da serina e treonina. Os grupos amino, carboxil e hidroxil são alvos
preferenciais, devido ser abundantes nas proteínas em geral.
Normalmente a imobilização é feita em duas etapas. Na primeira, o suporte é tratado
com um reagente capaz de ativar seus grupos funcionais. Após a remoção do excesso de
ativador, o suporte e a enzima são postos em contato. A mistura é deixada sob condições

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brandas de temperatura (no máximo igual à do meio ambiente) por um dado tempo, a fim de
que as ligações covalentes entre o suporte e a enzima se estabeleçam.
O uso da ligação covalente para imobilizar enzimas possui como vantagens, a saber, a
ligação forte entre a enzima e o suporte; a fácil interação enzima/substrato devido à
localização superficial do catalisador; o aumento da termoestabilidade em decorrência da forte
interação com o suporte; o aumento da estabilidade operacional (por exemplo, resistência às
forças de cisalhamento), tornando mais flexível a escolha do reator a ser empregado.
Entretanto, as desvantagens apresentadas por este tipo de imobilização, também,
devem ser lembradas: a susceptibilidade de estruturas ativas da macromolécula aos reagentes
utilizados e/ou às tensões conformacionais impostas pela união forçada a um material
estranho (suporte); a atividade catalítica pode diminuir devido à forte ligação existente entre o
suporte e a enzima, podendo, por exemplo, tolher ao catalisador a capacidade de assumir
modificações estruturais adequadas, que favoreçam o encaixe perfeito do substrato em seu
sítio ativo; dificuldade de se estabelecer as melhores condições de imobilização; não é
adequada para imobilizar células; os suportes usados não são recuperáveis com facilidade.
Este tipo de imobilização pode ser escolhido no caso em que a enzima for cara e
termolábil. Em geral, as enzimas utilizadas em métodos analíticos enquadram-se nesta
situação.
O contato covalente entre o suporte e a enzima pode ser feito segundo inúmeras vias
de síntese orgânica, citando-se, dentre elas, a diazotação, a reação com brometo de
cianogênio, a condensação, a alquilação, a silanização e os derivados azídicos.

2.2.3. Ligações cruzadas

Neste tipo de imobilização as moléculas de enzima são covalentemente ligadas uma às
outras por meio de reagentes bifuncionais (por exemplo, glutaraldeído, ácido bis-
diazobenzidina-2,2”-dissulfônico, 4,4’ difluoro-3,3’ dinitrodifenilsulfona, diazobenzidina,
tolueno-2,4-diisotiocianato e hexametilenodiisocianato).
O reagente bifuncional pode atuar agregando as macromoléculas entre si até a
formação de agregados insolúveis (ligação covalente cruzada pura). Entretanto, o mais
comum é o uso associado do intercruzamento com outros tipos de imobilização, obtendo-se,
com freqüência, um aumento significativo na estabilidade do catalisador. Neste caso, o
reagente bifuncional estabelece uma ponte de união entre a enzima e o suporte, com os quais
forma ligações covalentes análogas. Por exemplo, a diazobenzidina, que possui dois grupos

Apoio:
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azo em ambos os extremos da molécula, reage com grupos fenilas livres presentes na enzima
e com grupos amino existentes no suporte.
O reativo bifuncional pode ser adicionado tanto à enzima previamente adsorvida no
suporte, quanto à enzima livre com posterior adsorção ao suporte. Outra possibilidade, seria
misturar primeiro o suporte com o regente bifuncional, seguida da adição da enzima.
Finalmente, merece lembrança a possibilidade de se ligar a enzima a um polímero que
é solúvel nas condições de ação da enzima, mas que se torna insolúvel quando uma das
condições de reação é modificada, sobretudo o pH. Takeuchi e Makino (6) imobilizaram por
intercruzamento a celulase com o ácido poli-L-glutâmico, o qual é solúvel em pH 4,5 mas
insolúvel em pH 3,0.

3. SUPORTES
Muitos materiais sólidos ou geliformes podem ser usados como suportes para a
imobilização. Os requisitos básicos para um material ser considerado um suporte adequado
são: a) as características físicas do suporte devem ser adequadas para uso no reator
selecionado; b) manter a estabilidade química e mecânica sob as condições operacionais; c)
conter grupos químicos capazes de se ligarem ao biocatalisador; d) o material constituinte do
suporte deve permitir a obtenção de partículas com dimensões variadas, a fim de que se possa
alcançar um ponto de equilíbrio entre a redução de efeitos difusionais e a operacionalidade do
reator, sobretudo quando este for do tipo leito fixo; e) porosidade compatível com as
dimensões do biocatalisador a ser imobilizado; f) resistência aos microrganismos; g)
estabilidade térmica; h) permitir a regeneração.
Como se depreende do item anterior a diversidade e as características dos suportes são
muito variadas, sendo a origem dos mesmos tanto inorgânica quanto orgânica. Grosso modo e
de acordo com a morfologia, eles podem ser divididos em suportes não porosos e porosos.
Estes últimos, por sua vez, podem ser sólidos de porosidade controlada (poros com diâmetros
homogêneos e distribuídos regularmente pela superfície do material) ou irregular (poros com
diâmetros heterogêneos) ou ainda, géis semi-permeáveis (estrutura reticular, película
envolvente ou copolímeros).
Em conjunto com a morfologia básica do suporte, pode-se usar uma variedade de
configurações, a saber, pós, fibras, membranas, dentre outras.
Os suportes não porosos apresentam como principal vantagem a acomodação das
moléculas de enzima, apenas, na sua superfície externa, o que facilita a interação do

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catalisador com o substrato. No entanto, a pequena área superficial apresentada por estes
suportes é sua mais notória desvantagem, embora possa ser minimizada, usando-se material
com alto grau de cominuição. Contudo, ainda neste caso, poderão persistir problemas
relacionados à remoção das partículas do meio reacional e/ou à limitação da razão de fluxo no
reator.
O suporte poroso, por sua vez, possui grande área superficial, desde que a distribuição
das moléculas protéicas se dá tanto na face externa quanto interna dos poros. Grupos químicos
carregados localizados dentro dos poros poderão facilitar ou dificultar a catálise, dependendo
se o substrato é ou não ionizável nas condições de reação. Este fato poderá ser capitalizado
favoravelmente para a catálise através de um planejamento adequado, levando em conta os
tipos de enzima e do reator a serem empregados. Deve ser lembrado que problemas
difusionais podem surgir ao se usar suporte poroso, pois o substrato além da solução para a
superfície do suporte, deverá difundir-se, também, através dos poros, porque boa parte das
moléculas do catalisador estão situadas no interior dos mesmos. Aliás, o peso molecular do
substrato passa a ser um fator decisivo no rendimento da reação. Entretanto, a localização
interna da enzima confere-lhe uma proteção maior frente à eventual turbulência no meio de
reação.
Outro ponto a ser considerado relaciona-se à estabilidade dimensional do material
constituinte do suporte, ou seja, se é rígido (inorgânico) ou elástico (orgânico). A estrutura
rígida tem como vantagens a não deformação da matriz quando compactada em reatores do
tipo coluna, a proteção da enzima contra forças de cisalhamento e colaborar na manutenção da
estrutura terciária da proteína. O suporte elástico oferece a vantagem de poder ser empregado
sob a forma de membranas finas, possuindo grande área superficial e oferecendo baixa
resistência difusional. Contudo, devido a sua flexibilidade pode sofrer deformações durante o
uso e com isto afetar a estrutura conformacional da enzima.
Finalmente, o interesse crescente pelas biotransformações tem promovido um aumento
na disponibilidade comercial de suportes e de agentes ativadores e bifuncionais. Para a
imobilização por ligações covalentes dispõe-se para a aquisição, dentre outros, dos produtos:
caolin ativado com glutaraldeído (Biofix®), poliacrilamida derivatizada (Enzacryl®), vidro de
porosidade controlada (Glycophase®), kieselguhr ativado com glutaraldeído (Macrosorb®) e
Sepharose®. A vantagem de se dispor destes materiais já prontos, reside no fato de ser
desnecessário usar métodos de ativação, que em geral empregam reagentes tóxicos. Um

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 71

exemplo importante é a Sepharose ativada com BrCN, a qual vem sendo usada há anos como
suporte para imobilização.
A escolha do método de imobilização dependerá, basicamente, de dois fatores:
a) características do biocatalisador, que governará a escolha do tipo de imobilização; b)
destino que será dado ao sistema imobilizado.
Não existe um binômio suporte/tipo de imobilização geral, o qual só poderá ser
estabelecido empiricamente. Contudo, o empirismo nesta área tenderá a diminuir à medida
que uma área recentemente criada, a engenharia de proteínas, for sendo desenvolvida e
aprimorada.

4. EFEITOS CAUSADOS PELA IMOBILIZAÇÃO

4.1. Efeitos estéricos e conformacionais
Quando a enzima é ligada ao suporte pode sofrer alguma mudança na conformação, o
que poderá abalar sua eficiência catalítica. Além disso, como o processo de interação enzima-
suporte é quase sempre aleatório, poderá suceder que a região do sítio ativo se torne menos
acessível ao substrato (impedimento estérico), o que acarreta, também, uma queda da
eficiência catalítica. Estes efeitos, ainda, não foram corretamente equacionados.

4.2. Efeitos de difusão e transferência de massa

Quando a enzima é imobilizada sobre ou dentro de um suporte sólido, o substrato deve
se difundir do seio da solução até o sítio ativo da enzima. Assim, quando a velocidade de
difusão do substrato é menor do que a velocidade de transformação pela enzima, a velocidade
observada é mais baixa do que a esperada para uma dada concentração de enzima em solução,
visto que nem todas as moléculas de enzima estarão em contato com o substrato, isto é, não se
atinge a saturação.
Este fenômeno pode ser quantitativamente expresso pelo chamado fator de efetividade
(f). Este fator é definido como sendo a razão entre a velocidade observada (v’) e a esperada
(v):

Apoio:
 72

f = v’/v (1)

Se a reação obedece à equação :

v = [Vmax.(S)] ÷ [KM + (S)] (2)

Então, substituindo a equação (2) na (1):

v’ = f {[Vmax.(S)] ÷ [KM + (S)]} (3)

ou, tomando os inversos de ambos os membros da eq. (3), tem-se:

(1/v’) = [KM/(S).f.Vmax] + (1/f.Vmax) (4)

A eq. (4) poderá ou não representar uma relação linear, porque “f” é função da
concentração do substrato.
Existem basicamente dois tipos de resistências difusionais:
a) Resistências difusionais externas: surgem devido ao fato de que o substrato deve ser
transportado do seio da solução até a superfície de catálise, devendo, por conseguinte,
atravessar uma camada líquida. É claro que a transformação do substrato somente ocorre após
o mesmo ter alcançado a superfície do catalisador, sendo que o consumo de substrato através
da membrana líquida pode ser imaginado como resultado de um gradiente linear. Estes efeitos
podem ser minimizados quer aumentando-se a agitação da suspensão quer aumentando-se a
velocidade de fluxo do substrato;
b) Resistências difusionais internas: surgem devido à movimentação do substrato no interior
do meio catalítico poroso. Neste caso a difusão ocorre simultaneamente com a reação, o que
provoca um comportamento não linear das variações dos gradientes de concentração do
substrato no interior do sistema imobilizado.

Apoio:
 73

4.3. Efeitos da circunvizinhança

É esperado que ao se ligar a enzima em um suporte sólido inerte, ela ficará submetida
a uma circunvizinhança algo diferente do que quando se encontrava solubilizada. Este fato
poderá se refletir sobre os valores dos parâmetros cinéticos (Vmax, KM).
Os efeitos da circunvizinhança, que dependem da natureza física e química do suporte,
podem acarretar uma distribuição desigual do substrato, produto e cofatores entre a região
vizinha ao sistema imobilizado e o resto da solução. Um exemplo desta influência é o caso
das interações eletrostáticas e/ou hidrofóbicas entre o suporte e as espécies químicas de baixa
massa molar, o que torna os parâmetros cinéticos dependentes da concentração das mesmas.

4.4. Partição
O comportamento cinético de uma enzima presa a um suporte carregado pode diferir
daquele apresentado pela enzima livre, mesmo que os efeitos difusionais estejam ausentes.
Este comportamento pode ser atribuído ao fato de que a concentração de espécies químicas
(substrato, íons, produto,...) nas proximidades da enzima é diferente daquela do resto da
solução, devido às interações eletrostáticas daqueles elementos com as cargas do suporte. O
efeito de partição pode ser tido como um exemplo dos efeitos da circunvizinhança.

ψ)
(ψ
A linha tracejada verde representa a fronteira entre a
E região dentro da qual as moléculas de enzima (E) estão
próximas ao suporte eletricamente carregado (ψ) e o seio
da solução. As grandezas representadas em vermelho
referem-se àquelas relacionadas ao ambiente
(microambiente) dentro do qual as moléculas de enzima
se encontram e as representadas em azul àquelas
relacionadas ao seio da solução. Os círculos
amarelos representam a espécie química (íons
hidrônio e/ou moléculas de substrato
ionizadas)

Vamos considerar o caso em que a espécie química é o íon hidrônio (H3O+).

Sejam: *µ = potencial eletroquímico do microambiente; *µ = potencial eletroquímico do seio
da solução; µ = potencial químico do microambiente; µ = potencial químico do seio da
solução; z = carga elétrica da espécie química carregada; ψ = carga eletrostática do suporte; K

Apoio:
 74

= constante de Boltzman; T = temperatura absoluta; a = atividade da espécie química; µo=

potencial químico padrão da espécie química carregada (é um parâmetro característico da
substância e independe da região do sistema em que se encontra).
Quando o sistema está em equilíbrio, tem-se: *µ = *µ (5)
Mas: *µ = µ + zψ (6) *µ = µ (7)
µ = µo + KT.Ln a (8) µ = µo + KT.Ln a (9)
Substituindo as equações (6) e (7) na Eq. (5), temos:
µ + z.ψ = µ (10)
Substituindo as Eqs. (8) e (9) na (10) e lembrando que z = 1 (o íon hidrônio só tem uma
carga), temos
- Ln a – (-Ln a) = ψ/K.T ou pH – pH = (ψ.0,43)/K.T (11)
Pela equação (11) nota-se que devido às cargas do suporte o pH na região circunvizinha à
enzima é diferente do pH do resto da solução. Caso fossem traçados os gráficos pH x
atividade tanto para a enzima livre como para a mesma na forma imobilizada, os perfis
obtidos não seriam coincidentes.
Da equação (11) observa-se que: a) suporte aniônico: como ψ < 0, logo ψ/KT < 0 e
pH < pH; b) suporte catiônico: ψ > 0, logo ψ/KT e pH > pH.
Vamos considerar o caso em que a espécie química carregada seja o substrato da
enzima.
Por meio de argumentos análogos ao caso da partição dos íons hidrônio, tem-se para o
substrato carregado
S = S.(e)(-zψ/KT) (12)
Onde: S = concentração do substrato no microambiente; S = concentração do substrato no
seio da solução; z = carga elétrica do substrato.
Considerando que a enzima obedeça à equação:
v’= Vmax.S /(KM + S) (13)
Substituindo a Eq. (12) na (13), tem-se:
v’= [Vmax.S .(e)(-zψ/KT)] ÷ [KM + S.(e)(-zψ/KT) (14)
Se S = KM.(e)(zψ/KT) então v = Vmax/2 . Por conseguinte, a concentração de substrato no seio
da solução (S) que leva à metade da velocidade máxima, corresponde a uma constante de
Michaelis aparente (KM’) relacionada com o KM através da relação:
KM’ = KM.(e)(zψ/KT) (15)

Apoio:
 75

Esta última equação, mostra claramente que o potencial eletrostático do suporte

interfere diretamente sobre o KM e, por extensão, na performance catalítica da enzima.
Lembra-se, também, que o efeito de partição pode ser usado como um agente
facilitador da atividade catalítica da enzima, bastando utilizar suporte e substrato de cargas
opostas. O efeito atrativo faz com que as moléculas de substrato ionizadas tendam a se
acumular no microambiente e ser transformadas em moléculas do produto.

5. VANTAGENS E DESVANTAGENS DA TÉCNICA DE IMOBILIZAÇÃO

5.1. Vantagens
a) Reaproveitamento da enzima ou da célula;
b) Uso de processo contínuo
c) Aumento da estabilidade

5.2. Desvantagens
a) União aleatória do suporte com a enzima;
b) Inexistência de um método geral de imobilização;
c) Alto grau de pureza da enzima a ser imobilizada;
O importante a destacar é o fato de que quando a imobilização funciona bem,
consegue-se reduzir o custo global de um processo industrial em até 50%.

6. APLICAÇÕES
6.1. Reatores Enzimáticos
6.1.1. Introdução
Define-se biorreator como sendo um reator químico convencional adaptado para
operar com biocatalisadores (células, enzimas, organelas). O reator enzimático, portanto, é um
biorreator onde a reação é catalisada por uma enzima.
A primeira questão que surge ao se pensar em empregar um biorreator em um
determinado processo é avaliar a conveniência de se utilizar a enzima isolada no lugar da
célula da qual a enzima foi obtida. Para tanto, devem ser considerados os aspectos: a)
formação ou não de subprodutos pelas células; b) o produto de interesse ser ou não
consumido pela célula; c) os custos relacionados com o isolamento, produção e, eventual
imobilização da enzima; d) a origem da enzima, se extracelular (mais barata e disponível em

Apoio:
 76

grandes quantidades) ou intracelular (mais cara e disponível em pequenas quantidades); e)

exigência ou não de algum cofator pela enzima.
Caso se conclua que o uso da enzima em um biorreator seja adequado, então deve-se
avaliar a conveniência de se empregar a enzima na forma solúvel ou imobilizada. Neste caso,
os aspectos a serem considerados são: a) alteração do perfil catalítico da enzima após a
imobilização; b) o tipo de processo no qual a enzima vai ser utilizada (por exemplo, no
processo de amaciamento de carnes somente o uso da enzima na forma solúvel tem
importância); c) a estabilidade operacional apresentada por ambas as formas da enzima; d) a
origem da enzima, se extracelular (pode ser usada na forma solúvel ou imobilizada) ou
intracelular ( usada na forma imobilizada).

6.1.2. Tipos de Reatores Enzimáticos

Os reatores enzimáticos podem ser divididos em dois grandes grupos, a saber,
descontínuos (incluindo a variante descontínuo-alimentado) e contínuos. Os contínuos, por
sua vez, podem ser do tipo leito agitado ou fixo.
Os fatores a serem considerados para escolher o tipo de reator são: a) modo de
operação: descontínuo (mais barato e de multi-uso) e contínuo ( mais caro e desenhado para
um processo específico); b) custo do catalisador frente ao custo total do processo; c)
estabilidade da enzima ao longo do processo; d) requisitos operacionais, a saber, possibilitar
pleno controle do pH e da temperatura, permitir operar em concentrações não inibitórias de
substrato, ser adequado frente às características da matéria-prima (por exemplo, o reator
contínuo de leito fixo seria inadequado se a matéria-prima a ser processada contiver sólidos
insolúveis) e permitir a substituição do catalisador desgastado pelo uso sem interrupção do
processo (por exemplo, o reator continuamente agitado é muito versátil nesta situação).

6.1.3. Cinética de Reatores Enzimáticos

Sejam as equações fundamentais:
v = (Vmax . S)/ (KM + S) (1) (1/v) = (KM/Vmax). (1/S) + (1/Vmax) (2)
(Equação do balanço material) : RA – RS – Rc = RE (3)

Onde RA (vazão mássica de alimentação de substrato; Kg/h), RS (vazão mássica de retirada de

substrato; Kg/h), RC (razão de consumo do substrato no reator, devido à reação; Kg/h) e RE
(razão de variação do substrato no reator; Kg/h).

Apoio:
 77

6.1.3.1. Reator Descontínuo (RA = RS = 0)

RA (Kg/h)

So

VB S M

RS (Kg/h)

Sejam:

m = massa inicial de substrato (Kg)

M = massa total do sistema em reação (Kg)

VB = volume da mistura em reação dentro do reator (L)
x’ = (massa de S consumida / M) (4)
x = (massa de S consumida / m) (5)
Logo a Eq. 2 fica:
- RC = RE (6)
Mas Rc = v.VB e RE = - M. (dx’/dt)

Substituindo na Eq. 6, tem-se:

x'
t = M / VB .∫ dx' / v (7) (Equação de projeto do reator)
0

Igualando as Equações (4) e (5) :

M.dx’= m.dx ∴ dx’= (m/M).dx (8)
Substituindo a Eq. (8) na Eq. (7):
x
t = S0 .∫ dx / v (9)
0

Reescrevendo a Eq. 5 como segue:

x = (S0 – S)/S0 ∴ S = S0 . ( 1- x ) (10)
Substituindo as Eqs. (2) e (10) na (9):
x x
t = K M / Vmax .∫ dx /(1 − x) + S0 / Vmax .∫ dx
0 0

Integrando:
t = (x.S0/Vmax) – (KM/Vmax). Ln (1 – x) (11) (Equação de processo)

Apoio:
 78

6.1.3.2. Reator Contínuo (regime permanente; (RE = 0)

A(Kg/h) → RA→ RS→ mistura

(Kg/h)→

x’e x’S

x’ (x’+dx’)

Sejam:

x’ = (massa S consumida / A) e XS = (massa de S alimentada / A)

Assim sendo, a Eq. (3) se transforma em:

RA – RS – RC = 0 (12)
Sabendo que:
RA = A. XS - A.x’
RS = A.XS - A. (x’+ dx’)
RC = v. dVR
E substituindo na Eq. (12):
(dVR / A) = dx’/ v
x'
VR / A = ∫ dx' / v (13) (Eq. de projeto)
0

Lembrando que ρ = A /Q , onde ρ (densidade da solução; Kg/L) e Q (vazão volumétrica;

L/h), a Eq. (13) pode ser escrita como segue:
x'
VR / Q = tr = ρ .∫ dx' / v (14)
0

Onde tr = tempo de residência.

Substituindo as Eqs. (2) e (8) na Eq. (14):
x x
tr = K M / Vmax .∫ dx /(1 − x) + S0 / Vmax .∫ dx
0 0

Integrando:
tr = (x.S0 / Vmax ) – (KM / Vmax). Ln (1 – x) (15) (Equação de processo)

6.1.4. Operação com Reatores Enzimáticos

6.1.4.1. Problemas operacionais
Os principais problemas operacionais são: a) efeitos difusionais; b) retro-mistura; c)
gradientes de temperatura e pH no interior do reator; d) variação da pressão interna; e) queda
do desempenho do reator com o tempo.

Apoio:
 79

6.1.4.2 Estratégia operacional

Quando se opera com um biorreator enzimático, procura-se sempre minimizar o custo
global.
Para tanto, usa-se a equação:
tP
Pt = ∫ F .dt (16)
0

Onde Pt (produção total), tp (tempo de produção) e F (vazão de alimentação).

Para resolver a equação (16) é preciso conhecer a relação entre a conversão e o
decaimento do poder catalítico da enzima existente no reator.
Caso seja um decaimento exponencial dado pela equação (17):
F = Fi .e(- t.Ln2/t*) (17)
Então, substituindo a Eq. (17) na (16), tem-se:
Pt = (Fi.t* / Ln2) . [1 – e(- tp.Ln2 / t*)] (18)
Onde t* é o tempo de meia-vida da enzima imobilizada.

6.2. Eletrodos enzimáticos

São dispositivos formados basicamente de duas partes, a saber, sensor e enzima
imobilizada. O sensor eletroquímico, de acordo com o seu princípio de funcionamento, poderá
ser amperométrico ou potenciométrico, sendo a escolha do tipo, função da substância a ser
medida, a qual por sua vez será determinada pela enzima particular empregada. A
imobilização da enzima poderá ser feita por meio de qualquer um dos métodos descritos.
O eletrodo enzimático é imerso na amostra. A seguir o substrato atravessa a membrana
semipermeável (sua finalidade é estabilizar, fixar e proteger a enzima), entra em contato com
a enzima, forma-se o produto (deve ter a capacidade de estimular o sensor), cuja concentração
é medida.
Apenas a título de exemplo, citam-se:
a) eletrodo glicose/glicose oxidase(GO): a reação explorada neste eletrodo é:
glicose + O2 + H2O → GO→ Ac. glicônico + H2O2
Os sensores eletroquímicos úteis para este caso seriam o amperométrico (medida do
O2 consumido ou da H2O2 formada) e o potenciométrico (medida da variação do pH pela
formação do ácido glicônico);
b) eletrodo uréia/urease: a reação explorada é:
uréia + 2H2O + H+ → UREASE→ 2NH4+ + HCO3-
Os sensores eletroquímicos aplicáveis seriam aqueles estimulados pelos íons H+ e
NH4+ (potenciométricos).

Apoio:
 80

Sem dúvida alguma o advento dos eletrodos enzimáticos é uma das mais notórias
aplicações da técnica de imobilização. Porém, a despeito dos grandes avanços alcançados nos
dias de hoje, sobretudo no que se refere à vertente eletrônica do dispositivo, ainda, existem
vários problemas a serem contornados, a saber, custo elevado das enzimas puras; enzimas que
requerem cofatores são de uso limitado; falta de sensores eletroquímicos adequados para a
maioria das substâncias; vida útil curta do eletrodo; os eletrodos de pH são muito sensíveis às
variações do tamponamento do sistema em reação e à presença de cátions monovalentes; e, os
eletrodos sensíveis ao oxigênio podem não funcionar bem, nos casos em que a pO2 não é
saturante no decorrer do processo.

Sensor eletroquímico

Superfície sensível do

Enzima imobilizada

S Membrana
semioermeável
P

Figura 1. Esquema de um eletrodo enzimático.

6.3. Enzimaimunoensaio
Esta técnica explora a já conhecida reação antígeno-anticorpo, onde a enzima é
utilizada como marcador. O teste torna-se quantitativo devido à distribuição da enzima entre a
forma combinada (Anticorpo-enzima-antígeno) e a livre (anticorpo-enzima ou antígeno-
enzima). Este método é análogo a outros testes de imunoensaio (radioimunoensaio,
imunofluorescência, etc.), apresentando as seguintes vantagens: a) ensaio sensível e
específico; b) reagentes estáveis durante o armazenamento; c) manipulação simples; d)
ensaios rápidos; e) uma etapa de separação pode ser desnecessária; f) como há variedade de
marcadores, podem ser feitos ensaios simultâneos; g) automatização.

Apoio:
 81

Enzimas usadas como marcadores: malato desidrogenase (EC.1.1.1.37), glicose 6-

fosfato desidrogenase (1.1.1.49), glicose oxidase (EC.1.1.3.4), peroxidase (1.11.1.7), dentre
outras.
Lembra-se que nesta técnica são muito comuns os termos ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay), EIA (Enzyme-ImmunoAssay) e EMIT (Enzyme-Multiplied-
Immunoassay Technique). A sigla ELISA normalmente é usada para os testes que visam
determinar o teor de anticorpos, enquanto que EMIT é mais frequentemente usada para
designar um tipo especial de EIA, onde não há necessidade de se separar o elemento marcado
para a medida da atividade enzimática.
Os mecanismos envolvidos nos testes ELISA e EMIT são muito variados, citando-se,
apenas a título de exemplo, os esquemas:

a) ELISA (quando o anticorpo marcado com a enzima (Ac*) está em excesso):

Ac* + Ag → Ac*-Ag + Ac*
A remoção do excesso de Ac* é feita usando-se o antígeno imobilizado (Ag), resultando
Ac*-Ag. Após a separação da fase sólida, mede-se a atividade enzimática do complexo
Ac*-Ag.
b) EMIT (quando se deseja medir o teor de um hapteno[H]):

Ei H Ea H
H
H

Figura 2. Esquema genérico da técnica EMIT. A enzima contendo o

hapteno [H] - que é análogo estrutural à molécula cujo título se deseja
determinar [H] – se encaixa no sítio de ligação do anticorpo específico (Ac)
para [H], tornando-se inativa (Ei). Porém, ao se adicionar ao meio de
reação uma amostra contendo a substância [H] – cuja afinidade pelo Ac é

O primeiro ensaio deste tipo consistiu no uso da lisozima (EC.3.2.1.17) para dosar morfina. A
lisozima foi modificada pela introdução em sua estrutura de um hapteno [H], que era um
análogo estrutural da morfina, sendo, a seguir, posta em contato com o Ac normal da morfina.

Apoio:
 82

Pela reação antígeno-anticorpo a atividade lisozímica desapareceu, sendo, posteriormente,

restabelecida pela adição da morfina [H]. O restabelecimento da atividade enzimática refletiu
o teor de morfina na amostra adicionada.
As enzimas como marcadores devem ser escolhidas criteriosamente, segundo: a)
disponibilidade em alto grau de pureza; b) alta atividade específica; c) estabilidade frente às
condições de ensaio e armazenamento; d) alta solubilidade; e) a medida da atividade ser
simples, rápida e sensível; f) ausência nos fluidos biológicos; g) ausência do substrato e de
inibidores nos fluidos biológicos; h) capacidade de reter a atividade após a imobilização; i)
para o caso do EMIT: capacidade de ser inibida ou reativada, quando o Ac se liga ao
conjugado enzima-hapteno sob condições de ensaio compatíveis com a ligação hapteno-
anticorpo.

7. BIBLIOGRAFIA
ALFANI, F., CANTARELLA, M., CANTARELLA, L., VITOLO, M. Biologicl upgrading of wastes from
sucrose processing. Annals of the New York Academy of Sciences, v.542, p.346-350, 1988.

ADLERCREUTZ, P. Immobilized enzymes. In: NAGODAWITHANA, T., REED, G., Eds. Enzymes in Food
Processing, 3rd ed., Academic Press Inc., San Diego, 1993. p. 116.

SYNOWIECKI, J., SIONDALSKA, S.A., El-BEDAWEY, A.F. Adsorption of enzymes on krill chitin modified
with carbon disulfide. Biotechnol.Bioeng., v.29, n.3, p.352-354, 1987.

VIERA, F.B., BARRAGAN, B.B., BUSTO, B.L. Reversible immobilization of soybean beta-amylase on
phenylboronate-agarose. Biotechnol.Bioeng., v.31, n.7, p.711-713, 1988.

RUCKA, M., TURKIEWICZ, B. Hydrolysis of sunflower oil by means of hydrophobic membrane with lipolytic
activity. Biotechnol. Letters, v.11, n.3, p.167-172, 1989.

TAKEUCHI, T., MAKINO, K. Cellulase immobilized on poly-L-glutamic acid. Biotechnol.Bioeng., v.29, n.2,
p.160-164, 1987.

7.1. Leituras complementares

BON, E.P.S., FERRARA, M.A., CORVO, M.L. Enzimas em Biotecnologia. Rio de Janeiro, Editora
Interciência LTDA, 2008.

Apoio:
 83

SAID, S., PIETRO, R.C.L.R. Enzimas como agentes biotecnológicos. Ribeirão Preto, Leggis Summa, 2004.
BORZANI, W., SCHMIDELL, W., LIMA, U.A., AQUARONE, E. Biotecnología Industrial: Fundamentos.
São Paulo, SP, Ed. Edgard Blucher LTDA, 2001. vol. 1. 251p.

SCHMIDELL, W., LIMA, U.A., AQUARONE, E., BORZANI, W. Biotecnología Industrial: Engenharia
Bioquímica. São Paulo, SP, Ed. Edgard Blucher LTDA, 2001. vol. 2. 541p.

LIMA, U.A., AQUARONE, E., BORZANI, W., SCHMIDELL, W. Biotecnología Industrial: Processos
Fermentativos e Enzimáticos. São Paulo, SP, Ed. Edgard Blucher LTDA, 2001. vol. 3. 593p.

AQUARONE, E., BORZANI, W., SCHMIDELL, W., LIMA, U.A. Biotecnología Industrial: Biotecnología na
Produção de Alimentos. São Paulo, SP, Ed. Edgard Blucher LTDA, 2001. vol. 4. 523p.

GODFREY, T., WEST, S. Industrial Enzymology. 2nd Ed., New York, MacMillan Publishers Ltd., 1996.

Apoio:
 84

CAPITULO 8
ENZIMAS NA MODIFICAÇÃO DE MATERIAIS AMILÁCEOS E PROTÉICOS
Doutor Michele Vitolo

1. MATERIAIS AMILÁCEOS
1.1. INTRODUÇÃO
Quando se deseja modificar um material amiláceo por via química ou enzimática,
deve-se lembrar que é o grânulo de amido o componente a ser modificado.
O grânulo de amido possui como características: a) composição: os principais
componentes são a amilose (15-30%) e a amilopectina (70-85%), que estão intimamente
ligadas através de pontes de hidrogênio, dando estrutura compacta ao grânulo. A amilose é
um polímero formado por moléculas de glicose dispostas linearmente e ligadas entre si
através de ligações osídicas do tipo α-1,4. Uma solução de amilose em presença de iodo
adquire cor azul. A amilopectina, por sua vez, é um polímero ramificado da glicose. A cadeia
principal é formada por moléculas de glicose unidas por ligações osídicas α-1,4, ao passo que
nos pontos de ramificação – que se sucedem, em média, a cada vinte moléculas de glicose da
cadeia linear – a ligação osídica é do tipo α-1,6. Uma solução de amilopectina na presença de
iodo adquire cor avermelhada; b) bi-refringência; c) forma e tamanho dependentes da origem
do cereal.
O amido pode ser modificado com menor ou maior intensidade, dependendo do
produto final desejado. Na panificação procura-se modificar o amido ligeiramente, enquanto
que na produção de xaropes o amido é modificado intensamente.

1.2. ENZIMAS EM PANIFICAÇÃO

1.2.1. INTRODUÇÃO
Na panificação industrial a adição de enzimas é imprescindível, pois os constituintes
naturais da farinha de trigo devem ser convenientemente modificados para que a massa obtida
seja adequada à maquinaria da panificação em grande escala.

1.2.2. ENZIMAS
1.2.2.1. Amilases
1.2.2.1.1. α-amilase

Apoio:
 85

Fontes: vegetais, animais e microrganismos.

Termoestabilidade: as α-amilases de origem fúngica são mais termosensíveis que as de
origem bacteriana.
Faixa de pH: 4,5 a 7,0
Unidade de Atividade (SKB): 1 SKB é o inverso do tempo requerido para que a hidrólise de
uma solução de dextrina-padrão pela α-amilase provoque em presença do I2 o aparecimento
de uma intensidade de cor, previamente, estabelecida (Cereal Chemistry, 16:712, 1939).

1.2.2.1.2. β-amilase (enzima sulfidrílica e que não requer cofator)

Características: kcat : 250.000 ligações rompidas/min (30o C e pH = 4,8); Faixa de pH de
atividade: 5,0 a 6,0; Faixa de pH de estabilidade: 4,0 a 8,5; Termoestabilidade (depende da
procedência da enzima): Cevada: inativação a 70oC/10min; Soja: inativação a 70oC/30 min.
Esta enzima pode ser produzida a partir da água de lavagem residual proveniente da
industrialização da batata.

1.2.2.2. Proteases
Fontes: B.subtilis, A. oryzae, A. niger
Atividade Proteolítica (Anson Unit, AU): 1AU é a quantidade de enzima que sob condições
do teste libera 1 µmol/min de aminoácidos Folin-positivos (tirosina).

1.2.2.3. Outras
1.2.2.3.1. Lipoxidase: usada para branquear o miolo do pão. Usualmente usa-se a farinha de
soja desengordurada (0,5% de farinha desengordurada em relação ao peso total de farinha
usada para fazer a massa).

1.2.2.3.2. Pentosanase: hidrolisa as pentosanas existentes na farinha, evitando o

amanhecimento do produto (“staling”).

Apoio:
 86

1.2.3. EFEITOS DA SUPLEMENTAÇÃO ENZIMÁTICA

1.2.3.1. Noções sobre o processo de panificação

1.Etapa pré-forno P2/4

-Farinha + água
“Before Baking”
-levedura (2,5%)
-enzimas - Farinha + água (40%)
- sal (20%)
- açúcar (8%)
- gordura/manteiga

massa
1. Sovar(kneading) Fermentar: 20´
2. Fermentar 30°C/3-5h

55´a 42ºC

massa Subdivisão
moldagem Forno
enformar

“Baking”

1.Etapa pré-forno P3/4

“Before Baking” (cont)
Vista pictórica microscópica do interior da
massa antes de ir para o forno
Gluten
S---S
(gliadina+glutenina) -SH

HS - S---S
S---S

S---S
S---S
-SH

Grânulos de Amido Gluten

Pentosanas (gliadina+glutenina)
Lipídeos
Bolhas de Gás (CO2 + Ar)

Apoio:
 87

P4/4
2.Baking
180 Roasting products
Crust formation
160
Caramel formation
140
Light browning (reação de Mailard)
120 (sabor/aroma aparecem)
100 Evaporation of water
T (oC)

Crumb formation
Evaporation of ethanol
80 Gelatinization of starch
Denaturation of enzymes
60 Inactivation of yeast
40
Fermentation of the dough
20
0 Retarted dough
Frozen dough
-20

Changes in dough and baking affected by the temperature

1.2.3.2. α-amilases
1.2.3.2.1. Efeitos desejáveis a serem conseguidos
a) Formação de açúcar e velocidade de fermentação

Nível de açúcares residuais no pão devido à

ação da α-amilase de várias fontes
Tipo de Qtde. Açúcar no miolo (mg/g)
amilase Amilase* Glicose Maltose
Controle - 4 1
Cereal 140 6 4
560 8 6,5
1120 11,2 6,9
Fúngica 140 6 2
560 8 2
1120 10,5 2
Bacteriana 35 6 -
140 11,2 4,8
* SKB/700 g farinha Beck, H. Ceral Chemistry 34, 211, 1957.

Apoio:
 88

b) Propriedades da massa e qualidade do pão (Efeito na viscosidade e na maciez da massa)

Efeito de α-amilases na qualidade e no teor

de dextrina solúvel do pão
Enzima Amilase Volume do Dextrina Qualidade do miolo
(SKB/700 g) pão (mL) solúvel*
Maciez Textura
Controle - 2400 1,5 80 80
Malte** 140 2790 2,2 90 90
560 3000 3,1 85 90
1120 2860 3,7 80 85
Fúngica 140 2750 1,9 95 95
560 2900 2,1 85 85
1120 2950 1,9 80 80
Bacteriana 7 2600 2,8 90 90
35 2600 5,7 90 80
140 2640 10,6 75 60
*Expressa em %do miolo do pão/** Trigo maltado Beck, H. Ceral Chemistry 34, 211, 1957.

Firmeza relativa do miolo do pão frente à

várias α-amilases (210 SKB/Lb de massa)
Tempo* Peso (g) p/ provocar depressão no miolo **
(h)
Controle Fúngica Vegetal Bacteriana

18 100 90 90 70
42 141 125 130 73
66 190 155 162 75
90 240 175 183 79
114 240 220 218 80

* Tempo transcorrido após a fabricação;

** A depressão é medida contra a um padrão
Miller, B.S. Food |Technology, 7:38, 1953

Apoio:
 89

Efeito das proteases fúngica e bacteriana na

extensibilidade da massa
Resistência (BU) 800

600

400

200

0
0 1 2 3 4 5

Extensibilidade
Protease bacteriana (1x104HU)
Protease fúngica (1x105 HU)
Massa sem protease
Protease fúngica(1x106 HU)

1.2.3.2.2. Métodos de adição das α-amilases

a) Suplementação na moagem da farinha: α-amilase fúngica, trigo ou cevada malteada: 10 a
15 SKB/100 g farinha;

b) Suplementação no processo de panificação: A quantidade a ser usada depende da

composição da mistura, tipo de pão e tipo de equipamento. Exemplos: α-amilase
bacteriana (canapés, “brownies”); α-amilase fúngica (produto com miolo não gomoso);
xarope diastásico (obtido do malte) em biscoitos e bolachas.

1.2.3.3. Proteases
Usadas com o objetivo de influir na extensibilidade da massa, tornando-a adequada
para uso em laminadores. A adição é obrigatória porque o pH da massa sendo em torno de
7,0 não é o mais adequado para a atividade das proteases originalmente presentes na farinha
(pH= 4,0). Além disso, nos pães salgados costuma-se usar 3% de sal, que inibe as proteases
naturais da farinha.

Apoio:
 90

1.2.4. PREPARADOS ENZIMÁTICOS COMERCIAIS

Exemplos de preparados enzimáticos

usados em panificação
Empresa Enzima Observações
Novo Fungamyl α-amilase fúngica (A . oryzae)
Neutrase Protease bacteriana
AMG Glicoamilase
BAN α-amilase bacteriana
Novozym 384 Pentosanase
Miles/Solvay Clarase α-amilase fúngica (A .oryzae)
pH:3-7, 20-45°C
Tenase α-amilase bacteriana (B.
subtilis) pH: 5,5-7, 20-90°C
HT-proteolytic Protease (B. subtilis) pH:6-
8,5, 30-55°C
Biocon Biobake α-amilase fúngica
Amilo Amiloglicosidase

1.2.5. PERSPECTIVAS
Espera-se um aumento na intensidade de uso das proteases, devido ao fato de que as
farinhas disponíveis no mercado estão cada vez mais ricas em proteínas. O aparecimento de
pentosanases em grandes quantidades é, também, uma perspectiva nesta área, pois o “staling”
é um fenômeno danoso para os produtos de panificação.
De um modo geral, o uso de enzimas em panificação tende a aumentar, por causa dos
rigores da legislação alimentícia no que se refere ao uso de farinhas modificadas por via
química (remoção de pigmentos, por exemplo).

1.3. ENZIMAS NA PRODUÇÃO DE XAROPES

1.3.1. INTRODUÇÃO
Ao contrário do que sucede na panificação, a produção de xaropes requer uma
hidrólise intensa do amido.
O início da produção de xaropes em grande escala deu-se nos anos trinta, quando foi
desenvolvido o processo de hidrólise ácida do amido de maís. Os xaropes passaram a ser
usados como adoçantes e como componentes de meios de cultura para processos
fermentativos.

Apoio:
 91

No entanto, a indústria de xaropes recebeu grande impulso, quando a glicoamilase,

enzima responsável pela hidrólise final dos oligossacarídeos oriundos da hidrólise do amido, e
a glicoseisomerase, enzima que catalisa a isomerização da glicose em frutose, passaram a ser
usadas nos anos 60 e 70, respectivamente.

1.3.2. ETAPAS DO PROCESSAMENTO ENZIMÁTICO DO AMIDO

AMIDO
Gelatinização

PASTA DE AMIDO

LIQUEFAÇÃO: ÁCIDA OU ENZIMÁTICA

MALTO-DEXTRINAS
OLIGOSSACARÍDEO

(Sacarificação)

Xp de Xp Misto
Maltose
Xp de Glicose

(Isomerização)

Xp de Frutose

Na Tabela 1 são indicados os usos mais comuns dos produtos oriundos da hidrólise do
amido.

TABELA 1. Produtos provenientes da hidrólise do amido.

PRODUTO USOS
MALTO-DEXTRINAS ESTABILIZANTES, GOMAS, PASTAS, ESPESSANTES
Xp MISTOS CONFEITARIA, REFRIGERANTES, SORVETES ( 42 < DE < 63 )
BABY FOODS, CONSERVAS
Xp DE MALTOSE CONFEITARIA
Xp DE GLICOSE REFRIGERANTES, FERMENTAÇÕES, BALAS
Xp DE FRUTOSE REFRIGERANTES, CONSERVAS, YOGHURT, COMPOTAS

Apoio:
 92

Merece destaque que as maltodextrinas – além dos usos apontados na Tabela 1 – estão
sendo usadas para microencapsular sais de ferro para incorporação no sal de cozinha,
tornando este produto, que já é enriquecido com iodo, também uma fonte adicional de íon
ferroso para o organismo, com o objetivo de reduzir a incidência da anemia, sobretudo, em
crianças mal-nutridas do terceiro mundo (MARTINDALE, 2008).

1.3.2.1. Gelatinização do Amido

(Amido: 25-40%, BS)

H2O
misturar
Aquecimento*

Pasta de Amido Amido gelatinizado**

*A temperatura de aquecimento da pasta depende da origem do amido (por ex.,milho:70oC e

aveia 58oC). **Nesta condição a hidrólise do amido é pequena, ocorre um aumento acentuado
da viscosidade e pode ocorrer a retrogradação (insolubilização espontânea do amido devido à
formação de pontes de hidrogênio entre as moléculas).

1.3.2.2. Liquefação
A liquefação pode ser feita por via ácida (solução aquosa de HCl à 75o C) ou por via
enzimática (α-amilase bacteriana termoresistente).
O grau de liquefação do amido é expresso em Equivalente em Dextrose (DE), que
consiste em se comparar o poder redutor do amido liquefeito frente à uma solução de dextrose
pA (tomada como 100%).

1.3.2.3. Sacarificação
É a etapa que se segue à liquefação, sendo executada com glicoamilase de A.niger e/ou
α-amilase fúngica.

Apoio:
 93

O amido, que se apresenta na forma de grânulo( bi-refringente, dependendo sua

forma e tamanho da espécie vegetal), é constituído pela amilose (homopolissacarídeo
linear da glicose, que representa 15-30% do grânulo) e pela amilopectina
(homopolissacarídeo ramificado da glicose, que representa 70-85% do grânulo ), que se
entrelaçam e são mantidas fortemente unidas através de pontes de H. A amilopectina não é
inteiramente degradada por via enzimática, pelo fato das enzimas α-amilase bacteriana e
glicoamilase não hidrolisarem as ligações osídicas α,1-6, que formam os pontos de
ramificação. Por isso, é necessário empregar-se as enzimas desramificantes para a hidrólise
completa do amido.

1.3.2.4. Isomerização
É a última etapa do processamento do amido, quando se deseja obter um xarope
contendo frutose. A isomerização é um processo contínuo no qual se emprega a
glicoseisomerase imobilizada.
A produção de xaropes contendo frutose teve início nos anos 70, permitindo aos países
não produtores de sacarose a partir da cana-de-açúcar ou beterraba, disporem de um adoçante
comparável ao açúcar invertido e, proveniente, em última análise, de materiais amiláceos.
A glicoseisomerase (GI) atua conforme o esquema:

k1 kp
GI + GLICOSE GLICOSE-GI GI + FRUTOSE

k-1 k-p

GI-FRUTOSE

A equação de velocidade (v):

[VmaxS .(S)/KMs] – VmaxP .(P)/KMp]

v= (1)
1 + (S)/KMs + (P)/KMp

No equilíbrio tem-se que v = 0, logo a Eq. 1 fica:

Vmáxf . KMp (P)eq

= = Keq (2)
Vmáxr . KMs (S)eq

Apoio:
 94

Substituindo (2) na (1):

Vmáxf . [ (S) – (S)eq]
v= (3)
KMs ( 1 + (P)/KMp ) + (S)

Lembrando que a equação de velocidade para a reação em presença de inibidor competitivo é

dada por:
v = Vmáx . (S) / { KM (1 + [ I ]/Ki) + (S)}
Então, observa-se que na isomerização da glicose pela GI, o produto (frutose) atua como
inibidor competitivo.

1.3.3. EXEMPLOS DE PREPARADOS ENZIMÁTICOS COMERCIAIS

Miles/Solvay: Diazyme (glicoamilase), α-amilases bacterianas (Tenase, Taka-Therm,
Takalite). Novo Nordisk: α-amilases bacterianas ( Termamyl e BAN), AMG
(amiloglicosidase) Promozyme (pululanase), Sweetzyme (glicoseisomerase imobilizada),
Fungamyl (α-amilase fúngica), Dextrozyme (AMG + Promozyme). Biocon: Bioglucanase (β-
amilase), Biomaltase, Canalpha (α-amilase bacteriana).

1.3.4. PERSPECTIVAS
Neste setor as perspectivas resumem-se nos aspectos: Melhoramento das
características da GI imobilizada; Disponibilidade de α-amilase termoestável (T > 105o C);
Disponibilidade de glicoamilase imobilizada; e Disponibilidade de enzimas desramificantes
mais puras e termoresistentes

2. MODIFICAÇÃO DE MATERIAIS PROTÉICOS

2.1. Introdução
As proteínas são polímeros de aminoácidos e que podem ser hidrolisadas pelas
proteases.
A modificação enzimática de proteínas é feita pelo homem há milhares de anos,
considerando-se a fabricação do couro a partir da pele de animais (curtume).
A modificação de proteínas objetiva o aumento do valor agregado da proteína animal e
vegetal, e o aproveitamento de resíduos industriais ricos em proteínas.

Apoio:
 95

2.2. Classificação das Proteases

2.2.1. Quanto à Origem : papaína, bromelina, ficina.
2.2.2. Quanto ao Modo de Ação :
2.2.2.1. Endopeptidases: rompem ligações situadas dentro da cadeia peptídica.
2.2.2.2. Exopeptidases:
a) Carboxipeptidases: rompem as ligações a partir da extremidade C-terminal
b) Aminopeptidases: rompem as ligações a partir da extremidade N-terminal.
2.2.3. Quanto à Natureza do Sítio Ativo:
2.2.3.1. Proteases serínicas: possuem um resíduo de serina no sítio ativo. Ex. Tripsina,
quimotripsina;
2.2.3.2. Proteases sulfidrílicas: possuem um resíduo de cisteína no sítio ativo. Ex, papaína,
bromelina
2.2.3.3. Proteases “metálicas”: possuem em seu sítio ativo um íon metálico. Ex.
carboxipeptidase A
2.2.3.4. Proteases ácidas: possuem pelo menos um grupo carboxila no sítio ativo. Ex., pepsina
2.2.4. Conforme o pH de Atividade Máxima
2.3. AÇÃO TRANSFERÁSICA
Se a Aw (atividade de água) do meio reacional for baixa, então a protease pode
catalisar a formação da ligação péptica:
Bz-Tyr-NH2 + Gly-NH2 Bz-Tyr-Gly-NH2 + NH3

2.4. FONTES
As proteases são obtidas a partir de microrganismos, animais e vegetais.

Apoio:
 96

2.5. PROPRIEDADES DAS PROTEASES INDUSTRIAIS

P2/4
Proteases vegetais

N°lig
Enzima Fonte Tipo pH* T** (°C)
rompidas ***

Papaína C. papaya Sulfidril. 5-7 70 9

5-7
Ficina F. glabrata Sulfidril. 50 4

5-7
Bromelina abacaxi Sulfidril. 50 -

*Nesta faixa de pH a enz. apresenta mais de 80% da ativ. hidrolítica.

**A esta T a ação da enz foi mantida por no máximo 4h.
*** Ação hidrolítica sobre a cadeia β oxidada da insulina

P3/4
Proteases animais
N°lig
Enzima Fonte Tipo pH* T** (°C)
rompidas ***

Pepsina Boi/porco Ácida 2,5-3 60 5

3,5-6,5
Quimosina Bezerro Ácida 45 2

Tripsina Boi/porco Serina 6-9 45 2

Quimotripsina Boi/porco Serínica 6-9 38 3

*Nesta faixa de pH a enz. apresenta mais de 80% da ativ. hidrolítica.

**A esta T a ação da enz foi mantida por no máximo 4h.
*** Ação hidrolítica sobre a cadeia β oxidada da insulina

Apoio:
 97

Proteases microbiana P4/4

N°lig
Enzima Fonte Tipo pH* T** (°C)
rompidas ***

Ácida fúng. A. saitoi Ácida 2,5-4 45 9

Neutra 4,5-7
A. oryzae ? 45 9
fúng.
Alkal.
A. oryzae ? 8-9 45 5
Fúng.
Rennet M. mighei ? - 55 2
Neutra
B. subtilis metaloprotease 5-7,5 50 6
bact.
B.
Alkal. Bact. serínica 8-9 55 7
liguiniformis
*Nesta faixa de pH a enz. apresenta mais de 80% da ativ. hidrolítica.
**A esta T a ação da enz foi mantida por no máximo 4h.
*** Ação hidrolítica sobre a cadeia β oxidada da insulina

2.6. CRITÉRIOS PARA A ESCOLHA DAS PROTEASES

As proteases são selecionadas frente à especificidade, necessidade ou não de cofatores,
termoestabilidade, pH de maior atividade e estabilidade .

2.7. INTENSIDADE DA HIDRÓLISE

Uma proteína pode sofrer hidrólise parcial (caso da remoção de um octapeptídeo da k-
caseína pela renina na coagulação do leite), mediana (provocar mudança em alguma
propriedade funcional da proteína) e extensiva (reduzir a proteína a seus aminoácidos
constituintes).

Apoio:
 98

2.8. UNIDADES DE ATIVIDADE PROTEOLÍTICA

Unidade de atividade proteolítica

Ensaio colorimétrico de 1 NU = [E] que hidrolisa 40% de
Northrop (NU) uma solução de caseína

Unidade Miles (MDU=Miles 1 MDU = [E] que libera 10

detergent unit) mmoles tirosina/min

Hemoglobin unit (HU) 1 HU = [E] que libera 67,08mg de

nitrogênio

NPU = neutral protease unit µmol de tirosina/min

1 NPU = 1µ

SAPU=Spectrophotometric acid 1NPU = 1SAPU = 1 BTU

protease unit
BTU=Bromelain tyrosine unit
National formulary papain unit µg tirosina/h
1NFPU = 1µ
(NFPU)

2.9. USOS DAS PROTEASES

O tratamento enzimático de proteínas é efetuado tanto para melhorar o valor nutritivo
como para transformá-la numa forma mais adequada para um dado uso.
Existem dois parâmetros relevantes para o controle deste processo hidrolítico:
a) Dosagem de proteína total e/ou solúvel (métodos de Lowry, biureto, Kjeldahl);
b) Grau de hidrólise (GH): mede-se através da titulação dos aminoácidos livres com álcali. O
volume de álcali consumido corresponderia ao GH. Quando a proteína hidrolisada tem sua
composição conhecida então o GH pode ser expresso como a percentagem de ligações
pépticas rompidas.
Um problema a ser considerado na hidrólise protéica é o que se refere ao aparecimento
de sabor amargo no hidrolisado, provocado por peptídeos hidrofóbicos livres. Para
contornar este problema existem três possibilidades: a) mascaramento do sabor (adição de
polifosfato, que se combina com os peptídeos hidrofóbicos, ou de gelatina, que possui
sabor adocicado ); b) remoção dos peptídeos com C ativo e/ou resinas; c) evitar o
aparecimento dos referidos peptídeos, usando proteases específicas.

Apoio:
 99

2.9.1. Tratamento Direto da Proteína

2.9.1.1. Proteína da soja

Tratamento da proteína de soja pelos métodos:

Tradicional e Ultrafiltração
Flocos Flocos
de soja H2O de soja
H2O
Centrifugação
pH 4,5 pH 8,0

pH 4,5 pH 8,0
(1)

sobrenadante Residuo Residuo sobrenadante

descartado
Alcalase ®
(20g/kg prot)
pH 8,0 pH 8,0 ultrafiltração

1.inat.enzim 1.inat.enz.
2.pH 7,0 2.pH 7,0 (ajuste) ultrafiltrado
3.spray-drying 3.spray-drying
(1) Lavado 3x
c/água
acidulada
Derivado hidrolisado de soja

Propriedades funcionais do hidrolisado de soja

Propriedades Hidrolisado de soja

Tradicional Membrana

*Antes **Após *Antes **Após

Solub no pHi (%) 5 42 20 44

* Cap. Emulsificante 100 280 130 230

(mL/g)
Expansibilidade (%) 20 200 380 1100

* GH=3 *Antes da hidrólise;

*Em mL/g ** Após a hidrólise

Apoio:
 100

Hidrolisado solúvel de soja (GH=10)

H20
Soja 55°C

•(S)=8%
Hidrólise •E/S= 0,02 (Alcalase®)
Tanque agit. •50-55°C; pH 8,0
•GH=10;
Inativação enzimática •t~2h;
Centrifugação •Ác. Orgânico (pH 4,2)

Resíduo Sobrenadante

Filtração •50°C, 30min

1.H2O; •0,12p/p
2.Centrifugação
Sobrenadante Tratamento com C ativo
Filtração

Resíduo Tratamentos finais

Proteína não hidrolisada
e outros mat. insolúveis

2.9.1.2. Proteínas lácteas

Neste caso devem ser considerados a coagulação, importante na fabricação de queijos,
e o intenso sabor amargo do hidrolisado caseínico. A coagulação, hidrólise controlada da
k-caseína, é conseguida através da quimosina, como será visto adiante. O sabor amargo é
bastante reduzido, caso a hidrólise seja feita com proteases específicas (AlcalaseR,
NeutraseR). Os hidrolisados de caseína são muito usados como alimentos dietéticos para
suprir a falta da enzima tripsina no duodeno de certas pessoas.
Um derivado da caseína hidrolisada muito utilizado em formulações é o caseinato de
sódio, que é altamente solúvel. Por ex., pode ser usado em formulação que imita o leite de
cabra:

NEUTRASE
GORDURA.............20%
(0,5% p/V)
CONC. DE SOJA....15% EMULSÃO
PÓ DE SORO..........55% pH 6,6

CASEINATO DE Na...9%

SAIS MINERAIS......1%

Apoio:
 101

2.9.1.3. Hidrolisado funcional de levedura

Proteína funcional de levedura

Homogeinado
de levedura
30°C/ pH 9,0
Centrifugação Resíduo
Sobrenadante
70°C/min; pH 6,0
Centrifugação Sobrenadante

Massa de levedo
Protease
pH8,0; 50°C; 30 min
1. Inativação 80°C/5 min;
2. Ajustar pH a 7,0;
3. Secar
Proteína funcional de levedura

2.9.1.4. Tratamento do colágeno

Tratamento de colágeno

Pele picada e lavada

1g alcalase/L
(~200% p/p)
pH 9,0

Agitação a 25°C
por 6 e 24h
decantar

Lavar 2x com água em

pH 2,0;
deixar em contato por 30 min

Extração da gelatina
70°C (pH 6-7)

Apoio:
 102

2.9.2. Recuperação de Resíduos Protéicos

2.9.2.1. Proteínas de sangue animal
Consiste no aproveitamento do sangue resultante do abate de animais. O objetivo é
aproveitar a proteína existente nas hemácias (40% do volume total do sangue é constituído
por essas células). O teor de proteína nas hemácias corresponde a 75% de toda a proteína
existente no sangue (incluindo o plasma). Como a intensa coloração vermelha do material
impede seu uso generalizado, então, a descoloração enzimática é um processo de grande
interesse para o aproveitamento dessa proteína.

Descoloração enzimática do sangue

Sangue Centrifugação
Plasma (60% v/v)
Hemácias (40% p/p)
Sobrenadante
Hemólise:
Água 55°C; pH 8,5 Filtração
protease/proteína = 4%
Carvão ativado
Hidrólise
(sob agitação) Filtração

HCl Inativação da enzima GH=18%; Evaporação

pH=4,0

Separação I Spray-drying
Torta I
Água Separação II Sangue descolorido
Torta II
Porção colorida

2.9.2.2. Remoção da carne residual presa nos ossos

A carne residual presa no osso (que não foi removida após o abate) corresponde a 5%
do peso total do mesmo. A proteína cárnea hidrolisada, que forma uma suspensão, pode ser
usada em enlatados de produtos cárneos. Um esquema de tratamento dos ossos seria:

H 2O
0SS0S MOÍDOS HIDROLISADO
Decantar
o R
60 C/4h Alcalase
(0,3% em relação ao peso Total)
SOBRENADANTE

98O C/10min

PRODUTO FINAL

Apoio:
 103

2.9.2.3. Hidrolisado protéico de peixe

Neste caso a proteína residual proviria dos restos da industrialização de peixes (por
ex., atum enlatado) ou de peixes não comestíveis pescados juntos com os de interesse
comercial.

Obtenção de hidrolisado protéico de peixe

(J. Spinelli, US Patent 3,826,848, July 30, 1974)
Rhozyme P-II (Si) hexametafosfato
Peixe despedaçado (1:150 prot. Total BS) de sódio (10%)
H2O (1:1)
H2O

Moagem 30°C, 60´ H2SO4 Centrifugação

Ag/T pH 3,0

Macerado Hidrolisado
(pH 6,5) ↓ Fosfo-protéico
GH=5%

Lavagem com
H2O:2x
H2O H2O

Isopropanol
Centrifugação Centrifugação 50°C, 5´ (1:1)

↓Fosfo-protéico ↓Fosfo-protéico
Ajustar pH 7,0 desengordurado lavado

Spray-drying

Suspensão aquosa
concentrado ↓Fosfo-protéico Proteína de peixe
desengordurado

2.9.3. Amaciamento da Carne

2.9.3.1. Amaciamento não enzimático
Consiste no melhoramento genético do animal e/ou no tratamento direto do músculo
(envelhecimento em câmaras aeradas com UR= 84% à 2o C por 10 a 14 dias).

2.9.3.2. Amaciamento enzimático

O contato da enzima (papaína e/ou bromelina) com o músculo pode ser feito de várias
maneiras: pulverização ou borrifação (aerosol) direta sobre a peça de carne, imersão da
peça em solução da protease, introdução da solução enzimática através de injeções
aplicadas diretamente na peça e injeção da solução de enzima na jugular do animal antes
do abate.

Apoio:
 104

2.9.4. PERSPECTIVAS DAS PROTEASES

- A disponibilidade comercial de queratinase e colagenase, enzimas úteis no
aproveitamento da queratina (existente nos pelos e penas, resíduos da avicultura) e do
colágeno. O uso destas enzimas evitaria as altas temperaturas empregadas para a conversão
dos referidos materiais;
- A disponibilidade comercial de proteases ácidas (atuam em pH < 4,0), que permitiriam a
execução da hidrólise protéica em condições de baixa possibilidade de contaminação, bem
como serem usadas nos tratamentos de efluentes residuais protéicos (estes possuem alta
acidez devido à fermentação natural que ocorre);
- A disponibilidade comercial de exopeptidases, que permitiriam executar a hidrólise
protéica de forma mais controlada.

2.10. ENZIMAS EM LATICÍNIOS

2.10.1 Introdução
O leite é um produto altamente nutritivo constituído por proteínas, gorduras, lactose,
vitaminas, sais minerais e enzimas.
As enzimas naturalmente presentes no leite de vaca (α-amilase, fosfatase alcalina,
peroxidase, dentre outras) podem influir na cura de queijos e na termoresistência. A presença
de atividade fosfatásica indica que o processo de pasteurização não foi eficiente.

2.10.2. Enzimas usadas em laticínios

2.10.2.1. Catalase
É uma enzima usada para eliminar a água oxigenada adicionada ao leite antes de se
proceder à pasteurização da matéria-prima. O uso da água oxigenada como conservante do
leite no trajeto entre a fazenda e a usina de beneficiamento é um procedimento permitido em
alguns países. A enzima é totalmente inativada a 60ºC por 20 min.
Existem situações em que a adição de água oxigenada é feita para produzir certos tipos
de queijo, onde o uso do leite pasteurizado não seria adequado. A pasteurização destrói os
microrganismos patógenos e os acidófilos, bem como inativa as lípases e as fosfatases,
enquanto que a água oxigenada preserva os acidófilos e as citadas enzimas, que depois serão
importantes no processo de cura do queijo (por ex., queijo gorgonzola).

Apoio:
 105

2.10.2.2. Enzimas coagulantes

O homem fabrica queijos há pelo menos 4000 anos, constituindo-se até hoje em uma
arte, embora bem dinamizada pela tecnologia atual.
A enzima coagulante típica é a quimosina (protease ácida que rompe especificamente
a ligação péptica formada entre a fenilalanina e a metionina, a partir da extremidade N-
terminal da proteína láctea) obtida do 4º estômago de bezerros lactentes.
Os principais fatores que afetam a coagulação são: a) quantidade da quimosina
(depende do tipo de queijo, a saber, no cheddar usa-se entre 22 a 25mL de quimosina/100L de
leite; no cottage usa-se 5mL/100L de leite); b) temperatura; c) pH (o pH entre 5,8 e 6,5
permite que se obtenha um coágulo não granuloso, elástico e contráctil, enquanto que em pH
mais ácido o coágulo obtido é granuloso e inelástico); d) concentração do íon cálcio; e)
temperatura de armazenamento do leite (não é recomendável conservar o leite à baixa
temperatura por longos períodos, pois a estabilidade da emulsão pode ser comprometida,
dificultando a coagulação); f) teor de gordura do leite; g) eventuais interações da k-caseína
com aminoácidos e/ou ácidos graxos livres no leite; h) tempo de coagulação (varia entre 30 a
90 min, dependendo do tipo de queijo).
O poder coagulante (força do coalho) corresponde ao volume de leite (mL) que pode
ser coagulado com 1mL do coalho em 40 min a 35º C. O substrato é o leite em pó desnatado
dissolvido em CaCl2 0,01M.

COOH COO- -OOC

k- Quimosina
caseína
Ca+2 Ca+2
PO43-
(Micela)
octapeptíd
eo

NH2 N-O-P-O- +NH3

p-k-caseína coágulo

A coagulação do leite é um processo bifásico. A 1ª etapa é

catalisada pela quimosina e a 2ª etapa consiste da quelação
dos íons cálcio pelas moléculas de p-k-caseína.

Apoio:
 106

Ao longo dos anos ocorreu um desequilíbrio entre a produção de queijo e a

disponibilidade de coalho animal, favorecendo o aparecimento de coalhos alternativos de
origem microbiana.

2.10.2.3. Proteases
As proteases são usadas com o objetivo de influir nas propriedades organolépticas
(aroma e sabor) do queijo (tipo curado), que por sua vez dependem das quantidades relativas
de aminoácidos e de ácidos graxos na massa do produto.

2.10.2.4. Lípases
As lípases, também, influem nas características finais do produto.

2.10.2.5. Lactase
A lactase é uma enzima que hidrolisa a lactose do leite em glicose e galactose. As
principais fontes são as leveduras (Kluyveromyces fragilis, K.lactis) e os fungos (A.niger,
A.oryzae). Dependendo da origem a lactase tem aplicações diferenciadas, pois a de levedura,
cujo pHótimo está entre 6,0 e 7,0, é útil para deslactosar o leite (pH ≅ 6,8), enquanto que a
fúngica (4,0 ≤ pHótimo ≤ 5,0) é adequada para deslactosar o soro de leite (pH ≅ 4,5).
Algumas das aplicações da hidrólise da lactose em derivados do leite são:
a) A deslactosação do leite líquido ou em pó permite que o mesmo seja ingerido por
pessoas deficientes em lactase. Além disso, no caso de leite aromatizado aumenta o
índice de dulçor e realça o sabor deste produto;
b) Reduzir o tempo de fermentação de produtos lácteos fermentados;
c) Evitar a cristalização da lactose em sorvetes e leite condensado. Lembra-se que a
lactose na concentração da ordem de 12% em relação aos sólidos totais do leite (por
ex., desnatado) cristaliza com facilidade. Ao se reduzir em 50% o teor de lactose do
leite desnatado, este pode ser usado em maior quantidade nas formulações,
possibilitando a redução na quantidade de estabilizantes a serem adicionados, já que
esta função pode ser desempenhada pelas proteínas do próprio leite. Além disso,
estando a lactose hidrolisada o leite tem o número de moléculas livres aumentado, o
que colabora no abaixamento crioscópico da solução, quando o mesmo é usado em
formulações de sorvetes;

Apoio:
 107

d) A deslactosação do soro de leite permite a fabricação de xaropes com 70-75% de

sólidos, podendo ser usados em formulações alimentícias.

2.10.3. EXEMPLOS DE PREPARADOS ENZIMÁTICOS

Alguns exemplos de preaparados

enzimáticos para a ind. laticínios

Empresa Prep. Obs.

Enzimático
Novo Rennilase Coalho microbiano
LactozymTM Lactase
Alcalase Protease bacteriana
Palatase Lipase
CHR Hansen Hansozym Lisozima
Halactase K. fragilis
Lipase Calf, lamb, kid
Biocon Biolactase

Danilac Danilac Coalho bovino

Ind.Com.

2.10.4. PERSPECTIVAS DAS ENZIMAS EM LATICÍNIOS

a) Aumento da disponibilidade de proteases fúngicas termolábeis;
b) Uso de enzimas imobilizadas: b.1) Quimosina imobilizada para executar a 1ª etapa da
coagulação (5º C), e depois a T = 32º C ocorreria a formação do coágulo em presença
dos íons cálcio; b.2) Cápsulas gordurosas (lipossomas) adicionadas antes da
coagulação e que se decomporiam durante a cura do queijo;
c) Produção de quimosina pela técnica do DNA recombinante.

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AQUARONE, E., BORZANI, W., SCHMIDELL, W., LIMA, U.A. Biotecnología Industrial: Biotecnología na
Produção de Alimentos. São Paulo, SP, Ed. Edgard Blucher LTDA, 2001. vol. 4. 523p.

BON, E.P.S., FERRARA, M.A., CORVO, M.L. Enzimas em Biotecnologia. Rio de Janeiro, Editora
Interciência LTDA, 2008.

BORZANI, W., SCHMIDELL, W., LIMA, U.A., AQUARONE, E. Biotecnología Industrial: Fundamentos.
São Paulo, SP, Ed. Edgard Blucher LTDA, 2001. vol. 1. 251p.

Apoio:
 108

FOGARTY, W.M. & KELLY, C.T. Microbial enzymes and biotechnology. 2nd Ed., New York, Applied
Science Publishers, 1990.

GODFREY, T. & WEST, S. Industrial enzymology. 2nd Ed., New York, MacMillan Publishers Ltd., 1996.

LIMA, U.A., AQUARONE, E., BORZANI, W., SCHMIDELL, W. Biotecnología Industrial: Processos
Fermentativos e Enzimáticos. São Paulo, SP, Ed. Edgard Blucher LTDA, 2001. vol. 3. 593p.

MARTINDALE, D. Uma pitada de nutrição. Scientific American Brasil, v.6, n.69, p.13-14, 2008.

NAGODAWITHANA, T. & REED, G. Enzymes in food processing. 3rd Ed., San Diego, Academic Press,
1993.

SAID, S., PIETRO, R.C.L.R. Enzimas como agentes biotecnológicos. Ribeirão Preto, Leggis Summa, 2004.

SCHMIDELL, W., LIMA, U.A., AQUARONE, E., BORZANI, W. Biotecnología Industrial: Engenharia
Bioquímica. São Paulo, SP, Ed. Edgard Blucher LTDA, 2001. vol. 2. 541p.

Apoio:
 109

CAPÍTULO 9
ENZIMAS EM BEBIDAS ALCOÓLICAS E NÃO ALCOÓLICAS
Doutor Michele Vitolo

1. ENZIMAS EM BEBIDAS ALCOÓLICAS

1.1. Introdução
Apenas para fins didáticos, as bebidas serão classificadas em três grandes grupos, a
saber, álcool potável, vinho e cerveja.

1.2. ÁLCOOL POTÁVEL

O álcool potável corresponde às bebidas destiladas para fins humanos, as quais são
fabricadas pelo homem há milhares de anos através de processos fermentativos naturais
(microrganismos do ar + energia solar). Por exemplo, a tequila é obtida pela fermentação do
suco de cactus.
TABELA 1. Exemplos de bebidas obtidas de matérias-primas açucaradas e amiláceas.
MATÉRIA PRIMA PRODUTO
Açucaradas:
Melaço rum, pinga
Uvas cognac, pisco
Cherry kirsch
Pêra pear brandy
Ameixa slivovice
Palm juice ogogoro
Amiláceos:
Cevada whisky
Mais ou centeio whisky bourbon
Batata ou cevada aquavit
Batata, centeio ou trigo vodka
Arroz saquê

TABELA 2. Percentual das matérias-primas usadas na produção de álcool potável.

MATÉRIA-PRIMA (%)
Melaço 35
Grãos 44
Uvas 9
Batata 7
Frutas 5

O grande avanço neste tipo de indústria se deu quando microrganismos selecionados foram
cultivados em arroz cozido (processo koji). Aliás, em 1890 as enzimas presentes no koji

Apoio:
 110

foram precipitadas por Takamine, surgindo, daí, o primeiro preparado enzimático comercial
(representa o marco inicial da Enzimologia Industrial).
Quando o substrato for o açúcar, então sua conversão a etanol implica, apenas, no uso
do microrganismo adequado. No entanto, para aproveitar os materiais amiláceos, o amido
deve ser transformado em açúcares fermentescíveis, para posterior ocorrência da fermentação
(Figura 1).

Matéria- Gelatinização (com vapor de água) Amido

prima
gelatinizado
amilácea
Hidrólise enzimática

Fermentação (com levedura) Hidrolisado

Caldo
Fermentado

Destilação

Bebida

Figura 1. Esquema de obtenção de bebida alcoólica destilada. A hidrólise envolve

a liquefação (com o uso da α-amilase bacteriana) e a sacarificação (com o
emprego da glicoamilase), para as quais existem vários processos industriais,
como, por exemplo, os processos batelada tipos americano (Figura 2), alemão
(Figura 3) e o processo de cozimento contínuo.(Figura 4).

Apoio:
 111

[FIGURA 2]

Processo batelada (tipo americano)

Grãos moídos
α-amilase* (0,15 a0,3kg/ton Glicoamilase
H2O (1,5-2L/ton)
Vapor Levedura
H2O

Cooker 60°C/1h 32°C

100h
5 atm; 60´; 150°C
Cooler

α-amilase**
(0,35-0,7kg/ton)

Etanol
* Suficiente para permitir agitação;
** Reforço para cont. liquefação
(neste ponto, os grânulos são Vapor
completamente susceptíveis à
hidrólise , ocorrendo ↓ n Condensado

[FIGURA 3]

Processo batelada (tipo alemão)

Grãos, batatas, etc. α-amilase

Glicoamilase Levedura

H2 O

H2O
5 atm 32°C
60 min Álcool
100h
H2O
Vapor Mash tub
Fermentador
Vapor
cooker
H2O

Destilador

Apoio:
 112

[FIGURA 4]

Processo de cozimento contínuo

•Grãos moídos 1-glicoamilase (60°C)
•H2O 2-levedura (32°C)
•α-amilase
vapor
150°C
H2O
vapor
32°C
100h

Mash cooler
80°C H2O Fermentador

α-amilase Cooker
Etanol vapor

Destilador
H2O

1.2.1. Agentes de hidrólise do amido

1.2.1.1. Malte
Obtido, em geral, da cevada e contém as enzimas: α-amilase, β-amilase, proteases,
fitases e glucanases (Figura 5).

Água

germinação
Grãos de
Malte germinado
cevada
(10º -22º C/6-7 dias)
secage
m

Malte seco
(2% de umidade)

Figura 5. Esquema de preparo do malte a partir da cevada.

Apoio:
 113

1.2.1.2. Koji

Arroz Fermentação
Vapor (sob pressão)/1h
Arroz cozido
Moído e
(6 dias)
microrganismo

Massa seca Massa

Secagem (40º C) fermentada

Figura 6. Esquema do processo koji.

1.2.1.3. Enzimas microbianas

As enzimas de origem microbiana tendem a substituir os agentes citados
anteriormente. São de fácil manipulação, plenamente disponíveis e têm atividade padronizada.

1.2.2. Perspectivas das enzimas nesta área

Espera-se uma substituição mais intensa do malte e do koji por enzimas de origem
microbiana, havendo, por isso, necessidade de uma maior diversidade e disponibilidade destes
catalisadores, bem como o melhoramento da termoestabilidade.

1.3. VINHO
Sem dúvida, em enologia as enzimas pectinolíticas são as mais importantes, já que
participam da clarificação e do melhoramento da extração de substâncias naturalmente
presentes na uva macerada.
A qualidade da pectinase é muito importante, porque deve ser apta a hidrolisar
substâncias pécticas altamente esterificadas, e, por isso, deverá ter baixíssima atividade
saponificante (evitar uma concentração de metanol que possa ser danosa à saúde do
consumidor).
As vantagens do tratamento enzimático são verificadas em três pontos: a) Prensagem:
redução do “splashing”, extração mais eficiente do suco tanto em volume quanto nos
constituintes (açúcares, aromas, etc.); b) Fermentação: melhoramento da clarificação,

Apoio:
 114

redução da espuma formada, filtração melhorada, reflexo nas propriedades organolépticas do

vinho e remoção de substâncias mucolíticas (evita-se a turbidez e os processos oxidativos
catalisados pelas polifenoloxidases naturais, enzimas normalmente associadas aos
mucopolissacarídeos); c) Processo como um todo: os equipamentos sofrem menos desgaste
(prensa, bombas, filtros, etc.) e o tempo de processo é diminuído em cerca de 30-50% (a
capacidade da planta é aumentada).
Para se obter as vantagens elencadas, é importante que a enzima fique em contato
permanente com a camada de uva, que tende a flutuar. Para tanto, são suficientes duas a três
misturas diárias do meio.
Além das pectinases, utilizam-se, também, a β-1,3 glucanase e a β-1,6 glucanase.
Estas enzimas atuam sobre carboidratos poliméricos ramificados (cadeia principal com
ligações osídicas β-1,3 e β-1,6 nos pontos de ramificação), que surgem no mosto, quando são
empregados lotes de uvas parasitadas pelo fungo Botritis cinérea. A presença destes
carboidratos no macerado causa problemas nas etapas de clarificação e filtração do vinho.
As perspectivas das enzimas em enologia devem ser consideradas frente ao fato de que
elas são meros coadjuvantes do processo de fabricação do vinho. Por isso, seus usos
vinculam-se a problemas específicos, que podem ocorrer na clarificação, maceração, filtração
e/ou extração de pigmentos.

1.4. CERVEJARIA
1.4.1. Introdução
A produção de cerveja é um processo tradicional, sendo executado há séculos. As
enzimas entram no processo através do malte, um dos principais ingredientes do mosto para a
produção desta bebida.
As principais enzimas do malte são: α-amilase, β-amilase, β-glucanase e
carboxipeptidase, sendo as temperaturas-limites de estabilidade 68º C, 64º C, 62º C e 58º C,
respectivamente.
Para a transformação do material amiláceo em açúcares fermentescíveis, usando as
enzimas naturalmente presentes no malte, o cervejeiro deve realizar o cozimento programado
da pasta (“mashing”), que servirá de mosto para a fermentação (Figura 4).

Apoio:
 115

[FIGURA 7]

“Mashing” feito com uma mistura: 30%

coadjuvante e 70% malte

100

90

T (°C) 80

70

60

50

40
0 60 120 180 240 300

Minutes

A programação do mashing dependerá da temperatura de gelatinização do amido

constituinte do material amiláceo empregado para preparar o mosto (por exemplo, arroz 68-
75º C, batata 53-60º C, centeio 58-70º C, cevada 53-58º C).
A variabilidade do material amiláceo usado para preparar o mosto, resulta – muitas
vezes – da baixa disponibilidade do malte no mercado e, inclusive, de boa qualidade,
obrigando o cervejeiro a utilizar misturas de malte com outras substâncias amiláceas. Nestes
casos, ele deve lançar mão de enzimas para suplementar a atividade enzimática do malte
(malte de baixa qualidade ou usado em quantidade desproporcional aos outros materiais
amiláceos da mistura. Neste caso, o objetivo é a redução de custos) (TABELAS 3 e 4).

1.4.2. Enzimas usadas em cervejaria

TABELA 3. Enzimas usadas em cervejaria.
ENZIMA AÇÃO APLICAÇÃO
α-amilase bacteriana Auxiliar na liquefação/filtração Cozedor e tacho de mashing

α-amilase fúngica sacarificação fermentador

Glicoamilase sacarificação fermentador
Enzimas desramificantes açúcares fermentescíveis fermentador
Glucanase bacteriana Mosto enriquecido tacho do mashing
Decantação/filtração tacho do mashing/filtro
Separação do mosto tacho do mashing
Glucanase fúngica separação/extração melhoradas tacho do mashing
(celulases ) evita turbidez cozedor
Protease bacteriana neutra aumento do teor de N evita turbidez tacho do mashing
Papaína remoção de pentosana /fermentador tanque de
Pentosanases maturação tacho do
mashing/fermentador

Apoio:
 116

TABELA 4. Enzimas usadas no melhoramento da pasta de malte.

ENZIMA EXEMPLO Kg/Ton de malte
α-amilase bacteriana Bacterial-amylase NOVO 120L® 0,5 – 1,0
β-glucanase bacteriana CEREFLO 200L® 0,5 – 1,0
β-glucanase fúngica FINIZYM 200L® 0,2 – 0,5
Celulase fúngica CELLUCLAST® 0,2 – 0,4
Protease bacteriana NEUTRASE® 0,3 – 1,5

1.4.3. Etapas da produção da cerveja onde se usam enzimas

1.4.3.1. Preparação da pasta da qual resultará o mosto (cozedor e tacho do mashing)
1.4.3.1.1. Malte de Baixa Qualidade: caracteriza-se por baixa atividade glucanásica e
amilolítica. Como resultado, tem-se um mosto de péssima qualidade fermentativa (viscoso e
volume pequeno). Para contornar este problema, o cervejeiro adiciona: celulase (ao hidrolisar
a celulose, facilita a liberação dos grânulos de amido [ao redor de 20%] aprisionados) e
glucanase (hidrolisar a glucana). O preparado comercial CELLUCLAST® - contém atividade
glucanásica e celulásica – é usado na quantidade de 0,2 Kg/Ton de pasta. Nesta etapa usa-se,
também, a α-amilase (para hidrolisar o amido) e uma protease (para ajustar o teor de N na
pasta).

1.4.3.1.2. Uso de Auxiliares Amiláceos não Malteados: O cervejeiro os emprega por duas
razões básicas, a saber, para reduzir custos e por razões técnicas (o controle de taninos e de
proteínas em cervejaria é fundamental para evitar a turvação do produto final. Daí o uso do
material amiláceo auxiliar adequado. A ocorrência de glico-proteínas - permitem a
espumação da cerveja - provém de auxiliares amiláceos do tipo: farinha de trigo ou cevada).
O processamento destes materiais implica nas etapas (tal como já estudado): gelatinização 
liquefação  sacarificação  açúcares fermentescíveis.

1.4.3.2. Filtração e Decantação da Pasta

Neste ponto o cervejeiro saberá se a formulação da pasta e o mashing foram ou não
adequados. Os indicadores utilizados são o volume de mosto obtido e a maior ou menor
dificuldade na filtração. Se for preciso, ele adiciona β-glucanase.

1.4.3.3. Fermentador (dorna)

Neste ponto, a rigor, não haveria necessidade da adição de enzimas, desde que a
formulação da pasta e o mashing tenham sido bem feitos. Quando tal não sucede, o cervejeiro

Apoio:
 117

adiciona β-amilase (para aumentar o teor de açúcares redutores no mosto) e, eventualmente,

um pouco mais de β-glucanase (para eliminar de vez a goma residual). Quando se deseja
obter cerveja de baixa caloria (a maior parte da glicose seria consumida pela levedura)
adiciona-se amiloglicosidase.

1.4.3.4. Tanque de Maturação (tanque coletor)

Adiciona-se papaína ou bromelina (1 a 5g/100L de cerveja) para evitar a turvação do
produto final.

Função das enzimas nas várias etapas

da produção de cerveja
Etapas Ações das enzimas

Solubilização/ - liquefação do amido;

Extração - controle dos teores de nitrogênio e
açúcares;
- melhorar a extração;
- melhorar a decantação/controlar a
turbidez
Filtração do mosto - redução do teor de gomas;
- redução da viscosidade
Esterilização do - inativação das enzimas
mosto adicionadas
Fermentação - controle da turbidez;
- ajuste do teor da fonte de carbono
Maturação - controle da turbidez

Aplicação de enzimas nas operações

normais usadas em cervejaria

Decantador Dorna
Cozedor

Tanque
coletor
Resfriador
Preparo do
mosto Fervedor
(Cobre)

Apoio:
 118

1.4.4. PERSPECTIVAS DAS ENZIMAS EM CERVEJARIA

- Uso da papaína imobilizada (evitar sua presença no produto final);

- Desenvolver cepas de levedura, que além de produzir etanol, produzam, também, enzimas
sacarificantes;
- Dispor de glucanases e proteases mais termoestáveis;
- Dispor no mercado de celulases e pentosanases, que permitiriam ampliar a variedade de
materiais amiláceos a ser usados no preparo do mosto.

2. ENZIMAS NA OBTENÇÃO DE SUCOS DE FRUTAS

2.1. INTRODUÇÃO
A indústria de sucos de frutas tem como principal problema a variabilidade das frutas
a serem processadas. A otimização da produção implica no processamento da fruta a baixo
custo, no controle do tempo total de processo, na manutenção ou melhoramento da
estabilidade e das propriedades organolépticas do produto final e no aumento da capacidade
da planta. Em geral, o suco de fruta é comercializado na forma de concentrado, que permite
não só a redução do volume (facilita o transporte e o armazenamento), mas também aumentar
a estabilidade frente à contaminação por microrganismos.
Estes objetivos vêm sendo alcançados com o uso de enzimas nos vários estágios do
processamento desde 1930, quando Kertez e Mehlits usaram enzimas pela primeira vez neste
tipo de indústria.
Atualmente o produtor de suco de fruta tem a seu alcance diversas enzimas. Inclusive
o fabricante das enzimas está apto a fornecer preparados enzimáticos cada vez mais puros e
específicos, ou então, misturas de enzimas em quantidades adequadas para otimizar
determinado processamento de fruta.

2.2. PAREDE CELULAR E SUBSTÂNCIAS PÉCTICAS

A parede celular é a principal barreira a ser desarranjada para a extração adequada do
suco.
A parede celular em essência oferece proteção à célula vegetal, sobretudo, contra o
choque e às mudanças da pressão osmótica extracelular. A composição da parede celular
depende: a) da fruta; b) das condições sazonais; c) do modo e tempo de estocagem da fruta.
Em linhas gerais, as substâncias pécticas são polissacarídeos contendo unidades de
ácido galacturônico, e podem ser divididas em: ácido péctico (as carboxilas das unidades

Apoio:
 119

galacturônicas estão livres) e ácido pectínico (as carboxilas das unidades galacturônicas
encontram-se esterificadas (ex., pectina).
Nas substâncias pécticas, além do ácido galacturônico, encontram-se oses do tipo: L-
ramnose, arabinose, galactose, xilose.
Além das substâncias pécticas, acham-se na parede celular, também, a celulose
(cristalina na parede secundária e amorfa na parede primária) e hemiceluloses. Dentre estas
últimas tem-se as xiloglicanas, cuja cadeia principal é formada por glicoses ligadas por
ligações osídicas β,1-4 e com ramificações de D-xilopiranose, através de ligação osídica do
tipo α.
É interessante destacar que uma malha celulose-xiloglicana está inserida numa matriz
constituída de substâncias pécticas, determinando a força da parede celular e, talvez, a
porosidade da mesma.

2.3. FRUTAS QUE FORNECEM SUCOS DE INTERESSE COMERCIAL

Nas Tabelas 6 e 7 são apresentados alguns exemplos de frutas utilizadas na indústria
de sucos.
[TABELA 6]

Frutas que oferecem sucos de interesse

Frutas Observações
Maçã, pera, A concentração de substâncias pécticas tende a
pêssego, ser cte durante o crescimento, e corresponde a ≅
1% do peso total bruto do fruto. A distribuição
ameixa entre substâncias pécticas insolúveis
(protopectina) e as solúveis (pectina, ác.pectínico
e ác. Péctico) depende:
• do amadurecimento;
• armazenamento.

No fruto verde predomina a protopectina,
enquanto que no maduro predominam as
subst.pécticas solúveis.

Durante o armazenamento ocorre a
solubilidade da pectina, sendo lenta a 0oC e
rápida para T≥15oC.

Apoio:
 120

[TABELA 7]

Frutas que fornecem sucos de interesse

Frutas Observações
Framboesa,  O teor de substâncias pécticas
amora, morango varia de um fruto para outro:
e similares morango (0,5-1,4%), amora (0,7-
1,2%) e framboesa (0,6-1%).
 50% das pectinas são solúveis
mesmo no fruto verde.
Uvas  O teor de substâncias pécticas
depende da variedade da uva. No
fruto verde predomina a protopectina.
Ex: Vitis vinifera o teor de pectina
está entre 0,02-0,6%.
Frutas cítricas  As substâncias pécticas distribuem-
se por todo o fruto. Têm pectina com
60% de esterificação. A sua
solubilidade tende a aumentar com o
amadurecimento do fruto.

2.4. COMPOSIÇÃO DE ALGUMAS FRUTAS

Na Tabela 8 [GM = grau de metilação; EP = enzima pectinolítica naturalmente
presente na fruta] são apresentadas algumas propriedades de frutas usadas na produção de
sucos.

[TABELA 8]

Composição de algumas frutas

Pectina
Fruta GM EP pH Acidez
(% p/p)

Maçã 0,7-0,8 65-92 PE/PG 3,5 0,5-1,4

Banana 0,5-0,6 - PE/PS - 0,3-0,4

Uva 0,1-0,4 50-65 PE/PG 3,2 0,4-1,3

Laranja 0,6-0,9 65 PE - 0,8-1,1

Abacaxi 0,1 22-40 PG - 0,3-1,3

2.5. ENZIMAS
2.5.1. Pectinases
As pectinases são classificadas em dois grandes grupos: Saponificantes
(pectinoesterases) e Despolimerizantes. As despolimerizantes, por sua vez, se sub-dividem
em:

Apoio:
 121

DESPOLIMERIZANTES

AGEM SOBRE O
AGEM SOBRE ÁCIDO PÉCTICO
A PECTINA

POLIMETILGA- PECTINA LIASE (PL)

LACTURONASE
(PMG)

ENDO-PL EXO-PL

PECTATO POLIGALACTURONASE
LIASE (PAL) (PG)
ENDO-PMG EXO-PMG

ENDO-PAL EXO-PAL ENDO-PG EXO-PG

A endo-PL possui grande afinidade por substâncias pécticas altamente metiladas.

Hidrolisa a pectina ao acaso. Uma hidrólise da ordem de 5%, causa uma redução da
viscosidade da ordem de 50%. A endo-PL de A.niger tem pH ótimo entre 4,0 e 5,0.
A pectinoesterase só hidrolisa as ligações éster da substância péctica. Por isso, não é
capaz de reduzir a viscosidade. Aliás, a viscosidade poderá até aumentar se além dela existir
Ca2+ no meio. A de A.niger tem pH entre 4,0 e 4,5.
As poligalacturonases agem só sobre substâncias pécticas com baixo grau de
esterificação. A endo-PG atua ao acaso e a exo-PG atua a partir da extremidade não redutora.
A exo-PG não reduz significativamente a viscosidade. A endo-PG de A.niger tem pH ótimo
entre 4,0 e 4,5 e a exo-PG em pH = 5,0.
As pectinases são de origem vegetal e microbiana.

Apoio:
 122

A ramnogalacturonase hidrolisa a substância péctica nos pontos em que a ramnose se

liga ao resíduo de ácido galacturônico. A substância péctica deve ter baixo grau de
esterificação. É encontrada em A.aculeatus e tem pH ótimo entre 3,0 e 4,0.
Os polímeros da arabinose (arabinanas, arabinoxilanas, arabinogalactanas) são
hidrolisados pelas arabinofuranosidases (endo-arabinase e exo-arabinase). Evitam a turbidez
posterior do suco (maçã, pera).

2.5.2. Hemicelulases
Existem várias enzimas diferentes com o nome genérico de hemicelulase. As mais
importantes são as galactanases (hidrolisam a arabino-1,4-β-D-galactanas e a arabino-1,3-1,6-
linked-β-D-galactanas), xilanases, xiloglucanases e mananases.

2.5.3. Celulases
São sistemas multienzimáticos, que atuam sinergisticamente. As enzimas constituintes
são: endo-glucanase (Cx) (hidrolisa ligações osídicas β-1,4 ao acaso); exo-glucanase
(hidrolisa ligações β-1,4 a partir da extremidade redutora da cadeia do polissacarídeo);
celobiohidrolase (CBH)(atua após a ação da Cx, hidrolisando as ligações a partir da
extremidade não redutora da cadeia, resultando a celobiose) e celobiase (também chamada de
β-glicosidase; hidrolisa a celobiose em glicose).

2.5.4. Amilases
São usadas para evitar a turvação do produto final pela precipitação do amido
naturalmente presente na fruta, sobretudo não madura. Em geral, utilizam-se a
amiloglicosidase (pHotimo = 4,3 e temperatura entre 55 – 60o C) e a α-amilase ácida (pHótimo
entre 3,0 e 4,0; temperatura entre 70o C e 75o C).

2.6. PROCESSAMENTO
Na planta de processamento do suco de fruta (Figura 9), as enzimas são adicionadas
no tanque auxiliar (3-20g de PectinexR /100 Kg de fruta e 0,2-2g de CelluclastR/100 Kg de
fruta ; temperatura: 30-50o C) e no tanque de clarificação (1,5-3,0g de PectinexR/100 Kg de
fruta e 0,5-2,0g de Amylase AGR/100 Kg de fruta; temperatura: 25-45o C). A adição de
enzimas no tanque auxiliar visa à eliminação da pectina insolúvel, enquanto que no tanque de

Apoio:
 123

clarificação o objetivo é a redução da viscosidade, a degradação do amido residual e facilitar a

floculação de substâncias insolúveis.
[FIGURA 9]

Planta para o processamento de suco de fruta

Planta para aroma
Tanque
Trocador auxiliar
de calor Aroma
Moenda Prensa (vapor)

Separador

Tanque Filtro Separador Tanque

de (prensa) de clarificação
Concentrador
estocagem

2.6.1. Processamento do suco de maçã.

Como é do conhecimento geral, existe no mercado uma grande variedade de sucos de
frutas, não sendo o escopo desta apostila descrevê-los. Como o suco de maçã foi o primeiro a
ser comercializado, então foi tomado como paradigma. Os principais aspectos de produção
são apresentados nas Tabelas 9 A - E.

[TABELA 9A]
P1/5
Aspectos da produção do suco de maçã

Aspecto Observações
Mercadológico Formas comerciais de suco:
• “natural” (não filtrado e não clarificado);
• macerado com polpa bem densa;
• alto grau de turbidez (mat. Centrifugado e
não filtrado);
• suco límpido

Suco turvo X suco límpido

• límpido - não escurece com o tempo e não
tem gosto de “cozido” que surge por causa
da pasteurização (pectina e amido dão
esta sensação);
• Turvo - seria mais natural e mais rico em
voláteis.

Apoio:
 124

[TABELA 9B]

P2/5
Aspectos da produção do suco de maçã

Aspecto Observações
Clarificação Objetivo do uso de pectinases:

• Facilitar prensagem, a extração do suco e a

floculação;
• Procedimento: a maçã é macerada, prensada e
clarificada à T (ambiente) por 10-16h, filtrando-
se a seguir;
• Polifenoloxidases causam escurecimento do
suco;
• Entre 5°C e 50°C o tempo de clarificação é
inversamente proporcional à [E]. A pectinase é
dissolvida em H2O e a solução adicionada ao
suco. A viscosidade varia de acordo com a T,
[E], pH etc.
• Critérios de escolha da pectinase:
- Tempo de floculação;
- Velocidade de filtração e turbidez do suco.

[TABELA 9C]

P3/5
Aspectos da produção do suco de maçã
Clarificação (cont.)

Mecanismo ainda não elucidado: provável necessidade da

ação conjunta das enzimas.

A clarificação ocorre em duas etapas:

Despolimerização enzimática da pectina e neutralização
eletrostática.

Geralmente as pectinases comerciais contém gelatina (0,005-

,012) para melhorar a clarificação, tanto influindo no flóculo quanto
por remover taninos;

pH: do suco: 3,2-4,0; pectinase comercial: 3,5-4,0; endo e exo-

PG:4,0-4,5; PME:4,5-5,0; pectinaliase: 5,0-5,5. O pH do suco varia
com a variedade da fruta e do grau de amadurtecimento;

Apoio:
 125

[TABELA 9D]

P4/5
Aspectos da produção do suco de maçã

Clarificação (cont.)

T: ↑T⇒ ↑ v de despectinização ⇒ ↓t clarificação

Por exemplo: suco de maçã com pH 3,5, tratado entre T de 10-

50°C com pectinase (0,025%) e gelatina (0,005%) apresentou os
t clarif :

T (°C ) t c la rif. (m in )
10 200
20 93
30 50
40 34
50 24

[TABELA 9E]
P5/5

Aspectos da produção do suco de maçã

Turbidez pós-clarificação

Ocorre durante a estocagem, devido à polimerização de

polifenóis (catequinas) com pro-anticianidinas oxidadas durante
o processamento.
Solução: usar mais gelatina e fazer clarif a T ~5°C.

Turbidez amídica

Sucede quando se usa maçã verde, que tem 15% de amido.

Resolve-se usando α-amilase junto com a pectinase.

2.7. MECANISMO DA CLARIFICAÇÃO

A clarificação é um processo bifásico, onde na primeira fase tem-se a ação da enzima
pectinolítica - que rompe as micelas onde o suco está confinado - e na segunda ocorre
aglutinação das partículas, em decorrência da neutralização eletrostática promovida pelos íons
presentes no meio.

Apoio:
 126

2.8. PECTINASES COMERCIAIS

Na Tabela 10 são apresentados alguns exemplos de preparados enzimáticos comerciais
empregados na tecnologia de produção de sucos de frutas.

[TABELA 10]

Pectinases comerciais

Empresa Enzima
Celluclast
NOVO Pectinex
Ultrazym
Spark-L-HPG
MILES
Clarex-L
BIOCON Biopectinase

2.9. PERSPECTIVAS DAS ENZIMAS NA PRODUÇÃO DE SUCOS

a) Aumento da disponibilidade de pectinases que atuam em pH ácido, para que possam ser
usadas no processamento de cítricos;
b) Introdução de enzimas específicas, tal como a naringinase (eliminar o gosto amargo do
suco cítrico).

3. BIBLIOGRAFIA
FOGARTY, W.M. & KELLY, C.T. Microbial enzymes and biotechnology. 2nd Ed., New York, Applied
Science Publishers, 1990.

NAGODAWITHANA, T. & REED, G. Enzymes in food processing. 3rd Ed., San Diego, Academic Press,
1993.

GODFREY, T. & WEST, S. Industrial enzymology. 2nd Ed., New York, MacMillan Publishers Ltd., 1996.

UENOJO, M., PASTORE, G.M. Pectinases: Aplicações industriais e perspectivas. Química Nova, v.30, n.2,
p.388-394, 2007.

Apoio:
 127

CAPÍTULO 10
APLICAÇÃO DE PECTINASES NA CLARIFICAÇÃO DE SUCOS REGIONAIS
Doutora Maria Francisca Simas Teixeira

Enzimas pectinolíticas, fontes e importância

As enzimas pectinolíticas sintetizadas tanto por vegetais como por inúmeras espécies
de bactérias e fungos. Na comercialização mundial de biocatalisadores alimentares essas
enzimas ocupam 25% do mercado.
Estudos mostram que dos integrantes do Reino Fungi, Aspergillus, Penicillium,
Botrytis, Rhizopus, Erwinia, Fusarium e Saccharomyces são os mais citados enquanto
Aspergillus niger e Rhizopus oryzae já estão sendo utilizados na produção comercial de
pectinases, enzimas que atuam de forma sinérgica nos polímeros pécticos.
Embora, os fungos filamentosos já estejam sendo utilizados por mais de 50 anos na
produção de enzimas para processos industriais e a maioria deles excretem enzimas
simultaneamente, as leveduras tornam-se uma fonte alternativa para a produção em larga
escala de enzimas comerciais porque são unicelulares, além disso, têm crescimento
relativamente simples e comumente não secretam pectinesterase (PME), mas as pectinas liase
que podem ser usadas na clarificação de suco de fruta e vinho sem que haja formação de
metanol no produto final.
Nas últimas décadas diversas investigações demonstram a ação de pectinases no
processo de clarificação, maceração e extração de sucos, na preparação de néctares e purês
vegetais, assim como, na extração de óleo, melhoramento de fibras têxteis e também como
uma ferramenta analítica na estimativa de produtos fitofarmacêuticos.
Nas plantas superiores, as pectinases são responsáveis durante o crescimento pelo
elongamento celular e participam do processo inicial da patogênese vegetal. Além disso, são
importantes na interação de microrganismos parasita e simbiótico com plantas superiores, na
digestão de alimentos de origem vegetal, nos processos de amadurecimento e deterioração de
frutos e demais estruturas vegetais.
Na célula vegetal, as pectinases ou outras enzimas degradam a pectina presente na
lamela proporcionando a desintegração do tecido vegetal promovendo a separação celular,
processo designado de maceração. Na parede celular primária, a degradação promovida por
essas enzimas ocorre de forma diferente ao da lamela média devido à existência da rede

Apoio:
 128

microfibrilar de celulose disposta imersamente na matriz mais ou menos rígida de

hemicelulose-pectina.
Assim, na presença de uma preparação do complexo pectinolítico (Figura 1), as
moléculas de pectina são hidrolisadas e os produtos formados perdem as propriedades
coloidais, condição que uma rápida sedimentação das partículas formadoras da opacidade,
podendo assim ser facilmente centrifugadas, filtradas ou decantadas.

Figura 1 - Modo de ação das pectinases: (a) R=H para PG e CH3 para PMG; (b) PE; e (c)
R=H para PGL e CH3 para PL. As setas indicam o local de reação das enzimas nas
substâncias pécticas. PMG=polimetilgalacturonases; PG=poligalacturonases;
PE=pectinesteases; PGL= Pectatoliase; PL= pectina liase. FONTE: Gummadi e Panda, 2003.

SUBSTÂNCIAS PÉCTICAS
Substâncias pécticas são designações de heteropolissacarídeos com peso molecular
variando de 30.000 daltons a 300.000 daltons, embora que em certos frutos, ocorram de
tamanho menor. Esses polímeros são responsáveis pela manutenção da integridade dos
tecidos vegetais e participam da organização estrutural dos outros componentes da parede
celular, tais como celulose e hemicelulose, principalmente na lamela média e parede celular
primária das plantas superiores, mantendo a integridade e coesão entre as células dos tecidos
vegetais, como citado a seguir.

Apoio:
 129

Protopectina : polímero constituído por pectina com a celulose e hemicelulose

através der ligações covalentes, insolúvel em água, forma por hidrólise restrita ácidos
pectínicos e pectina. A insolubilidade pode estar relacionada ao tamanho do polímero ou da
ligação com cátions divalentes, especialmente o íon Ca2+ (pectato de cálcio) e/ou outros
polissacarídeos.
Pectina : Polissacarídeo complexo, de alto peso molecular, consistindo principalmente
de ácido poligalacturônico, este pode ter grau variável de grupos carboxílicos metilados. Sob
condição adequada pode formar gel com açúcar e ácido. Tem menos de 75% dos grupos
carboxílicos, das unidades de galacturonatos esterificados com metanol.
As pectinas são polímeros constituídos de uma cadeia principal de ácido α-1,4-D-
galacturônico parcialmente esterificado. Nesses polímeros normalmente estão presentes
açúcares neutros, como D-galactose, L-arabinose, L-ramanose, D-xilose, L-fucose e D-apiose,
ligadas à cadeia principal através de ligação covalente. L-Ramanose é o único presente no
interior da cadeia, interrompendo a seqüência de 10 a 20 resíduos de ácido galacturônico.
A pectina usada na indústria de alimentos e para outros fins tem diferentes
propriedades de geleificação, decorrente do seu grau de metoxilação. O grau de metoxilação,
por sua vez, é definido pela proporção dos grupos carboxílicos (ácidos), presentes na forma
esterificada pelo total das unidades de ácido galacturônico.
Baseando-se no grau de metoxilação as pectinas comerciais são classificadas em dois
grupos, Pectina de alto teor de metoxilas (tem grau de esterificação superior a 50%) e
Pectina de baixo teor de metoxilas (apresenta grau de metoxilação inferior a 50% e grau de
amidação não inferior a 25%). A pectina de baixo teor de metoxilas é produzida a partir da
pectina de alto teor de metoxilas, submetida a tratamento ácido ou alcalino, que promove a
desesterificação parcial de suas cadeias e a substituição de alguns grupos metoxílicos por
grupos amida.
Ácido Péctico (ácido poligalacturônico): Polímero com seus ácidos α-1,4-D-
galacturônico ricos em grupos carboxílicos (-COOH), sem grupo metil ester, solúvel em água,
capaz de formar sais e não geleificam.
Ácido Pectínico: É um composto de ácidos α-1,4-D-galacturônicos com grande
número de grupos carboxílicos metilados (COOHCH3). Sob condições adequadas têm
capacidade de formar gel com açúcares, como a sacarose, e ácidos. Como o ácido péctico, são
capazes de reagir com íons metálicos para formar sais.

Apoio:
 130

Existem também outros compostos de tamanho molecular reduzido, tais como os

oligogalacturonatos, os quais têm duas ou mais unidades de ácido galacturônico e os
oligometilgalacturonatos de constituição semelhante aos oligogalacturonatos, mas
apresentando metilação parcial ou completa no C-6.

Clarificação de suco de frutos tropicais

Há uma diversidade de frutas tropicais, todavia um número reduzido delas está sendo
cultivado e processado em larga escala por causa dos elevados custos de produção, falta de
infra-estrutura nas regiões em que são produzidos, por carência de conhecimento técnico e
também por falta da interação entre o setor empresarial e a pesquisa científica.
Os sucos de frutos tropicais são nutritivos, saborosos, ricos em vitaminas, sais
minerais, açúcares. Numa maioria já está comprovada a presença de substâncias
antioxidantes, além de proporcionarem sabor e aroma agradáveis.
Nesse contexto, uma forma de produzir sucos de frutos tropicais para atender as
exigências do mercado em relação a novos produtos e ampla variedade de escolha, as enzimas
pectinolíticas tornam-se uma opção que pode contribuir ao rápido desenvolvimento d os
procedimentos tecnológicos, ao excelente rendimento e obtenção de produtos com qualidade.
As enzimas pectinolíticas agem de formas diferentes nos sucos de frutas e vegetais,
por exemplo: 1) sucos límpidos e brilhantes (maçã, pêra e uva), as enzimas aumentam a
produção de suco durante a prensagem e a filtração promovendo a remoção do material em
suspensão; 2) sucos com turbidez (laranja, ameixa, tomate e néctar), as poligalacturonases
degradam rapidamente o ácido péctico formado, evitando assim, precipitação e originando
uma opacidade estável.
Alem disso, as pectinases promovem a desgeleificação da polpa durante a maceração e
extração do suco proporcionando a diminuição da viscosidade. Agem desestabilizando as
substâncias floculantes, provocam coagulação e precipitação com consequente clarificação.
Durante o tratamento enzimático aumenta o tamanho das partículas insolúveis devido à
redução da repulsão eletrostática entre as nuvens de partículas, agrupando-as.
No processo de fabricação de sucos de frutas com casca fina, após as etapas de
colheita, recepção e seleção, inicialmente estes são triturados e prensados, nos demais
primeiro separa-se a polpa da casca para produção do suco, incluindo as pectinases antes da
etapa de prensagem, após a trituração (Figura 2 e 3).

Apoio:
 131

Figura 2. Fluxograma do processo de clarificação de suco de fruta com enzima.

Apoio:
 132

CLARIFICAÇÃO DE SUCO DE FRUTAS DA AMAZÔNIA

CAMU-CAMU

SELEÇÃO Refugo

LAVAGEM

RETIRADA DA SEMENTE Semente

Água

Extrato enzimático
bruto

Casca + Polpa : água de Casca+ Polpa : Extrato

poço enzimático bruto 100g :
100g : 10 mL

TRATAMENTO CLARIFICANTE
50 oC/30 minutos

Inativação
enzimática

FILTRAÇÃO Resíduo
polposo

Determinação
Suco com do Resíduo
extrato
Suco com
enzimático Determinação
do Teor de
DETERMINAÇÕES

Atividade Acidez Total Rendimento em

enzimática pH Titulável Suco
quantitativa

Figura 3 - Fluxograma de processamento do suco clarificado de camu-camu

(Myrciaria dubia (H.B.K.) McVaugh). Fonte: Lima, 2006
Apoio:
 133

CARACTERÍSITCAS DO SUCO DE CAMU-CAMU TRATADO COM

PECTINASES DE Aspergillus tubigensis

Rendimento e características físico-químicas dos sucos de camu-camu com e sem tratamento

enzimático. Fonte: Lima, 2006.
Suco
Concentrado Polpa + água Suco + extrato
Determinações enzimático bruto
Rendimento em suco (mL) 36,30 42,00 51,00
Resíduo polposo (g) 17,96 16,52 12,96
Acidez total titulável 4,20 2,61 3,70
pH 3,82 3,86 3,89
Teor de pectina (% pectato de cálcio) 7,16 7,14 2,56

Atividades de EndoPG, ExoPG e PE e redução da viscosidade nas amostras de suco e extrato

enzimático bruto de Aspergillus tubingensis LUC40F4C1 (obtido a partir de concentração de 106
esporos/mL de meio, sob cultivos em pH 2,5 mantidos a 30 oC, contendo 1% de pectina cítrica). nd=
não determinado. Fonte: Lima, 2006.
Atividade de enzimas pectinolíticas Redução da
Amostras PE ENDO-PG EXO-PG Viscosidade
(U/mL) (UV/mL) (U/mL) (%)
Suco concentrado 7,33 nd nd nd
Suco aquoso 6,73 nd nd nd
Suco com extrato enzimático bruto 9,27 0,34 0,54 42,86
Extrato enzimático bruto 8,86 0,32 0,36 40,01

A B

Suco de camu-camu: (A) polpa + água; (B) polpa + extrato

enzimático bruto. Fonte: Lima , 2006

Apoio:
 134

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE ENZIMAS PECTINOLÍTICAS

ATIVIDADE DE PECTINESTERASE

• 2,0 mL da solução de pectina 1% (p/v), em

tampão Tris-acetato 0,025 M, pH 6,5;
• 1,0 mL do extrato enzimático dialisado.

50 oC/2 horas

Banho-Maria Resfriar banho

de gelo
(Ferver/3 min)

Titular com NaOH 0,01N

valores de pH inferiores ao branco

V NaOH X f NaOH X N NaOH

Atividade PE U/mL =
Tempo de incubação (h)
N = Normalidade da solução de NaOH V= Volume de NaOH gasto na titulação (mL)
f = fator de correção da solução de NaOH t = tempo de incubação a 50oC

Uma unidade de pectinesterase (U) foi definida como a quantidade de enzima que libera um
microequivalente de grupos carboxílicos em uma hora de reação, nas condições descritas.

Apoio:
 135

ATIVIDADE DE
ENDOPOLIGALACTURONASE

•5,5 mL de pectina cítrica 0,2% (p/v) em tampão

acetato de sódio 0,025 M, pH 5,0, adicionado de 1,0
mM de EDTA;

•250 µL do extrato enzimático dialisado.

50 oC/10 min

Resfriar banho Ler no

de gelo Viscosimetro de
“Ostwald “

t.e. branco - t.e. amostra

% Viscosidade = x 100
t.e. branco - t.e. H 2 O
t.e.= tempo de escoamento (segundos) % Visc = porcentagem de viscosidade

% V is c d.e.
mL =
Atividade viscosimétrica ×
(U/mL) 50 t
d.e.=diluição da enzima t=t empo de incubação a 50oC

Uma unidade viscosimétrica (UV)= a quantidade de enzima necessária para diminuir em 50% a viscosidade inicial
da solução do substrato em um minuto de reação, nas condições definidas

Apoio:
 136

ATIVIDADE DE
EXOPOLIGALACTURONASE
(Método do ácido dinitrosalicílico - DNS)

• 250 µL de solução de pectina cítrica 0,5% em

tampão acetato de sódio 0,025 M, pH 5,0, adicionada
de 1 mM de EDTA;

µ L de extrato enzimático dialisado .

• 250µ

Após 10 min adicionar

50 oC 0,5 mL de DNS

imediata agitação
incubação em água
fervente/5 min

Espectrofotômetro Diluir
575 nm (5 mL de água destilada)

Uma unidade de atividade enzimática (U) foi

A x d.e
U / mL =
definida como a quantidade de enzima capaz de
liberar um µmol de ácido monogalacturônico por
F. x t minuto da reação.

t = tempo de incubação a 50 oC
A = absorvância da amostra
d.e.=diluição da enzima
F= absorvância correspondente a 1µmol de ácido monogalacturônico

Apoio:
 137

BIBLIOGRAFIA

Bravo, C. E., C.; Carvalho, E.P.; Schwan, R. F., Gómez, R. J. H. C.; Pilon, L. Determinação de condições
ideais para produção de poligalacturonase por Kluyveromyces marxianus. Ciênc. agrotec., v.24 (Edição
Especial), p.137-152, 2000.

Cordeiro, C. A. M.; Martins, M. L S. Produção de poligalacturonase, pelo termofílico Bacillus sp. e algumas de
suas propriedades. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, v.29, n. 1, p. 135-141, 2009.

Gummadi, S. N.; Panda, T. Purification and biochemical properties of microbial pectinases -/a review. Process
Biochemistry , v. 38, p. 987-996, 2003.
Lima, A. R. Produção de pectinases por Aspergillus e clarificação de suco de camu-camu com
poligalacturonases e pectinesterases. Dissertação, 86p., 2006.

Lima, A. R.S.; Machado, M.L.; Castillo, T.A., Fernandes, O. C.C., Britto, E. N.; Peixoto, J.C.C.; Teixeira, M. F.
S. e Porto, A. L. F. Produção de endopoligalacturonases por Aspergillus tubingensis Luc 40 F4C1 por
fermentação submersa e semi-sólida. SINAFERM, 2005.

Peixoto, J. C. C.; Britto, E. N.; Castillo, T. A.; Silva, A.B.; Machado, M. L.; Fernandes, O.C.C.; Lima, A. S.; Caldas,
W. R.; Teixeira, M.F.S.; Porto, A. L. F. Partição de endopectinase de Aspergillus tubingensis Luc 40 F4C1 em sistema
de duas fases aquosas utilizando peg-sais de fosfato. SINAFERM, 2005.

Pinelo, M.; Zeuner, B.; Meyer, A. S. Juice clarification by protease and pectinase treatments indicates new roles
of pectin and protein in cherry juice turbidity. Food and bioproducts processing, 2009.

Teixeira, M. F. S. ; Lima Filho, J. L. ; Durán, N. . Carbon sources effect on pectinase production from
Aspergillus japonicus 586. Brazilian Journal of Microbiology, Brasil, v. 31, p. 286-290, 2000.

Teixeira, M. F. S. Otimização da produção de enzimas pectinolíticas por Aspergillus japonicus 586. Tese, 172p.,
1997.

Silva, E. G.; Borges, M. F.; Medina, C.; Piccoli, R. H.; Freitas, R. S. Pectinolytic enzymes secreted by yeasts
from tropical fruits. FEMS Yeast Research, v.5, p. 859–865, 2005.

Apoio:
 138

ROTEIROS DE ATIVIDADES PRÁTICAS

Disciplina: Tópicos Especiais em Diversidade Biológica

Professora Responsável: Ana Lúcia Figueiredo Porto e Ma Francisca Simas Teixeira
Colaboração: Rosana Antunes Palheta, Larissa Kirsch e Valéria de Carvalho (Doutorandas)

Atividade: Seleção de enzimas de importância industrial produzidas por fungos

anamorfos.

MEIOS DE CULTURA
1)Celulases
Composição do ágar Celulase - CMC
NaNO3………………………..0,2%
K2HPO4.....................................0,1%
MgSO4......................................0,05%
KCl............................................0,05%
Carboximetilcelulose ...............0,2%
Peptona......................................0,02%
Ágar............................................1,7%g

Preparação: Misturar todos os compostos e esterilizar a 121 °C por 10 minutos.

2) Lipase: Ágar Lipase

Ágar Nutriente ..................... 2,0g

CaCl2.H2O............................. 0,01g
Tween 80............................... 1,0mL
Água destilada......................99,0mL

Preparação: Dissolver o ágar nutriente, cloreto de cálcio em 99 ml de água destilada e

esterilizar por 15 minutos. Esterilizar o Tween 80 separadamente por 20 min, a 120 °C.
Misturar todos os componentes, mantendo o ágar a 45 °C para completa dissolução do Tween
80, em seguida verter nas placas de Petri.

3) Pectinases: Ágar Pectina

NH4H2PO4………………………..1,0g
MgSO4.7H2O.................................0,1g
KCl.................................................0,5g
Pectina cítrica..................................1,0g
Ágar................................................12g
Água destilada...............................1000 mL

Apoio:
 139

4) Proteases: Ágar Leite

Leite em pó desnatado...................5,0g
Ágar nutriente................................1,0g
Água destilada.............................100mL

Preparação: Dissolver o leite desnatado em 50 mL de água destilada e esterilizar a vapor

fluente por 15 minutos. O ágar será dissolvido em 50 mL de água destilada esterilizada.
Misturar as duas soluções, mantendo o ágar 45 °C, homogeneizar até obtenção de uma
mistura homogênea.

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA EM MEIO SÓLIDO

Para determinação da atividade em meio sólido, inocular um fragmento da cultura

(diâmetro igual a 5 mm), centralmente na superfície do meio sólido seletivo para cada enzima.
Ao término desse procedimento, manter o cultivos a 25 oC, por 5 dias. Observar a cada 24
horas a formação de halo em volta da colônia e após o período de incubação a atividade
enzimática será determinada pela formação do halo em torno das colônias.

REFERENCIAS
CHEN, Lu Shi ; HECK, J. X. ; JESUS, Kátia Regina de ; RIZZATTO, Márcia ; SILVA, Dênis ; SILVA, Flávio
L H; BIANCHI, Vanildo Del ; KRIEGER, Nádia ; MORAES, Rodrigo O de ; SOARES, Carla . Produção de
Enzimas Proteolíticas Neutras por Fermentação Fúngica em Meio Semi-sólido. In: XIV Simpósio Nacional de
Fermentações - Sinaferm, 2003, Florianópolis. Anais XIV Simpósio Nacional de Fermentações - Sinaferm,
2003.

Haba E.; Bresco O.; Ferrer C; Marque´s A.; Busquets M; Manresa A. Isolation of lipase-secreting bacteria by
deploying used frying oil as selective substrate. Enzyme and Microbial Technology, v. 26, p. 40–44, 2000.

Kasana, R. C; Salwan. R., Dhar, H.; Gulati, A.; 2008. A rapid and easy method for the detection of microbial
cellulases on agar plates using gram´s iodine. Current microbiology v. 57 p. 503-507.

Molina, S. M.G.; Pelissari, F. A.; Vitorello, C. B. M. 2001. Screening and genetic improvement of pectinolytic
fungi for degumming of textile fibers. Brailian Journal of Microbiology v. 32 p. 320-326.

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