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1. OBJETO
Establecer una guía para las actividades de validación de métodos de ensayo y calibración no
normalizados, desarrollados o diseñados por el Laboratorio, métodos normalizados
empleados fuera del alcance previsto, ampliaciones y modificaciones de los métodos
normalizados y para las verificaciones necesarias para confirmar que el laboratorio puede
aplicar correctamente los métodos normalizados antes de utilizarlos para los ensayos.
Evitar las discrepancia respecto a cuándo validar y la extensión de la validación según sea el
caso.
2. ALCANCE
Esta guía aplica a todos los laboratorios de ensayo y de calibración acreditados por ONA y a
aquellos que soliciten la acreditación, aplica, además, a los evaluadores y expertos técnicos
que actúan en los procesos de acreditación, y a todos los métodos de ensayo establecidos
dentro del alcance de acreditación.
3. TÉRMINOS / ABREVIACIONES
Adecuación al propósito: ‘Grado al cual los datos producidos por un proceso de medición
permiten a un Usuario tomar decisiones técnica y administrativamente correctas para un
Propósito establecido.’ (Guía EURACHEM)
Control de Calidad Interno: ‘Serie de procedimientos asumidos por el personal de un
laboratorio para el continuo seguimiento de las operaciones y de los resultados de las
mediciones con el fin de decidir si los resultados son lo suficientemente confiables como para
ser emitidos‘. (Guía EURACHEM)
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Límite de cuantificación: ‘La menor concentración de un analito que puede determinarse con
una precisión (repetibilidad) y una exactitud aceptables bajo las condiciones establecidas de
la prueba.’ (Guía EURACHEM)
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Rango: Se define como el intervalo entre la concentración superior e inferior para las cuales
se ha demostrado la correcta precisión, exactitud y linealidad del método. (Validación de
métodos analíticos; A.E.F.I.) 2001.
pendiente ( AP )
%R 100
pendiente ( PP )
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NOTA 3:
Nota 4: El estímulo puede ser por ejemplo, la cantidad del mensurando presente. La
sensibilidad puede depender del valor de estímulo. Aunque esta definición se aplica
claramente a un instrumento de medición, también puede aplicarse al método analítico como
un todo, tomando en cuenta otros factores tales como el efecto de los niveles de
concentración.
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4. INTRODUCCIÓN
La validación ha sido objeto de atención por ser requerida en normas sobre sistemas de
gestión de la calidad, sobre software y particularmente en la norma ISO/IEC 17025 sobre
requisitos generales para laboratorios de calibración y ensayo.
Para que un resultado analítico concuerde con el propósito requerido, debe ser lo
suficientemente confiable para que cualquier decisión basada en éste pueda tomarse con
confianza. Así, el desempeño del método debe validarse y debe estimarse la incertidumbre del
resultado a un nivel de confianza dado. La incertidumbre deberá ser evaluada y establecida de
una forma que sea ampliamente reconocida, consistente de forma interna y fácil de
interpretar. La mayor parte de la información requerida para evaluar la incertidumbre se
puede obtener durante la validación del método.
Esta guía aplica a todos los laboratorios de ensayo y de calibración acreditados por ONA y a
aquellos que soliciten la acreditación, aplica, además, a los evaluadores y expertos técnicos
que actúan en los procesos de acreditación, y a todos los métodos de ensayo establecidos
dentro del alcance de acreditación.
5. REQUISITOS GENERALES
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Se puede hacer una tabla que permita visualizar los parámetros de desempeño, como se
hará la determinación de cada parámetro de desempeño y que se reportara para la
evaluación final
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PARAMETRO
DE DETERMINACION REPORTAR
DESEMPEÑO
Un analista prepara solucione de estándar al
Precisión del
100% de la concentración del analito desde una Coeficiente de
sistema
solución más concentrada y la lee o inyecta 6 variación %
instrumental
veces en forma consecutiva
Un analista debe preparar por lo menos por Coeficiente de
triplicado 5 niveles de concentración de la determinación (r2)
solución de referencia por dilución (a partir de
una solución más concentrada).La concentración Pendiente (b)
Linealidad central debe ser la concentración que representa
del sistema el 100% en la muestra procesada para su
(1) medición. El intervalo debe incluir la
especificación. Medir la respuesta analítica bajo Intervalo de confianza
las mismas condiciones de medición, reportar la de la pendiente IC (β1)
relación concentración vs respuesta analítica
(Ejemplo. 60%,80%,100, 120%,140%)
Rango lineal
Y de igual forma los otros parámetros
G) Descripción del método analítico: debe describirse el método tal cual será puesto en
el uso rutinario, detallando todos los elementos abajo mencionados, y haciendo énfasis en
puntos críticos de la metodología, condiciones instrumentales y número de repeticiones,
verificación de idoneidad de las condiciones operatorias definidas, formulas para el cálculo de
resultados y su tratamiento estadístico si es necesario, bibliografía y referencias.
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Reactivos
Estandares
Materiales
Instrumentaciòn
Condiciones ambientales
Medidas de seguridad para el uso de reactivos
Preparacion de reactivos
Preparaciòn de estandares
Preparacion de la muestra
Procedimiento
Calculos
PARAMETRO DE
REPORTAR LIMITE
DESEMPEÑO
Coeficiente de variación
Precisión del sistema ≤ 1.5%
Coeficiente de determinación ( r 2 ) ≥ 0.98
Pendiente (β1) ≠0
No debe
Linealidad del sistema Intervalo de confianza de la pendiente IC (β1) incluir el
cero
Rango lineal --------
Y de igual forma los otros parámetros
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- Analito evaluado
- Matriz o matrices ensayadas
- Técnica utilizada
- Documentos relacionados (protocolos, procedimientos, instrucciones de trabajo)
- Rango Validado
- Cuadro resumen con los resultados de los parámetros de desempeño evaluados.
- Analistas autorizados para la realización del ensayo.
El laboratorio responsable del análisis o ensayo debe definir las condiciones y el alcance de la
validación de acuerdo a lo definido por esta guía y a su caso en particular.
En el caso de que el cliente lo solicite, el responsable del análisis o ensayo deberá ponerse de
acuerdo con el cliente sobre este aspecto.
Se diferencian tres casos, en los que la dificultad de la validación aumenta del primero al
tercero:
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La validación en los casos descritos en el numeral 5.2.2 tiene objetivos distintos como lo
establece la tabla siguiente (tabla a).
Caso 3: método
Comprobación de que el método cumple con las características
Desarrollado / interno.
necesarias para dar resultados confiables para el fin propuesto.
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Métodos Normalizados
Identificación Cuantificación Cuantificación de Evaluación de
de componentes características
Parámetros
componentes minoritarios o establecidas*
mayoritarios impurezas en trazas
Selectividad/ Especificidad Sí + + +
Estabilidad analítica de la
+ + + +
muestra
Linealidad del Sistema No Sí Sí +
Linealidad del Método No + + +
Rango No + + +
Exactitud No Sí Sí +
Repetibilidad No Sí Sí Sí
Precisión Intermedia No Sí Sí Sí
Reproducibilidad No ++ ++ ++
Límite de Detección + No No No
Límite de Cuantificación No + + +
Robustez + + + +
+: Puede o no requerirse, dependiendo de la normativa de referencia o la naturaleza del
análisis
++: Dependerá de la disponibilidad de laboratorios.
*: En esta categoría se hace alusión a procesos previos a la cuantificación (ej: disolución,
liberación de analitos, etc) el método usado para la cuantificación (cuando aplique) se
validará de acuerdo a columnas 2 ó 3.
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Rango No Sí Sí +
Exactitud No Sí Sí +
Repetibilidad No Sí Sí Sí
Precisión Intermedia No Sí Sí Sí
Reproducibilidad No ++ ++ ++
Límite de Detección + No Si No
Límite de Cuantificación No + Sí +
Robustez + + + +
+: Puede o no requerirse, dependiendo de la normativa de referencia o la naturaleza del
análisis o de las modificaciones que se le hagan al método.
++: Dependerá de la disponibilidad de laboratorios.
*: En esta categoría se hace alusión a procesos previos a la cuantificación (ej: disolución,
liberación de analitos, etc) el método usado para la cuantificación (cuando aplique) se
validará de acuerdo a columnas 2 ó 3.
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6. DOCUMENTOS DE REFERENCIA
7. REGISTROS
No aplica.
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8. ANEXOS
1. Selectividad/ Especificidad
En el estudio de la selectividad, como norma general se comparan los resultados del análisis
de muestras con y sin analito en presencia o ausencia de impurezas, productos de
degradación, sustancias relacionadas, excipientes (matriz o placebo), y dependiendo del tipo
de muestra, tipo de técnica analítica, instrumento de medición.
- La matriz sola
- con matriz adicionada de estos
- la matriz adicionada del analito
- la matriz adicionada analito y de productos de degradación.
- Analizar como lo indica el método.
Condiciones
1. En un horno desde 70ºC a 120 ºC o a 20 ºC por
debajo del punto de fusión del analito 2 a 4
semanas
2. Exponer a luz UV, fluorescente y/o humedad
relativa, por un tiempo apropiado
Analito, matriz y muestra
3. Hacer soluciones, ajustando el pH de 1 a 2 (HCl
0.1N) y/o de 10 a 12 (NaOH 0.1N) y someterlas a
60 ºC por un tiempo apropiado
4. Para muestras liquidas o semisólidas (formas
farmacéuticas) adicionar peróxido de hidrogeno
(3%) para favorecer la oxidación del analito.
Estos estudios no se deben llevar a cabo para analitos que según la bibliografía, tengan
propiedades reactivas que puedan dar lugar a condiciones inseguras al someter las muestras
a las condiciones antes mencionadas.
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En el caso de métodos no selectivos, como por ejemplo los métodos que utilizan sistemas de
medición volumétricas, la especificidad para los componentes de una muestra, es sustentada
con los resultados de exactitud y linealidad del método cumplidos los criterios de aceptación.
Criterios de aceptación
Muestras dependientes
El analista debe procesar hasta la etapa preestablecida por lo menos por triplicado una
muestra homogénea.
Fraccionar cada una de las preparaciones de acuerdo a las condiciones de almacenaje
(Ambiente, Refrigeración, t ºC , etc. durante un tiempo determinado ) de interés.
Terminar el análisis de una de las fracciones de cada preparación.
Proseguir el análisis de cada una de las fracciones al término de cada condición de
almacenaje, utilizando una solución de referencia recientemente preparada, si el
método contempla el uso de una solución de referencia.
Reportar el resultado.
Muestras independientes
A partir de una muestra homogénea, el analista debe analizar por triplicado hasta
completar el análisis y obtener el resultado.
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Cálculos
Criterios de aceptación
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El intervalo (rango) está en función del propósito del método, y por lo general se expresa
como concentración. Es crítico que el intervalo no excluya valores de concentración que
potencialmente puedan dar lugar al contenido del analito en la muestra.
En análisis farmacéutico:
Criterios de aceptación
r2 ≥ 0.98
IC (β1), no debe incluir el cero
Otros criterios de aceptación debe ser justificado.
Un analista debe preparar una matriz con el tipo de componentes que generalmente
están presentes en la muestra.
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Estándar
Matriz adicionado nivel inferior
Matriz adicionado 100%
Matriz adicionado nivel superior
Hasta terminar los 3 bloques
Hacer cálculos, como lo indica el método para cada bloque de muestras con referencia
a su estándar respectivo.
Determinar la cantidad recuperada del analito.
Un analista debe analizar la muestra con el método, para determinar el contenido del
analito.
El mismo analista debe preparar por lo menos 3 muestras adicionadas, por ejemplo
utilizando la mitad de la muestra analítica que originalmente requiere el método y
adicionar el analito (puede ser una sustancia de referencia secundaria) hasta
completar lo que represente el 100% de éste en la muestra.
Seleccionar al menos dos niveles, superior e inferior de la cantidad del analito
(intervalo) y preparar la muestra adicionada al menos por triplicado a cada nivel,
manteniendo constante la cantidad de muestra en los tres niveles.
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Las muestras adicionadas deben ser analizadas por un mismo analista bajo las mismas
condiciones utilizando como referencia la sustancia empleada en la adición de la
muestra.
Realizar una determinación de cada preparación de muestra, de acuerdo a la
siguiente secuencia :
Estándar
Muestra adicionada nivel inferior
Muestra adicionada 100%
Muestra adicionada nivel superior
Hasta terminar los 3 bloques
Hacer cálculos, como lo indica el método para cada bloque de muestras con referencia
a su estándar respectivo.
Determinar la cantidad recuperada del analito.
Cuando no sea posible adicionar de manera directa el analito a la muestra, la adición pude ser
llevada a cabo en alguna etapa del método. Se recomienda que la adición se lleve a cabo en las
primeras etapas del método, para poder asegurar que las etapas posteriores, no den lugar a
resultados incorrectos.
Por ejemplo, si una muestra se debe extraer, filtrar y diluir, es conveniente que la adición se
lleve a cabo antes de extraer; ya que si existiera algún problema con la extracción o con la
filtración, puede dar lugar a resultados incorrectos si el analito se adiciona a la muestra o
matriz analítico hasta antes de diluir.
El intervalo (rango) de la concentración del analito adicionado, depende del propósito del
método y debe incluir la especificación, los limites según una normativa en particular.
En análisis farmacéutico según la guía ICH Q2A se recomienda los rangos según el
propósito de método cuantitativo.
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Calcular
Promedio aritmético, la desviación estándar (S), el coeficiente de variación (CV) y el intervalo
de confianza para la media poblacional IC ( μ ) del porcentaje de recobro (recuperación)
Criterios de aceptación
Cantidad adicionada vs cantidad recuperada
r2 ≥ 0.995 (El criterio de aceptación definido por el laboratorio dependerá del tipo de análisis
y del nivel de concentración del analito en la matriz.)
IC (b), debe incluir la unidad
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Criterios de aceptación
r2 ≥ 0.995 (El criterio de aceptación definido por el laboratorio dependerá del tipo de análisis
y del nivel de concentración del analito en la matriz.)
IC (b), no debe incluir el cero
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r (n 2)
ESTADÍSTICO DE PRUEBA: t
1 r2
CRITERIOS DE DECISIÓN:
CONCLUSIONES:
CRITERIOS DE DECISIÓN:
CONCLUSIONES:
a
ESTADÍSTICO DE PRUEBA: tcalculado
Sa
CRITERIOS DE DECISIÓN:
CONCLUSIONES:
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5. Intervalo o Rango
6. Exactitud :
6.1 Veracidad
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a) Preparados por adición de materiales típicos con materiales de referencia con pureza
certificada u otros materiales de pureza y estabilidad adecuada.
CRITERIO DE DECISIÓN PARA LA EXACTITUD: Si texp < ttab, el método analítico desarrollado
tiene la exactitud requerida, y ambos valores no son estadísticamente diferentes. Mientras
que, si texp > ttab significa que el método analítico no es exacto y que existe un error sistemático
por defecto o por exceso que en valor absoluto es |µ-xmed|, donde µ representa el valor
verdadero o esperado de concentración del analito.
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7. Precisión.
REPETIBILIDAD: Estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la
misma muestra en las mismas condiciones operativas (un mismo analista, mismos aparatos y
reactivos, etc.) en un mismo laboratorio y en un tiempo de tiempo corto.
PRECISION INTERMEDIA: Estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis
sobre la misma muestra, pero en condiciones operativas diferentes (diferentes analistas,
aparatos, días, etc.) y en un mismo laboratorio.
S
( Xi X) 2
N1
( Xi X) 2
CRITERIOS DE DECISIÓN:
CONCLUSIONES:
ESTADÍSTICO DE PRUEBA:
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CRITERIOS DE DECISIÓN:
Si tcalculado < tCrítico: Las medias de los dos conjuntos de resultados no se diferencian
significativamente.
Si tcalculado > tCrítico: Las medias de los dos conjuntos de resultados se diferencian
significativamente.
CONCLUSIONES:
RECOMENDACIONES:
Tener en cuenta los “nuevos” grados de libertad (df), para el caso cuando las varianzas de
los dos conjuntos de resultados se diferencian significativamente.
H1: X1 X2 (test dos colas) -tα/2, df < t < tα/2, df H0 aceptada
H1: X1 < X2 (test una cola) t > -tα, df H0 aceptada
H1: X1 > X2 (test una cola) t < tα, df H0 aceptada
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Este se emplea en cromatografía en capa fina para hallar el límite de detección de las
impurezas y/o productos de degradación en una materia prima.
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Para ello, se preparan una serie de soluciones conteniendo una cantidad constante de
materia prima, del orden de la carga máxima y cantidades decrecientes del analito que se
desea estudiar.
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Fecha: 2012-01-09 Fecha: 2012-05-29 Fecha: 2012-11-26
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K S blanco
CL b
(A)
d.3- Las fórmulas anteriores sólo son válidas si la mayor fuente de error es la desviación
estándar del blanco o sea cuando se cumple que S blanco >> Sa y Sb. Estos dos últimos
evaluados en apego al método de mínimos cuadrados
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Cuando el ajuste de la recta es muy defectuoso, la estimación obtenida por (C) será poco
fiable; y al no presentar ninguna ventaja, es preferible en este caso determinar los límites
de detección y/o cuantificación por un método que suponga menos trabajo experimental
(relación señal-ruido).
K Sblanco 1
CL b
x
n
(D)
yblanco K Sblanco 1
CL b
x
n
(E)
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Los límites de detección y/o cuantificación obtenidos por cálculos en los literales c, d y
e han de comprobarse posteriormente, mediante el análisis de muestras conteniendo el
analito en concentración igual o próxima a los límites estimados, los resultados de Porcentaje
de Coeficiente de Variación y porcentaje de recuperación deberán ser coherentes con el tipo
de análisis que se realiza y del nivel de concentración del analito en la matriz.
(AOAC Peer-Verified Methods Program, Manual on policies and procedures, Arlington, Va., USA
(1998).
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S
( Xi X )2
n 1
- Coeficiente de variación.
S
Cv 100
X
Prueba de Fischer.- Se utiliza para determinar si existe diferencia significativa entre los
resultados de los analistas que emplearon el mismo método.
Se calcula:
2
S de forma tal que F 1
F 12
S2
El valor critico (F tabulado) debe consultarse en las tablas estadísticas. Para emplear estas
tablas debe hallarse primero el número de grados de libertad, el cual es igual a n-1, donde n
es el número de muestras para un analista individual. Si Fexp < Ftab (F n 1-1/n 2-1, P = 0.05)
no existe diferencia significativa entre la precisión alcanzada por los analistas.
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Condición 1 Condición 2
Media
X 1 X 2
Desviación estándar S 1 S 2
Número de muestras N1 N 2
( X 1 X 2)
t
1 1
S
N1 N 2
2 2
2 ( N 1 1) S1 ( N 2 1) S 2
S ( N 1 N 2) 2
Si texp < ttab (P = 0.05, GL = N1 + N2 -2 ) no existe diferencia significativa entre las medias
obtenidas por las dos condiciones.
S
t
n
Notación.
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S
Limite de confianza para el 95 %= X t
n
Las fórmulas anteriores se pueden utilizar también con porcentajes de recuperación, basta
sustituir el valor medio por el porcentaje de recuperación R, el valor verdadero m por 100 y
la desviación estándar S por el coeficiente de variación Cv.
100 R n
t exp
Cv
Para determinar si el factor concentración tiene alguna influencia en los resultados se utiliza
un test de igualdad de varianzas de los grupos muéstrales del mismo tamaño.
En este ejemplo, se utiliza el test G de Cochran:
2
S
Gexp 2 max 2 2
S1 S 2 S 3
Gtab = ( P = 0.05, K = 3, n=3 )
Si Gexp < Gtab las varianzas de las tres concentraciones son equivalentes, o lo que es lo
mismo que el factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados. En este caso
se calcula la recuperación media y el coeficiente de variación.
x (ug) Y xy x2 y2
x1 y1 x1y1 x12 y12
x1 y1 x1y1 x12 y12
x1 y1 x1y1 x12 y12
x2 y2 x2y2 x22 y22
x2 y2 x2y2 x22 y22
x2 y2 x2y2 x22 y22
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Cálculo de b:
x y
xy
b n
2 x
2
x
n
Cálculo de a:
a
y b x
n
Ecuación: y = bx + a
Coeficiente de correlación r.
Si r es cercano a la unidad, significa que existe correlación con una probabilidad elevada.
(Existen tablas de r que dan el grado de significación del valor obtenido para el coeficiente de
correlación).
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x (ug) y f (y/x)
x1 y1 f1
x1 y1 f1
x1 y1 f1
x2 y2 f2
x2 y2 f2
x2 y2 f2
x3 y3 f3
x3 y3 f3
x3 y3 f3
x4 y4 f4
x4 y4 f4
x4 y4 f4
Media de f: f
f n
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( f i f ) 2
Desviación Estándar de f: Sf
n 1
Sf 100
Coeficiente de variación de f:
f
Significación estadística de la varianza de la pendiente b (de la recta de regresión).
2
2 S y ,x
Sb
2 x
2
x n
2
2 y a y b xy
S y, x n2
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2
Sb Sb
Sb 100
Sb rel (%) b
b
t exp
Sb
En la tabla de t se halla el grado de significación para n-2 grados de libertad.
Hipótesis nula: b = 0.
Test de proporcionalidad.
2
2 2 x2 S y ,x x
2
Sa Sb
2
n 2 n
x
x n
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2
Sa Sa
- La desviación estándar relativa del término independiente es:
S a 100
S a rel (%) a
a t Sa
a
t exp
Sa
En la tabla de t se halla el grado de significación para n - 2 grados de libertad.
Hipótesis nula a = 0
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2
Límites de tolerancia = 1 xo x
b x o a t S y ,x 1
2
n
x x
2
Límite de confianza = 1 x o x
b xo a t S y, x
2
n
x x
En ambos casos se halla t para n-2 grados de libertad y al nivel de probabilidad escogido,
generalmente P = 0.05.
Los límites de tolerancia son los límites de confianza de los valores individuales de y en la
recta de regresión.
Los límites de confianza son los límites de confianza de los valores medios de y en la recta
de regresión.
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BIBLIOGRAFIA DE ANEXOS.
3. NC: 92-16:89. Técnica de estimación y dócimas relativas a las medias y las varianzas.
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