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Práctica no.

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“Tinción de Gram”

Objetivo:
Aprender una técnica de coloración diferencial para la identificación de
bacterias Gram positivas y negativas.

Introducción:
En microbiología el microscopio se utiliza de forma rutinaria, ya que
proporciona importante información para la identificación temprana y
definitiva de los microorganismos.
En la valoración de las muestras, es trascendente el poder de
resolución del microscopio, el cual se define como la capacidad que
posee un objetivo para distinguir la distancia mínima entre dos puntos
del objeto para que se puedan visualizar como dos puntos separados.
El poder de resolución de un objetivo es el responsable de la calidad,
claridad, nitidez y fineza detallada de la imagen, y depende de la
longitud de onda (λ) del haz de luz utilizado y de la apertura numérica
del objetivo empleado. El máximo poder de resolución en un
microscopio de luz emitida es de 0.2 μm, por lo que se requiere de una
amplificación entre 1000-1400x, mientras que el poder de resolución del
ojo humano es de aproximadamente 0.2 mm.
Para aprovechar esta ventaja de los microscopios, se han desarrollado
técnicas tintoriales que destacan las características morfológicas de los
microorganismos.
Existe una gran variedad de tinciones que pueden ser aplicadas dentro
del campo de la microbiología.
Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a células,
tejidos, fibras, etcétera. De acuerdo con su origen, se pueden dividir en:
colorantes naturales, los cuales son extraídos de plantas o animales, y
colorantes artificiales, que son aquellos de minerales procesados y
manipulados en el laboratorio.
Químicamente, el colorante está constituido de un componente
cromóforo y un auxócromo. El cromóforo es todo grupo aislado,
covalente e insaturado, que tiene una absorción característica en la
región ultravioleta o visible; dicho de otra forma, es la capacidad que
tiene la molécula para que sus electrones absorban energía o luz visible,
se exciten y emitan diversos colores de acuerdo con la longitud de
emitida como resultado del cambio en el nivel energético. Cabe
mencionar que esta longitud de onda corresponde al rango de espectro
visible. Los cromóforos se pueden presentar en dos formas
fundamentales: en sistemas conjugados pi o complejos metálicos. Los
cromóforos son principalmente grupos funcionales con dobles y triples
enlaces carbono-carbono, anillos aromáticos, grupos carbonilos,
iminodiazo, nitro y enlaces entre carbono-y (y es un átomo con pares
libres).Los auxócromos son grupos funcionales o radicales que
constituyen una molécula y poseen carga parcial positiva; tienen la
función de intensificar la formación de color mediante la acción de
grupos de átomos no saturados; su función es desplazar a los
cromóforos hacia longitudes de ondas largas para aumentar la
intensidad.
Los siguientes grupos funcionales son considerados auxócromos: grupo
metilo, halógenos, hidroxi, alcoxi y amino.4,5 Aunque los
microorganismos vivos se pueden observar directamente en fresco al
microscopio óptico, la mayoría de las veces es necesario teñirlos para
que por medio del uso de colorantes, sea mucho más fácil su
identificación; además, la presencia de ciertas estructuras, así como su
reacción a determinadas técnicas, nos permite clasificar a las bacterias.
Así pues, los colorantes tienen las siguientes funciones:
1. Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y
transparentes.
2. Revelan su forma y tamaño.
3. Muestran la presencia de estructuras internas y externas.
4. Producen reacciones químicas específicas.
Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra
se tiñe del mismo color y se utiliza un sólo colorante (azul de lactofenol
o tinta china); tinción diferencial, cuando se visualiza más de un color
porque se utiliza más de un colorante (Gram o Ziehl-Neelsen); tinción
específica, cuando se utilizan anticuerpos marcados con una molécula
fluorescente para identificar una estructura celular en particular
(inmunocitoquímico). El control de calidad de los métodos tintoriales es
importante, ya que así se asegura que la preparación de la muestra
haya sido adecuada, por lo que se recomienda realizar al mismo tiempo
de la evaluación de la muestra clínica, la tinción de un agente infeccioso
ya identificado mediante esa tinción, el cual funcionará como un control
positivo.
Algunas técnicas tintoriales como Gram o ZiehlNeelsen requieren antes
de su proceso la fijación de las muestras, con la finalidad de preservar
la arquitectura estructural y química de las células.
Existen dos tipos de fijadores: físicos y químicos. Entre los procesos de
fijación físicos se tienen los siguientes: desecación, calor seco, calor
húmedo, ultrasonido y microondas, mientras que los procesos de
fijación químicos se pueden clasificar como oxidantes y reductores, de
acuerdo con sus propiedades químicas.
Entre los agentes químicos oxidantes se encuentran: óxido crómico,
ácido acético, ácido pícrico, acetona, dicromato de potasio. Los agentes
químicos reductores son: formaldehído, glutaraldehído, etanol, metanol,
paraldehído, etcétera.
Quizá el método físico con mayor utilización en microbiología es el calor
seco, que consiste en exponer directamente la laminilla a la fl ama del
mechero, con esto se logra detener los procesos vitales de las células
y los microorganismos. Sin embargo, la sobreexposición, o la exposición
en una zona incorrecta de la flama (zona fría, zona caliente y zona de
fusión) repercutirá en el efecto deseado; es muy común provocar
alteraciones morfológicas y destrucción celular. Este método preserva
el extendido por poco tiempo, por lo que se recomienda utilizar un
método químico, que precipite proteínas, antes de teñir.
Materiales y reactivos:
 Asa de platino
 Cultivo de escherichia coli
 Microscopio
 Cultivo de staphylococcus
aureus
 Portaobjetos
 Cultivo de candida albicans
 Aceite de inmersion
 Colorante violeta cristal de
Gram
 Solución decolorante alcohol-acetona
 Safarina de Gram
 Yodo de Gram o Lugol para gran

Procedimiento:
Frotis
1. Colocar una gota de agua en el centro de un portaobjetos, hacerlo
con el asa de siembra
2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas una
pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a
la gota de agua. Remover la mezcla con el asa sembradora hasta formar
una suspensión uniforme que este extendida para facilitar el secado. Si
la muestra se toma de un cultivo en caldo, no es necesario realizar los
2 pasos ya que basta con colocar y extender la gota con la suspensión
bacteriana.
3. Esperar a que el líquido se evapore o acelerar la evaporación
manipulando el portaobjetos con una pinza y el mechero de bunsen
(tener sus precauciones)
Tinción
1. Preparar el frotis bacteriano
2. Teñir con cristal violeta 1 minuto
3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante
4. Cubrir con Lugol 1 minuto
5. Lavar con agua el exceso de Lugol
6. Decolorar con alcohol-acetona o con alcohol simple hasta que la
preparación deje de perder color (aprox. 30 segundos)
7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente
8. Teñir con zafarina 1 minuto
9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste
10. Secar la preparación
11. Examinar al microscopio con aceite de inmersión, fijarse en los
detalles

Observaciones:
De nueva cuenta, no tenemos muchas observaciones pues al
momento de realizar la práctica en un principio empacamos todo
el material y después preparamos el agar, cosa que ya hemos
llevado haciendo por vario tiempo.
Esta práctica no la realizamos en un solo día pues, como ya
sabemos, los cultivos deben dejarse reposar mínimo durante 48
horas.
El frotis y la tinción se realizó el lunes, o sea 2 días después de la
práctica.
En este laboratorio si nos dejan usar el puente, que se usa cuando
debes de usar cuando debes de lavar el exceso de la tinción en el
portaobjetos.
Las tinciones usadas fueron Zafarina y Lugol.

Resultados:
Bibliografías:
 http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf
 http://microbiologiaulat2013.blogspot.com/2013/12/tincion-de-
Gram_7.html?m=1

Actividades:
1. ¿Qué es un frotis?
Un frotis es un mecanismo científico que consiste en el extendido
de una gota en la superficie de un portaobjetos o de un
cubreobjetos, con el fin de analizarla posteriormente.
2. ¿Cuál es el objeto de fijar la muestra de microorganismos en el
portaobjetos?
Se fija el frotis por calor o por agentes químicos. Con las
siguientes finalidades:
- Se evita la deformación de las células con el colorante.
- Para posicionar las estructuras internas y externas de la célula
- Además se mata al microorganismo.
- Preserva la morfología general pero no las estructuras internas.
-Protege la subestructura fina y la morfología de los
microorganismos delicados de mayor tamaño
3. ¿Por qué se tiñen las muestras bacterianas?
La tinción bacteriana tiene dos propósitos fundamentales:
a) Identificar la bacteria (Gram positiva o Gran negativa).
b) Con base en la identificación, indicar el tratamiento correcto (los
antibióticos no funcionan por igual para bacterias Gram positivas
que Gram negativas).
Además tincionar las bacterias es importante para poder verlas en
el microscopio, dependiendo el tipo de bacterias se tinciona de
cierta manera siguiendo un protocolo.
4. ¿Cuál es el objeto de usar el aceite de inmersión?
El aceite de inmersión tiene aproximadamente el mismo índice de
refracción que el vidrio y con el se elimina casi completamente los
rayos de la luz y aumenta en gran cantidad la eficacia del uso del
microscopio.
Al ofrecer un índice de refracción similar al del vidrio, el objeto
aparece como "incluido en el vidrio del objetivo" eliminando el
efecto reflector del vidrio exterior del. Eso permite lograr mucho
mayores aumentos con menor distorsión esférica, menor
aberración cromática y mayor luminosidad o "abertura de pupila".
5. ¿Cuál es el colorante primario de la tinción de Gram?
Violeta cristal
6. ¿Cuál es la función del yodo en este proceso?
El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución
acuosa con el cristal violeta. El lugol es un compuesto formado
por yodo en equilibrio con yoduro de potasio, el cual está presente
para solubilizar el yodo, y actúa de mordiente, haciendo que el
cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula
bacteriana.
7. ¿Cuál es la coloración de las bacterias Gram positivas?
Las Bacterias Gram positivas. Poseen una pared celular gruesa
con numerosas capas de peptidoglucano, las cuales retienen el
colorante cristal violeta. Algunas de estas bacterias se rodean
además de una cápsula o cubierta gruesa y viscosa de
polisacáridos. AZUL
8. ¿Qué color tiener las bacterias Gram negativas?
Las Bacterias Gram negativas. Poseen una pared celular fina y
una segunda membrana lipídica denominada membrana externa,
la cual no retiene el colorante cristal violeta, como en Escherichia
coli, de ahí que tome una tonalidad de color rosado.
9. Enlista 3 bacterias Gram positivas y la enfermedad que causan
Erisipelotricosis: es una infección cutánea de lento desarrollo
causada por la bacteria Erysipelothrix rhusiopathiae.
A pesar de que la Erysipelothrix rhusiopathiae crece
principalmente en un medio con materia muerta o en
descomposición, también puede infectar a insectos, moluscos,
peces, aves y mamíferos.
- Listeriosis: es una enfermedad causada por Listeria
monocitogenes, da lugar a una sintomatología diversa de acuerdo
con el lugar en que se produce la infección y la edad de la persona
afectada.
La Listeria se encuentra en todo el mundo, tanto en el ambiente
como en los intestinos de los pájaros, las arañas, los crustáceos
y los mamíferos no humanos.
- Ántrax: es una enfermedad causada por la bacteria Bacillus
anthracis, que puede infectar la piel, los pulmones y el aparato
gastrointestinal.
El ántrax es una enfermedad muy contagiosa y potencialmente
mortal. Por lo general, pasa a las personas a través de algunos
animales, en especial las vacas, las cabras y las ovejas.
10. Enlista 3 bacterias Gram negativas y la enfermedad que
causan
a) Las Enfermedades Vasculares se caracterizan por la invasión de los haces
vasculares los cuales se llenan de bacterias y producto de su metabolismo
obstaculizan el flujo de agua y nutrientes a través de toda la planta,
provocando su marchitamiento y muerte. Por ejemplo: Erwinia trachephila.
b) Las Enfermedades Parenquimáticas, aquí Las bacterias invaden los
tejidos suculentos y después de invadir los tejidos vasculares adyacentes
provocando tizones, necrosis o manchas foliares. Por ejemplo:
Pseudomonas syringae pv. phaseolícola.
c) Las Enfermedades Hiperplásticas, aquí las bacterias invaden cualquier
parte de la planta, luego secretan sustancias reguladoras de crecimiento
(Auxinas, Giberelinas, etc.), las cuales, debido a su adicción, a la cantidad
normal de la planta, causan aumento y división celular normal del tejido
afectado, causando excesiva proliferación de tejidos (tumores) y formación
de órganos adicionales.