UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA

MATERIA:

ANÁLISIS INSTRUMENTAL II

TEMA:

INTRODUCCIÓN DE HPLC, COMPUESTOS DE ANÁLISIS,

FASE MÓVIL (TIPOS DE FASE NORMAL, FASE REVERSA,
CAMBIO IÓNICO, POR EXCLUSIÓN DE TAMAÑO,
GRADIENTE) COLUMNA LC

INTEGRANTES:

 MARITZA GUERRERO ACOSTA

 LISBETH CAMPUZANO CAMPUZANO
 NICOL PAZMIÑO
 ERIKA GUZMÁN
 ALEXANDRA CHEME VALENCIA
 DOCENTE:
 Q.F MAGALY DEFAZ OROZCO.

GRUPO: 4C
SÉPTIMO SEMESTRE CII
AÑO LECTIVO
2018 – 2019
CROMATOGRAFÍA EN FASE REVERSA:

La cromatografía de fase reversa es, con gran diferencia, la técnica de

separación por cromatografía líquida más utilizada actualmente en el laboratorio
y su popularidad se refleja en la amplia selección de columnas que ofrece Waters
en la actualidad (Carranza. L, 2015).
En su forma más sencilla, en la cromatografía de fase reversa se combinan una
fase móvil polar, normalmente una mezcla de agua o solución tampón con
eluyentes polares como el metanol, el acetonitrilo o el tetrahidofurano, y una fase
estacionaria no polar como hidrocarburos de cadena larga unidos a un soporte
de sílice o híbrido. En los últimos años, se ha destinado una gran cantidad de
trabajo en los campos de la investigación y el desarrollo al área de las fases
estacionarias con el fin de mejorar la eficacia de las columnas y la estabilidad
frente al pH y de proporcionar selectividades alternativas.
Las químicas de columnas modernas de Waters se pueden clasificar de manera
general en tres categorías:

 Híbrida: diseñada para obtener una estabilidad máxima frente al pH y

ofrecer opciones de desarrollo de métodos más flexibles.
 Sílice: históricamente, el soporte de fase reversa más utilizado; se
sintetizan a partir de materias primas y están diseñados para obtener una
capacidad de carga máxima. Intervalo de pH: 2-7
 Específica de la aplicación: diseñadas para un área de aplicación
específica, como las columnas Atlantis®, y para obtener una mejor
retención de las moléculas polares.

CROMATOGRAFÍA EN FASE NORMAL.

Antes del desarrollo de las fases enlazadas de fase reversa, la cromatografía en

fase normal era la técnica de separación más popular. Se basa en la interacción
de los analitos con grupos funcionales polares de la superficie de la fase
estacionaria, que alcanza su potencia máxima cuando se utilizan eluyentes no
polares como fase móvil.
La cromatografía en fase normal es una herramienta de separación muy potente
debido a la amplia gama de eluyentes disponibles que se pueden utilizar para
ajustar con precisión la selectividad de una separación. Sin embargo, muchos
cromatografistas han dejado de utilizarla debido a su complejidad. En
determinadas circunstancias, existe un período de equilibrado prolongado o
problemas de reproducibilidad que se deben principalmente a la sensibilidad de
la técnica a la presencia de pequeñas concentraciones de contaminantes polares
en la fase móvil. Si estos problemas se controlan, la técnica normalmente
proporciona unos cromatogramas mejores a los que se obtienen con los métodos
de fase reversa debido a la baja viscosidad de los eluyentes que se utilizan
habitualmente (Carranza. L, 2015).

CROMATOGRAFÍA HPLC DE INTERCAMBIO IÓNICO.

La cromatografía de intercambio iónico (IEC, ion exchange chromatography)
permite separar compuestos de naturaleza iónica (aniones o cationes). La fase
estacionaria está formada por una resina o un gel que contiene grupos cargados,
que son neutralizados por los iones de la fase móvil (contraiones, counter ions,
por ejemplo, Na+ ). De esta manera, si el analito contiene grupos de carga
opuesta a la fase estacionaria este se retiene en la columna. Si se hace pasar
una fase móvil que contenga una sal, el aumento de la fuerza iónica del medio
permite eluir los analitos de la columna de forma diferencial, aunque el orden de
elución es con frecuencia difícil de predecir. Las columnas de intercambio iónico
suelen tener base de sílice (con capacidad máxima de intercambio de 1 meq/g)
y estireno-divinil-benceno (3 meq/g). No obstante, como la densidad de la sílice
es mayor, la capacidad de intercambio de ambos sistemas es similar. Los
intercambiadores pueden ser aniónicos (atraen aniones) o catiónicos (atraen
cationes). Existen intercambiadores fuertes (están ionizados a cualquier pH, por
ejemplo, los que contienen grupos sulfato o aminas cuaternarias) o débiles (su
estado de ionización depende del pH, por ejemplo, los que contienen grupos
carboxílicos). La retención se basa en la afinidad de los diferentes iones por los
puntos de intercambio. Se utilizan fases móviles tamponadas que proporcionan
contraiones, permiten controlar el pH y variar la fuerza iónica del medio. En
general, para disminuir la retención de un analito existen varias estrategias: –
Cambiar el pH de la fase móvil para formar especies neutras. – Aumentar la
fuerza iónica de la fase móvil. – Aumentar la temperatura.
La retención de un compuesto en una columna de intercambio catiónico se ve
afectada por el catión (contraión) elegido en la fase móvil. La capacidad de
desplazamiento de los cationes sigue el orden: Li+ < H+ < Na+ < NH4 + < K+ <
Rb+ < Cs+ < Ag+ < Mn2+ < Mg2+ < Zn2+ < Co2+ < Cu2+ < Cd2+ < Ni2+ < Ca2+
< Sr2+ < Pb2+ < Ba2+. En el caso de las columnas de intercambio aniónico, la
capacidad de desplazamiento de los aniones sigue la secuencia: fluoruro < OH-
< acetato < cloruro < tiocianato < bromuro < cromato < fosfato < nitrato < borato
< yoduro < oxalato < sulfato < citrato. Se trata de una técnica muy útil para
cromatografiar iones inorgánicos y orgánicos, proteínas, etc. En la figura 19.18
se muestra la separación de una mezcla de aniones mediante cromatografía de
intercambio iónico. Ejemplos representativos de este tipo de cromatografía son
la determinación de aniones en agua de bebida, de nitratos en vegetales, de
fluoruros en pasta de dientes, de amonio y nitratos en fertilizantes, o de sodio y
potasio en muestras clínicas (transfusiones). Con iones más grandes, y muy
especialmente con tensioactivos iónicos, la cromatografía de par iónico da mejor
resultado que la de intercambio, debido fundamentalmente a una mejor difusión
interna y a una menor adsorción irreversible de los analitos (que impide su
elución).
CROMATOGRAFÍA HPLC DE EXCLUSIÓN.
También es posible separar los analitos en función de su tamaño molecular. Se
utilizan rellenos porosos para que los solutos penetren más o menos en la matriz
según su tamaño molecular. Se emplean fundamentalmente dos tipos de fases
estacionarias: materiales poliméricos (poliestireno-divinilbenzeno) y materiales
basados en sílice. Se han desarrollado rellenos basados en gel de sílice, con
poros desde 60 Å hasta 20.000 Å (6-2.000 nm), adecuados para disolventes
polares y apolares. A menor tamaño molecular, más penetración y mayor tiempo
de residencia en la columna, es decir, mayor retención. Esta técnica se conoce
abreviadamente como SEC (size exclusion chromatography) cuando se aplica a
proteínas y otros compuestos biológicos o GPC (gel permeation
chromatography) cuando se aplica a polímeros sintéticos (plásticos) con fases
móviles orgánicas. El principal inconveniente es que se trata de un método de
baja resolución, ya que la separación tiene lugar en el volumen total de líquido
de la columna (Vt), por lo que el número de picos que pueden resolverse es
bastante limitado (Figura 19.20). No obstante, es muy útil para la separación de
proteínas y otras moléculas de alto peso molecular, como los polímeros. Es
importante comprobar que no haya interacción (adsorción) entre la muestra y la
fase estacionaria, ya que este hecho alteraría el orden de elución.

Una aplicación típica de esta cromatografía es la separación de sustancias

naturales de elevado peso molecular (cuando están contaminadas con sales y
especies de bajo peso molecular). Otra aplicación es la separación de series
homólogas de oligómeros (por ejemplo, ácidos grasos, oligosacáridos, etc.). En
general es recomendable una diferencia del 10% en el peso molecular de los
distintos compuestos de la serie para obtener una buena resolución. En
ocasiones la fase móvil elegida puede afectar al tamaño de un analito. También
es muy útil para la determinación del peso molecular (o la distribución de pesos
moleculares) de polímeros o sustancias naturales (por ejemplo, proteínas), como
se muestra en la Figura 19.21. Para ello los volúmenes de elución de la muestra
se comparan con los volúmenes de elución de una serie de patrones que tienen
la misma naturaleza que los componentes a analizar. (Torres, s.f.)

GRADIENTE, COLUMNA LC.

El sistema lineal de vaciado de gradientes con orificio lateral, para ocho
volúmenes diferentes. El flujo del gradiente se controla mediante una válvula de
PTFE entre las dos cámaras. El canal de flujo de salida tiene un adaptador Luer
en el lado exterior, que es compatible con todas las agujas o válvulas Luer. Los
sistemas de vaciado de gradientes pequeños, con volúmenes de 10 ó 50 mL por
lado, poseen una varilla de soporte con la que se pueden fijar a un soporte anular.
Los sistemas de vaciado más grandes permiten trabajar con volúmenes de 75,
100, 250, 500 y 1000 mL por lado (TÉCNICA, 2016).
Código Volumen Cantidad
(mL)
20447301622 20 1
20447301618 75 1
20447301617 500 1
20447301616 50 1
20447301619 10 1
20447301620 100 1
20447301621 1000 1
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC).
En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través
de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas
redondeadas con ciertas características químicas en su superficie) mediante el
bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna. La muestra
a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan
diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase
estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retención de
los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la
composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un
compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y se
considera una propiedad identificativa característica de un compuesto en una
determinada fase móvil y estacionaria. La utilización de presión en este tipo de
cromatografías incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro de la
columna y reduce así su difusión dentro de la columna mejorando la resolución
de la cromatografía. Los disolventes más utilizados son el agua, el metanol y el
acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el
ácido trifluoroacético, que ayudan a la separación de los compuestos.

Una mejora introducida en la técnica de HPLC descrita fue la variación en la

composición de la fase móvil durante el análisis, conocida como elución en
gradiente. Un gradiente normal en una cromatografía de fase reversa puede
empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de forma lineal hasta un 50% en 25
minutos. El gradiente utilizado varía en función de la hidrofobicidad del
compuesto. El gradiente separa los componentes de la muestra como una
función de la afinidad del compuesto por la fase móvil utilizada respecto a la
afinidad por la fase estacionaria.
En el ejemplo, utilizando un gradiente agua/acetonitrilo los compuestos más
hidrofílicos eluirán a mayor concentración de agua, mientras que los compuestos
más hidrofóbicos eluirán a concentraciones elevadas de acetonitrilo. A menudo,
hace falta realizar una serie de pruebas previas con tal de optimizar el gradiente
de forma que permita una buena separación de los compuestos.
Cromatografía líquida:
Con fase móvil líquida.

 Cromatografía líquido-líquido.
 Cromatografía líquido-sólido.
BIBLIOGRAFÍA
 Carranza. L. (15 de Abril de 2015). Cromatografia . Obtenido de
http://www.waters.com/waters/es_ES/Separation-
Modes/nav.htm?locale=es_ES&cid=10009385
 TÉCNICA, I. C. (20 de Marzo de 2016). Obtenido de
http://www.ictsl.net/productos/instrumental/electroforesismarcadoresdegradiente
cbs.html
 Torres, P. (s.f.). Tecnicas de analisis . Obtenido de
http://www.icp.csic.es/abgroup/web3/documentos/Tecnicas_Analisis_baja%20si
n%20ind%20analitico_0789.pdf