LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 502507

GUÍA 1: PRUEBAS DE RECONOCIMIENTO DE AMINOÁCIDOS Y

SEPARACIÓN POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA

I. EL PROBLEMA

El carácter único de cada α-aminoácido se debe a la estructura del grupo R, en los

péptidos y proteínas estos grupos R a menudo se denominan cadenas laterales y
pueden variar desde un átomo de hidrógeno, hasta grupos complejos como el
guanidino. El propósito de esta práctica es identificar algunos aminoácidos y sus
grupos característicos en las cadenas laterales por reacciones específicas
observables como cambios de color, además de usar la técnica de cromatografía
en capa delgada (CCD) para identificarlos y separarlos por su diferente afinidad por
las fases móvil y estacionaria.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Aminoácidos
Los aminoácidos tienen un papel primordial en la formación de los seres vivos por
si solos o polimerizados en péptidos o proteínas. Se conocen por sus nombres
comunes, con frecuencia estos nombres indican alguna característica física del
aminoácido, por ejemplo, el aminoácido más sencillo en estructura se llama glicina
proviene del griego “glyKos” que significa dulce, la asparragina se encontró por
primera vez en los espárragos (“asparagus” en inglés) y la tirosina se encontró en
el queso (“tyros” en griego). Así los aminoácidos se estudian con sus nombres
comunes y se clasifican de acuerdo con el tipo de la cadena lateral R, En la figura
1 se ilustra la estructura básica de los aminoácidos.

Figura 1. Estructura química de un aminoácido

Configuración de los aminoácidos

El carbono α de los aminoácidos naturales es un centro asimétrico, excepto para la

glicina, en consecuencia pueden existir como enantiómeros. La notación D y L que
se usa en los monosacáridos es también válida para los aminoácidos, en la figura
2 se representa un aminoácido en la proyección de Fischer, con el grupo carbonilo
arriba y el grupo R abajo en el eje vertical, de tal manera, que la molécula es un D
aminoácido si el grupo amino está a la derecha y un L aminoácido si el grupo amino
está a la izquierda.

Figura 2. Configuración L y D de los aminoácidos

Reacciones de identificación de los aminoácidos

Reacción con la ninhidrina

El grupo alfa-amino forma complejos coloreados con la ninhidrina: violeta-azuloso

en la mayoría de los aminoácidos cuyo grupo amino es primario, amarillo para la
prolina e hidroxiprolina, café para la asparragina que tiene un grupo amido en la
cadena lateral. Esta reacción también identifica los grupos alfa-amino presentes en
péptidos y proteínas.

Reacción de Millón

El anillo fenólico tiene un comportamiento característico frente a las sales de

mercurio a pH ácido, formando complejos color rojo ladrillo con el anillo fenólico de
la tirosina y los péptidos y proteínas que la contienen.

Reacción de Sakaguchi

El grupo guanidinio presente en la cadena lateral de la arginina reacciona con

soluciones de alfa-naftol en presencia de bromo en medio alcalino formando
complejos coloreados rosados o rojos.

Reacción de Ehrlich

La presencia de anillos aromáticos fenólicos o nitrogenados en la cadena lateral de

los aminoácidos se puede identificar mediante la reacción con ácido sulfanílico y
nitrito de sodio por formación de sales de diazonio fuertemente coloreadas
permitiendo así detectar la presencia de tirosina e histidina libres o formando
péptidos y proteínas.
Cromatografía

La Cromatografía se define como un método de separación relativamente rápido,

basado en la distribución selectiva de las sustancias a separar, entre dos fases
inmiscibles, denominadas FASE ESTACIONARIA y FASE MÓVIL. Las dos fases
deben permanecer en contacto pero no deben mezclarse. Con base en lo anterior,
la denominada FASE ESTACIONARIA, normalmente es un material SÓLIDO
granulado , poroso y adsorbente sobre una delgada capa de un soporte de vidrio,
metal u otro material inerte, y la FASE MÓVIL es un LÍQUIDO constituido por un
solvente o mezcla de solventes .Estas características del sistema cromatográfico,
lo hacen altamente eficiente para separar mezclas de sustancias que tienen gran
semejanza en su estructura química y sean afines con las dos fases del sistema, lo
cual no es posible por otros métodos como el de destilación o extracción con
solventes ya estudiados en cursos previos. La separación se fundamenta en
diferentes principios como la absorción, adsorción, reparto y arrastre mecánico, de
tal manera que se establece una competencia entre las dos fases por las sustancias
a separar, la fase móvil "lavará" a estas con diferente eficiencia, de modo que
aquellas que "prefieren disolverse" en la fase móvil se moverán rápido, mientras las
que sean preferencialmente solubles en la fase estacionaria se moverán menos.
Existen diferentes tipos de cromatografía: sobre papel, en capa delgada (CCD),
también llamada TLC (de la sigla en inglés para thin layer chromatography), en
columna, cromatografía de gases y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC
de la sigla en inglés).

III. MATERIALES Y REACTIVOS

1. CROMATOGRAFÍA
TRAER LÁPIZ DE GRAFITO ( no portaminas) Y REGLA EL DÍA DE LA
PRÁCTICA

TRAER MASCARILLA CON FILTRO PARA SOLVENTES,ESTA SE COLOCA

MIENTRAS SE ABRA LA CÁMARA

Materiales 3 Cámaras para cromatografía

1 Placa de celulosa
10 Tubos capilares para aplicación de muestras
1 Bandeja para colorear
1 pipeta graduada de 10 mL
1 vaso de precipitados de 250 mL
2 vasos de precipitados de 100 mL
2 probetas de 100 mL
1 espátula
El volumen del solvente requerido depende del tamaño y número de las cámaras
de revelado que se dispongan para la práctica.
Solventes ( fase móvil): butanol-acetona-ácido acético-agua (28:28:6:18)
300 mL solución reveladora de ninhidrina en etanol y acidulada (PREPARADA EL
MISMO DÍA)

50 mL Soluciones patrón de los siguientes aminoácidos: valina, histidina, triptófano,

leucina, acido aspártico, lisina, metionina, prolina, serina, ácido glutámico, arginina,
cisteína, asparragina, lisina, fenilalanina, isoleucina y alanina. (Ver método de
preparación)

Cinco bandejas de metal (o de disección) para adicionar la ninhidrina.

2. REACCIONES DE RECONOCIMIENTO

Las soluciones están propuestas para cada grupo de trabajo en el laboratorio, por
ejemplo 10 mL de ninhidrina para un grupo, si el curso es de 8 grupos se requieren
máximo 80 mL de ninhidrina.

Materiales

12 Tubos de ensayo
2 Pipetas graduadas de 1 mL.
2 Pipetas graduadas de 2 mL.
2 Pipetas graduadas de 5 mL.
2 Vasos de precipitados de 250 mL.
1 Vaso de precipitados de 600 mL.
1 Embudo ordinario
1 Erlenmeyer de 125 mL.
1 Gradilla para tubo de ensayo
1 Pinza metálica para tubo de ensayo
1 Placa refractaria
1 Aro con nuez

Material de uso general

Soportes

Para prevenir la contaminación de los reactivos: las soluciones que no estén en

frasco gotero deben tener una pipeta exclusiva y el monitor debe estar pendiente,
que las pipetas no las intercambien durante al práctica.

Reactivos por cada grupo de trabajo:

10 mL de Ácido acético concentrado
Se requiere la preparación de los siguientes reactivos:
10 mL de reactivo de ninhidrina : disolver 100 mg. de nilhidrina en 10 mL. de etanol
a 95% y completar a 100 ml con agua destilada
10 mL de reactivo de millon: disolver 1 g de mercurio en 1 mL. de ácido nítrico
concentrado,calentar suavemente, dejar enfriar y completar a 60 mL con agua
5 ml}L de reactivo de sakaguchi: cuidadosamente disolver 2 g. de bromo en 100
mL. de NaOH al 5%

Soluciones

10 ml de Hidróxido de amonio 10%

20 ml de Ácido clorhídrico 2%.
20 ml de Sulfato de cobre 0.5%.
10 ml de Nitrito de sodio 0.5% (fresco).
10 ml de Ácido sulfanílico 0.5% en HCl.
50 ml de Alfa-naftol 0.15%.
15 ml de Soluciones al 0.1% en agua acidulada de los aminoácidos disponibles en
el laboratorio como:
Cisteína o metionina.
Glutamina o asparragina.
Lisina u ornitina.
Tirosina.
Fenilalanina.
Prolina.
Arginina.
Histidina.
Triptófano.
Alanina.

Posibles muestras proteicas a seleccionar por su profesor:

Clara de huevo: separar la clara de un huevo y diluir en relación 1: 10 en cloruro
de sodio al 1%.
Yema de huevo: separar la clara de un huevo y diluir en relación 1: 10 en cloruro
de sodio al 1%.
Harina de trigo: dispersar 10 g. de harina de trigo en 100 mL. de agua caliente y
filtrar a través de gasa doble.
Albúmina sérica bovina : solución al 2% en cloruro de sodio al 1%

IV. PROCEDIMIENTO

1. CROMATOGRAFÍA
Precauciones: use guantes y gafas durante toda la práctica, colóquese la mascarrilla
al abrir la cámara, mantener la cámara de cromatografía tapada y cuando sea
necesario destaparla hágalo rápidamente y tape de nuevo. Una vez puestas las
placas en la cámara NO LA MUEVA DE SU LUGAR.
Para la extracción de aminoácidos a partir de muestras vegetales puede usar las
siguientes técnicas:

Extracción etanólica de aminoácidos presentes en espinaca

Pese en un vidrio de reloj 5 g de material vegetal (espinaca) seco y finamente
picado, transfiéralos completamente a un mortero y realice dos extracciones, cada
una con 15 mL de etanol al 70%. Centrifugue los extractos etanólicos y reúnalos en
un vaso de precipitados de 100 mL, luego al baño maría o directamente en un
pequeño vaso de precipitados evapore el etanol hasta una cuarta parte del volumen
original (esté siempre pendiente para no secar la muestra) y guarde
cuidadosamente.

Para el monitor: Método de preparación de los patrones de aminoácidos

Preparar las soluciones de los siguientes aminoácidos patrones, suspendiendo 1
mg (0,99) de cada aminoácido en 2,5 mL de solución metanol:agua (50:50, v/v) a
pH 1,7. Calcular que la solución de cada aminoácido patrón sea del 39,6 % (m/v).

Coloque 10mL de la fase móvil (mezcla de solventes) en cada una de las cámaras,
tápelas y déjelas en reposo mientras prepara las cromatoplacas.

Preparación de las cromatoplacas

Tome una cromatoplaca e identifique la parte donde está la celulosa (fase

estacionaria), con un lápiz trace una línea a 1,5cm del borde inferior; (Observe las
figuras 3 y 4) esta será la línea de siembra. Según las instrucciones del profesor
aplique con un tubo capilar sobre las líneas de siembra, cinco gotas del extracto
etanólico preparado en el procedimiento anterior (espinaca) y tres gotas de cada
uno de los aminoácidos patrón en el lugar correspondiente; seque la placa en la
estufa. Una vez hayan secado las gotas aplicadas, introduzca lo más rápidamente
posible con cuidado y de manera perpendicular la placa en la cámara de
cromatografía que contiene la fase móvil, tape la cámara. Cerciórese que los
solventes hayan quedado por debajo de la línea de aplicación y deje que asciendan
por la placa hasta el límite superior de la misma. Una vez hayan ascendido
completamente, seque en la estufa a 100ºC, pase la placa por la bandeja con la
solución reveladora de ninhidrina y seque nuevamente a la misma temperatura por
cinco minutos o hasta que desarrolle el color. Encierre las todas las manchas con
lápiz, marque el centro de las mismas. Calcule el Rf como se indica en la figura 5.
Marque las placas y envuélvalas en película plástica para entregarlas con el informe.

Figura 3. Recorte de las placas cromatográficas

 Figura 4. Pasos para sembrar y correr las placas.

cm

Figura 5. Cálculo del RF

2. REACCIONES DE RECONOCIMIENTO
*Realice todos los ensayos en tubos limpios y secos

Ensayo con ninhidrina

Rotule tres tubos de ensayo identificando cada uno como: blanco, alanina y muestra
proteica. A cada uno de los tubos de ensayo agregue 1mL de las respectivas
sustancias que indica el rótulo usando agua destilada para el tubo marcado como
blanco. Adicione a cada tubo 1 mL de reactivo de Ninhidrina, caliente en baño de
agua a ebullición por 10 minutos. Observe los colores desarrollados y anote los
resultados.
Ensayo de Millon

Rotule 4 tubos de ensayo identificados cada uno como: blanco, tirosina, fenilalanina,
y muestra proteica. A cada uno de ellos agregue 2mL de la solución correspondiente
y 1mL de reactivo de Millon. Caliente en baño de agua en ebullición por 10 minutos.
Observe los colores desarrollados y anote los resultados.

Reacción de Sakaguchi

Rotule 3 tubos de ensayo como: blanco, arginina y muestra proteica.

Agregue a cada uno 5mL. de las soluciones correspondientes, enfríe en baño de
hielo por 10 minutos y luego adicione 1mL de NaOH 40%, deje enfriar 10 minutos
más y luego agregue 5mL de α-naftol y 3 gotas de Reactivo de Sakaguchi, la
aparición de un color rosado o rojo es prueba positiva para el grupo guanidinio.
Observe y anote los resultados.

Reacción de Ehlrich

En 5 tubos de ensayo rotulados como: blanco, triptófano y muestra proteica.

Agregue a cada tubo en el siguiente orden: 1 mL de ácido sulfanilico 0.5% y 1 mL
de nitrito de sodio, mezcle bien y deje en reposo durante 15 minutos luego a cada
tubo agregue 1 mL de la solución correspondiente al rótulo. Mezcle y adicione a
cada tubo 0.5 mL de NH4OH 10%.Observe y anote los resultados.

V. BIBLIOGRAFÍA

Bohinski. Robert. 1991. Bioquímica. 5ed. México: Pearson.

Brieger, Gottfried. 1970. Química Orgánica Moderna. Curso Práctico de Laboratorio.

España: Harper y Row Publishers INC.

Daniels, Farrintong. 1972. Curso de Fisicoquímica Experimental. Centro Regional

de Ayuda Técnica AID. Españ: McGraw-Hill.

Fessenden, Ralph y Joan S. Fessenden. 2002. Química orgánica. México:

Interamericana.

Mathews, Christopher K y Van Holde, K.E. 2004. Bioquímica. 3 ed. España:

Pearson

Pecsok, Robert & Shields, Donald. 1970. Modern Methods of Chemical analysis.
Estados Unidos: John Wiley & Sons.

Skoog, D.A. y West D.M. 1999.Química analítica. 7 ed. España: Reverte.

 PREINFORME

Nombre _____________________________ Grupo ________________________

I. CUESTIONARIO DE CONSULTA PARA EL PREINFORME

Responda las siguientes preguntas en forma concreta, ordenada y con citas en

normas APA:

1) Consulte los nombres, símbolos, estructuras desarrolladas y la clasificación de

los aminoácidos proteicos desde los siguientes puntos de vista y realice una tabla
ilustrativa clasificándolos en: esenciales y no esenciales para el hombre, ácidos y
básicos, aromáticos, alifáticos, iminoácido, azufrados, hidroxilados, polares con
carga y sin carga y apolares. (*se recomienda estudiar los aminoácidos y
clasificaciones porque esto es un factor de éxito para su primer examen parcial).

2) Dentro de la anterior tabla, para cada aminoácido, encierre la cadena lateral o el

grupo R e identifique los grupos funcionales presentes.

3) Defina oligopéptido, péptido y proteína.

4) Realice una tabla de composición de aminoácidos en la espinaca y en su muestra

proteica para reacciones de reconocimiento.

5) ¿Describa la naturaleza química de la celulosa y tipos de sustancias que pueden

usarla como fase estacionaria en la CCD?

6) ¿Cómo se mide el Rf y para qué se utiliza?

II. RESULTADOS ESPERADOS Y DIAGRAMAS DE FLUJO

1.Separación e identificación de aminoácidos por cromatografía

Complete el resultado esperado

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Diagrama de flujo
2. Identificación de aminoácidos por reacciones cualitativas

Reacción con la ninhidrina

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Reacción de Millón
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Reacción de Sakaguchi
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Reacción de Ehrlich
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III. Fichas técnicas.

Propiedades de los reactivos a usar en el laboratorio (incluya las filas

necesarias para los solventes de la fase móvil y sustancias que componen
los reactivos para reacciones de reconocimiento).

LOS AMINOÁCIDOS NO SON PELIGROSOS POR LO TANTO NO SE LES HACE

FICHA

Aspe Peligrosida Primeros auxilios y medidas Forma de

Nombre Fórmula
cto d* de higiene eliminación
*Indique la peligrosidad con el símbolo correspondiente: explosivo (E), comburente
(O), inflamable (F), extremadamente inflamable (F+), tóxico (T), muy tóxico (T+),
corrosivo (C), nocivo (Xn), irritante (Xi) y/o peligroso para el medio ambiente (N).
 PAUTAS PARA LA ELABORACIÓN DEL INFORME

I. TABLA DE DATOS

1.CROMATOGRAFÏA

Completa la siguientes tabla de datos para la cromatografia

Cromatografía del extracto etanólico

Compuesto No Distancia al Distancia al Rf Nombre

* centro de la límite del del
mancha solvente compuesto
probable

*Calcule los valores de Rf de todas las señales obtenidas de los patrones y la

muestra.

2. REACCIONES DE RECONOCIMIENTO
Construya una tabla por cada reactivo de reconocimiento, evite limitarse a escribir
tubo 1, tubo 2,etc, describa en forma organizada las observaciones en cada tubo y
si la prueba puede considerarse positiva o negativa. Luego de las tablas incluya
fotos claras de tubos debidamente marcados( muestra, reactivo y nombre de quién
realizó la prueba)

II. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

A continuación encuentra pautas para discutir, explicar y no solo describir sus

resultados, recuerde que no es simplemente un cuestionario a responder, redacte
con base en citas de autores confiables, haciendo llamados a fotos y tablas.

1.CROMATOGRAFIA

Determine la cantidad de aminoácidos diferentes que encontró por cromatografía

en la muestra de espinaca.
Compare los valores de Rf de las señales obtenidas en la espinaca con los
correspondientes patrones e identifique hasta donde sea posible los aminoácidos
presentes.
Consulte en la literatura, los valores de Rf para sistemas cromatográficos similares
(fase estacionaria y fase móvil similar) y analice qué tan válida es la comparación
con los valores por usted obtenidos.
Realice las estructuras de todos los aminoácidos usados en la práctica, analice las
estructuras y establezca cuál fue el orden de migración, es decir ¿cuáles
aminoácidos migraron más, los polares con carga, polares sin carga, o los apolares
y por qué cree usted que fue así de acuerdo con las condiciones de la cromatografía
en cuanto a polaridad de la fase estacionaria y móvil?.

2.PARA CADA PRUEBA DE RECONOCIMENTO DE AMINOÁCIDOS

Describa el fundamento químico de la prueba realizada.

Encierre y nombre el o los grupos funcionales que reaccionaron o los responsables
de la coloración positiva del ensayo con aminoácidos o proteína, use imágenes de
fórmulas estructurales desarrolladas.
Realice la ecuación de la reacción química correspondiente con él o los aminoácidos
particulares que pudo identificar, no con R.

Realcione con toda la información del preinforme:consulta y resultado esperado.

*Recuerde explicar tanto las pruebas positivas o negativas.

II. BIBLIOGRAFÍA.

Enuncie la bibliografía utilizada como apoyo para la elaboración de la discusión de

los resultados (Normas APA).