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PRÁCTICA: determinación de

aminoácidos terminales con grupo alfa


amino libre. Método de sanger

Carreón F. Valery, Corro I. Edgar A.

Resumen: se realiza el método de sanger para demostrar que grupo de aminos se encuentra en la hemoglobina bovina y
comparar con las muestras de VAL. DNFB, ASP Y PHE, que grupo amino contiene esa muestra de hemoglobina

Introducción: La determinación de la estructura primaria Se acidifico el medio con HCl 3N para detener la reacción
de una proteína suele denominarse secuenciación. del (DNFB) con la hemoglobina en medio alcalino que
Existen varias maneras de determinar la secuencia de realizamos anteriormente, se extrajo con éter para
aminoácidos. El primero en lograr esto fue Frederick separar en dos fases, la orgánica que es nuestra
Sanger, quién diseño un método, el cual consiste en el sustancia problema que contiene aminoácidos
marcaje del amino terminal a través del uso de DNFB. dinitrofelinados, y la etérea la cual hace que se eliminen
Este compuesto químico color amarillo reacciona con los los residuos del (DNFB) que no reaccionaron en la etapa
grupos amino libres en condiciones ligeramente básicas anterior de nuestra reacción, posteriormente se agregó
formando los dinitrofenil derivados (DNP-aa), también HCl 6N para realizar una hidrolisis acida, que al aplicar
reaccionará con los grupos imidazol, fenólicos y temperatura y presión en el autoclave esta provee que los
epsilonamino, por lo que se dará una dinitrofenilación en aminoácidos libres y dinitrofenil derivados puedan
la cadena lateral de la tirosina, histidina y lisina. Al extraerse del hidrolizado.
hidrolizar el péptido o la proteína ya dinitrofenilada, se da Para identificar y separar el grupo amino terminal de la
una ruptura total de los enlaces peptídicos lo que nos da hemoglobina, se utilizo el extracto obtenido en la
como resultado un hidrolizado que contendrá hidrolisis y con éter se extrajo nuestra sustancia problema
aminoácidos libres y DNP derivados que se conservan calentamos los extractos etéreos en una parrilla con el fin
intactos, ya que su enlace es más difícil de romper. Los de evaporar el éter que hay en nuestra sustancia para
DNP de aminoácidos terminales, a diferencia de los que nuestro problema estuviera concentrado y sin
demás DNP y de los aa’s libres, son no polares por lo que residuo alguno de las sustancias anteriores que
se pueden extraer muy fácilmente con un disolvente no utilizamos, disolvimos en alcohol absoluto para la
polar. Estos DNP son sometidos a cromatografía, y se aplicación en cromatografía nuestro DNP-problema, que
determina al aminoácido amino terminal de la proteína en es el grupo amino terminal de la hemoglobina.
comparación con otros DNP derivados. Edman utilizó una
técnica similar a la de Sanger, utilizando el Para la aplicación de nuestro problema en la
fenilisotiocianato para marcar al grupo amino del aa cromatografía, se realizó con papel Whatman; aplicamos
terminal, a diferencia de Sanger, al hidrolizar la proteína las muestras de DNP-Glu, DNP-Ala , DNP-VAL, DNFB y
únicamente rompía el enlace entre el aa terminal y el nuestra sustancia problema para identificar y hacer una
comparación de cuál de estas sustancias que colocamos
resto de la de la cadena, la cual permanecía intacta, por
es nuestro aminoácido con grupo α-amino terminal.
lo que la secuenciación se facilita.
En donde se colocaron estos estándares [DNP-
Objetivos: Identificar el aminoácido alfa-amino terminal
derivados]. Al revelar el cromatograma se encontraron
de las cadenas de la molécula de hemoglobina mediante
dos manchas en la corrida del problema, uno
el método de Sanger.
correspondiente al DNP-Valina y el otro corresponde al
Interpretación del procedimiento: DNFB sin reaccionar. Hubo unas ligeras diferencias entre
la corrida del problema y de los DNP-derivados. Estas
Cuando se le adiciona bicarbonato de sodio al 4% a la diferencias se pueden deber a la temperatura ambiente
hemoglobina, realizamos un medio alcalino el cual la cual hace que acelere o sea más lento cuando el
favorece la reacción, posteriormente al agregar el cromatograma corre en el disolvente. Además el
reactivo de Sanger 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (DNFB) problema presento DNFB, lo cual se debe a los restos de
agitamos el tubo para favorecer la reacción y así obtener DNFB que se quedaron en la muestra debido a que no se
DNP derivados de la hemoglobina. extrajo en su totalidad antes de la hidrólisis que se hizo
con el fin de eliminar todo este exceso.

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El método de Sanger es muy útil para identificar solo un
aminoácidos alfa amino terminal de las cadenas de las
moléculas de las proteínas, en este caso dela
hemoglobina. Es muy método muy preciso y confiable
pero tiene la desventaja de ser muy tardado, si se
comprar con los métodos de identificación actuales
resulta ser un poco obsoleto. La cromatografía revelo la
afinidad que tienen diferentes aminoácidos y el DNFB
con la hemoglobina.

Ilustración 1: metodo de sanger en la hemoglobina BIBLIOGRAFÍA.

Fonaguera J. y G. Gómez (2004), “BIOQUIMICA:


LACIENCIA DE LA VIDA”, Editorial de la Universidad
Resultados:
Estatal a Distancia (2004).
Rf = distancia recorrida por el soluto / distancia recorrida
Nelson, D.L. y Cox, M.M. (2005). Lehninger “Principios de
por el solvente
Bioquímica” 4ª Edición. Ed. Omega.
COMPUESTO Rf
Donald Voet, Judith G. Voet. 2006 Fundamentos de
DNP-Asp bioquímica 2da edicion Editorial Panamericana Pags.
DNP-Val 109-110.
DNP-Glu Lehninger, A,L. “Principios de Bioquimica”. Editorial
DNFB Omega,España
PROBLEMA
Enrique Battaner Arias, 2012 Biomoleculas 1ra. Edición.
Tabla 1: resultados de Rf obtenidos Ediciones Universidad de Salamanca.España. Pags.
290- 292.

Discusión:

En base a lo realizado en la práctica, la reacción de


sanger nos ayudó a identificar el grupo α-amino terminal
de la hemoglobina, poniendo en evidencia la coloración
amarilla característica de esta prueba, esta gracias al
proceso intermedio llamado Dinitrofenilacion, que es la
adición del grupo Dinitrofenil al amino terminal de la
proteína. El proceso de identificación consto de en una
cromatografía en papel, colocando en él, cada uno de
los derivados dinitrofenilados de los aminoácidos tipo
DNP-Asp, DNP-Val, DNP-Glu, DNFB, solución
problema, notando una similitud entre la solución
problema y la solución de valina, la cual se confirmó con
cálculos de Rf, donde la valina fue el dato más cercano
al del problema denotando así a este aminoácido como
el que contiene el grupo alfa-terminal de la proteína de
la hemoglobina, igualmente se observó la aparición de
una mancha que por medio de Rf que indico la
presencia de DNFB que no reacciono lo cualquier decir
que los lavados no se hicieron correctamente.

Conclusión:

El aminoácido N-terminal de la hemoglobina es la Valina.


La técnica de Sanger permitió extraer dicho aa.
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