ACTA BIOLÓGICA COLOMBIANA

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ARTÍCULO DE REFLEXIÓN / REFLECTION PAPER

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE AZUL DE

METILENO EN SOLUCIÓN PROBLEMA UTILIZANDO EL MÉTODO
DE ESPECTROFOTOMETRÍA

Determination of the concentration of methylene blue in

unknown solution using the spectrophotometry method
Juan Pablo Gómez Gómez1, Michelle Negrette Bohórquez2.
1 Estudiante de Pregrado de Biología, Universidad Nacional de Colombia.
2 Estudiante de Pregrado de Biología, Universidad Nacional de Colombia.
For correspondence: juagomezg@unal.edu.co, mnegrette@unal.udu.co.

RESUMEN

En uno de los laboratorios de la Universidad Nacional se realizó la determinación de la concentración de soluto (azul de metileno)
en una solución problema dada utilizando el método de la espectrofotometría. En el presente artículo se explica el proceso
realizado, en el cual primeramente se generó la curva espectral, donde se midió la absorbancia para cada longitud de onda de
una solución stock que tenía 50 ppm como concentración y se concluyó que la mayor absorbancia se daba en 650,30 nm;
posteriormente, a través de un sensor colorimétrico y una interfase Lab-Quest, se analizaron los valores obtenidos de
absorbancia para diferentes diluciones que tenían concentraciones conocidas, y, con los cuales, se construyó una curva de
calibración que permitió interpolar los datos recolectados con la absorbancia medida de la solución problema. Teniendo en
cuenta la ley de Beer-Lambert y los fundamentos de la espectrofotometría, se obtuvo la línea de tendencia de los datos y con ella
la ecuación de la pendiente, con la cual fueron realizados los cálculos necesarios para obtener finalmente como concentración
11,81 ppm del azul de metileno en la antes mencionada solución, resultado que se comparará ulteriormente al valor real
calculado.
Palabras claves: absorbancia, curva de calibración, espectrofotómetro, longitud de onda, partes por millón.

ABSTRACT

In one of the Universidad Nacional de Colombia’s laboratories, the determination of the concentration for the solute (methylene
blue) in an unknown solution was done using the spectrophotometry method. In the preset article, the process executed is
explained, in which firstly, a spectral curve was generated, where the absorbance was measured for each wavelength of a stock
solution that had 50 ppm as concentration, it was concluded that the higher absorbance was at 650.30 nm; afterwards, using a
colorimetric sensor and a Lab-Quest interface, the values obtained for absorbance of different dilutions that had known
concentrations, were analyzed and with them, a calibration curve was built, this allowed to interpolate the recollected data with
the absorbance gauged of the unknown solution. Recognizing the Beer-Lambert law and the fundamentals of
spectrophotometry, a tendency line of the data was attained and with this, the equation of the slope, with which the necessary
calculations were made to finally achieve as a concentration 11.81 ppm of methylene blue in the solution, result that will be
furtherly compared to the real value that was calculated.
Keywords: absorbance, calibration curve, parts per million, spectrophotometry, wavelength.

Acta biol. Colomb., enero-abril 2018 - 1

Gómez, JP, Negrette, M.
INTRODUCCIÓN
La espectrofotometría es un método de análisis óptico
que hace referencia a la interacción de la luz con la
materia y de esta con el espectro electromagnético
(Vargas y Loaiza, 2014). Es decir, mide la cantidad de
energía radiante que absorbe una sustancia en función
de una determinada longitud de onda (Brunatti y Martín,
s.f.), con lo cual se puede obtener la concentración de
compuestos en una solución.
Profundizando en lo anterior, el sistema se
estimula con una fuente de radiación, esta señal
interactúa con la muestra, y, gracias a sus propiedades
fisicoquímicas, modifica o reacciona mostrando una
respuesta cuantificable de la que se extrae información
analítica (Vargas y Loaiza, 2014). Es así como se integran
conceptos de transmitancia, absorbancia, curvas de
calibración y la ley de Beer-Lambert, entre otros, los
cuales son fundamentales para entender la
espectrofotometría.
La transmitancia será la radiación incidente que
atraviesa la solución y se define con la ecuación 1 donde I
es la intensidad transmitida y I o, la intensidad incidente.
También se puede expresar como porcentaje con la
ecuación 2.
(1)
(2)
La absorbancia será la cantidad de radiación que
la muestra retiene y es adimensional, se describe como el
logaritmo negativo de la transmitancia y se expresa con
la ecuación 3.
(3)
2- Acta biol. Colomb., enero-abril 2018
La ley de Beer-Lambert plantea una relación
directamente proporcional entre la absorbancia y la
concentración de soluto en la muestra, su ecuación (4)
define a la absorbancia con el coeficiente de absorción
molar (fijo para cada sustancia), el ancho de celda b (1
cm en este experimento), y la concentración c. Sin
embargo, se debe aclarar que esta ley presenta ciertas
limitaciones sobre las cuales se discutirá más adelante en
el presente artículo.
(4)
Por último, la curva de calibración es la gráfica
que indica la relación entre los dos anteriores, su función
es comprobar que los resultados se ajustan a la
mencionada ley (Vargas y Loaiza, 2014), es
recomendable generarla basándose en la curva espectral
o gráfica de espectro electromagnético, que dirá en qué
longitud de onda cierta solución posee una mayor
absorbancia.
Volviendo la mirada hacia los aspectos
conceptuales de este procedimiento, el instrumento
utilizado para esta técnica es el espectrofotómetro, un
aparato óptico atraviesa a la muestra con luz
monocromática, la cual es detectada y cuantificada por
un sensor. Utilizar este mecanismo brinda ventajas como
la velocidad y sensibilidad para obtener las medidas e
incluso se destaca la simpleza al realizar el
procedimiento.
Este método posee una amplia variedad de
aplicaciones en diferentes campos que van desde las
ciencias naturales y exactas (como la física, la química, la
biología, la medicina y las ingenierías) hasta la industria
alimenticia y el monitoreo ambiental (Vargas y Loaiza
2014).
En este artículo, se aplicarán todos los conceptos
definidos en esta sección para encontrar - por medio de
análisis, instrumentos, mediciones, recolección de datos,
gráficas y cálculos - la concentración de azul de metileno
diluida en la solución problema.

MATERIALES Y MÉTODOS
En el laboratorio 151 del edificio de química se hicieron
análisis a unas muestras cuantificadas del compuesto
azul de metileno (C16H18ClN3) (CTR, 2012). Para realizar
dichos análisis primero se tuvo que depositar esta
sustancia en un vaso de precipitado, el cual se colocó
en los mesones laterales del laboratorio, de ahí se
tomó un volumen de 25 ml con la ayuda de una bureta
(+ 0,05 ml) y se fijó a un soporte que se colocó sobre la
mesa de trabajo, después de ello y con la ayuda de un
balón aforado (+ 0,06 ml) y nueve tubos de ensayo, el
azul de metileno se fue repartiendo en cada tubo en
concentraciones de: 50 ppm, 40 ppm, 30 ppm, 25 ppm,
20 ppm, 15 ppm, 10 ppm, 5 ppm y 1 ppm (ver anexo 1).
Esto se realizó con el fin de poder crear una curva de
calibración del azul de metileno con respecto al valor
de su absorbancia la cual es descrita por la ley de Beer-
Lambert.
Para poder crear esta curva de calibración fue
necesario el uso de un módulo característico, es decir,
un espectrofotómetro Vernier (SVIS-PL) (+ 0,001), y de
un módulo procesador, para el que se utilizó una
interfase Vernier LabQuest 2 (LQ2-LE), con los cuales
después de calibrar con un blanco de reactivo (celda
llena de agua con absorbancia 0,0) (Anónimo), se
generó la curva espectral del azul de metileno con una
disolución de 50 ppm, la cual se colocó en una celda y
se insertó en el espectrofotómetro de tal manera que
se le hacía incidir radiación de longitudes de onda que
iban desde los 380,5 nm hasta los 699,30 nm (ver
figura 1). Esto se realizó para seleccionar un menor
rango de longitud de onda y así optimizar tiempo y
resolución al momento de medir la absorbancia.
La mayor absorbancia se presentó en la
longitud de onda de 650,30 nm (Fig. 1), la cual se tomó
de base para empezar a llenar la tabla de los datos
para la curva de calibración colorimétrica de las demás
soluciones.
Determinación de la concentración de azul de metileno
Para realizar tal procedimiento, primero se tuvo
que calibrar de nuevo el espectrofotómetro con el blanco
de reactivos y luego cada celda se iba llenando con las
distintas concentraciones de los tubos de ensayo y se
medía su valor de absorbancia con la misma longitud de
onda de 650,30 nm. A medida que se introducían las celdas
de menor a mayor concentración, la absorbancia crecía, al
ver tal fenómeno, se pudieron realizar ciertas predicciones
como el crecimiento proporcional de absorbancia y
concentración (Fig. 2), en donde, hasta cierto momento, se
confirmaba la ley de Beer-Lambert.
Después de haber realizado la curva de calibración
y tener los datos necesarios se siguió con el proceso de
hallar la concentración de la muestra problema, y para
hacer esto se repitieron procesos anteriores como volver a
calibrar el espectrofotómetro, introducir la solución
problema en una celda e insertarla en este mismo aparato,
y de esta manera el módulo procesador arrojó un resultado
que correspondía a un valor (y). Con esto y los datos
anteriores se puede despejar x de la ecuación 5:
Y = mx + b (5)
Donde m es la pendiente, x la concentración y b el punto
de corte con y, que, para este caso, sería 0.
Luego de realizar este cálculo, se obtuvo la concentración
de la muestra problema en ppm.
RESULTADOS
Gracias a toda la información recopilada en la toma de
datos, los resultados de esta experimentación con el azul
de metileno fueron abundantes y ayudaron a entender
mejor los aspectos de las disoluciones, como entender de
qué manera se puede conocer la concentración de
disoluciones problema como en el caso de la solución con
una absorbancia de 1,298.
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Gómez, JP, Negrette, M..

Figura 2. Curva de calibración del azul de metileno para la longitud de

onda 650,30 nm.

Figura 1. Curva espectral del azul de metileno entre 380,5 y 699,3 En la curva de calibración (Fig. 2) se puede
nm para la concentración de 50 ppm donde ♦ representa el
apreciar la relación entre la absorbancia (eje Y) y la
punto máximo de absorción.
concentración (eje X) que fue construida a partir de la
tabla que se encuentra en el anexo 1. La anterior gráfica
En la figura 1 se pueden apreciar los análisis de
muestra la absorbancia obtenida para todos los datos,
la muestra que poseía una concentración de 50 ppm
desde concentración 0 (blanco de reactivos) hasta la
cuando fue llevada al espectrofotómetro. A la muestra
solución más concentrada, que es 50 ppm. A partir de la
contenida en la celda se le incidieron radiaciones
ubicación de los puntos se establece una línea de
monocromáticas de longitud de onda desde los 380,50
tendencia que suministra adicionalmente la ecuación de
nm hasta los 699,30 nm. Al inicio se puede apreciar
la pendiente (5). Teniendo estos datos, se asume que al
como la curva crece a medida que la longitud de onda
despejar x, como ya se ha mencionado antes, se obtiene
aumenta hasta los aproximadamente 650 nm, luego de
la concentración de la muestra problema. Sin embargo,
este máximo la absorbancia decae rápidamente hasta
relacionando los fundamentos de la ley de Beer-Lambert
los 699,30 nm donde el espectrómetro dejó de arrojar
con la gráfica, se puede ver a simple viste que a partir de
más información, con los anteriores datos se pudo
la concentración de 25 ppm, la línea de tendencia en los
determinar que el máximo de absorción era dado por
puntos deja de ser clara y esto se puede comprobar con
𝛌=650,30 nm tal y como aparece en la gráfica. Ya
el valor del coeficiente de determinación, que al ser
conociendo este dato se pudo hacer el análisis para la
0,6036, indica que el ajuste de los datos al modelo no es
curva de calibración de las distintas concentraciones del
completamente fiable. Si se intenta despejar la
azul de metileno.
concentración de esta pendiente utilizando la ecuación
(5), el resultado será 20,3 ppm, el cual es demasiado alto
teniendo en cuenta que para la absorbancia de la
muestra el valor debería estar entre 10 y 15 ppm.

4- Acta biol. Colomb., enero-abril 2018

 Determinación de la concentración de azul de metileno

Figura 3. Curva de calibración del azul de metileno para la longitud de onda 650,30 nm, con datos de concentraciones mayores a 20 ppm
descartados.

Por lo anteriormente demostrado, se decide confianza de 95%, fueron multiplicados para ser
descartar los datos que no cumplen visiblemente con sumados y restados al promedio, con lo que se alcanzó
la ley para obtener un mejor ajuste de los datos y así el rango entre el cual los datos debían estar, fue así
una concentración de la muestra problema más como se realizó el rechazo de datos y se obtuvo el
precisa, este proceso genera la gráfica tres, en donde nuevo promedio o valor real.
se refleja un cambio en la pendiente y en el coeficiente
de determinación, el cual ahora es 0,9872,
significativamente más cercano a 1 que el primer valor, Tabla 2. Datos obtenidos por los 12 grupos de
laboratorio y las diferentes longitudes de onda
esto lo hace más fiable, y al despejar nuevamente x de
utilizadas para la obtención de la absorbancia.
la ecuación (5), la concentración final obtenida es 11,81
GRUPO [ ] problema long onda (nm)
ppm, que sí se encuentra en el rango esperado.
1 11.6671 630.3
Para calcular el valor real de la concentración, y
poder compararlo con el obtenido en el laboratorio 2 10.4163 612,2
por nosotros, se realizó un análisis estadístico de los 3 9.9654 626.1
resultados de la concentración obtenidos por cada 4 11.4467 650
grupo que se pueden observar en la tabla 2. 5 11.25 639.4
Se ha establecido que el nuevo promedio, 6 12.2891 625.5
calculado a partir del rechazo de datos que no se 7 10.118 600
encuentran dentro del rango del valor verdadero (fig.
8 10.6992 630.2
3), será el valor verdadero. Para llegar a esto, se realizó
9 11.127 634.3
un promedio con todos los datos, seguido del cálculo
de la desviación estándar y el coeficiente de variación 10 11.81 650.3
de los mismos, después la desviación estándar de la 11 10.6364 651.4
muestra y el valor de distribución t con un nivel de 12 10.51763 660

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Gómez, JP, Negrette, M..
Tabla 3. Análisis estadístico de los datos (promedio, desviación estándar, rechazo de datos y nuevo promedio).
X[]
S 0.72
%CV
Sx
t (95%)
Sx * t
μ X + (Sx * t)
R. MÍNIMO
R. MÁXIMO
NUEVO X
DISCUSIÓN
En la anterior sección se muestran los datos de
absorbancia y concentración obtenidos gracias a la
experimentación y a los diferentes instrumentos de
laboratorio utilizados. Al realizar todos los
procedimientos y cálculos requeridos, se determinó
finalmente que la concentración de la solución
problema es 11,81 ppm.
Sin embargo, al analizar detenidamente los
datos expuestos por otros grupos (tabla 2) y al
compararse el valor real (tabla 3) con el obtenido, se
llega a la conclusión de que es uno de los datos que se
sale del rango promedio. Para analizar este hecho, se
deben tomar en consideración diferentes factores que
pudieron haber sido causales de error, como las
desviaciones debidas a la ley de la espectrofotometría,
las desviaciones químicas y las instrumentales.
En cuanto al primer tipo de desviación, las
limitaciones que existen para la ley de Beer-Lambert
son determinantes para los resultados, entre estas se
encuentra que, la mayoría de las veces, la ley solo se
cumple para soluciones que poseen hasta 0,01 M
(Vargas y Loaiza, 2014), sin embargo, en la figura 2, se
evidencia que a partir de la concentración de 25 ppm,
la relación deja de ser directamente proporcional; es
por esto que fue necesario descartar cierto grupo de
datos, debido a que se afectaba de manera significativa
la pendiente de la línea de tendencia y por lo tanto, el
valor final de la concentración.
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11.00
6.54
0.22
2.179
0.47
10.52
11.47
11.03
Sin embargo, es importante resaltar que a
pesar de no haber alcanzado una concentración que se
ajustara al promedio, el conjunto de datos obtenidos
confirma sin lugar a duda la Ley de Beer-Lambert hasta
determinado valor de concentración, esto se puede
evidenciar en la figura 3.
Las desviaciones químicas se dan por
formación de subproductos causados por diferentes
reacciones que absorben mayor cantidad de radiación
que la muestra, o por presencia de sustancias con
características ópticas semejantes (Vargas y Loaiza,
2014).
Por último, las desviaciones instrumentales se
refieren a contaminación por otras radiaciones o ruido
que afectan al sensor del instrumento, además, se tiene
debe tener en cuenta la incertidumbre de los mismos,
que influye en el margen de error de cada una de las
mediciones realizadas.
En cuando a recomendaciones para futuros
experimentos, se sugiere ser extremadamente
cuidadosos con la calibración del sensor de
espectrofotometría para tener la mejor recolección de
datos posible, se aconseja calibrarlo con el blanco de
reactivos (que debe tener 0,00 de absorbancia) entre
cada muestra de disolución, de esta manera se
minimiza la propagación de errores y que se afecte la
absorbancia obtenida para cada solución.
 Determinación de la concentración de azul de metileno

CONCLUSIONES REFERENCIAS

En este artículo, se determinó la concentración del azul Brunatti C, Martín A. Introducción a la Espectroscopía de
de metileno en la solución problema propuesta, esto Absorción Molecular Ultravioleta, Visible e Infrarrojo
por medio del método de espectrofotometría, el uso de Cercano [Internet]. Available from:
http://materias.fi.uba.ar/6305/download/Espectrofotom
los instrumentos necesarios para las mediciones, y la
etria.pdf
relación y aplicación de conceptos vinculados a estos
CTR. Hoja De Datos De Seguridad Azul De Metileno.
procedimientos como lo fueron la transmitancia, 2012:2–7. Available from:
absorbancia, espectro electromagnético y curva de http://www.dcne.ugto.mx/Contenido/CCESH/Fichas
calibración. Se confirmó la ley de Beer-Lambert por Seguridad/Azul de Metileno.pdf
medio de gráficas que reflejaron la proporcionalidad Anónimo. Vernier SpectroVis Spectrophotometer.
directa en determinado rango de concentraciones y se Vargas R, Loaiza H. Análisis digital de señales en
reconocieron las limitaciones que la misma presenta. espectrofotometría. 1ra ed. Popayán, Colombia:
También se determinaron posibles causales de errores Universidad del Cauca; 2014.
en los resultados finales basándose en análisis
estadísticos y tratamiento de datos que se realizaron
previamente para poder comprar la concentración
obtenida con el valor real de la misma.

Acta biol. Colomb., enero-abril 2018 -7

Gómez, JP, Negrette, M.

ANEXO 1

Tabla de las concentraciones y sus valores de absorbancia respectivos a una longitud de onda de 650,30 nm.

ANEXO 2

Imagen del color de las soluciones de mayor a menor desde 50 ppm a 1 ppm.

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