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Palabras clave:
Cultivo,aislar,bacteria,morfología,siembra
Abstract:
different methods were performed using different planting methods as well as pure cultures and identification by means
of Gram staining in order to exercise these techniques maintaining aseptic conditions and likewise isolate a colony of
bacteria and characterize microscopically were performed using Gram staining. This was done, in the case of the
platings, placing a diluted sample on the plate with the handle or rod previously sterilized with heat by adding shaped
groove or dispersing the entire surface. Emptying plate it is only added dilution pipette with agar nutritivo.En planting
tubes the previously sterile handle is also used to inoculate culture plates either in the case of solid by spline means, in
semisolid pitting and homogenizing the liquid inside the tube and finally the pure cultures of these smears for Gram
staining which was added dyes and alcohol timeouts and visualized under a microscope were performed. Gram
negative bacilli was observed in all samples, in addition, mobility and yellow colonies on nutrient agar and salmon pink
on Hektoen presented. All this plus the usual characteristic of fruit milk drinks waters have coliforms, bacteria indicates
the isolation of these microorganisms. All this is likely because it must be performed morphological, biochemical and /
or serological tests to achieve a finish identification
Keywords:
Culture,isolate,,bacterium,morphology,planting
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de una determinada enfermedad. Las prácticas de
sembrar, aislar y teñir son rutinarias en un laboratorio
Introducción de microbiología independientemente del campo en
que se desarrollen pero aún existen muchas
Pasteur diseño matraces con cuellos largos y finos bacterias, archeas y hongos que no crecen en los
doblados, pero abiertos al exterior, dentro de los medios de cultivo. Algunos autores afirman que solo
cuales había introducido caldos de carne. Tras hemos podido cultivar el 1% de las bacterias
hervirlos y calentar los cuellos de los matraces existentes, las pruebas de ADN directamente
demostró que no se producía crecimiento, aun aplicada a una muestra de suelo evidencian esta
cuando se mantuvieran sin cerrar los extremos. Por afirmación. La biodiversidad del suelo es mucho
su parte, John Tyndall demostró en 1877 la existencia mayor a la que se puede cultivar.
de formas de microorganismos muy termoresistentes
que justificaban algunos resultados publicados por El cultivo de microorganismos es una actividad que
los partidarios de la generación espontánea, y requiere del conocimiento de técnicas de siembra o
desarrolló un método de esterilización mediante inoculación y de aislamiento para transferirlos de un
calentamientos separados entre si 24 horas que medio a otro, o mantener su crecimiento y actividad.
eliminaban estas formas de resistencia. En 1882 Es indispensable para realizar diversos estudios
Koch empleo técnicas de aislamiento de morfológicos, de identificación, bioquímicos, de
microorganismos con medios de cultivo solificados patogenicidad y ecológicos, entre otros.
con gelatina o agar en placas estériles de gran Las aguas frescas son bebidas que se elaboran con
superficie (placa de Petri, desarrolladas por Richard frutas, en ocasiones leche condensada, cereales y/o
Petri) para aislar e identificar al agente causante de semillas, además de agua y azucares para endulzar.
la tuberculosis. (Berenguer, 2003) Es una bebida tradicional mexicana, sin alcohol y que
se consume fría, la finalidad no es tan solo
El éxito de Koch, conjuntamente con el de Pasteur refrescarse, sino que son fuente de vitaminas y
aproximadamente en la misma época, fue el punto de minerales, que contribuyen a fortalecer el sistema
partida de un periodo de intensa investigación. Este inmunológico, y algunas de ellas tienen cualidades
periodo (desde finales del siglo diecinueve hasta antioxidantes. Los microorganismos mesófilos,
principios del siglo veinte) es conocido como la edad Staphylococcus aureus, coliformes, hongos y
de oro de la bacteriología clínica. La mayoría de los levaduras son marcadores presentes en los
principales patógenos bacterianos fueron aislados alimentos y en aguas de consumo humano (aguas de
durante esta época; las técnicas eran muy básicas: bebidas preparadas) que advierten sobre la
aislar el microorganismo, cultivarlo en cultivo puro y manipulación incorrecta y/o contaminación previa de
examinar células humanas y microbianas al la materia prima, así como de una contaminación por
microscopio. (Ingraham, 1998).Entonces los medios instalaciones inadecuadas en el sitio de elaboración,
de cultivo ideados y aplicados por Robert koch y Luis indicando la presencia de un peligro para el
Pasteur fueron importantes para el desarrollo del consumidor.
aislamiento e identificación de los agentes causantes
de las grandes enfermedades infecciosas que Un cultivo puro es aquel que contiene una sola
azotaban a la humanidad; además los trabajos de los especie de microorganismos, mientras que el cultivo
rusos Beijerink y Winograsky en la microbiología del mixto es el que tiene dos o más especies. En la
suelo dieron las bases para la preparación adecuada naturaleza las bacterias conviven con gran variedad
de los medios de cultivo para aislar in vitro las de otros microorganismos y solo en muy raras
bacterias y hongos de diferentes ambientes. (Toro, ocasiones se encuentran como especie única. En
2005).Hasta hace relativamente muy poco tiempo, muchos procesos industriales es necesario recuperar
casi todo lo que sabíamos acerca de la virulencia solo el agente de interés, dentro de una flora mixta.
microbiana, y la patogénesis se basaba en las Por estas y otras razones, se emplean técnicas que
mismas técnicas; los médicos observaban las permitan la separación de los diferentes tipos de
manifestaciones o síntomas de la enfermedad, los bacterias presentes en una muestra, así como
patólogos examinaban el tejido enfermo, a simple también que permitan evaluar la pureza de un cultivo.
vista y al microscopio: los microbiólogos utilizaban los Solo al tener la certeza de que el cultivo esta puro, es
postulados de Koch para demostrar que un posible realizar cualquier estudio bacteriológico.
determinado microorganismo es el agente etiológico (Rodriguez, 2005)
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Las bacterias se cultivan en el laboratorio en El aislamiento de un microorganismo con
materiales nutritivos denominados medios de cultivo, características específicas es una labor ardua y
cuyos componentes son muy variados. La elección costosa. Muchos microorganismos son
del medio se basa en el propósito de estudio. El irremplazables, pues han sido obtenidos por
material que se inocula en el medio se denomina procedimientos empíricos: no existe un método bien
inoculo, cuando se inocula un medio como el agar definido para obtener la cepa nuevamente, en caso
nutritivo u otros medios con agar en cajas de Petri, de perderla. Además, la modificación de un
por el método de siembra por estría cruzada en placa, microorganismo para variar sus características hace
las células quedan separadas individualmente. que sea muy inestable y susceptible de perderlas con
Durante la incubación, las células microbianas facilidad.
individuales se reproducen tan rápidamente que en Actualmente, el aislamiento se realiza en condiciones
un tiempo de 18 a 24 horas producen masas visibles cada vez más estandarizadas y repetibles, y se
a simple vista, denominadas colonias. Cada colonia recurre al mejoramiento genético de las cepas para
que se observe diferente, presumiblemente es un obtener cualidades especiales, tales como una mayor
cultivo puro de una sola clase de bacterias. Si dos productividad de biomasa o sustancias de interés.
células microbianas procedentes del inoculo original (Hernández, 2014)
quedan muy cerca una de la otra sobre el medio de
agar, las colonias que resultan pueden quedar La evaluación inicial de la morfología de la colonia
mezcladas o muy juntas. Las siembras por estría en las placas de cultivo tiene extrema importancia y
permiten aislar las bacterias que dan lugar a colonias que permite decidir qué medidas se adoptaran para
separadas y posteriormente, transfiriendo una sola lograr la identificación y la caracterización definitivas
colonia a un medio nuevo, se permite el desarrollo de del microorganismo. Para toda identificación
un cultivo puro bacteriano. (Alarcón, 2004) bacteriana es importante destacar las características
clave de una colonia bacteriana: el éxito o fracaso
Los métodos de aislamiento más frecuentes son: de los procedimientos posteriores de identificación a
siembra por agotamiento por estrías, siembra por menudo dependen de la precisión de estas
diseminación en superficie y siembra por diluciones observaciones.
seriadas. En la siembra por agotamiento por estrías,
se trata de un método rápido y simple de agotamiento Los criterios utilizados con frecuencia para
progresivo y continuo del inoculo (material caracterizar el crecimiento bacteriano son:
microbiano utilizado para sembrar un medio de tamaño de la colonia (por lo común calculado en
cultivo) sobre un medio solido contenido en una milímetros o descrito en términos relativos como
capsula de Petri. A medida que se realizan estrías las cabeza de alfiler, pequeño, medio grande)
bacterias pasan del asa al medio en un número cada
vez menor, de manera que las estrías iniciales pigmentación de la colonia, forma de la colonia
proporcionan un crecimiento confluyente, mientras (incluye forma, elevación y bordes de la
que a lo largo de las últimas estrías se desarrollan colonia),aspecto de la superficie de la colonia(por
colonias bien aisladas. La siembra por diseminación ejemplo brillante, opaca, mate,
en superficie es un método que consiste en colocar transparente),cambios en los medios con agar como
0.005ml del inoculo en el centro de una placa de Petri resultado del crecimiento bacteriano(por ejemplo
con medio de cultivo. Se extiende con espátula de patrón hemolítico en agar sangre, cambios en el color
Drigalsky hacia adelante y atrás, mientras se hace de los indicadores de pH, corrosión de la superficie
girar la placa, se tapa, se invierte la placa y se lleva a del agar),olor(ciertas bacterias producen olores
incubar. En la siembra de diluciones seriadas característicos que pueden ayudar a la identificación
consiste en realizar diluciones sucesivas de la preliminar).Aunque es importante la determinación
muestra con el objeto de sembrar después cuidadosa del aspecto de la colonia, es imprudente
cantidades conocidas de esas diluciones en capsulas confiar totalmente en la morfología de la colonia para
de Petri. Esto permite conocer el número de su identificación preliminar. Las colonias de una
microorganismos viables. La viabilidad en especie bacteriana a menudo presentan
microbiología se define como la capacidad del características casi indistinguibles de las mucha
microorganismo para multiplicarse en un medio de otras especies. Además, las bacterias de la misma
cultivo. (Negroni, 2009) especie exhiben diversidad morfológica. Por ejemplo,
ciertas características de la colonia pueden ser
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típicas de una especie dada pero otras cepas de esa (asa de Digralsky) previamente flameada, y
especie pueden tener morfología distintas, suspendida en alcohol de 96°.
El aislamiento de las colonias individuales durante los
cultivos no solo es importante para examinar la Estría cruzada. Se tomó una caja Petri con Agar
morfología y las características sino que también es entérico Hektoen y otra con Sal y manitol. Se
necesario para la realización oportuna de la tinción esterilizó el asa flameando y se procedieron a realizar
de Gram y los subcultivos. La tinción gram y la la primera estría con una muestra de la dilución 10-2.
evaluación microscópica de los cultivos de las Se esterilizó el asa de nuevo y se continúo con la
bacterias, junto con la morfología de la colonia, sirven siguiente estría tocando la estría anterior. Se repitió
para decidir los pasos de identificación necesarios, este proceso hasta haber echo 4 estrías.
Para evitar confusiones se tiñen los microorganismos
provenientes de cada colonia. En muchos casos Las cajas Petri se colocaron en la incubadora (VWR
debe teñirse cada colonia que presenta una USA) durante 48 horas a 37°C. Una vez que se
morfología diferente en placa primaria, En otros observó el crecimiento y se escogieron las colonias
casos la tinción puede no ser necesaria porque el aisladas de la placa de vertido 10-3 se resembraron
crecimiento en un agar selectivo determinado con las siguientes técnicas:
proporciona datos relacionados con la morfología de
la tinción de Gram del microorganismo (Forbes, Siembra en medio sólido ( tubos en Slant). Se
2009) esterilizó el asa de platino en la flama, se retiró el asa
Esta práctica se realizó con el objetivo de organizar y se dejó enfriar. Se destapo la caja Petri y se tomó
el material para su identificación y fácil manejo dentro el inoculo introduciéndolo en el tubo inclinado (slant)
de una zona aséptica, de manipular adecuadamente por la técnica de estría ondulada.
los dispositivos que se emplean en la transferencia
de cultivos microbianos y aplicar diferentes técnicas Siembra en Agar Semisólido. Se esterilizó el asa de
de siembra (métodos de aislamiento). Con el objetivo platino recta en la flama del mechero. Una vez fría,
específico de aprender a trabajar en condiciones se tomó el inoculo de la caja Petri y se depositó la
asépticas esterilizando el material y con técnicas para muestra por picadura evitando tocar el fondo.
mantener dicha esterilidad. También realizar
Siembra en medios líquidos. Se esterilizó el asa de
diferentes métodos de siembra como vaciado en
placa, dispersión con varilla de vidrio, estría cruzada, platino en la flama del mechero y se tomó el inoculo
siembra en medio solido (tubos en slant), siembra de de la caja Petri. Se colocó en el tubo de cultivo liquido
agar semisólido y siembra en medios líquidos y homogenizando.
cuantificar y describir las UFC desarrolladas. Por
Se incubaron durante 48 horas (VWR USA) y se les
último identificar las bacterias aisladas en el cultivo
realizó tinción Gram a los medios sólido, semisólido
puro por medio de tinción de Gram.
y líquido. Se observó en el microscopio Sargent-
Welch (Mod S664733, USA) y se describieron sus
características
Metodología
Se prepararon 5 diluciones decimales a partir de la
muestra láctea de agua frutal y se realizaron los Resultados
siguientes métodos de siembra:
En las diferentes siembras en placa que se
Vaciado en placa. Se tomaron 5 cajas Petri y se realizaron en distintos medios se obtuvieron una
rotularon con el nombre y fecha. Se colocaron 1 ml variedad de microorganismos provenientes de la
muestra de la bebida láctea de agua frutal. Se
de cada dilución seriada respectivamente en cada
observaron colonias predominantemente verdes y
caja, y se vertió agar nutritivo en cada una de las rosa salmón con halo alrededor y algunas negras en
placas. el cultivo de agar Hektoen (fig. 1).Estas últimas
Dispersión con varilla de vidrio. Se tomó 1 placa con irregulares con margen ondulado. Las colonias
verdes circulares con elevación convexa y con
agar nutritivo y se colocaron 0.1 ml de la dilución 10-
2 margen entero y las colonias rosa salmón fusiformes
. Se dispersó la muestra con una varilla de vidrio
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con elevación umbonada y margen ondulada. En el
cultivo de sal y manitol (fig. 2) se presentaron
colonias amarillentas irregulares, convexa y margen
entero y en el cultivo de agar nutritivo(fig. 3) colonias
blancas grandes irregulares, planas y onduladas,
también se presentaron colonias amarillas circulares
elevadas con margen ondulado, mas acentuadas en
la dilución 1x10-3. Esta relación del crecimiento de
colonias con las disoluciones realizadas a la muestra
láctea de agua frutal se puede apreciar en la tabla I
donde el numero de UFC va disminuyendo conforme
la dilución es mayor, incluso se observó que en las
últimas dos diluciones no hubo un aparente
crecimiento bacteriano. Fig. 2. Cultivo sal y manitol en placa
1x10-1 1x10-2
1x10-3 1x10-4
Fig. 4. Tubo inclinado con cultivo puro en medio Se realizó la técnica de tinción Gram a los cultivos
solido puros de bacterias coliformes; encontrándose bacilos
Gram negativos en los 3 frotis de los diferentes
medios (fig 7,8 y 9) .se visualizan mejor las
características en la Tincion gram de colonia de
medio semisólido (fig 7), en las demás la cámara no
captó de manera clara y definida la morfología y color
de las bacterias, pero si se tomó datos de éstos
donde se mostró que comparten las mismas
características que en el medio semisólido.