1.

¿Cuál es el fundamento de la técnica de aislamiento de PBMC realizada

en clase?
Al estratificar una muestra de sangre sobre el EDTA y centrifugar, las células
mononucleares se separan de las demás debido a diferencias de densidad. Como se
sabe, el EDTA al ser un agente quelante aglutina los eritrocitos, por lo que estos pasan a
través del medio y se sedimentan al fondo. Los fanulocitos también sedimentan por su
tamaño y densidad, y por su tendencia a formar agregados. Los mononucleares
(linfocitos y monocitos), por su menor densidad, se quedan en la interface entre el
plasma y el medio, con una contaminación relativamente baja de plaquetas y otros tipos
celulares. Al final de la centrifugación, los leucocitos mononucleares se recogen del
anillo blanco que se forma en la interface del plasma. Este procedimiento permite
recuperar alrededor de un 50% de los linfocitos presentes en la muestra, con una
viabilidad mayor del 90% (determinada mediante exclusión del azul tripan, ver abajo).
2. Describa brevemente una técnica alternativa para el aislamiento de
leucocitos.

Aislamiento de Leucocitos a partir de Sangre Total

Para este procedimiento se usa Dextran-Heparina, el cual genera una sedimentación
diferencial de los glóbulos rojos con respecto a los leucocitos. Se aplica 2ml de esta
sustancia en 10ml de sangre total recién extraída, luego se mezcla suavemente para
homogenizar la sangre con el reactivo y se pone a reposar en una gradilla.
Es recomendable que la temperatura del ambiente donde se realiza el procedimiento
no sea mayor de los 12 grados centígrados ya que podría comprometer al proceso de
sedimentación.
Al cabo de aproximadamente 45 minutos el proceso de sedimentación debe estar
completo, algunas recomendaciones son:

 No dejar pasar más del tiempo indicado.

 No acelerar el procedimiento de sedimentación con centrifugado.
 Evitar al máximo contaminar la muestra con glóbulos rojos.
Luego de pasado los 45 minutos se extrae el sobrenadante con una pipeta, esta no debe
tocar el fondo que contiene los glóbulos rojos, pero, se tiene que extraer la mayor
cantidad posible de sobrenadante. Después se tiene q repartir en dos tubos de ensayo
limpios y el resultado seria 2 tubos por paciente que constituyen el espécimen y un
duplicado para confirmación de resultados.
Ahora se tiene q sellar los tubos con tapas de caucho para evitar contaminación en la
muestra y para su conservación se pueden poner los tubos en refrigeración por 24 horas
(no congelar).

Bibliografía

 KAMPINE JP, BRADY R. JKAUFER JN. FELD M. SHAPIRA D.

Diagnosis of Gaucher's disease and Nieman - Pick's disease with small samples of
venous blood. Science 1966.155.86.

 SHAPIRA E, Blitzer MG Miller JB, Africk DK.

Biochemical Genetics. A laboratory manual. Oxford University Press. New York,
1989.