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PRACTICA Nº 1

BIOSEGURIDAD, IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS PROCARIÓTICAS Y


EUCARIÓTICAS

BIOSEGURIDAD

La Bioseguridad es un conjunto de medidas preventivas de sentido común para proteger la salud


y la seguridad del personal que trabaja en el laboratorio, frente a diferentes riesgos producidos
por agentes biológicos. Complementariamente, se incluyen normas contra los riesgos
producidos por agentes físicos, químicos y mecánicos.
La seguridad se realiza en conjunto el personal debe cumplir con las Normas de Bioseguridad;
los directivos deben hacerlas cumplir; y por otro lado, la administración debe dar las facilidades
para que estas normas sean cumplidas.

1. AGENTES DE RIESGO

El personal del laboratorio diariamente realiza muchas actividades que pueden causar
enfermedad o daño en él o en las personas que trabajan en ambientes cercanos, e incluso en sus
familiares y la comunidad.
Estas enfermedades pueden ser causadas por:
- Agentes biológicos: Transmitidos por ingestión, inhalación, inoculación y por contacto
directo a través de piel o mucosa.
- Agentes físicos y mecánicos: Como las temperaturas extremas, radiaciones ionizantes,
contactos eléctricos o conexiones defectuosas y vidrios resquebrajados de recipientes
dañados o tubos rotos.
- Agentes químicos :
. Corrosivos, que causan destrucción o alteración a los tejidos.
. Tóxicos, cuyos efectos se manifiestan, según la vía de exposición, por
Inhalación, ingestión o contacto directo con mucosas o piel.
. Carcinogénicos.
. Inflamables.
. Explosivos.

2. PRINCIPIOS DE BIOSEGURIDAD

El término “Contención” es usado para describir métodos seguros para el manejo de agentes
infecciosos en el laboratorio. Intervienen las técnicas de procesamiento de las muestras de
laboratorio, los equipos de seguridad diseñados para la protección de personal y el diseño del
edificio. Se considera una contención primaria y una contención secundaria.
La contención primaria es la protección del personal y del medio ambiente inmediato contra la
exposición de un agente infeccioso y/o productos químicos de riesgo. Es provista por una buena
técnica microbiológica y el uso apropiado del equipo de seguridad. El uso de vacunas aumenta
el nivel de protección personal.
La contención secundaria es la protección del medio ambiente externo contra la exposición de
material infeccioso. Se logra por una combinación de las características de la edificación y
prácticas operacionales.
El propósito de la contención es reducir la exposición del personal de los laboratorios y de otras
personas a agentes potencialmente peligrosos, y prevenir el escape de éstos al exterior.
Los modos de transmisión en el laboratorio pueden ser insidiosos, y algunas veces complicados,
debido a que los vehículos y rutas de transmisión difieren de los modos clásicos. Los
laboratorios están frecuentemente expuestos a niveles muy altos de los agentes infectantes, por
lo que los períodos de incubación pueden ser más cortos que los del mismo tipo de infección
provocada por una exposición corriente.

3. NIVELES DE BIOSEGURIDAD (BSL)

a) Nivel de Bioseguridad 1 ( BSL – 1)


Consiste en un nivel básico de contención, que utiliza buenas practicas microbiológicas
estandarizadas no necesita de barreras primarias o secundarias, ya que el trabajo que se
realiza en dicho ambiente utiliza cepas de microorganismos viales pero no originan
enfermedad en el ser humano sano. Los equipos que se usan son apropiados para la
enseñanza. Se recomienda lavatorios para el lavado de manos, control de temperatura y
ventilación adecuada del ambiente.
b) Nivel de Bioseguridad 2 ( BSL – 2)
Se aplica a los laboratorios que trabajan una amplia gama de agentes de riesgo
moderado en la comunidad pero ocasionan enfermedad en el hombre con diferentes
grados de severidad. El riesgo primario para el personal que trabaja, esta en la auto
inoculación, la exposición de superficies mucosas, piel y la ingestión. Las buenas
prácticas y procedimientos utilizados deben proteger adecuadamente a los que trabajan
y prevenir derrames o formación de aerosoles. El uso de cabinas de flujo proporciona
un ambiente estéril al inocular placas de cultivo, etc.
c) Nivel de Bioseguridad 3 ( BSL – 3)
Protege al personal y a la comunidad. Se aplica en las prácticas para la investigación o
producción, cuando el trabajo se realiza con especies conocidas o exóticas, potenciales
de transmisión respiratoria y originar infección letal. Deben existir barreras primarias y
secundarias para impedir la formación de aerosoles. Todo el trabajo se realiza en
cabinas de bioseguridad de flujo. El acceso al laboratorio es a través de dos juegos de
puertas de cierre automático, pisos monolíticos y techos y paredes selladas, con sistema
de ventilación de aire purificado en una sola dirección hacia adentro.
d) Nivel de Bioseguridad 4 ( BSL – 4)
Se aplica cuando se trabaja con agentes extremadamente peligrosas estos tienen alto
riesgo de enfermedad mortal en la cual no hay vacunas ni tratamiento. El personal se
expone a aerosoles, contaminación de sus mucosas y el auto inoculación. Las barreras
de contención protegen al personal, la comunidad y el ambiente. El laboratorio es de
acceso muy restringido, aislado con sistema de manejo del aire con filtración de entrada
y salida, colección de líquido de desecho, suministro de aire purificado y energía de
emergencia.

4. NORMAS DE BIOSEGURIDAD

Bioseguridad en un laboratorio de Microbiologia Clínica o de Investigación comprende en


conjunto la utilización de las prácticas satisfactorias, el equipo de contención adecuado, las
instalaciones bien diseñadas y los controles administrativos necesarios con el fin de minimizar
los riesgos de una infección por agentes biológicos y materiales en el laboratorio y prevenir la
contaminación del medio ambiente fuera de este. Los agentes biológicos que pueden ser
potencialmente peligrosos son las bacterias, virus, hongos, parásitos, productos recombinantes,
alergenos, priones, etc.
En el Laboratorio de Microbiología existen dos fuentes principales de peligros biológicos, uno
de ellos lo representa el procesamiento de muestras provenientes de un paciente y en segundo
lugar el manejo de cultivos de microorganismos, los cuales pueden alcanzar concentraciones
muy elevadas y pueden llegar a provocar una infección, razón por la cual debemos llevarlas a
cabo con precaución.
5. REGLAS GENERALES PARA EL USO DEL LABORATORIO

a) El ingreso al Laboratorio está limitado o restringido .porque se lleva a cabo


experimentos o trabajos con cultivos y especimenes.
b) Debe llevarse obligatoriamente mandil blanco para uso exclusivo en el laboratorio y no
se permitirá el uso de las casacas u otras prendas sobre el mandil.
c) El alumno no ingresara al laboratorio de práctica sin su Manual de Microbiología,
mandil, guantes, lentes protectores y plumón indeleble.
d) Dejar los maletines, libros y otros objetos personales en el lugar que se indique nunca
en las mesas de trabajo.
e) NO SE PERMITIRÁ COMER, BEBER, FUMAR, GUARDAR ALIMENTOS, NI
APLICARSE COSMÉTICOS
f) Lavarse las manos antes y después de haber manipulado material infecciosos y al salir
del laboratorio.
g) Las superficies de trabajo son descontaminadas diariamente; realizarlo antes y después
de cada practica realizada .y luego de cada derrame o salpicadura de material
infeccioso. El operador es el responsable de desinfectar el área de trabajo antes y
después de cada actividad, con Fenol al 5%, Cresol al 3% u otro desinfectante,
dejándolo actuar durante 30 minutos.
h) Todas las muestras deben ser tratadas como altamente infecciosas para evitar el
posible contagio.
i) Todos los procedimientos se realizan cuidadosamente para evitar la formación de
aerosoles. No se permite pipetear con la boca
j) Se debe utilizar mascarillas y guantes, cuando sea necesario, por el tipo de riesgo.
k) Desarrollar el hábito de mantener las manos lejos de la boca, nariz, ojos y cara. Esto
puede prevenir la autoinoculación.
l) Evitar molestar en los laboratorios con sonidos de alto volumen.
m) Mientras no sea posible hacer la descontaminación de las muestras en el propio
laboratorio, el material contaminado debe colocarse en cajas de metal con tapa y
enviarse a la sala de esterilización de material contaminado. No se debe acumular
inadecuadamente material contaminado. Asegúrese que el material infeccioso
descartado sea fácilmente identificable como tal y sea esterilizado lo antes posible.
n) Las piezas de vidrio reusable (pipetas Pasteur, láminas de microscopio, etc.) deben ser
colocadas en un depósito con desinfectante y esterilizarlas cuando esté lleno en sus ¾
partes, o al final del día de trabajo esté lleno o no.
o) Se debe trapear el piso a diario con una solución desinfectante.

6. CLASIFICACIÓN DE DESINFECTANTES

Basado en las diferencias existentes entre los desinfectantes en uso, se estableció tres niveles de
acción microbicida. Su reconocimiento servirá de fundamento para establecer los
procedimientos de desinfección efectiva en cada laboratorio.
Los términos que se definen son: alto nivel, nivel intermedio y bajo nivel de desinfección.

A. Desinfección de Alto Nivel


Algunos instrumentos o materiales no resisten la exposición al calor y es necesario someterlos a
desinfección utilizando agentes químicos. Los desinfectantes de alto nivel se diferencian de los
demás por su capacidad esporicida, siendo su principal desventaja el largo tiempo de exposición
que debe tener el material (hasta 24 horas). Este método requiere de técnicas de limpieza
rigurosa para reducir al máximo la contaminación microbiana de los instrumentos y eliminar
residuos orgánicos que inactivan los desinfectantes.
B. Desinfección de Nivel Intermedio
Los desinfectantes de nivel intermedio no son capaces de destruir las esporas bacterianas, pero
tienen la capacidad de inactivar el bacilo tuberculoso, que es más resistente a los germicidas en
solución acuosa que las bacterias veget0ativas comunes. También son efectivos contra los
hongos (esporas asexuadas, pero no siempre clamidiosporas secas o esporas sexuadas) y contra
los virus con cubierta lipídica de tamaño mediano, además de algunos virus sin cubierta lipídica
de tamaño pequeño.

C. Desinfección de Bajo Nivel


Los desinfectantes de bajo nivel son aquellos que no tienen capacidad para actuar sobre las
esporas bacterianas, el Mycobacterium tuberculosis, o los virus no lipídico de tamaño pequeño.
Pueden ser útiles en la práctica por tener una acción rápida sobre las formas vegetativas
comunes de las bacterias y varios tipos de hongos, así como sobre los virus de tamaño mediano
y con cubierta lipídica. Algunos de estos desinfectantes, a mayor concentración, pueden elevar
su acción microbicida al nivel intermedio, como los yodoforos y fenoles; otros no tienen esta
propiedad.

NIVEL DE ACTIVIDAD DESINFECTANTE DE AGENTES QUIMICOS


Clase Concentración Nivel de Actividad
Glutaraldehido solución acuosa 2% Alto
Peroxido de hidrogeno 6 – 10% Alto
Formaldehído + alcohol 8% + 70% Alto
Formaldehído solución acuosa 3 – 8% Alto e intermedio
Yodo + alcohol 0.5 – 1% + 70% Intermedio
Alcohol 70% Intermedio
Compuestos de cloro 0.1%* Intermedio
Compuestos de fenol 0.5 – 3% Intermedio a bajo
Yodo solución acuosa 1% Intermedio
Yodoforos 0.007 – 0.015%** Intermedio
Compuestos de amonio cuaternario 0.1 0.2% Bajo
Hexaclorofeno 1% Bajo
Compuestos mercuriales 0.1 – 0.2% Bajo

* Cloro Libre al 0.1% equivale a una solución de 1000 ppm de cloro libre (se utiliza
Hipoclorito de sodio o hipoclorito de calcio)
** Yodo libre
IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS PROCARIÓTICAS Y EUCARIÓTICAS

OBJETIVOS:

 El objetivo de la práctica es adquirir destreza en el manejo del microscopio compuesto.

 Reconocer microorganismos procariontes y eucariontes de vida libre, diferenciándolos,


describiendo sus características morfológicas y agrupándolos según la clasificación de
Wittaker.

INTRODUCCION:

Según el sistema de clasificación taxonómica creado por R. H. Whittaker en 1959 se clasifica en


5 reinos: Monera, Protista, Fungi, Plantas y Animalia. Se consideran como microorganismos a
todo el reino Monera, muchas especies del reino Protista y algunos hongos microscópicos.
El reino Monera creado por Haeckel (1834-1919) reúne a todos los organismos Procariontes:
Bacterias y Algas azules verdosas. Morfológicamente las bacterias son muy simples, pero tienen
un papel clave en aspectos tan fundamentales como la salud, agricultura, bosques, aire que
respiramos y pueden efectuar un gran número de transformaciones químicas diferentes y son
metabolicamente mucho más diversas que todos los Eucariotas.
Los Procariotas son los seres vivos más resistentes, pueden sobrevivir durante años a
temperatura bajísima o pueden habitar en manantiales de agua hirvientes por medio de las
esporas algunas especies pueden tolerar la desecación total.
El Reino Protista fue creado por Copelando en 1956, sus miembros no incluyen animales,
plantas, hongos y procariotas. En este reino se sitúan los microorganismos eucariotas y sus
descendientes como: algas nucleadas (incluyendo las algas multicelulares), hongos acuáticos,
flagelados, mixomicetes y protozoos. Todas las células protistas tienen propiedades
característicamente eucariotas, como la aerobiosis y la respiración mitocondrial y muchas tienen
flagelos en algún estado de su ciclo vital. No se sabe concretamente el número de especies de
protistas. Tradicionalmente los hongos acuáticos y los parásitos de plantas han sido tratados en
la literatura micológica, los protozoos parásitos en la literatura médica, las algas en la literatura
botánica, los protozoos de vida libre en la literatura zoológica, etc. Pero todos los protistas son
acuáticos.
El reino fungí comprende a los eucariota que se desarrollan a partir de esporas y carecen de
flagelos en todos los estadios de su ciclo vital. Cuando las esporas fúngicas germinan, producen
hifa, las cuales se entrecruzan formando un micelio que constituye la forma vegetativa de la
mayor parte de los hongos. Los hongos presentan reproducción sexual por conjugación, son
aerobios en su mayoría y todos son heterótrofos y los eucariota más adaptables. Aunque muchos
de los hongos causan enfermedades al hombre y especialmente a las plantas, la mayoría forman
asociaciones importantes de antibióticos y muchos otros son utilizados en la industria.

* MANEJO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

Estas recomendaciones se deben tomar en cuenta para el correcto uso del microscopio
compuesto:

1. Levante completamente el condensador.


2. Abra el diafragma completamente.
3. Haga girar el revólver de los objetivos y enfoque el objetivo de menor aumento.
4. Coloque la lámina porta objetos sobre la platina y asegúrela.
5. Prenda la luz del microscopio de menor a mayor intensidad.
6. Baje el objetivo hasta más o menos medio centímetro de la altura de la lamina y
empiece a subir lentamente hasta que focalice.
7. Ajuste la altura del condensador para la posición que le de la luz mas fuerte y uniforme.
8. Abriendo parcialmente el diafragma, tendrá la luz adecuada para su observación.
9. Para usar el objetivo seco de mayor aumento, haga girar el revolver después de haber
enfocado con el pequeño aumento.
10. Para usar el objetivo de inmersión siga las siguientes instrucciones:
a) enfoque un campo apropiado con el objetivo de menor aumento.
b) Levante el condensador y abra el diafragma.
c) Coloque una gota de aceite de inmersión sobre el frotis.
d) Cambie por el objetivo de inmersión procediendo con mucho cuidado y termine de
enfocar usando el tornillo micrométrico.
11. Cuando termine de observar, limpie el lente de inmersión con papel lente; el objetivo de
menor aumento deberá estar en posición cuando el microscopio se va a guardar.

Nota: Dibuje un microscopio compuesto e indique sus principales partes.

Ejercicio 1. Observación en fresco de las Bacterias (Procariotas)


Procedimiento:
1. Tome una lámina portaobjeto limpia y coloque con el asa de siembra, una gota de cultivo
de Escherichia coli en caldo.
2. Coloque una lámina cubreobjeto sobre una gota y observe al microscopio a 400 X.
3. Haga un esquema de lo observado y describa forma y movimiento.

Ejercicio 2. Observación de Protistas (Eucariotes)


El alumno traerá una muestra de agua de estanque, pecera y agua de mar. Observe su forma,
tamaño, estructura y diferencie:
a. Algas microscópicas
b. Diatomeas
c. Ciliados
d. Flagelados
e. Amebas
Procedimiento:
1. Tome una lámina portaobjeto limpia y deje caer una gota de la muestra de agua
proporcionada
2. Colocar una laminilla cubreobjeto sobre la gota
3. Realizar una segunda muestra pero antes de colocar la laminilla dejar caer también una
gota de glicerina. Observar a 40X
4. Haga el esquema de todos los microorganismos observados, describa cada uno de ellos.

Ejercicio 3. Observación de Hongos y Levaduras (Eucariota)


Procedimiento:
1. Colocar una gota de la muestra de Candida sp que se le proporcionará sobre la lámina,
agregar una gota de KOH al 10% y coloque encima la laminilla.
2. Observar al microscopio con objetivo de 40X, la morfología, tamaño, yema, pseudohifas.
Esquematice.
3. Colocar sobre otra lámina, una gota de KOH al 10% y sobre ella, y con una asa de siembra
estéril, coloque una muestra de Aspergillus níger que se le proporcionar. Cubrir con la
laminilla y observar a 400x
4. Observar la forma, el tamaño de las estructuras e identifiquelas. DESCRIBA y
ESQUEMATICE
MORFOLOGÍA BACTERIANA Y MÉTODOS DE COLORACIÓN
PARTE I

1. Objetivo

En esta práctica empezamos a tener contacto con las bacterias por lo tanto es necesario utilizar
colorantes a fin de hacerlas más visibles para que nos permita estudiar su morfología, cuya
información contribuye a la caracterización e identificación.

2. Introducción

Las bacterias presentan básicamente 3 formas: Cocos, bacilos y espirilos. Los cocos pueden
disponerse en racimos (estafilococos), en cadena (estreptococos), ó agruparse de dos en dos
(diplococos) o de cuatro en cuatro (sarcinas). Algunos bacilos son tan cortos que se les puede
denominar cocobacilos, como es el caso del género Brucella.

Debido a que el índice de refracción de las bacterias (y otros microorganismos) es similar al


líquido de montaje, no son frecuentemente visibles en un campo brillante de iluminación; se
hacen necesarias ciertas manipulaciones de luz. Por ejemplo bajar el condensador de manera
que el foco de la luz transmitida esté directamente sobre el objeto, produciéndose el
oscurecimiento del fondo que hace que los objetos previamente visibles puedan ser observados.

La introducción de los colorantes a mediados del siglo XIX fue en gran parte responsable de los
avances que han ocurrido en Microbiología Clínica, se hizo uso de colorantes biológicos para
visualizar adecuadamente las bacterias, demostrar su presencia en una muestra; distinguir su
morfología, el fino detalle de sus estructuras internas contribuyendo de este modo a su
identificación y diferenciación taxonómica.

La estructura química fundamental de la mayoría de los colorantes es el anillo bencénico;


generalmente están compuestos de dos o más anillos bencénicos conectados por enlaces
químicos bien definidos (cromóforos) que están asociados con la producción de color. Aunque
el mecanismo de desarrollo de color no está entendido del todo, se ha teorizado que ciertos
radicales químicos tienen la propiedad de absorber la luz de diferentes longitudes de onda,
actuando como prismas químicos. La profundidad del color del colorante es proporcional al
número de radicales cromóforos en el compuesto.

Los Colorantes son referidos como ácidos y básicos si una parte significativa de su molécula es
aniónica o catiónica, desde un punto de vista práctico los colorantes básicos tiñen estructuras
que son ácidas, como por ejemplo la cromatina del núcleo de las células. Las preparaciones
utilizadas para colorear bacterias son siempre soluciones acuosas., estas soluciones
generalmente contienen baja concentración del colorante hasta 1% raramente mayor
concentración.

3. Tipos de Tinciones: Cada una de ellas con una finalidad específica, las más usadas en
bacteriología son:

a. Coloraciones Vitales; se utilizan para preparados en fresco, es decir sobre


microorganismos que serán observados vivos, estos colorantes se concentra en el
soma de los mismos sin afectar la viabilidad. Son útiles para observar
movilidad, morfología y agrupaciones de las bacterias. Ejemplos: Azul de
metileno, Verde Jano, Azul brillante Cresil, Rojo neutro y Azul de Nilo

b. Coloraciones Simples; se usa un único colorante, que siempre es de tipo básico.


Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las células absorberán
el colorante y quedarán teñidas del mismo color. Por tanto, la tinción simple
mejora la observación de la célula completa. Ejemplos: Tinta china, Azul
Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol.

c. Coloraciones Diferenciales; se utilizan para distinguir entre tipos de


microorganismos. La técnica de tinción diferencial consta de dos etapas: una tinción
primaria (tinción simple) seguida de una tinción de contraste que revela las células no
teñidas por el primer colorante. Ejemplo Coloración Gram y Coloración Ziel Nielsen.

d. Coloraciones Especiales; son tinciones específicas que incrementan el contraste en


las células microbianas y revelan estructuras particulares, entre las que se incluyen las
endosporas, los flagelos y las cápsulas. Ejemplo: Técnica de Wirtz Conklin para
esporas, Técnica de Anthony, Hiss para capsulas, Técnica de Leifson para flagelos,
Giemsa para Membrana plasmática, .ácido tánico, azul Victoria. para Pared celular y
Feulgen para núcleos.

e. Los mordientes, aunque no son colorantes, tienen gran importancia en algunas


técnicas de tinción porque aumentan la afinidad de la célula por el colorante,
también se usa para producir un engrosamiento de ciertas estructuras celulares
externas, como los flagelos que debido a su delgadez no podrían ser visualizados
de otra forma.

4. Preparación de Colorantes y Reactivos

En la preparación de colorantes se debe verificar lo siguiente:

- Si estos se disuelven en soluciones acuosas o alcohólicas.


- Si el pH del agua altera el resultado de la coloración
- Es necesario conocer si el recipiente en el cual se conserve debe ser oscuro.
- Se requiere tener información sobre el tiempo de preparación antes de su uso ya
que ciertos colorantes no pueden usarse inmediatamente después de su
preparación.
- Todos los reactivos para tinción deberán conservarse en frascos de cristal
perfectamente tapados y protegidos de la luz solar directa.
- No deberán colocarse cerca de ácidos concentrados o amoníaco.
- El agua destilada para los reactivos deberá ser de reciente preparación y tener
reacción neutra.

a. Coloración de Azul de Metileno


Solución A:
Azul de metileno……………………..0.3g
Etanol 95%..........................................30ml
Agua destilada……………………..100ml
Mezclar y disolver

b. Coloración GRAM
Cristal Violeta
- Cristal violeta………………………..1g
- Agua destilada………………………100ml
Mezclar y disolver

Bicarbonato de sodio
- Bicarbonato de sodio………………..5g
- Agua destilada………………………100ml
Mezclar y disolver

Alcohol – acetona
- Mezclar el alcohol con la acetona v/v

Lugol
- Yodo de cristales……………………1g
- Yoduro de potasio…………………..3g
- Agua destilada……………………...100ml
Pulverizar en un mortero el yodo y el yoduro de potasio seco, añada agua poco a
poco hasta disolver. Mezclar ésta solución en un frasco de vidrio oscuro con el resto
del agua destilada.

Safranina
- Safranina…………………………..0.1g
- Agua destilada…………………….100ml
Mezclar y disolver

c. Coloración ZIEHL NEELSEN

Fuccina fenicada
Solución A:
- Fuccina básica……………………..1g
- Etanol al 95%..................................10ml
Disolver y dejar reposar a 37ºC por 24 horas.

Solución B:
- Fenol de cristales…………………5g
- Agua destilada……………………95ml
Mezclar y disolver

Solución de trabajo:
Mezclar 1ml de la solución A con 9ml de la solución B

Alcohol – Acido
- Acido clorhídrico………………….3ml
- Etanol al 95%..................................97ml

Azul de metileno
- Azul de metileno……………………0.3g
- Agua destilada……………………..97ml
Mezclar y disolver
d. Coloración de Vago

Solución A
- Mercurio cromo ……………………..2g
- Agua destilada……………………….100ml

Solución B
- Cristal violeta………………………..2g
- Agua destilada……………………….100ml

MORFOLOGIA BACTERIANA
Figura 2. Morfología: 1. cocos; 2. diplococo; 3. cocos en cadenas;4. cocos en racimos; 5. cocos
entetradas; 6. cocobacilos; 7. bacilos;8. bacilos bordes redondeados; 9. bacilos bordes rectos; 10.
bacilosfusiformes; 11, 12. bacilos curvos; 13 al 15. Espiroquetas
Ejercicio 1:

COLORACIÓN SIMPLE:

A. COLORACIÓN AZUL DE METILENO

Muy útil para detectar bacterias en frotices de líquido cefalorraquídeo en casos de sospecha de
meningitis bacteriana o en otras muestras de interés clínico. El colorante mayormente utilizado
es el Azul de Metileno.

Procedimiento:
1. Tome la lámina portaobjeto limpia, coloque tres gotas pequeñas de agua destilada para
hacer tres frotices, con tres gérmenes diferentes proporcionados por el laboratorio.
2. Con el asa, tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y disuelva en la gota de
agua (cuando el cultivo es medio líquido no necesita el agua). Los frotices que se obtengan
no deben ser ni muy gruesos ni muy finos.
3. Dejar secar a temperatura ambiente o pasando por la llama muy suavemente, para obtener
la fijación del frotis
4. Cubra la preparación con dos o tres gotas de AZUL DE METILENO, dejando que el
colorante actúe por un minuto, luego lave la preparación con agua corriente, evitando que
el chorro de agua caiga directamente sobre el frotis.
5. Seque y observe al microscopio, usando lente de inmersión con aceite de inmersión o
cedro.

Resultado: Al examen microscópico los microorganismos se observan de color azul intenso.

B. COLORACIÓN SIMPLE CON FUCSINA BASICA

Procedimiento:
1. Preparar un frotis a partir de la mezcla bacteriana
2. Fijar al calor
3. Cubrir el frotis con el colorante fuccina básica y dejar actuar de 3 a 5 minutos
4. Lavar con agua y dejar secar
5. Observar al microscopio con objetivo de inmersión
Resultado: Al examen microscópico los microorganismos se observan de color rosado.

C. COLORACIÓN DE VAGO

Esta técnica se utiliza primordialmente para la observación de espiroquetas en frotices.


Dependiendo del tipo de muestra a colorear, es posible observar otro tipo de bacterias.

Procedimiento:
1. Preparar el frotis del cultivo o sarro dentario, en este último caso colocar previamente
una gota de solución fisiológica en la lámina
2. Cubrir el frotis con la solución mercurio cromo al 2% por 3 minutos y luego lavar con
agua corriente
3. Cubrir el frotis con cristal violeta del GRAM por 3 minutos y luego lavar con agua
corriente y dejar secar
4. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión
Resultado: Las espiroquetas se ven de color violeta claro y si el frotis fue realizado del sarro
dentario se observará además de las espiroquetas otras formas bacterianas de color violeta
intenso