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Laboratorio de biocatálisis: Cinética enzimática

PRÁCTICA DE LABORATORIO # 3: ACTIVIDAD


ENZIMÁTICA DE LA FOSTATASA ALCALINA
BIOCATÁLISIS 19-01
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA
FACULTAD DE INGENIERÍA

OBJETIVOS:
Calcular los parámetros cinéticos de una reacción enzimática (K M y Vmax) a partir de datos
experimentales.

Familiarizar a los estudiantes con métodos experimentales para el seguimiento y estudio de


reacciones biocatalíticas.

1. Introducción.

La actividad de una enzima está estrechamente relacionada con la concentración enzimática, es


decir, esta actividad es directamente proporcional a la concentración. En muchas ocasiones, se
requiere determinar la cantidad de enzima presente en una muestra, la mayoría de veces esto sólo
puede hacerse mediante medidas de la actividad enzimática.

Este ensayo enzimático representa un estudio específico de muchos casos potenciales, en los cuales
una enzima particular que actúa sobre un sustrato, cataliza su conversión en un producto que
absorbe luz a una longitud de onda determinada. De esta forma, se puede hacer seguimiento a la
reacción enzimática y determinar información cinética relevante con base al valor de absorbancia
que indica un espectrofotómetro.

Para una gran cantidad de enzimas de interés práctico se requiere determinar su actividad, un
ejemplo de estas enzimas es la fosfatasa alcalina, la cual es de gran relevancia a nivel industrial y
biomédico. En el área industrial, específicamente en el sector de alimentos, se ha empleado en
estudios de calidad e impacto metabólico de diversos productos alimenticios, por ejemplo como un
indicador de eficiencia en la pasteurización de la leche. En el campo de la biomedicina y molecular,
se sabe que la fosfatasa alcalina está presente en el riñón, hígado, intestino y huesos de los seres
humanos. La medida de niveles anormales de esta enzima en el suero, indican la existencia de
enfermedades óseas degenerativas (raquitismo, osteomalacia, hiperparatiroidismo secundario,
osteosarcoma) o bien daños hepáticos (Mercado, Duarte, Álvarez, Rosa, & Wall, 2012).

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2. Consultas preliminares a la práctica.

2.1. Elabore un diagrama de flujo esquemático donde se describa el procedimiento a realizar


durante el desarrollo de la práctica. Señale los puntos críticos que considere en las diferentes etapas
del proceso.

2.2. Estudie la presente guía antes del desarrollo de la práctica.

2.3. Repase el material de la clase teórica relacionado con la actividad enzimática, la ecuación de
Michaelis-Menten y sus métodos de linealización.

2.4. Revise previo a la práctica de laboratorio la ficha de seguridad de los siguientes materiales: (1)
Fosfatasa Alcalina de mucosa intestinal bovina- P6774 sigma -, (2) 4-nitrofenil fosfato – CAS
4264-83-9-, (3) Buffer Glicina (100mM), pH 9.8 con: 1mM MgCl 2, 1mM ZnCl2.

3. Fundamento teórico.

La fosfatasa alcalina (E.C. 3.1.3.1.) hidroliza los fosfoésteres liberando el fosfato inorgánico de
acuerdo con la siguiente reacción generalizada (Figura 1):

R-OPO(OH)2 + H2O ⎯⎯⎯⎯⎯⎯ R=O + OP(OH)3 + H+


Figura 1. Reacción enzimática de la Fosfatasa alcalina para un fosfoéster en medio básico con la presencia de
un cofactor.

Se denomina fosfatasa alcalina porque actúa mejor a pH elevado, en el rango 8-10, pero para
nuestro caso concreto el pH óptimo es 9.8. Su actividad como biocatalizador requiere de la
presencia de iones metálicos que actúan como cofactores (e.g. Zn2+ o Mg2+), mientras que la
presencia o acumulación de fosfato la inhibe.

La especificidad de la enzima por el sustrato es débil, y un amplio número de fosfoésteres pueden


ser hidrolizados por esta enzima, en este caso particular se usará como sustrato el 4-nitrofenil
fosfato (4NFF) debido a que es un compuesto que tras la acción enzimática, libera el grupo fosfato
y el 4-nitrofenil, un compuesto cromóforo fácil de detectar espectrofotométricamente; para esta
práctica la reacción global catalizada por la fosfatasa alcalina se presenta en la Figura 2.

Figura 2. Ruptura del enlace fosfoester del 4-nitrofenil fosfato como consecuencia del efecto catalítico de la
fosfatasa alcalina.

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El seguimiento de la reacción se hace detectando la absorbancia del 4-nitrofenil a una longitud de


onda de 405 nm, teniendo en cuenta que este posee un coeficiente de extinción de 18.5 mM-1cm-1.

Otros conceptos relevantes para el desarrollo de la práctica:

-La actividad enzimática se mide generalmente en una escala específica para cada enzima, y en
ocasiones puede incluso variar para diferentes sustratos. En este caso, la actividad enzimática de la
fosfatasa alcalina se mide en unidades DEA. Una unidad DEA hidrolizará 1µmol de 4-nitrofenil
fosfato por minuto a pH 9.8 y 37°C.

-La ecuación propuesta por Michaelis-Menten relaciona la velocidad inicial (Vi) de la reacción con
la concentración del sustrato (EC 1). Para que esta ecuación sea válida, deben realizarse mediciones
bajo ciertas condiciones experimentales que garanticen la irreversibilidad de la reacción y la
formación constante del complejo enzima sustrato (ES).

EC 1 𝑉 (𝑠) =

4. Seguridad durante la práctica

4.1. Equipos de protección personal.

Usar durante todo el desarrollo de la práctica los siguientes elementos de seguridad:

 Bata de laboratorio
 Guantes de nitrilo
 Gafas de seguridad

Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Está prohibido su
intercambio con los demás compañeros de laboratorio.

4.2. Manejo de residuos químicos y biológicos

Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los
residuos generados en las prácticas del laboratorio en forma adecuada. Por ello el estudiante debe:

1. Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los
cuales están debidamente identificados según el tipo de sustancia a desechar.

2. Verter únicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no


controladas y potencialmente peligrosas.

3. No arrojar por el desagüe los desechos o residuos químicos obtenidos durante el desarrollo de la
práctica.

NOTA: Si tiene alguna inquietud al respecto comuníquela al responsable del laboratorio, quien le
indicará la forma correcta de hacerlo

5. Materiales y métodos

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5.1 Materiales y reactivos

Cada grupo contará con los siguientes materiales para la elaboración de la práctica:

Tabla 1. Materiales y equipos requeridos para el desarrollo de la práctica


Materiales y equipos (unidades) Reactivos
Espectrofotómetro VIS (1) Solución de 4-nitrofenil fosfato (4NFF) 10mM
Cubeta para Baño de hielo (1) (1ml), preparar antes de la práctica.
Celda desechable 1000 µL para Vis (7) Solución buffer y cofactores (20ml):
Buffer Glicina (100mM), pH 9.8
Micropipeta de 10-100 µL (con puntas) 1mM MgCl2, 1mM ZnCl2
Micropipeta de 100-1000 µL (con Solución de la enzima A2356-10KU (1ml):
puntas) Preparada por los laboratoristas en buffer
glicina (mantener refrigerada).
Cronómetro (2)
*Cada mesa tendrá disponible 2 espectrofotómetros.

5.2 Metodología

La solución donde se va a llevar a cabo la biocatálisis, estará conformada a partir de tres soluciones
iniciales: (1) solución madre de enzima, (2) solución del sustrato, y (3) solución de buffer y
cofactores para completar el volumen de la reacción que será de 2 ml (Figura 3).

50µl Enzima

Max. 60 µl Sustrato
2ml

Buffer

Figura 3. Diagrama de la cubeta con volúmenes que conforman el sistema de reacción biocatalítica.

Se deben tener en cuenta diversos factores como: la cantidad de enzima (50µl) debe ser constante
para todos los ensayos, la cinética de Michaelis-Menten se basa en obtener datos de variaciones en
la concentración de sustrato para obtener la velocidad inicial de cada ensayo, y el volumen total de
reacción (2 ml) debe ser fijo para todos los ensayos.

Realice un diseño experimental variando el volumen de sustrato y de buffer (Tabla 2), que le
permita obtener datos de la cinética de Michaelis-Menten de la fosfatasa alcalina, con el objetivo de
calcular sus parámetros cinéticos (KM y Vmax). Tenga en cuenta que el volumen máximo de
sustrato a añadir no debe superar 60 µl, y la suma del volumen del sustrato y el buffer debe
ser 1950 µl, recuerde que el volumen de enzima es 50 µl en todos los ensayos con excepción del
blanco.

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5.3. Procedimiento

Antes de iniciar el procedimiento experimental asegúrese de tener las columnas 2 y 3 de la Tabla 2


completas. Una vez esté completa la tabla, discuta su estrategia con el personal encargado de la
práctica de laboratorio y cuando las soluciones estén correctamente diseñadas, agregue directamente
en las cubetas del espectrofotómetro únicamente el volumen correspondiente de buffer y sustrato
(4NFF, 10mM) de cada uno de los 7 ensayos (no adicionar la enzima aún). Una vez estén
preparadas y rotuladas las 7 cubetas con las respectivas soluciones, comenzaremos con el
procedimiento. Tenga en cuenta que todos los ensayos se deben medir a los tiempos que aparecen
en la Tabla 2, por lo cual debe planear con anticipación una estrategia de la distribución de las
labores entre los integrantes de cada grupo.

1. Ajustar la longitud de onda del espectrofotómetro a 405nm, y calibrar con el blanco (Ensayo 7,
solución de sustrato y buffer, sin la enzima). Guarde el blanco.

2. Adicione 50µl de la solución madre de enzima a la cubeta que corresponde al primer ensayo,
mezcle inmediatamente por reflujo con ayuda de la micropipeta y colóquela rápidamente en el
espectrofotómetro. Comience a contar el tiempo con el cronómetro.

3. Mida la absorbancia a 405nm del primer ensayo exactamente a los 45seg, 1.5min y 3min de
acuerdo con la Tabla 2.

4. Retire del espectrofotómetro la cubeta del primer ensayo y repita el procedimiento 1-3 para el
segundo ensayo. Recuerde tener en cuenta el tiempo transcurrido de cada uno de los ensayos,
con el fin de poder tomar las absorbancias correspondientes a los 5min y 10min para cada
ensayo. Una vez complete toda la información en la tabla 1 para los ensayos 1 y 2, puede
pasar a la actividad 5.

5. Repita los pasos 1-4 para los ensayos 3 y 4, teniendo en cuenta que se debe medir la
absorbancia exactamente al tiempo determinado en la Tabla 2.

6. Repita los pasos 1-4 para los ensayos 5 y 6, teniendo en cuenta que se debe medir la
absorbancia exactamente al tiempo determinado en la Tabla 2.

7. Tras terminar esta sección usted debe tener por completo toda la información requerida en la
Tabla 2.

6. Resultados y discusión

6.1. Elabore una gráfica de concentración de producto [P] vs tiempo para cada concentración de
sustrato analizada (Ensayos 1-6). Recuerde que la concentración de producto se puede calcular
usando la absorbancia del producto (4-nitrofenil) y su coeficiente de extinción (mencionado en
la guía).
6.2. Calcular la velocidad inicial de reacción (Vi) a distintas concentraciones de sustrato [S] a partir
de la gráfica obtenida en la pregunta 6.1. ¿Qué información decidió usar para el cálculo de la
velocidad inicial y por qué?

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6.3. ¿Qué consideraciones experimentales deberá tener en cuenta para poder analizar la cinética de
esta enzima bajo las suposiciones del estado estacionario y poder calcular los parámetros
cinéticos (KM, Vmax)?
6.4. Utilice los diferentes métodos gráficos de linealización vistos en la clase teórica para calcular
los valores experimentales de KM y Vmax. Haga las gráficas necesarias, y explique las ventajas y
desventajas de cada método para este ensayo en particular.
6.5. Con la información experimental, estime la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina en
unidades DEA.

7. Bibliografía

Bisswanger H. (2012). Practical Enzymology (360 p). Second edition. Wiley Blackwell.

Caicedo N. Prácticas de laboratorio: Biotransformaciones II. Universidad ICESI

Facultad de Ciencias Naturales (2017). Practica de Laboratorio 5: Cinética de la fosfatasa alcalina.


Laboratorio de Enzimología, Universidad ICESI.

Mercado, G., Duarte, N. L., Álvarez, E., Rosa, L. A., & Wall, A. (2012). Fosfatasa alcalina
(E.C.3.1.3.1): bioquímica y aplicaciones en las ciencias biomédicas, ecológicas y
alimentarias. Tecnociencia, 112-120.

www.sigmaaldrich.com/us-export.html, último acceso en junio 7 del 2017.

Elaborado por: Dr. Carlos Andrés Alvarez Vaco y Dr. Nelson Caicedo.

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ALUMNO: _________________________________________ CÓDIGO: ___________________

ALUMNO: _________________________________________ CÓDIGO: ___________________

DATOS DEL LABORATORIO

Tabla 2. Diseño experimental para obtener datos de velocidades iniciales de una cinética
enzimática.
Ensayo Sustrato Buffer [S]f A405nm A405nm A405nm A405nm A405nm
# (µl) (µl) (mM)* (45s) (1.5min) (3min) (5min) (10min)
1 60 1890
2

7 60 1940

Tener en cuenta la siguiente fórmula para encontrar la concentración de sustrato final [S] f luego de
preparadas las soluciones:

𝑺𝟏 × 𝑽𝟏 = 𝑺𝟐 × 𝑽𝟐 ; siendo: S: concentración de sustrato (mM); V: Volumen (µl).

Nota: El volumen de reacción de 2000µl se completa con la adicción de los 50µl de enzima.

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ANEXO 1 (para uso del laboratorista)

PREPARACION DE SOLUCIONES

Buffer glicina 100 mM pH 9,8; 1mM MgCl2; 1mM ZnCl2

Glicina 7,507 g

Agua destilada Hasta 1 litro

Ajustar el pH con HCl a 9,8

Adicionar los cofactores: MgCl2 (hexahydrate) 0,203g; ZnCl2 (anhydrous) 0,136g

Solución sustrato: p-nitrofenil-fosfato 10 mM (99% pure)

p-nitrofenilfosfato 0,0367 g

Buffer glicina hasta 10 ml

Solución madre de enzimática (A2356-10KU):

A partir de la solución de enzima original hacer una dilución 1/1000 (primera dilución), y luego una
dilución 1/100 (segunda dilución). La dilución global es 1/100,000

Tomar 10µl de enzima y completar volumen con buffer glicina hasta 10 ml (primera dilución).
Luego en un beaker nuevo tomar 200µl de la primera dilución, y completar volumen con buffer
glicina hasta 20 ml (segunda dilución). La enzima de la segunda dilución es la que se emplea en los
experimentos.

Información del lote de la enzima:

Proteína: 20 mg/ml Actividad: >5500 DEA/mg