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IDENTIFICAR LOS FUNDAMENTOS DE LA BIOTECNOLOGIA ALIMENTARIA Y
LA APLICACIÓN DE ENZIMAS
Bermúdez, D.F.1, Pérez, G.M.1, Perez, E.J.1 Montenegro, J.I.1 y Fernández, F. F.2.
1. Estudiantes Ingeniería Alimentos, Universidad Nacional Abierta y a Distancia (UNAD).
2. Tutor Universidad Nacional Abierta y a Distancia (UNAD).
 La cromatografía de líquidos clásica fue la primera en
RESUMEN
El presente trabajo tiene como finalidad establecer la
identificación y fundamentos de la biotecnología alimentaria
y la aplicación de enzimas para lo cual se seleccionó la
técnica molecular de cromatografía liquida y las proteasas
como enzimas utilizadas en procesos biotecnológicos,
presentando en este proceso la fundamentación teórica de la
técnica seleccionada. De esta manera se logra establecer una
comparación objetiva en el comportamiento de esta técnica
molecular la cual consiste en separar, aislar e identificar los
analitos de una mezcla de compuestos químicos, teniendo en
cuenta la siguiente problemática; Determinación, de
histamina en conservas de pescado mediante la técnica de
cromatografía en capa delgada (TLC).
PALABRAS CLAVES: Cromatografía liquida, Enzimas,
Proteasas microbianas, Biotecnología, Analitos.
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
 Identificar los fundamentos de la biotecnología
alimentaria y la aplicación de enzimas bajo la técnica de
cromatografía liquida.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
 Determinar la presencia de histamina en conservas de
pescado mediante la técnica de cromatografía en capa
delgada.
 Conocer el método de aplicación y como es ejecutado en
el proceso biotecnológico.
 Fundamentar teóricamente la técnica molecular que fue
seleccionada.
 Identificar bajo que problemática en el área de alimentos
tendrá aplicación y ejecución la técnica seleccionada.
INTRODUCCION
La cromatografía es un método de separación de los
componentes de una muestra según su capacidad para
distribuirse entre una fase móvil, que contiene la muestra, y
una fase estacionaria. Cuando la fase móvil es un líquido
hablamos de cromatografía de líquidos.
*
Revista Argentina de Trabajos Estudiantiles. Patrocinada por la IEEE.
aplicarse y se llevaba a cabo en columnas de vidrio rellenas
de partículas granulares sólidas en las que el flujo se
producía por gravedad. Si los gránulos eran los
suficientemente pequeños para conseguir una buena
separación, los tiempos de separación se hacían demasiado
grandes. Si se disminuía el tamaño de las partículas o se
forzaba el flujo mediante una bomba o por la presión de un
gas, se aumentaba la rapidez, pero a costa de un aumento
considerable de la altura de plato teórico y, en consecuencia,
una disminución de la eficacia de la separación.
Estos inconvenientes hicieron que la cromatografía de
líquidos quedara durante muchos años relegada, debido al
éxito alcanzado por la cromatografía de gases. Hasta los
años 70 no se desarrolló la tecnología apropiada para poder
producir y utilizar rellenos de tamaño de partícula muy
pequeño en sistemas instrumentales resistentes a las elevadas
presiones necesarias para poder realizar con éxito la
separación cromatográfica. Para distinguir estos nuevos
métodos de los clásicos se emplea la denominación
de cromatografía de líquidos de alta eficacia o HPLC (high
performance liquid chromatography).
La cromatografía HPLC es la técnica analítica de separación
más ampliamente utilizada, debido a su sensibilidad, su
fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas, su grado
de automatización y su capacidad para separar compuestos
no volátiles o termolábiles (que no pueden emplearse en
cromatografía de gases), muchos de los cuales tienen
una gran importancia industrial y científica.
METODOLOGIA
El presente artículo fue desarrollado bajo un enfoque
conceptual y metodológico mediante consultas en fuentes de
investigación que ayudaron a planificar y estructurar el
cuerpo del trabajo, el cual estuvo fundamentado en la
aplicación de la cromatografía liquida de alta presión
(HPLC) con el objetivo de conocer y ampliar el
conocimiento sobre las técnicas moleculares aplicadas en la
industria de alimentos, teniendo en cuenta que este tipo de
estudio más adelante será insumo para los procesos prácticos
de laboratorio que se llevaran a cabo en las distintas plantas
piloto de la Universidad Nacional Abierta y a Distancia
(UNAD).
 Técnica molecular empleada en la industria de
alimentos.
Cromatografía Liquida.

 Enzima utilizada en el proceso de biotecnología
alimentario.
Proteasas microbianas.
 Presenta la fundamentación teórica de la técnica de
la biotecnología molecular y las enzimas en procesos
de biotecnología alimentaria.
Fundamentación teórica de la Cromatografía Líquida de
Alta Presión (HPLC): o Resolución es una técnica de
permite separar, aislar e identificar los analitos de una mezcla
de compuestos químicos (basada en la transferencia de masa
entre la fase estacionaria y la fase móvil), por lo que es
utilizada frecuentemente en Bioquímica y Química Analítica
para la separación de componentes de una sustancia
determinada, basándose en diferentes tipos de interacciones
químicas. Recientemente es una de las técnicas más utilizada
en la industria Química y de alimentos, ya que ofrece la
posibilidad de identificar y cuantificar sus componentes
mediante el uso de sustancias patrón. La cromatografía de
líquidos abarca un grupo muy amplio entre los métodos
cromatográficos, puesto que el sistema ternario fase
estacionaria/fase móvil/analito ofrece muchas y muy distintas
posibilidades para separar compuestos químicos muy
diferentes. La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo
en una columna generalmente de vidrio, la cual está rellena
con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte
superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna
por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la
eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de
fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los
micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas
presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta
manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial
que permita trabajar con las altas presiones requeridas. La
descripción de la HPLC no se puede basar solo en la
instrumentación, sino que también hay que ofrecer una
aproximación sistemática para lograr separaciones
adecuadas.
Clasificación de la cromatografía líquida
Los diferentes tipos de cromatografía líquida se pueden
clasificar de diferentes maneras, pero la forma más habitual
de clasificarlas es la realizada en base a la naturaleza de la
fase estacionaria, ya que es esta la que impone finalmente el
mecanismo de separación; de este modo se pueden numerar
cuatro tipos de técnicas:
Cromatografía de adsorción (líquido- solido): La fase
estacionaria es un adsorbente y la separación se basa en
repetidas etapas de adsorción-desorción.
Cromatografía de reparto/ adsorción (fases ligadas
químicamente): La separación en este caso, se basa en un
reparto del soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria.
Cromatografía de intercambio iónico: Este tipo de
cromatografía se da cuando la fase estacionaria presenta en
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su superficie grupos ionizados capaces de retener
selectivamente a iones de signo contrario que circulan en la
fase móvil.
Cromatografía de exclusión molecular: La fase
estacionaria, en este caso, es un material poroso de tamaño
de poro controlado, que permite la entrada de ciertas
moléculas de manera selectiva, dejando fuera otras de mayor
tamaño.
El mecanismo de retención en los dos primeros casos es
similar, variando únicamente el tipo de interacciones que se
producen y cuál de ellas es la predomínate; por tal razón, en
la práctica se realiza otra división de los dos primeros tipos
de cromatografía atendiendo a polaridad de la fase
estacionaria:
Cromatografía de fase normal: La fase estacionaria
presenta puntos activos de alta polaridad y las interacciones
que se producen con el soluto son específicas del grupo
activo. La fase estacionaria puede ser un sólido adsorbente, o
bien un soporte, al que se unen químicamente moléculas
orgánicas que presentan grupos funcionales de alta polaridad.
Cromatografía de fase reversa (inversa): La fase
estacionaria tiene una naturaleza apolar y las interacciones
que se producen son inespecíficas.
Instrumentación
La moderna cromatografía de líquidos de alta eficiencia,
debido al pequeño diámetro de las partículas de la fase
estacionaria que se utilizan, requiere de la utilización de unos
dispositivos que constituye el cromatógrafo.
Sus componentes básicos de un cromatógrafo líquido son:
 Dispositivo de suministro de eluyentes (bomba y
dispositivo de mezclado de eluyentes)
 Dispositivo de inyección
 Conducciones y conexiones
 Detector y registrador
 Columna
Imagen 1. Esquema Componentes básicos de un
cromatógrafo de líquidos.
Fuente: Google 2018, imagen extraída de:
http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investiga
cion/cromatografia/cromatografia_liquida_de_alta_efica
cia.pdf

Además de los dispositivos anteriormente nombrados se
pueden incorporar en el sistema otros que pueden simplificar
el trabajo o bien mejorar algún aspecto de la técnica
cromatografíca como pueden ser:
 Inyectores automáticos
 Colectores de fracciones
 Hornos termostatizados para las columnas
 Sistema de tratamiento de datos
Fundamentación teórica de las proteasas: Las proteasas
son enzimas capaces de hidrolizar los enlaces peptídicos.
Reacción no catalizada
La reacción no catalizada consiste en un ataque nucleofílico
por el átomo de O del H2O sobre el carbono carbonílico del
enlace peptídico formando un intermediario tetraédrico.
El carácter parcial de doble enlace del enlace peptídico hace
que el carbono carbonílico sea mucho menos reactivo que los
carbonos carbonílicos en los ésteres.
La tarea catalítica de las proteasas consiste en transformar al
carbono carbonílico, normalmente no reactivo, en mucho
más susceptible al ataque nucleofílico por el agua.
Funciones de las proteinasas.
1) Función digestiva.
a) Extracelular.
b) Intracelular.
2) Turnover proteico.
3) Procesamiento post-traduccional de proteínas.
a) Proteasas del péptido señal.
b) Proteasas de procesamiento de pro-Hormonas y otras
proteínas.
c) Dominio pro- en muchas proteinasas.
4) Invasión de tejidos (parásitos, metástasis tumorales).
Proteasas: Endo y exo
Las endopeptidasas hidrolizan uniones peptídicas internas en
una cadena poli peptídica, tendiendo a actuar lejos del
Nterminal o del C-terminal.
Las exopeptidasas requieren un amino terminal, un carboxilo
terminal, o ambos, libres, e hidrolizan una unión peptídica a
no más de tres residuos desde el N terminal o del C terminal.
Según el extremo que cortan, serán aminopeptidasas o
carboxipeptidasas.
Clasificación de Proteasas
Clasificación por relación evolutiva
 Propuesta en 1993 por Alan J. Barrett y N.D. Rawlings
(Cambridge, UK). Comparación de secuencias proteicas
y clasificación en:
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 Familias, cuyos miembros derivarían de una misma
proteína ancestral por evolución divergente. Tienen
homología estadísticamente significativa, al menos en el
dominio catalítico (es decir, en el que tiene actividad de
proteasa).
 Clanes, grupos de familias con una proteína ancestral
común. La homología de secuencia entre ellas es mucho
más baja, pero se conservan el orden lineal de los
residuos del sitio activo y los pequeños grupos de
residuos que los rodean; además, tienen una estructura
terciaria similar.
 La información, que se mantiene actualizada, está
contenida en la base de datos MEROPS
(merops.sanger.ac.uk). Se complementa con la
nomenclatura de enzimas de la IUBMB (peptidasas, EC
3.4; la cruzipaína es EC 3.4.22.51 y C01.075 en
MEROPS)
Por la reacción catalizada: Son pocos los casos en que se
conoce exactamente la reacción catalizada, en términos de
qué unión es hidrolizada en el substrato. Se aplica sobre todo
a exopeptidasas.
Por el mecanismo catalítico: Es la más usada, desde su
propuesta por Brian Hartley hace más de 50 años. Se basa en
cuáles son los grupos que intervienen en la catálisis y en
cómo actúan.
Por su secuencia y estructura: Es la clasificación más
moderna, propuesta por Alan Barrett, y complementa a la
anterior.
Endopeptidasas: clasificación por el tipo de reacción
catalizada.
 Pueden ser denominadas en base a la preferencia por un
determinado residuo en P1 o en P1´ (por ejemplo, glicil-
endopeptidasa; peptidil-lisil endopeptidasa). Si hay
varias enzimas con igual especificidad, hay que
distinguirlas (glutamil endopeptidasas I y II).
 En la gran mayoría de los casos, la especificidad es
demasiado compleja, y se usan nombres triviales
(pepsina, tripsina, quimotripsina, papaína, termolisina).
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD
PROTEOLÍTICA.
1. SUSTRATOS PROTEICOS.
1) Proteínas naturales como sustratos generales
(hemoglobina, caseína).
a) Precipitación de proteína no digerida y determinación de
A280 nm en el sobrenadante.
b) Precipitación y reacción de Folin en el sobrenadante.
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2) Derivados cromogénicos de proteínas naturales Ensayos espectrofotométricos:

(azocaseína, azoalbúmina) Precipitación y lectura de la A440
nm de los azopéptidos. a) 4-nitroanilidas (NH-Nan): Derivados N-acilados de la 4-
nitroanilina. La A400 nm difiere en aprox.10.000 M-1cm-1
3) Derivados fluorogénicos de proteínas naturales: Caseína entre las 4-nitroanilidas y la 4-nitroanilina a pH 8.0.
ligada a isotiocianato de fluoresceína (FITC-caseína). Utilizables en determinaciones espectrofotométricas
Excitación a 490 nm y emisión a 525 nm. continuas.

4) Proteínas específicas. b) 2-naftilamidas (NH-Nap): La 2-naftilamina tiene su

máximo de absorción a 340 nm, y difiere de las 2-
a) Colágenos para colagenasas. naftilamidas en aprox. 1.700 M-1cm-1. Esto depende del pH:
por debajo de 5.5 no hay diferencia. Se puede aumentar la
sensibilidad por diazotación de la naftilamina libre con N(1-
b) Pre-proteínas radioactivas (sintetizadas por traducción in
naftil) etilendiamina diclorhidrato, o por reacción con una sal
vitro de su mRNA), para las proteinasas del péptido señal.
de diazonio estable, el Fast Garnet, que da un producto
insoluble (requiere un detergente para mantenerse en
5) Proteínas naturales marcadas con radioisótopos (125I en solución).
Tyr). Precipitación y determinación de radioactividad en el
sobrenadante.
c) Amidas y ésteres: La hidrólisis de amidas puede seguirse a
230 nm, o siguiendo la liberación de aminoácidos con
6) Separación de fragmentos grandes después de proteólisis ninhidrina. Baja sensibilidad.
limitada.
 Identificar una problemática presentada en la
a) HPLC en fase reversa. industria de alimentos para cada temática, que
brinde solución a la misma mediante una
b) SDS-PAGE. justificación pertinente y comparación con al menos
un autor que trabajó la misma técnica.
c) Filtración por gel.
Problemática: Determinación de histamina en conservas
7) Determinaciones en fase sólida (proteinasa, o sustrato, o de pescado mediante la técnica de cromatografía en capa
ambos, inmovilizados). delgada (TLC).

a) Electroforesis en gel de poliacrilamida. Actividad Las proteínas que componen la carne del pescado
determinada in situ después de la electroforesis. - Métodos contienen todos los aminoácidos esenciales por lo que es
histoquímicos: b-naftilamidas y Fast Garnet. - Proteína considerada de alto valor biológico. Es un medio muy
copolimerizada: Gelatina, fibrinógeno. Gel lavado para propicio para el desarrollo de bacterias, algunas de las
eliminar el SDS, incubado al pH adecuado, teñido con cuales intervienen en la formación de una variedad de
Coomassie Blue. Actividad detectada como zonas incoloras aminas, como resultado de la descarboxilación directa de
sobre fondo azul. los aminoácidos. La descarboxilación de la histidina por
enzimas bacterianas resulta en histamina, una amina
b) Ensayos de ELISA Determinación de colagenasa. Ab anti- biógena con propiedades tóxicas, en ciertos niveles, para
colágeno, revelado con Ab contra la IgG usada conteniendo el humano. Normalmente, los pescados involucrados son
un cromóforo adecuado. aquellos con un alto contenido de histidina libre como los
pertenecientes a la familia Scombridae y otros distintos
como los de la familia Clupeidae y Scaridae. La mayoría
2. SUSTRATOS SINTETICOS: Péptidos cromogénicos o
de las bacterias productoras de histamina pertenecen a la
fluorogénicos.
familia Enterobacteriaceae. Luego de ser capturado, el
pescado puede contaminarse por contacto con superficies
a) Sustratos de endopeptidasas (sin amino ni carboxilo no higiénicas y exposición a temperaturas inadecuadas
libres). Bz-L-Arg-NHNan, 400 nm. por largos períodos. Consumida en cantidades mayores a
las permitidas, puede afectar la salud del consumidor.
b) Sustratos de aminopeptidasas (sólo el carboxilo Una de las técnicas empleadas para la determinación de
bloqueado). L-Arg-NHNan, 400 nm. esta amina biógena es la cromatografía, un método físico
de separación, en el que los componentes a separar se
c) Sustratos de carboxipeptidasas (sólo el amino bloqueado). distribuyen entre dos fases, una estacionaria y otra que se
{N-(3-[2-furyl]acryloyl)}-Ala-Lys (FA-AlaLys), 340 nm. mueve en una dirección definida. Se determinó el
Grupos bloqueantes del amino: Benzoil (Bz); contenido de histamina en conservas de pescado mediante
Benzoiloxicarbonil (Z); O-Aminobenzoil (Abz); Acetil (Ac); la técnica de cromatografía en capa delgada, según Torry
Succinil (Suc); Furil-acrilol (FA). Research Station. Se analizaron muestras de conservas de

atún, caballa, bonito y sardina argentina, recibidas en el
Laboratorio del Departamento de Físico-química del
Centro Regional Buenos Aires Sur (SENASA) de la
ciudad de Mar del Plata, en el período comprendido entre
abril y julio del año 2016. Como resultado, se obtuvo una
proporción de muestras aptas ampliamente superior a las
no aptas.
Cromatografía en capa delgada o fina (TLC) La
cromatografía agrupa un conjunto importante y diverso
de métodos físicos de separación, que permite aislar
componentes estrechamente relacionados en mezclas
complejas, lo que en muchas ocasiones resulta imposible
por otros medios. En todas las separaciones
cromatográficas, la muestra se desplaza con una fase
móvil, que puede ser un gas, un líquido o un fluido
supercrítico. Esta fase móvil se hace pasar a través de una
fase estacionaria con la que es inmiscible, y que se fija a
una columna o a una superficie sólida. Las dos fases se
eligen de tal forma, que los componentes de la muestra se
distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase
estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente
retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente
con el flujo de la fase móvil; por el contrario, los
componentes que se unen débilmente a la fase
estacionaria, se mueven con facilidad. Como
consecuencia de la distinta movilidad, los componentes
de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que
pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente. La
cromatografía en capa fina (TLC) es un procedimiento
rápido y sencillo para separar mezclas de sustancias y
para identificar/ caracterizar o para determinar
semicuantitativamente componentes individuales, por lo
que frecuentemente se utiliza como procedimiento de
screening. Como en el caso de otros métodos
cromatográficos, la separación se basa en que las
sustancias investigadas se reparten de modo diferencial
entre una fase estacionaria y otra móvil: en la TLC el
eluyente (fase móvil) se desplaza por una fina capa del
sorbente (fase estacionaria), transportando así los
componentes individuales de la mezcla de sustancias más
o menos lejos dependiendo de la solubilidad y/o de su
comportamiento frente a la adsorción. Hay que señalar
que, al contrario que en la cromatografía en columna, el
proceso separativo transcurre en un sistema abierto, la
placa separativa plana. El recorrido particular de cada
sustancia se emplea así para su identificación. Las
separaciones se realizan generalmente por el
procedimiento “ascendente”, introduciendo el borde
inferior de la placa cromatográfica en el solvente, que
será succionado por acción de las fuerzas capilares del
recubrimiento de la superficie de la placa. Las placas
cromatograficas constan de un soporte liso, inerte (placas
de vidrio, láminas de aluminio o de fibra) sobre las que se
dispone el sorbente formando un espesor lo más
homogéneo posible (por lo general 0,25 mm);
dependiendo la separación a realizar, se tratará de
silicagel, óxido de aluminio, poliamida, celulosa, etc., o
mezclas de las mismas. El eluyente, cuya composición
depende de cada problema concreto, se pone en la cubeta
5
cromatográfica por lo menos 30 min antes del principio
de la separación hasta una altura de 0,5 cm. La cubeta se
cierra con su tapa para que se sature con los vapores del
disolvente y se coloca en un lugar adecuado. Para
desarrollar la placa, su extremo inferior se introduce en el
eluyente y se vuelve a cerrar la cubeta inmediatamente.
Para evitar eluciones, las manchas cargadas deberán estar
completamente por encima del nivel del eluyente.
Problemática: Proteasa Dietética y su Aplicación en
Alimentos para Peces
Muy pocas fuentes de proteínas en el mundo hoy día
están bien estandarizadas, bien caracterizadas, o de
calidad relativamente consistente, en comparación con las
otras fuentes. Entre ellas, destacan la harina de pescado,
la harina de soja, la harina de canola y algunos
subproductos animales como la harina de subproductos
avícolas y la harina de plumas. Para ser coherentes, estos
productos se deben obtener de proveedores confiables y
bien reconocidos, lo que contribuye a limitar el
suministro de estos productos, además el costo podría
estar fuera de alcance para la mayoría de los fabricantes
de alimentos.
El limitado suministro, los altos precio y la creciente
demanda de estas fuentes de proteínas bien caracterizadas
han estado forzando a los fabricantes de piensos en todo
el mundo a utilizar proteínas vegetales y animales menos
conocidas y mal caracterizadas. Estas proteínas
normalmente poseen un desequilibrado perfil de
aminoácidos, pueden contener algunas toxinas o anti-
nutrientes y pueden ser altos en fibra o ceniza,
haciéndolos difíciles de digerir.
La alta inclusión de estas fuentes de proteínas en la dieta
de peces puede traer como resultado una menor
digestibilidad de nutrientes, un rendimiento de
producción deficiente, ya veces, un deterioro de la salud
gastrointestinal. La calidad de estas materias primas
también varía de una región a otra, de una estación a otra,
de un fabricante a otro, e incluso varían entre lotes de un
solo fabricante. Como resultado de estas variaciones, los
nutricionistas y formuladores a menudo tienen que usar
márgenes de seguridad irracionalmente altos para algunos
aminoácidos y micronutrientes claves, con el fin de
satisfacer las necesidades nutricionales de los animales
puntuales.
Solución: La calidad de estas fuentes alternativas de
proteína puede mejorarse y las variaciones en sus perfiles
de aminoácidos digeribles pueden reducirse usando
enzimas, específicamente usando proteasas. En los
últimos años, los estudios han demostrado que las
proteasas no sólo mejoran la digestibilidad de nutrientes o
el rendimiento de crecimiento, sino que también mejoran
la salud intestinal y proporcionan mejores respuestas
inmunes en condiciones de estrés.
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grafia/cromatografia_liquida_de_alta_eficacia.pdf
septiembre 2018
ANALISIS DE RESULTADOS
Extraído de
http://www.iib.unsam.edu.ar/archivos/docencia/licenciatu
ra/biotecnologia/ 2017/BioProt/1495658058.pdf
septiembre 2018
CONCLUSIONES Extraído de
http://www.ridaa.unicen.edu.ar/xmlui/bitstream/handle/1
 Luego de realizar las evaluaciones correspondientes a la 23456789/1433/
técnica de cromatografía en capa delgada (TLC), se Manterola%2C%20Julieta.pdf?sequence=1&isAllowed=
encuentra que es segura para su aplicación en carne de y Septiembre 2018
pescado, la cual contienen todos los aminoácidos
esenciales por lo que es considerada de alto valor Extraído de http://www.aquafeed.co/proteasa-dietetica-
biológico, esta técnica asegura así la inocuidad ya que peces/ septiembre 2018
determina la presencia de histamina en conservas de
pescado.

BIBLIOGRAFIA

Hernández-Abad, Vicente Jesús, Sánchez-González,

Elizabeth Guadalupe, Espinosa-Contreras, Cynthia,
Mora-Guevara, José Luis Alfredo, Marroquín-Segura,
Rubén, Aprendizaje significativo de la técnica de
Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución por
alumnos de la Carrera de QFB de la FES Zaragoza.
Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas, 41
(Octubre-Diciembre): [Fecha de consulta: 18 de
septiembre de 2018] Disponible
en:<http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=57916060007
> ISSN 1870-0195

Extraído de
http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investig
acion/cromato