Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Laboratorio de Genética Microbiana

Practica No. 1 “Aislamiento y

caracterización del DNA”.

Grupo 5QV1
Sección 2
Equipo 12

Alumnos:
Suarez Gómez Alexis Gabriel
Torres Márquez Dafne Yaqueline
Urquizo Pulido Gerardo Gustavo

Profesores:

Mora Ramírez Sergio Salvador

Español Español francisco Javier
Pérez Enríquez Verónica
Gómez Guzmán Octavio

Ciclo escolar 2019-1

Ciudad de México, 14 de febrero de 2019

INTRODUCCIÓN
El DNA consta de dos cadenas de polinucleótidos enrolladas una alrededor de la otra
formando una doble hélice y son antiparalelas. Los ácidos nucleicos contienen
información que puede ser transmitida de una generación a la siguiente. Está formada
por nucleótidos unidos, cada uno de ellos compuesto por un azúcar, un grupo fosfato
y una base nitrogenada, (los azúcares unidos a través de los grupos fosfatos forman
un eje común que forma la parte estructural, mientras que la información genética
está almacenada en la secuencia de las bases dispuestas a lo largo de la cadena).

El patrón de rayos X del DNA puso de manifiesto la estructura helicoidal y el diámetro

del DNA. En 1953 los estudios de la composición de bases del ADN de muchas
especies habían revelado que, dentro de los márgenes de error experimental, los
porcentajes molares de adenina y timina eran iguales y que lo mismo sucedía con la
guanina y la citosina.
Un par de bases adenina-timina (A-T) tiene dos puentes de hidrógeno entre las bases;
un par guanina-citosina (G-C) tiene tres.

El diámetro exterior de la hélice es de 20 Å, la longitud de una vuelta completa de la

hélice entorno a su eje es de 34 Å y contiene 10 pares de bases. Existen huecos
llamados surcos, hay un surco mayor profundo y un surco menor más pequeño en la
doble hélice; ambos pueden ser sitios de unión del DNA a fármacos o a polipéptidos.
En solución acuosa la molécula de DNA se encuentra con carga negativa ya que los
grupos fosfatos quedan por fuera de la molécula, mientras que las bases nitrogenadas
que son hidrófobas quedan en el interior de la molécula.

Fig 1. Esquema del modelo propuesto por Watson y Crick en 1953. A la derecha se muestra
una representación de cómo funciona el apareamiento de bases nitrogenadas, creando tres
puentes de hidrógeno entre Guanina y Citosina, dos puentes entre Adenina y Timina.

Cuando una solución de DNA bicatenaria se calienta por encima de una temperatura
característica su estructura nativa se pierde y se separan sus dos hebras
complementarias, y asume un estado conformacional flexible y que fluctúan con
 rapidez conocida como espirales al azar. Este proceso de desnaturalización se
acompaña por un cambio cualitativo en las propiedades físicas del DNA.
La manera más conveniente de monitorizar el estado nativo del DNA es por su
espectro de absorción ultravioleta. Cuando el DNA se desnaturaliza, su absorbancia
UV, que casi en su totalidad se debe a sus bases aromaticas, aumenta alrededor del
40% en todas las longitudes de onda. Este fenómeno, conocido como efecto
hipercrómico, es resultado de la ruptura de las interacciones electrónicas entre las
bases cercanas. El cambio hipercrómico del DNA, monitorizado a una longitud de
onda particular (por lo general 260 nm), se produce en límites de temperatura
estrechos. Esto indica que el colapso de una parte de la estructura dúplex del DNA
desestabiliza el resto, un fenómeno conocido como proceso cooperativo.

OBJETIVOS
● · Aislar DNA cromosómico de alto peso molecular, a partir de un cultivo
bacteriano de Escherichia coli w3350.
● · Establecer el espectro de absorción del DNA aislado.
● · Determinar la concentración y grado de pureza del DNA obtenido.
● Determinar la influencia de algunas características de la secuencia del DNA
sobre su desnaturalización empleando el programa bioinformático DNAMAN

DESARROLLO EXPERIMENTAL
1er. día
Inocular 200 µl del cultivo
5mL caldo L obtenido

Sembrar asada

Cepa W3350 E. coli Incubar 37°C con

agitación (5 h) Tubo con de ensayo con
5 ml de caldo Luria

Colocar en un Incubar 37°C con

agitación (18 h)
microtubo 1.5 ml 2º. día
del cultivo.

9200 rpm x g
5 minutos

Eliminar el
Eliminar el sobrenadante
sobrenadante
Suspender el
9200 rpm x g
paquete celular en
5 minutos
500 µl de TE pH 7.8
(Tris 50 mM/EDTA
20 mM).
 Agitar suavemente Incubar 37°C con
Suspender las Adicionar 1 µl de por inversión agitación (10 minutos)
células en 175 µl RNAsa (10 mg/ml)
de TE pH 7.8 (Tris
50 mM/EDTA 20
mM).

Incubar 37°C con
agitación (30 minutos)
Adicionar 50 µl de
Lisozima (50 mg/ml) y 20
µl de (SDS) al 10%
Mezclar por inversión

Agregar en 500 µl Agregar 500 µl de Fenol

de solución (Tris 10 saturad mezclar por
mM/EDTA 1 mM) y inversión hasta formar
20 µl de NaCl 5M. emulsión.
Agitar
cuidadosamente

Extraer cuidadosamente
Pasar la fase acuosa con la micropipeta la fase
a un tubo limpio acuosa

9200 rpm x g
3 minutos

Adicionar 500 µl de Mezclar por inversión

cloroformo-alcohol 9200 rpm x g
isoamílico (24:1) 2 minutos
Extraer la capa
superior
 Adicionar 500 µl de 9200 rpm x g
Depositar en otro Mezclar por inversión
Etanol absoluto. 10 minutos
tuvo.

Descartar el
sobrenadante
sin desprender Adicionar
9200 rpm x g
el botón 1mL de 3 minutos
sedimentado Etanol al 70%
frio.

Permitir que el
DNA seque Descartar el
y disolver en sobrenadante
200 µl de agua
destilada estéril
o TE.

Determinación de la concentración de DNA

3er. día
Nota: El protocolo siguiente puede emplearse para DNA de doble cadena de cualquier
tipo de fuente.

Leer la absorbancia del espectrofotómetro

Calcular la concentración de
A las longitudes de onda de 260 y 280 nm
DNA en la solución original:
si la absorbancia a 260 nm es mayor de 1,
aumentar la dilución de la solución 𝐀𝐬 𝟐𝟔𝟎 𝐧𝐦
𝒄=
Mezclar 0.1 𝐀𝐞 𝐱 𝐛
ml de DNA
con 1.9 ml de  C= concentración (g/ml)
Sol. salina  Ae= índice de absorción
Calcular la concentración especifica. (22,500 para el
con la relación: DNA).
1 unidad de Abs260nm de DNA  Paso de la luz de la celda.
en centímetros
de doble cadena = 50 µg/mL de
DNA de doble cadena

Determinar pureza de la solución

del DNA.
Soluciones con una relación de 1.8- 𝐀𝐬 𝟐𝟔𝟎 𝐧𝐦
𝑷𝒖𝒓𝒆𝒛𝒂 = 𝐀𝐬 𝟐𝟖𝟎 𝐧𝐦
2.0, son adecuadas para trabajar
por tener una mayor pureza.
 RESULTADOS
Tabla 1. Absorbancias obtenidas a diferentes longitudes de onda (200-280) para la
construcción del espectro de absorción del DNA cromosómico aislado de Escherichia
coli W3350.

Equipos λ (nm)

200 210 220 230 240 250 260 270 280

7 0.263 0.429 0.663 0.415 0.546 0.739 0.836 0.646 0.402 A

B
0.248 0.409 0.599 0.407 0.496 0.673 0.742 0.615 0.386
S
8
O
R
9 0.261 0.332 0.478 0.310 0.357 0.410 0.452 0.365 0.238 B
A
10 0.242 0.394 0.537 0.390 0.493 0.631 0.839 0.556 0.346 N
C
I
11 0.248 0.414 0.646 0.461 0.505 0.551 0.753 0.469 0.315
A

12 0.188 0.324 0.428 0.314 0.368 0.429 0.454 0.374 0.251

Figura 2. Espectro de absorción de DNA cromosómico aislado por el equipo 12 de

Escherichia coli w3350
Figura 3. Espectro de absorbancia del DNA de Escherichia coli nativo y desnaturalizado.

Tabla 2. Purezas de DNA obtenidas de Escherichia coli w3350

Equipo Abs260nm Abs280nm Pureza(Abs260nm/Abs280nm)

7 0.836 0.402 2.07

8 0.742 0.386 1.92

9 0.452 0.238 1.89

10 0.839 0.346 2.42

11 0.753 0.315 2.39

12 0.454 0.251 1.8

-Cálculos de pureza del DNA de Escherichia coli W3350 extraído por el equipo 12
𝐴𝑠260𝑛𝑚 0.454
𝑃𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 = = = 1.8
𝐴𝑠280𝑛𝑚 0.251

Tabla 3. Concentraciones obtenidas de DNA de Escherichia coli w3350(µg/mL)

Equipo Fórmula(µg/mL) Relación(µg/mL)* Dilución

7 37.2 41.8 -------------

8 65.95 74.2 1:2

9 20.8 22.6 -------------

10 149.15 167.8 1:4

11 33.46 37.65 -------------

 12 80.71 90.8 1:4
*1 unidad de Abs260nm de DNA de doble cadena = 50 µg/mL de DNA de doble cadena

-Cálculos de concentración de DNA de Escherichia coli W3350 extraído por el equipo

12.
0.454𝑛𝑚
𝐶= = 2.0177𝑥10−5 𝑋4 = 8.071𝑥10−5
22500𝑥1
8.071𝑥10−5 ∗ 1000 = 0.08071
0.08071 𝑚𝑔/𝑚𝐿 ∗ 1000 = 80.71 µ𝑔/𝑚𝐿
1 𝑢𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑 Abs260nm = 50 µg/mL
0.454 ∗ 50 µg/mL
= 22.7 µ𝑔/𝑚𝐿𝑋4 = 90.8µ𝑔/𝑚𝐿
1

Construcción de oligonucleótidos y determinación de sus Temperaturas medias

de desnaturalización (Tm) empleando el programa bioinformático DNAMAN.

A. Influencia del contenido de GC (40 nucleotidos).

Oligo 1: 5´ATGCGGGGCC CCAAAATTTT ACTGCAGTTA GCATGCATGG 3´
23% A; 28% C; 28% G; 23% T
TM en base al % GC(°C )= 70.0
Oligo 2: 5´ACCCTGAGTC TAGCGGAGTC GTGCCTAGAA GCCTTAGCGC 3´
20% A; 30% C; 30% G; 20% T
TM en base al % GC (°C )=71.2
Oligo 3: 5´ ACCCTACCCT GGAGTCTCGG AGTAATGGCT GAAGCTAGTC3´
23% A; 28% C; 28% G; 23% T
TM en base al % GC(°C )=69.0

B. Influencia de la variación en la secuencia de nucleótidos -(40

nucleotidos).
Oligo 1: 5´ATGCGGGGCC CCAAAATTTT ACTGCAGTTA CCATGCATGG 3´
25% A; 25% C; 25% G; 25% T
TM en base al % GC(°C )= 67.3
Oligo 2: 5´CCCTACCCTG GAGTCTACAG GTAATGGCTG ATAAGCTAGT 3´
25% A; 25% C; 25% G; 25% T
TM en base al % GC(°C )=67.3
Oligo 3: 5´ ACCCTACCCT GGAGTCTCGG AGTAATGGCT GAAGCTAGTC3´
25% A; 25% C; 25% G; 25% T
TM en base al % GC(°C )=67.3
C. Influencia de la longitud de la secuencia de nucleótidos.
Oligo 1 (20 nucleotidos): 5´ATGCGGGGCC CCAAAATTTT 3´
25% A; 25% C; 25% G; 25% T
TM en base al % GC(°C )= 55.6
Oligo 2 (30 nucleotidos): 5´CCTCTGGTAA ATGTTAAATC GCTAGCGCAC 3´
27% A; 27% C; 20% G; 27% T
TM en base al % GC(°C )= 62.2
Oligo 3 (60 nucleótidos): 5´ACCCTACCTG AGTTCGGGTA ATGGCTGAAG
CTAGTCAAAT TTCCCGGGGT ACGTTCAACA3´
25% A; 25% C; 25% G; 25% T
TM en base al % GC(°C )= 71.1

DISCUSIÓN
La determinación de la concentración del DNA se calculó por 2 métodos, el primero
fue en una fórmula con su absorción a 260nm y su índice de absorción específica,
qué es la medida de la potencia máxima con la que el campo electromagnético de
radiofrecuencia será absorbido por el DNA, en este cálculo se obtuvo una
concentración de 80.71µg/mL mientras que en el otro cálculo en el cual, está basado
en la turbidimetría, se toma en cuenta las unidades de absorbancia del DNA de doble
cadena con su relación de 50 µg/mL por cada unidad de absorbancia se obtuvo una
concentración de 90.8µg/mL Sin embargo este último método no considera que el
DNA no es la única molécula que absorbe a una longitud de onda de 260nm, por lo
tanto este último método también puede verse interferido por la absorbancia de otras
sustancias como el DNA de cadena sencilla el RNA, que también tiene gran
absorbancia a 260nm, o los aminoácidos aromáticos presentes en las proteínas, que
tienen su mayor absorbancia a 280nm, todos estos factores pueden hacer que el
cálculo de la concentración del DNA por este método se vea sobreestimado por lo
que el cálculo basado en el índice de absorción específica puede ser más exacto en
la cuantificación de DNA. Por lo tanto la concentración más viable es la del método
uno, en donde se utiliza la formula puesto que no hay un componente que interfiera.

Otra determinación realizada fue el cálculo de la pureza basados en la absorción, El

cual se obtiene al dividir la absorbancia en 260 nm que corresponde a la absorbancia
dada por el DNA, entre la absorbancia a 280 nm, que corresponde a la absorbancia
dada por los aminoácidos aromáticos de las proteínas, por lo cual al hacer este cálculo
eliminamos la interferencia de la absorbancia generada por las proteínas. Este valor
debe de estar entre 1.8 y 2, para ser considerado como una muestra adecuada para
trabajar, un valor menor a esto nos indica una alta presencia de contaminantes que
pueden ser sales u otros compuestos orgánicos como proteínas que hayan quedado
después de la extracción; mientras que un valor mayor a 2, indica la contaminación
por RNA y fragmentos de DNA. Experimentalmente se calculó un valor de 1.8 lo cual
nos indica que el DNA extraído califica apenas como una muestra adecuada para su
trabajo, y también nos indica que tiene cierta contaminación por proteínas. Con base
en esto se puede decir que los equipos con una mejor pureza fueron el 8, 9 y 12, ya
que como se observa en la tabla 2, sus valores son igual a 1.8 y no mayores a 2,
mientras que los equipos 7, 10 y 11 que presentan una pureza >2, según los
parámetros establecidos antes mencionados, pudiesen estar contaminados con RNA.
Entre los factores a considerar sobre la alta pureza en los equipos 7,10 y 11,
posiblemente en las etapas de purificación del DNA cromosómico al separar las
fases de las cuales el sobrenadante se colocó en quinientos microlitros de
etanol frío para deshidratar y precipitar el DNA, se haya arrastrado parte de la
interfase llevando proteínas en la muestra afectando la pureza.

Experimentalmente, también se realizó el espectro de absorción del DNA

cromosómico aislado (fig. 2) en el cual se observa que la mayor absorción se tuvo a
260nm, con una absorbancia de 0.753, esto corresponde a la observancia del DNA.
También se observa otro pico en los 220 nm, este corresponde a las absorbancia es
por los carbohidratos, como el de la ribosa, perteneciente a los nucleótidos, o a otro
tipo de sustancias como el fenol residual; Sin embargo este pico dentro del espectro
de absorción es normal.

Haciendo referencia al análisis de los valores de TM en base al % GC y al largo de

las secuencias de nucleótidos, de acuerdo a las especificaciones del inciso A se
puede comprobar que conforme va incrementando la cantidad de GC, la Tm de los
oligonucleótidos incrementa aunque estos tengan la misma longitud, debido a la
mayor cantidad de energía necesaria para romper esa clase de enlaces G-C. En el
inciso B donde se evaluó el efecto que tiene la secuencia de los nucleótidos
conservando la misma longitud y la misma proporción de GC y AT difiriendo en la
secuencia de nucleótidos, se observa que la TM resultante del programa es igual a
cada uno de los casos por la misma proporción en guanina y citosina en cada oligo,
sin embargo cabe mencionar si hubiera trabajo con una secuencia de nucleótidos
consecutivos de G o C en los extremos la Tm hubiera sido mayor dado a la alta
energía necesaria para romper esas secuencias consecutivas de guanina y citosina.
En el inciso C donde se evaluó la longitud de un oligonucleótido con relación a su Tm
conservando la misma proporción de GC y AT, se observó que conforme incrementa
el número de nucleótidos, la Tm también aumenta.

CONCLUSIONES
● Se logró el aislamiento del DNA cromosómico de doble cadena de una cepa
de Escherichia coli W3350, comprobando su aislamiento por
espectrofotometría
● El espectro de absorción del DNA extraído mostró una mayor absorbancia a
260 nm
● Se obtuvo una concentración de 80.71µg/mL y una pureza de 1.80
● Se determinó por medio del programa bioinformático DNAMAN que el factor
más influyente en la temperatura media de fusión es el contenido porcentual
de guanina y citosina dentro del oligonucleótido
REFERENCIAS

● Neidhardt F.C. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology.
Vol 1. pp. 14, ASM Press 1996.
● creeme wey, soy 100tifico
● Surzycki, Stefan. (2003)“Human Molecular Biology” EU. Blackwell Publishing.
pp 3-11
● Donald Voet, Judith G. Voet. “Bioquímica” 3ª Edición. Buenos Aires: Editorial
Medica Panamericana, 2006, pp-97,98.
● http://www.bancoadn.org/docs/programa-control-calidad-muestras.pdf
(consultada 10-Febrero-2019)