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Fluoreszenzmikroskopie

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Mikroskopische Aufnahmen eines Blattes des Mooses Plagiomnium undulatum. Oben Hellfeldmikroskopie,
unten eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme. Die rote Autofluoreszenz der Chloroplasten ist gut zu
erkennen.

Fluoreszenzmikroskopie ist eine spezielle Form der Lichtmikroskopie. Sie beruht auf dem
physikalischen Effekt der Fluoreszenz. Wenn fluoreszierende Stoffe mit Licht
bestimmter Wellenlängenangeregt werden, strahlen sie Licht anderer, längerer Wellenlängen ab
(Stokes-Verschiebung).
Bei der Fluoreszenzmikroskopie wird das erzeugte, vergrößerte Bild des untersuchten Objekts
nur durch abgestrahltes (emittiertes) Licht erzeugt. Farbfilter verhindern, dass Anregungslicht auf
das Bild gelangt. Fluoreszenzmikroskopische Bilder sind dann informativ, wenn nicht das ganze
mikroskopische Präparat gleichmäßig fluoresziert, sondern wenn nur einige Strukturen leuchten.
Diese Strukturen erzeugen helle Signale vor dunklem Hintergrund.
Jedes fluoreszierende Molekül im Präparat kann dabei als neue Lichtquelle angesehen werden.
Liegt die Intensität der von diesen Molekülen abgestrahlten Fluoreszenz über der
Nachweisgrenze, können mit der Fluoreszenzmikroskopie auch Strukturen nachgewiesen
werden, die weit kleiner sind als die Auflösungsgrenze des Mikroskops. Die Auflösungsgrenze
wird bei der klassischen Fluoreszenzmikroskopie aber nicht überwunden, da bei kleinem
Abstand zwar ein Nachweis möglich ist, aber keine Aussage darüber, ob das Signal von einer
oder von mehreren Strukturen hervorgerufen wird. In dieser Hinsicht besteht Ähnlichkeit
zur Dunkelfeldmikroskopie.
Neben der klassischen gibt es zahlreiche weiterentwickelte Spezialformen der
Fluoreszenzmikroskopie. Hierzu gehören beispielsweise die konfokale
Laserscanningmikroskopie und die Multi-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie. Ab den 1990er-
Jahren wurden verschiedene Verfahren entwickelt, die tatsächlich eine deutlich verbesserte
Auflösung ermöglichen. Diese sogenannten Höchstauflösungs- oder Superresolution-Verfahren
sind ebenfalls fluoreszenzmikroskopischer Art.[1]
Inhaltsverzeichnis

• 1Grundlagen
o 1.1Fluoreszenz
o 1.2Autofluoreszenz und Fluorochrome
o 1.3Farbkanäle
• 2Aufbau von Fluoreszenzmikroskopen
o 2.1Das Epifluoreszenzmikroskop: das typische Fluoreszenzmikroskop
o 2.2Lichtquellen
o 2.3Filter
o 2.4Detektoren
• 3Schwierigkeiten bei der Fluoreszenzmikroskopie
o 3.1Ausbleichen der Fluoreszenz
o 3.2Phototoxizität
o 3.3Übersprechen von Signalen in benachbarte Farbkanäle
• 4Präparateerstellung und Anwendungen in den Lebenswissenschaften
• 5Anwendungen in den Materialwissenschaften
• 6Spezielle fluoreszenzmikroskopische Verfahren
o 6.1Lichtscheibenmikroskopie
o 6.2Konfokale und Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie
o 6.3Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie
o 6.4Verfahren mit erhöhter Auflösung
▪ 6.4.1STED-Mikroskopie
▪ 6.4.2Strukturierte Beleuchtung
▪ 6.4.3Lokalisationsmikroskopie
▪ 6.4.4Weitere Verfahren zur Auflösungsverbesserung
o 6.5Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (FLIM)
o 6.6Förster-Resonanzenergietransfer (FRET)
o 6.7Absichtliches Bleichen zur Diffusionsmessung (FRAP und FLIP)
• 7Geschichte
o 7.11904: Köhlers Entdeckung
o 7.21910–1913: Erste Fluoreszenzmikroskope und Anwendungen
o 7.31933–1940: Max Haitinger und die Fluorochromierung
o 7.41942–1958: Entwicklung der Immunfluoreszenz und die Fluoreszenz herkömmlicher
Farbstoffe
o 7.51962–1972: Johan Sebastiaan Ploem und die Einführung der Interferenzfilter
• 8Weblinks
• 9Einzelnachweise

Grundlagen[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]


Fluoreszenz[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]
→ Hauptartikel: Fluoreszenz
Jablonski-Diagramm, das die Energieniveaus veranschaulicht. Die Anregung hebt ein Elektron von einem
der Grundzustände auf einen der angeregten Zustände. Bei der Fluoreszenzemission fällt es vom
niedrigsten angeregten Zustand auf einen der Grundzustände.

Anregungs- (schwarz) und Emissionsspektrum (rot) von Fluorescein. Es wird am effektivsten mit Licht einer
Wellenlänge von ca. 490 nm angeregt und strahlt am hellsten bei 520 nm.

Ein fluoreszierendes Molekül hat ein Elektron, das durch Absorption eines Photons von einem
energiearmen Grundzustand (S0) in einen energiereicheren, angeregten Zustand (S1) übergehen
kann. Sowohl S0 als auch S1 haben mehrere Unterzustände, die sich jeweils im Gehalt der
Schwingungsenergie (auch: Vibrationsenergie) des Elektrons unterscheiden. Der
Energieunterschied zwischen dem Ausgangs-Schwingungszustand innerhalb von S0 und dem
erreichten Schwingungszustand in S1 entspricht genau dem Energiegehalt des absorbierten
Photons.
Fällt das Elektron auf einen Grundzustand zurück, wird ein Photon ausgesendet. Diese
Lichtemission erfolgt wenige Nanosekunden nach der Absorption – das ist die Fluoreszenz.
Damit sie zustande kommt, muss zwischen S0 und S1 ein deutlicher Unterschied im
Energiegehalt liegen und es dürfen keine weiteren Energieniveaus dazwischen liegen, da
angeregte Elektronen sonst über nichtstrahlende Prozesse in den Grundzustand zurückkehren.[2]
Da sowohl der Grundzustand S0 als auch der angeregte Zustand S1 mehrere Unterzustände
haben, können nicht nur Photonen mit genau einem bestimmten Energiegehalt absorbiert oder
emittiert werden, sondern auch Photonen mit ähnlichen Energiegehalten. Da sich der
Energiegehalt eines Photons umgekehrt proportional zu seiner Wellenlänge verhält, bedeutet
das, dass ein fluoreszierender Stoff durch einige ähnliche Wellenlängen angeregt wird: Man
spricht vom Anregungsspektrum. Genauso strahlt er einige ähnliche Wellenlängen ab,
das Emissionsspektrum.[2]
Das Abstrahlen der Fluoreszenz geschieht grundsätzlich vom niedrigsten angeregten
Energieniveau aus (Kasha-Regel). Wird das Elektron durch die Absorption des
Anregungsphotons auf einen höheren angeregten Zustand gehoben, so gelangt es zunächst
durch nichtstrahlende Energieabgabe auf das niedrigste angeregte Energieniveau, bevor es zur
Emission eines Photons kommt. Dies hat für die Fluoreszenzmikroskopie mehrere wichtige
Konsequenzen:[2]
• Die emittierten Photonen sind im Mittel deutlich energieärmer und daher zum roten Ende
des Lichtspektrums verschoben. Dieser Effekt wird als Stokes-Verschiebung bezeichnet. Der
Energieunterschied verbleibt als Schwingungsenergie, also Wärme im Präparat.
• Die spektrale Verteilung des abgegebenen Fluoreszenzlichts ist unabhängig von der Wellenlänge des
Anregungslichts.
• Die Zeitdauer von der Absorption über das Erreichen des niedrigsten angeregten Zustands bis zur
Abgabe des Photons hat für einen fluoreszierenden Stoff eine charakteristische Verteilung. Sie wird
als Fluoreszenzlebensdauer bezeichnet und ist die Grundlage der Fluoreszenzlebensdauer-
Mikroskopie.

Stoffe, die fluoreszieren, werden als Fluorophore bezeichnet. Fluorophore, die verwendet werden
um Präparate anzufärben, werden als Fluoreszenzfarbstoffe oder Fluorochrome bezeichnet.
Autofluoreszenz und Fluorochrome[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Pollenkorn von Hibiskus. Autofluoreszenz angeregt mit 405 nm und aufgezeichnet in drei Farbkanälen.
Projektion von konfokalen Bildern. Der weiße Balken ist 170 µm lang.

Querschnitt durch die Sprossachseeines Sämlings der Gemeinen Fichtemit starker Autofluoreszenz

Wenn ein Präparat von selbst fluoresziert, wird dies als Autofluoreszenz, Eigenfluoreszenz oder
Primärfluoreszenz bezeichnet. Viele Pflanzen haben in verschiedenen Teilen sehr starke
Autofluoreszenz, zum Beispiel Samenpflanzen in den hölzernenTeilen ihrer Sprossachsen.
Das Chlorophyll in den Chloroplasten der grünen Pflanzenzellen ist stark rot fluoreszierend.
Tierische Zellen fluoreszieren im Vergleich dazu nur schwach, jedoch noch stark genug, um
Fluoreszenzmarkierungen unter Umständen zu verschleiern. Die Hauptquellen hier sind Flavine,
die in den Mitochondrien vorkommen und Lipofuscin in
den Lysosomen.[3]Das Coenzym NADPH zeigt ebenfalls Autofluoreszenz.[4]
Eine in einem Präparat mit Fluorochromen künstlich erzeugte Fluoreszenz ist eine
Sekundärfluoreszenz. Der Prozess, der dazu führt, heißt Fluoreszenzmarkierung. Gute
Fluorochrome vereinigen mehrere Eigenschaften: (1) Sie haben eine hohe Wahrscheinlichkeit
ein Photon zu absorbieren, das heißt sie haben einen hohen Absorptionskoeffizienten. (2) Die
meisten der absorbierten Photonen führen tatsächlich zur Emission eines Flureszenzphotons
(hohe Quanteneffizienz). Beides zusammen führt zu einer großen Helligkeit. (3) Fluorochrome
sollten ein geringes Bleichen aufweisen, das heißt, dass sie sich oft anregen lassen, ohne
zerstört zu werden. (4) Außerdem sollten Fluorochrome in einem möglichst schmalen Bereich
des Lichtspektrumsfluoreszieren, damit möglichst viele Fluorochrome mit unterschiedlichen
Fluoreszenzfarben gleichzeitig verwendet werden können, um unterschiedliche Strukturen
anzufärben.[2]
Farbkanäle[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Markierung von menschlichen Chromosomen in einem Zellkern mit sieben verschiedenen Fluorochromen

Wenn sich die Anregungs- und Emissionsspektren zweier Fluorochrome stark überlappen, dann
können diese nicht voneinander unterschieden werden. Beispielsweise haben Fluorescein, Grün
fluoreszierendes Protein, Spectrum Green und eine Reihe weiterer kommerziell erhältlicher
Farbstoffe sehr ähnliche Spektren, so dass sie anhand ihrer Fluoreszenzfarbe nicht
unterschieden werden können. Wenn verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe nebeneinander
eingesetzt werden sollen, um verschiedene Strukturen anzufärben, müssen diese Farbstoffe
unterschiedliche Spektren haben. Typischerweise regt UV-Licht blau fluoreszierende
Fluorochrome an, blaues Licht grüne Fluorochrome und grünes Licht rote Fluorochrome. Diese
drei Farbkanäle lassen sich also gleichzeitig verwenden, um unterschiedliche Strukturen
darzustellen.
Damit ist die Zahl der gleichzeitig nachweisbaren Farben jedoch nicht erschöpft. Acht
verschiedene Fluorochrome wurden bereits parallel eingesetzt. Dazu verwendete man DAPI als
blau fluoreszierende Gegenfärbung für DNA sowie sieben weitere Farbstoffe, die
an Gensonden für Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung gekoppelt wurden: Diethylaminocoumarin
(Deac), Spectrum Green und die Cyanin-Farbstoffe Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 und Cy7.[5][6] Die
meisten Fluoreszenzmikroskope haben drei bis fünf Farbkanäle.

Aufbau von Fluoreszenzmikroskopen[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]


Bei der „normalen“ Lichtmikroskopie, der Durchlicht-Hellfeldmikroskopie, wird das Bild durch
Licht erzeugt, welches das Präparat durchstrahlt. Dies ist bei der Fluoreszenzmikroskopie nicht
der Fall. Hier wird das Bild durch Fluoreszenzlicht erzeugt, das erst im Präparat entsteht. Das
Anregungslicht, welches das Präparat bestrahlt, wird dagegen durch spezielle Filter von der
Bilderzeugung ausgeschlossen. Da sich Fluoreszenzlicht unter normalen Bedingungen
gleichmäßig in alle Raumrichtungen ausbreitet, ist es daher grundsätzlich egal, ob das
Anregungslicht von oben, von unten oder von der Seite kommt. Tatsächlich wurden alle drei
Varianten umgesetzt.
Zu Beginn der Fluoreszenzmikroskopie, in der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts,
wurden Durchlicht-Fluoreszenzmikroskope gebaut. Sie sind heute nur noch von historischem
Interesse (siehe Abschnitt Geschichte unten). Durch die Verfügbarkeit Dichroitischer
Spiegel (auch: dichroitischer Strahlteiler) wurde es ab etwa 1970 möglich, Auflicht-
Fluoreszenzmikroskope zu bauen, bei denen das Anregungslicht über das Objektiv in das
Präparat eingestrahlt wird. Sie werden auch Epifluoreszenzmikroskope genannt, nach
griechisch ἐπί für „auf“. Seit Ende des 20. Jahrhunderts wird dieser Bautyp fast ausschließlich
verwendet. Die seitliche Beleuchtung findet bei einem spezialisierten Fluoreszenzmikroskop
Anwendung, dem Lichtscheibenmikroskop (siehe unten).
Das Epifluoreszenzmikroskop: das typische
Fluoreszenzmikroskop[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]
Im Vergleich zu Durchlicht-Hellfeldmikroskopen haben Epifluoreszenzmikroskope eine
zusätzliche Auflicht-Beleuchtungsachse für das Fluoreszenz-Anregungslicht. Das zu
beobachtende Objekt wird durch das Objektiv beleuchtet. Die folgende Nummerierung bezieht
sich auf die Schemazeichnung.

1. Durch einen passend ausgewählten optischen Filter, den Anregungsfilter, wird von der
verwendeten Lampe nur der Teil des erzeugten Lichts durchgelassen, der die für die
Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs notwendigen Wellenlängen enthält. Der Bereich
des Spektrums, in welchem der Fluoreszenzfarbstoff leuchtet, darf vom
Anregungsfilter nicht durchgelassen werden.
2. Ein Strahlteiler spiegelt das Anregungslicht zum Objektiv, worauf im Präparat die
Fluoreszenz entsteht. Das Objektiv übernimmt also auch die Funktion des Kondensors.
Die Fluoreszenz ist langwelliger als das Anregungslicht.
3. Der Anteil des Fluoreszenzlichts, der vom Objektiv gesammelt wird, gelangt wiederum
zum Strahlteiler. Durch dessen besondere Eigenschaften wird dieses längerwellige Licht
in Richtung Okular oder Detektor durchgelassen (und nicht gespiegelt). Anregungslicht,
das im Präparat reflektiert wird, wird dagegen weitgehend wieder zur Lampe gelenkt.
4. Da Strahlteiler nicht ganz perfekt arbeiten, gelangt ein geringer Teil des im Präparat
reflektierten Anregungslichts trotzdem in Richtung Okular beziehungsweise Detektor. Da
die Intensität der Fluoreszenz im Vergleich zur Anregung sehr schwach ist, ist deshalb
ein weiterer optischer Filter, genannt Sperrfilter oder Emissionsfilter, erforderlich, um
dieses restliche Anregungslicht zu eliminieren.[1][2]
Die drei genannten Filter sind in heutigen Fluoreszenzmikroskopen oft in einen gemeinsamen
Block eingebaut. Dieser befindet sich bei aufrechten Mikroskopen in der optischen Achse über
dem Objektiv. Bei inversen Fluoreszenzmikroskopen befindet er sich entsprechend unter dem
Objektiv. Bei Geräten mit Unendlich-Optik liegt er im Unendlichraum zwischen Objektiv und
Tubuslinse.

Schema eines Epifluoreszenzmikroskops

Ein aufrechtes Epifluoreszenzmikroskop. Das schwarze Gehäuse rechts enthält die Lichtquelle für
die Fluoreszenz-Anregung. Im schwarzen Gehäuse oben auf dem Mikroskop befindet sich eine
CCD-Kamera.

Aufrechtes Epifluoreszenzmikroskop mit offener Abdeckung und Blick auf den Revolver mit
Fluoreszenzfilter-Würfeln

Inverses Epifluoreszenzmikroskop. Das Objektiv befindet sich unter der Präparatposition und ist hier
nicht sichtbar.

Lichtquellen[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]


Die Erzeugung der Fluoreszenz im Präparat ist kein effektiver Prozess: Nur ein Bruchteil des
Anregungslichts wird von den Fluoreszenzfarbstoffen absorbiert. Um trotzdem helle, mit dem
Auge sichtbare Signale erzeugen zu können, sind daher sehr hohe Leuchtstärken erforderlich.[2]
Typischerweise sind Fluoreszenzmikroskope
mit Quecksilberdampflampen, Halogenmetalldampflampen, Xenon-Gasentladungslampen oder,
seit dem 21. Jahrhundert, mit LED-Lampen ausgestattet. Die meisten Lichtquellen leuchten über
das gesamte sichtbare Spektrum sowie im ultravioletten Bereich. Die für das jeweils zu
untersuchende Fluorochrom erforderlichen Wellenlängen werden durch einen entsprechenden
Filter ausgewählt und alle anderen unterdrückt.[2]
Filter[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Filterwürfel für grüne Fluoreszenzfarbstoffe. Links unten Blick durch den Anregungsfilter, rechts unten
durch den Emissionsfilter.

Schieber mit Filtern für drei Farbkanäle

Während früher Farbfilter aus gefärbtem Glas zum Einsatz kamen, werden heute
oft Interferenzfilter verwendet. Interferenzfilter sind jedoch deutlich teurer, so dass gefärbtes Glas
immer noch zur Anwendung kommt. Für Anregungs- und Emissionsfilter können beide Typen
verwendet werden. Der dichroitische Strahlteiler kann nur als Interferenzfilter hergestellt
werden.[2]
Interferenzfilter bestehen aus einer Glasscheibe, auf die mehrere dünne Materialschichten
aufgetragen werden. Zwischen den Schichten entstehen Interferenzen, so dass bestimmte
Wellenlängen durchgelassen werden, andere aber gespiegelt werden. Im Gegensatz zu
farbigem Glas wird das Licht also nicht absorbiert. Durch die Wahl geeigneter Materialien und
Schichtdicken können Filter für unterschiedliche Wellenlängen hergestellt werden. Licht, das in
unterschiedlichen Winkeln auf Interferenzfilter auftrifft, legt unterschiedlich lange Strecken in den
jeweiligen Schichten zurück. Daher ändern sich die Filtereigenschaften in Abhängigkeit vom
Einfallswinkel des Lichts. Ein Interferenzfilter muss deswegen im vorgesehenen Winkel im
Mikroskop eingebaut werden, um richtig zu funktionieren.[7]
Von der Funktionsweise her werden Kurzpass-, Langpass- und Bandpass-Filter unterschieden.
Kurzpassfilter lassen Licht bis zu einer bestimmten Wellenlänge durch. Ein KP480 würde also
Licht bis zu 480 nm durchlassen und Licht längerer Wellenlängen blockieren. Im Gegensatz dazu
lassen Langpass-Filter Licht ab einer bestimmten Wellenlänge durch, ein LP520 also Licht mit
Wellenlängen länger als 520 nm. Bandpass-Filter lassen nur einen bestimmten Abschnitt des
Spektrums durch. Ein Bandpassfilter mit der Bezeichnung 525/50 lässt ein spektrales Fenster
von 50 nm passieren, dessen Mitte bei 525 nm liegt, also ein Fenster von 500–550 nm. Die
Eigenschaften eines Filters werden meist nur auf den sichtbaren Bereich und direkt angrenzende
spektrale Bereiche bezogen. Es kann daher sein, dass zum Beispiel ein Bandpassfilter für den
sichtbaren Bereich im Infrarot wieder durchlässig wird. Dies kann bei Zwei-Photonen-
Fluoreszenzanregung (siehe unten) zu Problemen führen.[7]
Mit Interferenzfiltern lassen sich auch komplexere spektrale Eigenschaften realisieren.
Beispielsweise kann ein Filter mehrere spektrale Fenster durchlassen, die Bereiche dazwischen
aber blockieren (Multi-Bandpass). Auch dichroitische Strahlteiler, die mehrere spektrale Bereiche
spiegeln und dazwischen liegende Bereiche durchlassen, sind machbar (Multi-Dichroic).
Dadurch wird es möglich, mehrere Fluoreszenzkanäle gleichzeitig zu sehen. Manche
Lichtquellen können sehr schnell zwischen verschiedenen Anregungswellenlängen hin und
herschalten, zum Beispiel einige LED-Geräte. Unter Verwendung eines Multi-Dichroics und eines
Multi-Bandpassfilters als Emissionsfilter können verschiedene Fluoreszenzkanäle sehr schnell
abwechselnd verwendet werden, da keine Filter bewegt werden müssen.[2]
In Epifluoreszenzmikroskopen sind Anregungsfilter, Strahlteiler und Emissionsfilter meist zu
Filterblöcken zusammengefasst. Von einem Kanal zum anderen werden dabei alle drei Filter
gemeinsam ausgetauscht, indem man entweder einen Schieber verschiebt, in dem
Kombinationen für drei bis vier Farben enthalten sind, oder indem ein Rad gedreht wird, auf dem
mehrere Filterwürfel für jeweils einen Kanal montiert sind.
In manchen Laserscanningmikroskopen, die mit Fluoreszenz funktionieren, wird die Funktion von
Anregungsfiltern oder Strahlteilern durch Akustooptische Modulatoren(AOM, auch: acousto-
optical tunable filter (AOTF) oder acousto-optical beam splitter (AOBS)) ersetzt. Der
Emissionsfilter kann ersetzt werden, indem das Fluoreszenzlicht, das in diesen Geräten nur von
einem Punkt kommt, vor der Detektion spektral aufgetrennt wird und dann nur gewünschte Teile
des Spektrums detektiert werden. Eine solche Auftrennung wird mit einem Prisma oder
einem Beugungsgitter erreicht.[8]
Detektoren[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]
Präparate mit heller Fluoreszenz im für das menschliche Auge gut sichtbaren Bereich bis etwa
620 nm Wellenlänge können direkt durch das Okular betrachtet werden. Zur Dokumentation
werden Kameras eingesetzt. Während früher fotografischer Film verwendet wurde, fand Ende
des 20. Jahrhunderts eine Umstellung auf elektronische Kameras statt. Häufig werden CCD-
Kameras verwendet, die Schwarzweißbilder aufnehmen. Durch den Verzicht auf Farbfilter in der
Kamera können alle Pixel jede Farbe aufnehmen, das Bild wird heller, als es bei Farbkameras
der Fall wäre. Welche Farbe von der Kamera tatsächlich aufgenommen wird, wird durch den
vorgeschalteten Emissionsfilter festgelegt. Verschiedenfarbige Fluoreszenzfarbstoffe in einem
Präparat werden nacheinander aufgenommen und können im Computer übereinander gelegt
werden. Dabei kann den jeweiligen Farbstoffen eine beliebige Farbe zugeordnet werden,
wahlweise ihre natürliche Farbe oder eine andere, letzteres etwa um Farben besser zu
kontrastieren.[9][10]

Schwierigkeiten bei der


Fluoreszenzmikroskopie[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]
Ausbleichen der Fluoreszenz[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]
Energiediagramm (Jablonski-Diagramm) mit S0, S1, S2und T1

Absorptions- (blau) und Emissionsspektrum (rot) eines hypothetischen Fluorochroms. Die beiden Maxima
im Absorptionsspektrum entsprechen dem Übergang vom S0 nach S1beziehungsweise von S0 nach S2.

Fluoreszierende Moleküle lassen sich nicht beliebig oft anregen, da sie durch das Anregungslicht
zerstört werden können. Der als Photobleichungbezeichnete Prozess geschieht je nach
Photostabilität der fluoreszierenden Präparate schneller oder langsamer. Für ein einzelnes
fluoreszierendes Molekül ist Ausbleichen dann mehr oder weniger wahrscheinlich.
Ein Molekül im angeregten Zustand kann nicht nur durch Fluoreszenz wieder in den
Grundzustand (S0) übergehen. Eine zweite Möglichkeit ist die Innere Umwandlung, bei der die
Energie beim Übergang in den Grundzustand in Wärme umgewandelt wird. Eine dritte ist das
Ausbleichen, bei der es zur Zerstörung des Farbstoffs durch photochemische Reaktionen
kommt. Diese Reaktionen hängen mit den Spin-Zuständen der Elektronen zusammen.
Die Elektronen eines Fluorochroms befinden sich normalerweise in einem Singulett-Zustand, in
dem alle Elektronen des Moleküls Spin-gepaart sind. Daher wird der Grundzustand auch als S0,
der „normale“ angeregte Zustand als S1 bezeichnet (siehe Abbildung mit Energiediagramm).
Wie obenbeschrieben haben S0 und S1 mehrere Unterzustände, die sich im Energieniveau
jeweils wenig unterscheiden. Zusätzlich gibt es aber weitere, noch energiereichere angeregte
Zustände, die im Energieniveau deutlich höher liegen als S1. Sie werden als S2, S3 und so weiter
bezeichnet. Auch diese haben mehrere Unterzustände. Durch ein energiereiches Photon kann
ein Molekül aus dem Grundzustand auch in einen dieser Zustände befördert werden. Das
Absorptionsspektrum zeigt dann bei Wellenlängen mit dem entsprechenden Energiegehalt ein
lokales Maximum (siehe Abbildung der Spektren). Das Fluoreszenzspektrum bleibt aber gleich,
da das Fluoreszenz-Photon immer vom niedrigsten angeregten Zustand ausgesandt wird (siehe
auch oben).[2]
Neben den Singulett-Zuständen kommen auch Triplett-Zustände vor. Der energieärmste Triplett-
Zustand wird als T1 bezeichnet (siehe Energiediagramm), energiereichere als T2, T3 und so
weiter. Der Übergang von einem Singulett- in einen Triplett-Zustand wird als Intersystem
Crossing bezeichnet. Bei diesem Übergang muss sich der Spin eines Elektrons umdrehen, so
dass dann ein ungepaartes Set von Elektronenspins vorliegt. Die Wahrscheinlichkeit hierfür ist
normalerweise gering, steigt aber deutlich, wenn sich das Molekül in einem der höheren
angeregten Zustände befindet, also S2 oder höher. Um die Wahrscheinlichkeit für einen
Übergang zu den Triplett-Zuständen zu minimieren, sollte die Anregung nach S2 oder höher
nach Möglichkeit vermieden werden, denn aus Triplett-Zuständen kann keine Fluoreszenz
entstehen, und diese Zustände sind langlebig.[2]
Aus dem Triplett-Zustand kann das Elektron seine Energie entweder als Wärme abgeben, um
wieder in den Grundzustand zu gelangen, oder es gibt ein Photon ab. Dieses Photon entsteht
deutlich später nach der Anregung als Fluoreszenz, es handelt sich um Phosphoreszenz.
Aus dem Triplett-Zustand heraus kann das Fluorochrom aber auch zerstört werden,
also Ausbleichen. Im Gegensatz zu den angeregten Singulett-Zuständen ist die Verweildauer im
Triplett-Zustand deutlich länger, daher ergibt sich hier eher die Möglichkeit mit anderen
Molekülen der Umgebung chemisch zu reagieren. Hat der Fluoreszenzfarbstoff chemisch
reagiert, ist das Reaktionsprodukt in der Regel nicht fluoreszierend und der Farbstoff ist
ausgebleicht. Von besonderer Bedeutung ist die Reaktion mit molekularem Sauerstoff, O2, da
dieser einen Triplett-Grundzustand hat und Triplett-Triplett-Reaktionen sehr effektiv ablaufen.[2]
Bleichen kann daher verringert werden, wenn Sauerstoff aus dem Präparat entfernt wird. Dies
kann durch sogenannte Antifade-Substanzen (englisch für Antibleichmittel) erreicht werden,
die reduzierende Wirkung haben. Zum Einsatz kommen Antioxidantien, zum Beispiel para-
Phenylamin-Diamin, DABCO oder Gallate.[2]Ganz lässt sich das Bleichen jedoch nicht
verhindern. Daher ist es wichtig, für die Fluoreszenzmarkierung Fluorochrome auszuwählen, die
möglichst photostabil sind.[11]
Phototoxizität [Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]
Die im vorigen Abschnitt beschriebenen Reaktionen treten auch bei der Fluoreszenzmikroskopie
von lebenden Zellen oder Organen auf. Hier kommt es nicht nur zum Ausbleichen, sondern die
bei der Reaktion mit Sauerstoff entstehenden reaktiven Sauerstoffspezies können in einer
Nachfolgereaktion zelluläre Komponenten schädigen und so zum Tod der Zelle führen. Auch hier
kann die Zugabe von reduzierendenStoffen helfen, etwa Ascorbinsäure oder Trolox.[12][13]
Kurzwelliges Licht, besonders UV-Licht, kann Zellen aber auch direkt schädigen, ohne dass
Fluoreszenz hervor gerufen wird. Dies stellt ein Problem bei Lichtquellen mit breitem Spektrum
und hohem UV-Anteil dar, wie bei Quecksilberdampflampen. Der hohe UV-Anteil der Lichtquelle
kann durch Filter nicht vollständig blockiert werden. Die Verwendung von UV-freien Lichtquellen
wie LED, Lasern oder Halogenlampen ist daher für Lebendbeobachtungen von Vorteil.
Beide Probleme verringern sich, wenn die Belichtung für die jeweilige Fragestellung so gering
wie möglich gehalten wird. Hierzu können auch besonders empfindliche Kameras oder andere
Detektoren beitragen. Die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies kann verringert werden, wenn das
Aufsuchen des Bildbereichs (Zellen) und das Fokussieren nicht mit Fluoreszenz, sondern mit
Hellfeld, Phasenkontrast, Differentialinterferenzkontrast oder vergleichbaren Verfahren erfolgt
und die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung dadurch auf ein Minimum beschränkt
wird.[12][13]
Neben den genannten phototoxischen Effekten kann es bei zu hohen Konzentrationen der für die
Fluoreszenzmarkierung verwendeten Substanzen zur direkten Vergiftung der Zellen kommen.[13]
Übersprechen von Signalen in benachbarte Farbkanäle [Bearbeiten | Quelltext
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Als bleedthrough (englisch für durchbluten) oder crosstalk, also Übersprechen, wird es
bezeichnet, wenn bei einer Mehrfachmarkierung ein Signal auch im benachbarten Farbkanal zu
sehen ist. Das langwellige Ende des Emissionsspektrums der meisten Fluorochrome fällt nur
sehr langsam gegen Null ab. Daher kommt es bei gleichzeitiger Anregung und Detektion von im
Spektrum benachbarten Fluorochromen häufig zum Übersprechen, beispielsweise eines grünen
Fluorochroms in den benachbarten orangefarbenen Kanal. Dies kann verhindert oder zumindest
vermindert werden, wenn enge Bandpass-Filter verwendet werden und/oder die Farbstoffe nicht
gleichzeitig, sondern nacheinander angeregt werden.[14]

Präparateerstellung und Anwendungen in den


Lebenswissenschaften[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]
Siehe auch: Fluoreszenzmarkierung
In den Biowissenschaften wird Fluoreszenzmikroskopie vielfältig eingesetzt. Manche zu
untersuchende Objekte sind von selbst fluoreszierend. Dies wird als Autofluoreszenz bezeichnet.
Beispielsweise haben Pflanzen Chlorophylle und andere Pigmente, die natürlicherweise
fluoreszieren. Autofluoreszenz ist aber häufig unerwünscht, da sie als Hintergrundfluoreszenz
das Erkennen von künstlichen Fluoreszenzen erschwert.
Für biomedizinische Anwendungen ist eine Vielzahl von Methoden für die
Fluoreszenzmarkierung entwickelt worden. Manche Fluoreszenzfarbstoffe binden auf Grund ihrer
chemischen Eigenschaften direkt an die zu untersuchende Struktur. In diese Gruppe fallen
beispielsweise DNA-Farbstoffe wie DAPI, Acridinorange und Hoechst 33342 oder
Membranfarbstoffe wie Nilrot oder DiI. Einige solcher Farbstoffe können auch lebende Zellen
anfärben.[15]
In anderen Fällen wird ein nicht-fluoreszierendes Molekül, das an die zu untersuchende Struktur
bindet, chemisch mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt. Beispiele für diesen Ansatz sind
die Immunfluoreszenz, bei der Fluoreszenz-markierte Antikörper verwendet werden,
die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, eine Technik zum mikroskopischen Nachweis von
größeren DNA-Abschnitten, oder die Färbung von Aktin mit fluoreszenzmarkiertem Phalloidin.[15]
Proteine können gentechnisch mit einem fluoreszierenden Protein wie GFP fusioniert werden.
Aus dem fluoreszenzmikroskopischen Bild können anschließend Rückschlüsse auf die
Verteilung und Anordnung des untersuchten Proteins in der lebenden und meist fixierten Zelle
gezogen werden, (etwa im Zellkern, im Cytoplasma, Zellmembran-gebunden oder nach außen
exportiert) beziehungsweise Zellbestandteile durch ihre spezifischen Proteine visualisiert werden
(wie Aktinfilamente durch Aktin oder Mikrotubuli durch Tubulin). Auch Interaktionen von
Proteinen untereinander sind beobachtbar, wenn diese mit verschiedenen fluoreszierenden
Proteinen fusioniert werden. Fluoreszierende Proteine können auch unter Kontrolle eines Zelltyp-
spezifischen Promotors exprimiert werden, um bestimmte Zelltypen zu identifizieren.[16]
Eine weitere Gruppe bilden Sonden, deren Fluoreszenzverhalten sich in Abhängigkeit vom
Zustand Ihrer Umgebung ändert. Calcium-abhängige Farbstoffe wie Aequorin, Fura-
2, Furaptra, Calcein und Indo-1können Schwankungen der Konzentration an Calciumionen in
einer Zelle anzeigen. Mit spannungsabhängigen Farbstoffen oder
den Reporterproteinen VSFP oder PROPS können Spannungsänderungen in einer Zelle
dargestellt werden. Mit Redox-sensitiven Reporterproteinen
wie roGFP, rxYFP oder HyPer können Redox-Potentiale verfolgt werden. Fluoreszierende pH-
Indikatoren können unterschiedliche pH-Werte in einer Zelle sichtbar machen.[17]

• Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen

Endothelzellen unter dem Fluoreszenzmikroskop. Die Mikrotubuli sind grün (mit FITC-markiertem
Antikörper), Aktinfilamentesind rot (mit Phalloidin-TRITC) markiert worden. Die DNA in
den Zellkernen wurde mit DAPI angefärbt (blau).

Lebende HeLa-Zellen im Konfokalmikroskop. Mitochondrien in Rot, der Zellkern in Blau, Mikrotubuli


in Grün.

Zelle am Ende der Mitose in der Telophase. Chromosomen blau (DAPI), Mikrotubuli rot, das
Protein INCENP ist durch eine Fusion mit GFP grün gefärbt.

Immunfluoreszenz-Aufnahme im Spinalganglion der Ratte. Zwei verschiedene Proteine wurden mit


rot oder grün fluoreszierenden Markern gefärbt.

Metaphasechromosomen aus einem weiblichen menschlichen Lymphozyten, gefärbt mit


Chromomycin A3.

Zellkern eines Mausfibroblasten, durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung wurden die Territorien der


Chromosomen 2 (rot) und 9 (grün) angefärbt. DNA-Gegenfärbung in blau.

HeLa-Zellen, die Mitochondrien sind mit GFP markiert, welches mit einem
entsprechenden Signalpeptid fusioniert ist.

Hefezellen, bei denen zwei verschiedene Membranproteine mit GFP oder RFP (Rotes
fluoreszierendes Protein) fusioniert sind. Einzelne Zellen haben unterschiedliche Mengen der beiden
Proteine und dadurch unterschiedliche Schattierungen.

Anwendungen in den Materialwissenschaften[Bearbeiten | Quelltext


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Im Gegensatz zu den Lebenswissenschaften werden in den Materialwissenschaften selten
Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt. Die Anwendung von Fluoreszenzmikroskopie beschränkt sich
meist auf Fälle, in denen das Material autofluoreszent ist. So sind manche Bestandteile
von Verbundwerkstoffen fluoreszierend und können von anderen nicht fluoreszierenden
Bestandteilen unterschieden werden. Zur besseren Darstellung der Gegebenheiten kann in
einem Konfokalmikroskop Fluoreszenz mit Reflexion kombiniert werden. Dadurch lassen sich
etwa in glasfaser-verstärkten Verbundwerkstoffen fluoreszierende Bindemittel (Grundpolymer)
von nicht fluoreszierenden Fasern unterscheiden.[18]
Organische Fasern in Papier, Holz oder Bast wurden in etlichen Studien untersucht, um deren
Anordnung oder Zusammensetzung zu bestimmen.[19]
Auch verschiedene Typen von Solarzellen können fluoreszenzmikroskopisch untersucht werden.
Häufig kommt dabei konfokale Fluoreszenzmikroskopie zum Einsatz, auch in Kombination mit
konfokaler Reflexions-Mikroskopie. In organischen Solarzellen kann der Verlust von
fluoreszierenden organischen Komponenten untersucht werden, der durch Oxidation mit in die
Zelle eingedrungenem Sauerstoff verursacht wird; vorausgesetzt die Abbauprodukte sind nicht
fluoreszierend. In Perowskit-Solarzellen wurde analysiert, welchen Einfluss Licht auf die Bildung
der gleichnamigen Perowskit-Schicht hat.[20][21][22]

Mikroskopische Bilder einer Kohleoberfläche mit Mazeralen. Links mit Reflexion von weißem Licht
aufgenommen, rechts Fluoreszenzmikroskopie.

Obwohl etliche Mineralien fluoreszieren, wird Fluoreszenzmikroskopie in der Petrologie wenig


genutzt. Eine bemerkenswerte Ausnahme sind Untersuchungen von Kohle und von organischen
Einschlüssen in Sedimenten. Reine Mineralien sind meist nicht fluoreszierend, eine Fluoreszenz
kann aber durch verschiedene anorganische oder organische Verunreinigungen hervorgerufen
werden. Solche gesteinsbildenden Komponenten von Kohle, die einen organischen Ursprung
haben, werden als Mazerale bezeichnet. Eine Untergruppe sind die lipidreichen Liptinite. Diese
fluoreszierenden Bestandteile können besonders gut an polierten Oberflächen mikroskopisch
von nicht-fluoreszierenden anorganischen Bestandteilen unterschieden werden. Während der
Kohleentstehung ändern sich die fluoreszenten Eigenschaften, so dass sich Materialien aus
verschiedenen Lagerstätten unterscheiden lassen.[23]

Spezielle fluoreszenzmikroskopische
Verfahren[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]
Lichtscheibenmikroskopie[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Prinzip eines Lichtscheibenmikroskops. Das Anregungslicht (blau) wird durch eine Zylinderlinse (links) zu
einer Scheibe geformt, so dass nur in einer Ebene Fluoreszenz erzeugt wird.

→ Hauptartikel: Lichtscheibenmikroskopie
Bei der Lichtscheibenmikroskopie (englisch light sheet microscopy; auch Lichtblattmikroskopie
oder single plane illumination microscopy, SPIM) wird das Anregungslicht von der Seite
als Lichtscheibe beziehungsweise Lichtblatt eingestrahlt. Dies kann durch ein zweites Objektiv
oder eine entsprechende Zylinderlinse geschehen, das oder die senkrecht zum
Beobachtungsobjektiv steht und eine eng begrenzte Ebene des Präparats ausleuchtet. Nur in
dieser ausgeleuchteten Scheibe wird Fluoreszenz erzeugt und diese Ebene wird im
Beobachtungsobjektiv scharf gestellt. In anderen Ebenen wird also keine unscharfe
Hintergrundfluoreszenz erzeugt, die bei normaler Fluoreszenzmikroskopie zu einer
Verminderung des Kontrasts führt. Das Verfahren erlaubt es, die axiale Auflösung eines
normalen Fluoreszenzmikroskops zu verbessern, wenn das Lichtblatt dünner als
die Schärfentiefe des Beobachtungsobjektivs ist. Die seitliche Beleuchtung des
Untersuchungsobjekts ähnelt der Anordnung im Spaltultramikroskop.[24]
Konfokale und Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie[Bearbeiten | Quelltext
bearbeiten]

Ein konfokales Bild (links) zeigt deutlich weniger Hintergrund-Fluoreszenz aus Ebenen über und unter der
Schärfeebene als ein nicht-konfokales Bild des gleichen Objekts.

→ Hauptartikel: Konfokalmikroskop und Multiphotonenmikroskop


Bei konfokalen wie auch bei Zwei-Photonen-Mikroskopen wird das Präparat abgerastert: Das
Anregungslicht wird auf einen Punkt fokussiert, die Fluoreszenz von diesem Punkt gelangt zum
Detektor. Der Punkt wird über das Präparat bewegt und die jeweils gemessenen
Fluoreszenzintensitäten werden in einem Steuerungscomputer zu einem Bild zusammengesetzt.
Bei der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie entsteht im Beleuchtungskegel über und unter der
Schärfeebene ebenfalls Fluoreszenz. Diese gelangt jedoch nicht zum Detektor, da sie von einer
Lochblende (engl. pinhole) in der Zwischenbild-Ebene blockiert wird. Durch das Blockieren
dieser Hintergrundfluoreszenz tritt das Signal in der Schärfeebene gegenüber dem Hintergrund
besser hervor als in der klassischen Fluoreszenzmikroskopie. Auf Grund dieser deutlich
kontrastreicheren Bilder sind konfokale Mikroskope in der biologischen Forschung weit
verbreitet.[25]
Ein Fluoreszenzfarbstoff kann statt durch Absorption eines Photons auch durch eine Zwei-
Photonen-Absorption angeregt werden. Voraussetzung dafür ist, dass diese beiden Photonen
quasi gleichzeitig am Fluoreszenzfarbstoff eintreffen, und dass beide zusammen den richtigen
Energiegehalt haben, um ein Elektron des Farbstoffes auf ein angeregtes Energieniveau zu
heben. Beide Bedingungen können erfüllt werden, wenn zur Anregung ein gepulster
Laser verwendet wird, der, je nach anzuregendem Fluoreszenzfarbstoff, Wellenlängen zwischen
700 und 1200 nm mit hoher Intensität erzeugt, und dieses Licht durch das Objektiv auf einen
Punkt fokussiert wird. Die Photonendichte ist dann so hoch, dass eine ausreichende
Wahrscheinlichkeit, dass zwei Photonen gleichzeitig am fluoreszierenden Molekül eintreffen,
gegeben ist. Im Gegensatz zur Konfokalmikroskopie, wo das Auslesevolumen beschränkt wird,
ist hier das Anregungsvolumen limitiert. Längerwelliges Licht hat eine höhere Eindringtiefe in
biologische Gewebe, da es von diesen weniger stark absorbiert und auch weniger
stark gestreut wird. Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie wird daher eingesetzt, um tiefer in
Gewebe einzudringen, als dies mit anderen Verfahren möglich ist. Zusammen mit Methoden, die
nicht auf Fluoreszenz beruhen, wird dieses Verfahren als Multiphotonenmikroskopie oder Nicht-
lineare Mikroskopie bezeichnet.[26]
Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]
Mit FCS wird die Wanderungsgeschwindigkeit von fluoreszierenden Partikeln durch das
Beobachtungsvolumen bestimmt.

→ Hauptartikel: Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie
Die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (abgekürzt FCS nach englisch fluorescence
correlation spectroscopy) ist zwar eine fluoreszenzmikroskopische Methode, bei ihr wird jedoch
kein Bild erzeugt. In einem Konfokalmikroskop wird der Anregungslaser nicht über das Präparat
gerastert, sondern auf einer Stelle geparkt. Es wird somit ein sehr kleines Volumen über einen
längeren Zeitraum beobachtet. Bewegen sich fluoreszierende Moleküle in dieses Volumen hinein
oder hinaus, so ändert sich die gemessene Helligkeit. Anhand einer solchen Messreihe kann
beispielsweise bestimmt werden, wie schnell Moleküle in einer Lösung diffundieren. Da die
Diffusionsgeschwindigkeit unter anderem von der Größe abhängt, lässt sich beispielsweise
untersuchen, ob ein fluoreszenzmarkiertes Protein an ein zweites, ebenfalls in der Lösung
vorhandenes Protein bindet und sich dadurch langsamer bewegt.[27]
Verfahren mit erhöhter Auflösung[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]
Als Auflösung wird in der Mikroskopie der Abstand bezeichnet, den zwei Strukturen haben
müssen, um als getrennte Strukturen wahrgenommen zu werden. Ernst Abbe hat im 19.
Jahrhundert als erster verstanden, dass diese Auflösung fundamental durch Beugung begrenzt
ist. Diese Grenze wird daher als Abbe-Limit bezeichnet. Sie kann mit entsprechenden Formeln
genau berechnet werden und liegt für gute Mikroskope bei Verwendung von Ölimmersion und in
Abhängigkeit von der Wellenlänge bei etwa 200 nm.
Das Abbe-Limit galt lange als unüberwindbar. Ab der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts
wurden jedoch einige mikroskopische Verfahren entwickelt, deren Auflösung besser ist als vom
Abbe-Limit vorhergesagt. Das mit Abstand älteste dieser Verfahren ist die Konfokalmikroskopie
(siehe auch den Abschnitt Auflösung im Artikel Konfokalmikroskop.) Die theoretische
Verbesserung liegt jedoch nur beim Faktor Wurzel von 2 ≈ 1,41. Aus praktischen Gründen kann
auch dieser nicht erreicht werden.

Funktionsschema der TIRF-Mikroskopie. Das Deckglas ist als Objektträger beschriftet.

In den 1980er-Jahren wurde die TIRF-Mikroskopie (englisch total internal reflection fluorescence
microscopy) vorgeschlagen. Mit ihr werden ausschließlich Fluoreszenzfarbstoffe im Präparat
angeregt, die sich sehr nah am Deckglas befinden. Ist das Präparat, zum Beispiel lebende
Zellen, in wässrigem Medium, so dringt die Anregung vom Deckglas ausgehend nur in eine
Schicht von 100–200 nm Dicke ein. Die Schichtdicke ist damit deutlich geringer als es
beugungsbedingt mit normaler Mikroskopie möglich wäre. Dadurch ergibt sich ein deutlich
höherer Kontrast, da nur wenig Material zur Fluoreszenz angeregt wird. Diese spezielle Form der
Anregung wird erreicht, indem das Präparat in einem Winkel angestrahlt wird, der so groß ist,
dass an der Kante vom Deckglas zum wässrigen Medium Totalreflexion auftritt und der
Lichtstrahl somit gar nicht in das Präparat eindringt. An der Kante tritt jedoch eine evaneszente
Welle auf, die zur Anregung führen kann, die sich aber mit zunehmender Entfernung vom
Deckglas sehr schnell abschwächt.[24]
Während „Auflösung“ per Definition den Mindestabstand zwischen zwei Strukturen bezeichnet,
kann man die genaue Position eines Objekts sehr genau messen. Fluoreszenzmikroskopisch
kann man daher das Abbe-Limit umgehen, wenn man die genaue Position von Objekten in
verschiedenen Farbkanälen bestimmt und danach den Abstand zwischen diesen misst. Diese
Technik wurde in den 1990er-Jahren entwickelt und später als Spektrale Präzisions-Distanz-
Mikroskopie (SPDM) bezeichnet. Zwar ließen sich mit ihr Abstände von kleinen fluoreszierenden
Strukturen bis auf etwa 70 nm genau messen. Sie führt jedoch nicht zu einer generellen
Auflösungsverbesserung, da jeder der aufgenommenen Farbkanäle für sich der Beugung
unterliegt.[28][29]
Ende des 20. und Anfang des 21. Jahrhunderts sind jedoch einige Methoden entwickelt worden,
mit denen eine generelle Verbesserung möglich ist. Sie werden gemeinschaftlich im Englischen
als superresolution microscopy, manchmal auch als nanoscopy bezeichnet. Allen ist gemeinsam,
dass sie auf Fluoreszenzmikroskopie beruhen. Drei dieser Verfahren haben eine gewisse
Verbreitung erfahren und sind kommerziell erhältlich: STED, strukturierte Beleuchtung und
Lokalisationsmikroskopie. Daneben gibt es weitere Verfahren, die sich nicht gegen die
genannten behaupten konnten, oder die bisher nur von einzelnen Gruppen angewendet werden.
Einige Verfahren werden auf Grund von gemeinsamen Eigenschaften als RESOLFT-
Mikroskopie zusammengefasst.
Die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie wurde von der Zeitschrift Nature Methods zur
Methode des Jahres 2008 gekürt.[30] William Moerner, Eric Betzig und Stefan Hell erhielten 2014
den Nobelpreis für Chemie für die Entwicklung einiger dieser Methoden.
STED-Mikroskopie[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Vergleich einer konfokalen (links) mit einer STED-Aufnahme von Vimentin-Fasern in einer Zelle.

→ Hauptartikel: STED-Mikroskop
Bei der STED-Mikroskopie (englisch stimulated emission depletion) wird
die Beugungsgrenze deutlich überwunden. Der Anregung eines beugungsbegrenzten Volumens
im Präparat folgt eine ringförmige Abregung durch Licht längerer Wellenlänge. Dabei fallen die
angeregten Moleküle im Bereich der Abregung über stimulierte Emission wieder in den
Grundzustand. Das Fluoreszenz emittierende Volumen verkleinert sich dadurch wesentlich und
die Auflösung des Mikroskops erhöht sich.[31][24]
Strukturierte Beleuchtung[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]
Vergleich der Auflösung von konfokaler (oben) und 3D-SIM-Mikroskopie (unten).

→ Hauptartikel: 3D-SIM-Mikroskop
Bei der strukturierten Beleuchtung oder 3D-SIM-Mikroskopie (englisch structured illumination
microscopy) werden nicht alle Fluorochrome angeregt, sondern nur ein Teil des Präparats in
Form einer bestimmten ‚Struktur‘, einem Streifenmuster. Bei der Überlagerung des bekannten
Beleuchtungsmusters mit der unbekannten Fluorochrom-Verteilung im Präparat entstehen Moiré-
Effekte, deren Größe über der Auflösungsgrenze liegt, selbst wenn die unbekannte Struktur
kleiner ist. Durch Verschiebung und Verdrehung des Beleuchtungsmusters lässt sich durch die
zusätzliche Information aus den Moiré-Mustern der jeweiligen Bilder durch Computerberechnung
ein endgültiges Bild mit bis zu zweifach erhöhter Auflösung erzeugen.[32]
Lokalisationsmikroskopie[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]
Als Lokalisationsmikroskopie (englisch localization microscopy) werden mikroskopische
Verfahren zusammengefasst, die auf einem gemeinsamen Grundprinzip beruhen: Während bei
klassischer Fluoreszenzmikroskopie alle Fluorochrome gleichzeitig angeregt werden, werden sie
hier zeitlich nacheinander angeregt, so dass immer nur ein kleiner Teil von ihnen leuchtet. Von
einer Schärfeebene werden viele Bilder hintereinander gemacht, oft über Tausend. In jedem
dieser Bilder wird nun die genaue Position der jeweils leuchtenden Fluorochrome bestimmt und
diese Position wird in das endgültige Bild übertragen. Die Verfahren unterscheiden sich in der
Methode, wie die einzelnen Farbstoffmoleküle ein- und ausgeschaltet werden, also zum
„Blinken“ gebracht werden.
Die Photoactivated Localization Microscopy (PALM) beruht auf Varianten des Grün
Fluoreszierenden Proteins, die sich mit Licht bestimmter Wellenlängen ein- und ausschalten
lassen. STORM und dSTORM verwenden geeignete Fluoreszenzfarbstoffe, die in bestimmten
Pufferlösungen nur selten fluoreszieren. Ground State Depletion (GSD) beruht darauf, dass sich
zu jedem Zeitpunkt die Mehrzahl der Fluorochrome in einem nicht fluoreszierenden Triplett-
Zustand befindet, der durch starke Lichtanregung erzeugt werden kann. DNA-Paint beruht auf
einer vorübergehenden Bindung von kurzen, einsträngigen DNA-Molekülen an komplementäre
Zielmoleküle.[24]
Weitere Verfahren zur Auflösungsverbesserung[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]
4Pi-Mikroskopie war die erste kommerziell verfügbare Superresolution-Technik, ist jedoch heute
nicht mehr verfügbar.[24] Eine weitere Technik ist Vertico-SMI, die in Heidelberg entwickelt wurde.
Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (FLIM)[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]
Nach der Anregung verbleibt ein fluoreszierender Stoff eine kurze Zeitspanne im angeregten
Zustand, bevor er das Fluoreszenzlicht abstrahlt. Die Dauer dieser Zeitspanne variiert für einen
konkreten Stoff in einem bestimmten Bereich, so dass eine mittlere Fluoreszenzlebensdauer für
einen jeweiligen Stoff bestimmt werden kann. Sie liegt im Nanosekundenbereich, beispielsweise
für Fluorescein bei 3,25 ns, für Texas Red bei 3,41 ns und für Eosin bei 1,1 ns. Wenn die
Fluoreszenzanregung im mikroskopischen Präparat mit einem gepulsten oder modulierten Laser
erfolgt und spezielle Detektoren verwendet werden, dann lässt sich mittels
spezieller Messverfahren die Zeitspanne bestimmen, nach welcher die Fluoreszenz am Detektor
eintrifft. Nicht nur durch ihre Farbe, sondern auch durch ihre Lebenszeit können daher
Fluoreszenzfarbstoffe voneinander unterschieden werden. Dies wird in
der Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (englisch fluorescence lifetime imaging microscopy,
FLIM) ausgenutzt. Gepulste und modulierte Laser gibt es im sichtbaren Wellenlängenbereich für
die Anregung mit einem Photon. FLIM kann aber auch in Kombination mit Multi-Photonen-
Anregung (siehe oben) verwendet werden, für die ohnehin gepulste Laser erforderlich sind.[33][34]
Förster-Resonanzenergietransfer (FRET)[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Jablonski-Energiediagramm für FRET. Die Farben orientieren sich am Beispiel CFP-YFP.

→ Hauptartikel: Förster-Resonanzenergietransfer
Beim Förster-Resonanzenergietransfer (manchmal auch: Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer)
wird die Energie eines angeregten Fluoreszenzfarbstoffs, des Donors, nicht durch Fluoreszenz
abgegeben, sondern direkt auf einen anderen Fluoreszenzfarbstoffs (Akzeptor) übertragen. Dies
ist möglich, wenn erstens Donor und Akzeptor weniger als 10 nm voneinander entfernt sind und
zweitens die Emissionsenergie des Donors der Anregungsenergie des Akzeptors entspricht. Das
Emissionsspektrum des Donors muss also mit dem Anregungsspektrum des Akzeptors
überlappen. Beispielsweise kann ein grün fluoreszierender Farbstoff als Donor für einen orange
fluoreszierenden Akzeptor dienen. Ein weiteres Beispiel ist das cyan fluoreszierende Protein
CFP als Donor für das gelb fluoreszierende Protein YFP.[35]
Tritt FRET auf, so wird trotz Anregung des Donors von diesem keine Fluoreszenz ausgesendet,
stattdessen kann die Fluoreszenz des Akzeptors beobachtet werden. Die FRET-Effizienz nimmt
mit der sechsten Potenz des Abstands zwischen Donor und Akzeptor ab. Das Auftreten von
FRET zeigt daher die direkte Nachbarschaft der beiden an, mit einer Genauigkeit, die weit unter
der Auflösungsgrenze liegt.[35]
Absichtliches Bleichen zur Diffusionsmessung (FRAP und
FLIP)[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]
→ Hauptartikel: FRAP (Biologie) und Fluorescence Loss in Photobleaching
Bei FRAP (engl. fluorescence recovery after photobleaching) wird ein fluoreszenzmarkiertes
Molekül in einer lebenden Zelle in einem Teilbereich der Zelle durch kurzfristige, starke
Lichteinwirkung absichtlich gebleicht, meist durch einen fokussierten Laserstrahl. Anschließend
wird beobachtet, wie schnell Moleküle aus dem nicht gebleichten Teil der Zelle in den
gebleichten Teil zurückkehren. Über die ermittelte Diffusionsgeschwindigkeit können
Rückschlüsse auf das Bindungsverhalten des Moleküls gezogen werden.[36]
Bei FLIP (engl. fluorescence loss in photobleaching) wird dagegen ein Bereich der Zelle
kontinuierlich gebleicht. Es wird beobachtet, wie schnell die Fluoreszenz im nicht gebleichten Teil
der Zelle abnimmt.[36]

Geschichte[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]


1904: Köhlers Entdeckung[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]
Die ersten fluoreszenzmikroskopischen Beobachtungen waren zufällig und ein Ärgernis. August
Köhler, Mitarbeiter beim Mikroskophersteller Carl Zeiss, wollte die lichtmikroskopische Auflösung
steigern. Die Auflösung hängt von der Wellenlänge ab, daher baute er ein Mikroskop für UV-
Licht, um dessen kürzere Wellenlänge zu nutzen. Das damit erzeugte Bild war zwar für die
Augen nicht sichtbar, konnte aber fotografisch aufgefangen werden. Er stellte dabei fest, dass
„das Objekt selbst unter dem Einfluß der es treffenden ultravioletten Strahlung fluoresziert. Eine
derartige Fluoreszenz tritt aber bei der Mehrzahl der Präparate auf. … Das Fluoreszenzlicht …
liegt jedenfalls zum Teil im sichtbaren Bereich des Spektrums;… Daß dadurch die
Wahrnehmung des durch die ultravioletten Strahlen erzeugten Bildes, auf die es eigentlich
ankommt, erschwert, wenn nicht gar unmöglich gemacht wird, liegt auf der Hand. … Unter
Umständen könnte selbstverständlich auch die Beobachtung dieses direkten Bildes Interesse
bieten …“
– AUGUST KÖHLER: Mikrophotographische Untersuchungen mit ultraviolettem Licht. 1904.
Zeitschrift für Wissenschaftliche Mikroskopie 21:128–165 und 273–304.[37]
Bereits früh war Köhler also bewusst, dass die bei der UV-Mikroskopie störende Fluoreszenz
auch nützliche Anwendungen ermöglichen könnte.
1910–1913: Erste Fluoreszenzmikroskope und
Anwendungen[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Zeitgenössische Darstellung des ersten Fluoreszenzmikroskops der Firma Reichert. Links die große
Beleuchtungseinrichtung, rechts das eigentliche Mikroskop. Dazwischen eine Quarzlinse mit 70 mm
Durchmesser und 150 mm Brennweite sowie die Filterküvette.

Das erste kommerziell erhältliche Fluoreszenzmikroskop wurde von Oskar Heimstädt entwickelt,
der beim Wiener Mikroskopbauer Karl Reichert das Rechen- und Konstruktionsbüro leitete. Es
wurde von Reichert persönlich 1911 auf der Versammlung der Deutschen Naturforscher und
Ärztevorgestellt. Im gleichen Jahr veröffentlichte Heimstädt eine Arbeit mit dem Titel „Das
Fluoreszenzmikroskop“ in der Zeitschrift für wissenschaftliche Mikroskopie.[37][38]
UV-Licht war für die Fluoreszenzanregung gut geeignet, da es für das Auge nicht sichtbar und
somit kein Sperrfilter erforderlich war. Eine gute Anregung erforderte, dass von der Lichtquelle
kein sichtbares, aber möglichst viel UV-Licht zum Präparat gelangte. Ein geeigneter
Anregungsfilter wurde kurz zuvor, 1910, von Hans Lehmann bei Zeiss entwickelt. Er bestand aus
einer Filterküvette, die entlang der optischen Achse aus zwei Kammern bestand. Die drei Wände
waren aus Jenaer Blau-Uviolglas, eine Kammer wurde mit gesättigter Kupfersulfat-Lösung, die
andere mit verdünnter Nitrosodimethylanilin-Lösung gefüllt. Das so erzeugte Anregungslicht
wurde als „gefiltertes Ultraviolett“ bezeichnet.[39] Da normales Glas UV-Licht absorbiert, wurde
wenig später ein Kondensor aus Quarz eingesetzt, um hohe Beleuchtungsstärken zu erhalten.
Es entstand jedoch ein neues Problem: Die Glaslinsen im Objektiv fingen an zu fluoreszieren.
Daher setzte Lehmann einen Dunkelfeldkondensor ein: So wurde das Anregungslicht am
Objektiv vorbei geleitet und auch Reste von sichtbarem Licht aus der Lichtquelle im
mikroskopischen Bild wurden vermieden.[37][38]
Über die Möglichkeiten und Zukunftsaussichten der Fluoreszenzmikroskopie schrieb Heimstädt
„Es ist z. B. ein leichtes, die Anwesenheit sehr kleiner Mengen von Mutterkorn im Mehl …
festzustellen, da Stärke intensiv violett fluoresziert, während Mutterkorn ein gelblich weißes Licht
aussendet. …
Ob und wie weit das Fluoreszenzmikroskop … eine Möglichkeit der Erweiterung des
mikroskopischen Abbildungsgebietes in sich [schließt], muss die Zukunft lehren.“
– OSKAR HEIMSTÄDT: Das Fluoreszenzmikroskop, 1911.[38]
Ebenfalls 1911 wurde von Michail Tswett die Fluoreszenz der Chloroplasten
beschrieben.[40] Stanislaus von Prowazek veröffentlichte 1913 die erste Arbeit, in der mit
Fluoreszenzfarbstoffen gearbeitet wurde, namentlich mit Eosin und Neutralrot.[41]
Ein Jahr nach dem Reichert’schen Fluoreszenzmikroskop wurde auf der Versammlung
deutscher Naturforscher und Ärzte 1912 das von Lehmann entwickelte Zeiss’sche
„Lumineszenzmikroskop“ vorgestellt. Eine Dunkelfeld-Beleuchtung führt zu einer
verringerten Numerischen Apertur und somit zu einer verringerten Auflösung. Daher setzte
Lehmann auf eine normale Hellfeldbeleuchtung mit UV-Licht. Um zu verhindern, dass UV-Licht
ins Auge drang, setze er auf einen UV-blockierenden Glasfilter aus Euphosglas, der
als Deckglas verwendet wurde. Der Filter musste zwischen Präparat und Objektiv liegen, um
Fluoreszenzanregung im Objektiv zu vermeiden, daher war keine andere Position für den Filter
möglich. Der Kondensor hatte Quarz-Linsen, die verwendeten Objektträger waren
aus Bergkristall, um UV-Durchlässigkeit zu gewährleisten. Die empfohlene
Standardvergrößerung lag bei 62× (inklusive Okularvergrößerung), 300× sollte nicht
überschritten werden. Die Fluoreszenz-Zusatzausstattung, also ohne das eigentliche Mikroskop,
kostete mit der billigsten Anregungslichtquelle, einer von Hand regulierbaren Bogenlampe, etwa
500 Mark. Hinzu kamen 4,50 M für einen 0,5 mm dicken 30×25 mm Bergkristall-Objektträger und
eine Mark pro Euphosglas-Deckglas. Neben Schwarzweiß-Fotografien konnten auch Farbbilder
mit dem Autochromverfahren erstellt werden.[37]
1933–1940: Max Haitinger und die Fluorochromierung[Bearbeiten | Quelltext
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Abbildung aus Haitinger, 1938. „Wurzelspitze von Allium cepa, längs, mit Coriphosphin O; … 10 Minuten
Belichtungszeit, scharfe Differenzierung zw. Kern und Protoplasma“.

In der Anfangszeit der Fluoreszenzmikroskopie wurden fast ausschließlich autofluoreszente


Objekte betrachtet. Auch Max Haitinger, zunächst Privatforscher in Weidlingbei Wien, später an
der Universität Wien, begann mit der Untersuchung der Fluoreszenz von Wein und Obstweinen.
Ab 1933 entwickelte er jedoch Fluoreszenzfärbungen, die er als „Fluorochromierungen“
bezeichnete. Von ihm stammen die Begriffe Sekundärfluorszenz für zu erzeugende Signale und
Primärfluoreszenz für im Präparat von selbst vorhandene. Auch die Bezeichnung Fluorochrom
für einen Fluoreszenzfarbstoff wurde von ihm eingeführt. Als Fluorochrome setzte er erst
Pflanzenextrakte ein und später eine Reihe von Chemikalien. Dadurch gelang es ihm,
Dünnschnitte von tierischen und menschlichen Geweben anzufärben, so dass sich auch
Histologen für die Fluoreszenzmikroskopie zu interessieren begannen. Da nur sehr geringe
Konzentrationen der Fluorochrome benötigt wurden, waren auch Lebendfärbungen möglich, die
hauptsächlich in der Botanik angewendet wurden. Mit Auramin O gelang die Färbung
von Tuberkulose-Bakterien. Auch Mehrfachfärbungen waren möglich. Eine erste Abhandlung
veröffentlichte Haitinger 1934, sein Buch „Fluorescenzmikroskopie – Ihre Anwendung in der
Histologie und Chemie“ erschien 1938.[37][39][42]
Haitinger arbeitete eng mit der Firma Reichert zusammen, um deren Fluoreszenzmikroskop zu
verbessern. Das neue Modell „Kam F“ wurde ab 1931 verkauft. Auch dieses hatte eine
Bogenlampe mit Eisenelektroden als Lichtquelle, da diese einen vergleichsweise hohen UV-
Anteil zwischen 300 nm und 400 nm hatte. Trotzdem benötigte er bis zu 20 Minuten
Belichtungszeit für seine Fotografien. Für schwache Vergrößerungen nennt er Belichtungszeiten
mit Kohlebogenlampen von einer bis zehn Minuten. Die Nitrosyldimethylanilin-Lösung in der
Anregungsfilter-Küvette konnte durch Nickeloxid-haltige Schwarzglasfilter ersetzt werden. Die
Kupfersulfat-Lösung, die den verbleibenden Rotanteil im Anregungslicht filterte, wurde erst
Anfang der 1940er-Jahre durch blaue Glasfilter ersetzt. Die Beleuchtung erfolgte durch einen
Hellfeldkondensor mit normalem Glas; es hatte sich gezeigt, dass Quarzglas hierfür nicht
erforderlich ist. Das verbleibende Anregungslicht wurde am Okular blockiert, indem ein Sperrfilter
aus 1 mm dickem gelben Glas aufgesetzt wurde. Falls ein farbloser Sperrfilter benötigt wurde,
konnte stattdessen eine Küvette mit einer 5 mm dicken Schicht Natriumnitrit-Lösung verwendet
werden. Deckgläser aus Euphosglas waren dank des gelben Sperrfilters nicht mehr nötig, auch
zeigte sich, dass normale Objektträger geeignet waren. Dadurch sanken die laufenden Kosten
erheblich.[37][42]

Der Strahlengang im Epilum von Reichert verlief wie in dieser Schemazeichnung. (1) Einfallendes Licht. (2)
Ringspiegel mit hoher UV-Reflexion. (3) an dieser Stelle war ein Ringkondensor (nicht eingezeichnet) um
das Licht auf das Objekt (4) zu leiten. Der Fluoreszenzlicht-Strahlengang (5) verlief durch das Objektiv
Richtung Okular.[42]

In seinem Buch von 1938 beschreibt Haitinger auch Auflicht-Beleuchtungen für die
Fluoreszenzmikroskopie von undurchsichtigen Gegenständen (Epikondensor von Zeiss-Jena,
Epilum der Optischen Werke C. Reichert-Wien (siehe Schemazeichnung), Ultropak von E. Leitz-
Wetzlar und Univertor von E. Busch-Rathenow). Sie sind jedoch nicht mit heutiger
Auflichtfluoreszenzanregung mit Hilfe eines dichroitischen Strahlteilers vergleichbar. Als
Anwendungsbeispiele nennt er die Untersuchung von Nahrungsmitteln, Drogen und Farbstoffen
sowie Erstuntersuchungen von Präparaten, von denen Dünnschliffe hergestellt werden sollen.
Als „ganz besonders wertvoll“ bezeichnet er Auflichtbeleuchtungen für Studien am lebenden
Tier.[42]
Um 1940 brachte Osram Quecksilberhöchstdrucklampen auf den Markt, für die bald bei Zeiss
und unter Mitentwicklung von Haitinger bei Reichert (Lux UV und Lux UW)
Beleuchtungseinrichtungen ins Programm genommen wurden. Neben der wesentlich
vereinfachten Handhabung und einer größeren Helligkeit gaben diese Lampen nicht nur einzelne
Linien ab, sondern ein kontinuierliches Spektrum, mit der sich alle fluoreszierenden Stoffe
anregen ließen. Auch produzierten sie keine unangenehmen Dämpfe wie Eisenbogenlampen.
Vergleichbare Lampen sind auch heute noch in Verwendung.[37][39][43]
In den 1940er-Jahren begann sich Farbdiafilm zur Dokumentation durchzusetzen. Trotz aller
Fortschritte lagen die Belichtungszeiten meist noch im zweistelligen Minutenbereich.[37]
1942–1958: Entwicklung der Immunfluoreszenz und die Fluoreszenz
herkömmlicher Farbstoffe[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]
Ein Durchbruch für die Fluoreszenzmikroskopie war die Einführung der Immunfluoreszenz. 1942
veröffentlichten Albert Hewett Coons und Kollegen die Kopplung von Fluorescein-
Isocyanat an Antikörper. Mit seiner hellen grünen Fluoreszenz hob sich dieses Fluorochrom
besser von der bläulichen Autofluoreszenz vieler Gewebe ab als das zuvor probierte Anthracen-
Isocyanat. Die Antikörper waren gegen Pneumokokken gerichtet, die so in Mausgeweben
fluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen werden konnten.[44] Die Kopplung der Antikörper war
jedoch technisch anspruchsvoll und die Konjugate waren instabil.[37]
Siegfried Strugger stellte fest, dass manche bekannten herkömmlichen Farbstoffe auch
fluoreszieren, so etwa Neutralrot und Rhodamin B. Auch Acridinorange führte er in die
Fluoreszenzmikroskopie ein. In einem Buch beschrieb er 1949 detailliert die Möglichkeiten der
Fluoreszenzanregung mit blauem Licht statt mit UV. Strugger nutzte Auflichtbeleuchtung, um den
Fluss von Wasser in Pflanzen zu verfolgen.[37]
Eine wesentliche Verbesserung der Immunfluoreszenz gelang 1958 J. L. Riggs und Kollegen,
indem sie Isothiocyanate statt Isocyanaten verwendeten. Einer anderen Arbeitsgruppe war
zwischenzeitlich ein Zwei-Farben-Nachweis mit Fluorescein-Isocyanat und dem orange
fluoreszierenden Rhodamin B-Isocyanat gelungen. Riggs und seinen Mitstreitern gelang nun die
Markierung von Antikörpern mit den deutlich stabileren Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und
Rhodamin B-isothiocyanat.[45][37]
1962–1972: Johan Sebastiaan Ploem und die Einführung der
Interferenzfilter[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]
Noch in den 1950er-Jahren wurde Fluoreszenzmikroskopie ausschließlich mit UV, violettem oder
blauem Anregungslicht durchgeführt.[46][47] Dies änderte sich erst mit der durch den
Niederländer Johan Sebastiaan Ploem vorangetriebenen Einführung von Interferenzfiltern in den
1960er-Jahren. Die ersten, die einen dichroitischen Strahlteiler in der Mikroskopie einsetzten,
waren die Russen Brumberg und Krylova im Jahr 1953.[48] Die auf Russisch veröffentlichte Arbeit
blieb jedoch im Westen unbekannt und wurde erst später „wiederentdeckt“.
Angetrieben durch die Entwicklung zahlreicher Antikörper für Immunfluoreszenzen entstand ein
Bedarf an Fluorochromen unterschiedlicher Farben. Diese ließen sich jedoch durch die
herkömmliche Verwendung mit UV-Licht oft nur schlecht anregen. Um 1962 begann Ploem eine
Zusammenarbeit mit den Schott-Werken in Mainz zur Entwicklung dichroitischer Strahlteiler, die
blaues oder grünes Licht reflektierten. Schott stellte zuvor schon viele der in der
Fluoreszenzmikroskopie gebräuchlichen Glasfilter her. Die Firma Leitz lieferte Ploem eine Opak-
Auflichtbeleuchtung mit einem halbdurchlässigen, farbunabhängigen Spiegel. Diese wurde an
der Universiteit van Amsterdam umgebaut und erhielt einen Schieber mit vier Positionen für
dichroitische Strahlteiler zur Anregung mit UV, Violett, Blau und Grün, so dass die jeweilige
Anregungswellenlänge bequem ausgewählt werden konnte. Erstmals erfolgte die Anregung
damit wie heute üblich durch das Objektiv. Durch die Wahl von schmalbandigen Interferenzfiltern
für blaues beziehungsweise grünes Anregungslicht konnten außerdem die in der
Immunfluoreszenz häufig verwendeten Farbstoffe FITC (grün fluoreszierend) und
Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat (TRITC; orange fluoreszierend) nahe an ihrem
Absorptionsmaximum angeregt werden, ohne gleichzeitig große Mengen Autofluoreszenz durch
überflüssige Anregungswellenlängen auszulösen. Seine Ergebnisse veröffentlichte Ploem in
mehreren Arbeiten ab 1965.[37][49]
Prospekt der Firma Will-Wetzlar von ca. 1980. Im Vordergrund ein Auflichtfluoreszenzmikroskop, im
Hintergrund die ältere Anordnung mit Durchlichtanregung. Die Lampenhäuser für die Fluoreszenzanregung
sind an den Kühlrippen zu erkennen.

Leitz Metallux II (ca. 1972) ausgestattet für Auflicht-Fluoreszenz, das entsprechende Lampenhaus ist am
Stativ hinten oben. Hier kombiniert mit Phasenkontrast und Mitbeobachter-Tubus.

Im Anschluss entwickelte Leitz den PLOEMOPAK, eine Einrichtung, auf der vier Strahlteiler
durch Rotation abwechselnd in den Strahlengang eingeschwenkt werden konnten. Spätere
Versionen wurden um Sperrfilter und Anregungsfilter ergänzt bis schließlich um 1972 eine
Variante auf den Markt kam, die vier Fluoreszenzfilterwürfel mit je einem Anregungsfilter,
Strahlteiler und Sperrfilter enthielt. Die Würfel konnten durch den Anwender ausgetauscht
werden, um sie den jeweils verwendeten Fluorochromen anzupassen.[49]
Damit war die Entwicklung des Epifluoreszenzmikroskops, wie es heute noch verwendet wird, im
Prinzip abgeschlossen. Es sollte jedoch noch etliche Jahre dauern, bis sich dieser Bautyp
allgemein durchsetzte. Britische Mikroskopie-Lehrbücher von 1975 und 1977 erwähnen
ausschließlich die Möglichkeit der UV-Anregung und Durchlichtbeleuchtung.[50][51] Ein späteres
von 1982 meinte, dass die Beleuchtung für gewöhnlich mit einem Dunkelfeldkondensor erfolge,
beschrieb aber auch die Auflichtbeleuchtung mit dichroitischem Strahlteiler und stellte diese als
die lichtempfindlichere vor. Die Möglichkeit, durch den Austausch aller Filter Fluorochrome wie
FITC und Rhodamin nacheinander nachweisen zu können, wurde ebenfalls erwähnt.[52]
Ein westdeutsches Lehrbuch von 1985 beschrieb alle drei Möglichkeiten, Durchlicht-Hell- und -
Dunkelfeld sowie Auflicht-Hellfelderregung durch das Objektiv, schrieb letzterer besonders
einfache Einstellung (da kein Kondensor benötigt wird) sowie hohe Anregungsintensität bei
ausgezeichnetem Kontrast zu und erwähnte die Möglichkeit, Filterblöcke schnell auszutauschen.
Als Hersteller solcher Systeme wurden Leitz, Olympus, Reichert, Zeiss und Jena genannt, womit
wohl der VEB Carl Zeiss Jenagemeint war.[53] Ein Lehrbuch von 1988 erwähnte zwar die älteren
Methoden, stellte dann aber fest: „Moderne Fluoreszenzmikroskope arbeiten nach dem Prinzip
der Auflicht-Hellfeldanregung“ mit dichroitischer Teilerplatte. Im Weiteren hieß es: „Die meisten
Mikroskophersteller bieten Einrichtungen für die Durchlicht- und Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie
an“.[54]

Weblinks[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]


Commons: Fluoreszenzmikroskopie-Bilder – Sammlung von Bildern, die mit
Fluoreszenzmikroskopie erstellt wurden

• Michael Volger (Hrsg.: Irene K. Lichtscheidl): Fluoreszenzmikroskopie. Abgerufen am


25. März 2017 (Theoretische Einführung und Anleitung zur praktischen Anwendung an der
Uni Wien. Auch als pdf-Datei verfügbar.).
• Multi-Wavelength Epi-Illumination in Fluorescence Microscopy by Johan Sebastiaan Ploem
and Friedrich Walter on Leica Science Lab.
• Datenbanken für Fluoreszenzfarbstoffe: Fluorophores.org, Spectra Database an der
University of Arizona, Fluorescence SpectraViewer bei Thermo Fisher.

Einzelnachweise[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]


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53. ↑ Dieter Gerlach: Das Lichtmikroskop. Eine Einführung in Funktion und Anwendung in
Biologie und Medizin. 2. Auflage. Thieme Verlag, Stuttgart 1985, ISBN 3-13-530302-
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54. ↑ Gerhard Göke: Moderne Methoden der Lichtmikroskopie: vom Durchlicht-Hellfeld- bis
zum Lasermikroskop. Franckh’sche Verlagshandlung, Stuttgart 1988, ISBN 3-440-
05765-8, S. 211–212.

source:
https://de.wikipedia.org/wiki/Fluoreszenzmikroskopie