CARACTERIZACIÓN Y RÉPLICA DE CULTIVOS

1. INTRODUCCION
El aislamiento y recuento de las levaduras se realiza en placas Petri con medio
rico agarizado. Se suele identificar basándose fundamentalmente en
características morfológicas y fisiológicas, metabolismo de algunos azucares y
asimilación de diversos compuestos nitrogenados. (Krejer van rij y Barnett 1990).
El agar, una sustancia similar a la gelatina que se extrae de las algas rojas, es
usado comúnmente para cultivar microorganismos. Se le agregan varios
nutrientes para favorecer el crecimiento bacteriano y se coloca tanto en placas
planas como en tubos de ensayo. Cuando se coloca en un tubo de ensayo, el agar
está en forma líquida. Estos luego son colocados en ángulo para que se enfríen y
solidifiquen, creando una superficie inclinada, o un agar inclinado (agar slant, en
inglés). (Christine Lehman, 2018).
Un cultivo que contiene solamente una clase de microorganismo se conoce como
cultivo puro; el que comprende más de una clase de microorganismo se
denomina cultivo mixto. En el estudio de los microorganismos es importante
tener presente dos aspectos fundamentales: el cultivo, procedimiento mediante
el cual se promueve el crecimiento de los microorganismos al brindarles las
condiciones ambientales adecuadas, y el aislamiento de un organismo en cultivo
puro, mediante la aplicación de técnicas de laboratorio para separar-lo de las
poblaciones mixtas. (Plata Pérez, 2004).
La manera más fácil de obtener cultivos puros de los microorganismos que forma
colonias sobre los medios sólidos se lleva a cabo mediante la separación e
inmovilización de los organismos individuales sobre o dentro de un medio
nutritivo solidificado; cada célula crecerá dando una colonia aislada. La sustancia
solidificante ideal para la mayor parte de los medios de cultivo microbiológicos
es el agar, un polisacárido ácido extraído de ciertas algas rojas. En una
concentración de 1,5-2 %, en suspensión acuosa, se disuelve a 100 °C formando
una solución clara que solidifica a 45 °C, la cual no volverá a licuarse hasta
temperaturas mayores de 80 °C, de manera que cualquier temperatura
empleada para la incubación posterior puede ser usada.
(Raúl Ricalde Velasco, 2004)
La siembra por estría es el método más útil de sembrar en placa y se realiza
empleando un asa de alambre estéril que se introduce en la suspensión original
para luego hacer una serie de estrías paralelas, no superpuestas, sobre una placa
de agar. Al ir avanzan-do la estría, el inóculo va disminuyendo hasta obtener
colonias bien aisladas sobre el agar. los aislamientos pueden hacerse con placas
sembradas por vertido, para ello una suspensión del microorganismo se mezcla
con el medio de cultivo que contiene agar fundido el cual se vacía en placas de
Petri y se desarrollan dando colonias aisladas.
La tinción simple se basa en la afinidad del colorante por los componentes
celulares. La tinción puede ser uniforme o presentar algunos gránulos en su
interior. Utiliza un solo colorante (violeta de genciana, azul de metileno, fucsina
diluida). (Marta Ortega, 2009)
 En el campo de la microbiología ya sea alimenticia o de investigación el
aislamiento de microorganismos de interés son una manera de poder tener
cultivos puro que puedan ser usados de manera directa en la elaboración de
requerimientos en el campo industrial.
2. OBJETIVO
2.1 OBJETIVO GENERAL
Conocimiento de técnicas apropiadas al uso de caracterización y
replicación de colonias para uso posterior en la elaboración de algún
producto de interés.

2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

- Preparación de solución agar como medio cultivo PDA
- Realizar la siembra en medio agar PDA de forma estrías, superficie
y tubo inclinado
- Caracterización macroscópica y microscópicamente por medio de
tinción simple
- Evaluar la importancia en la elaboración de vinos.
3. MATERIALES
Materiales y equipo
- Autoclave
- Cajas Petri
- Pipetas
- Vaso precipitado
- Balanza analítica
- Mechero
- Garrafa
- Algodón
- Tubos ensayo
- Microscopio
- Azas
- Gaza tipo venda
- Estufa
- Matraz Erlenmeyer
- Papel sabana
- Porta objetos
Reactivos
- Agar PDA (potato dextros agar)
- Alcohol
- Agua destilada
- Agua de red
- Levadura saccharomyces cereviseae
- Levadura veronae
 - Fucsina y violeta como tintes
- Aceite inmersión

4. PROCEDIMIENTO
Cultivo de levadura
- Se preparo el calculo para 20 cajas Petri- 30ml el agar PDA a
necesitar y 16 tubos ensayo 5ml
3g 1000ml
X 700ml x=2.1g PDA
- Se peso y diluyo el agar con agua destilada en matraz Erlenmeyer
de 1000ml y tapar con aluminio.
- Cubrir los materiales con papel y sujetarlos adecuadamente
- Preparación de auto clave e introducción de materiales y agar a ser
esterilizar por 15min a presión 1atm, 121ºC.
- Realizar el desmontaje cuidadoso de al autoclave y preparación de
mesón de trabajo desinfectar con alcohol al 70%.
- Llenado en cajas Petri agar PDA y en tubos de ensayo en
inclinación en caliente a fuego de mechero, dejar enfriar.
- Realización de siembra mediante método de estrías, superficie y
en tubos inclinados con ayuda de azas con levaduras
sacharomices sereviceae y veronae
- Se llevo a estufa para su cultivo con requerimiento de temperatura
adecuada
Tinción simple de levaduras
- Siguiente semana de clases de laboratorio se pudo realizar la
verificación de crecimiento de lavaduras en placas y tubos.
- Se preparo el material para la tinción simple
1 observación sin tinte
- limpiar un portaobjeto colocar sobre portaobjeto gota de agua y en
medio de mechero se extrae muestra de levadura veronae y
cereviceae con ayuda de aza dridalski
- Expandir sobre portaobjeto y se dejo secar
- Se realizo observación en microscópico 40x la estructura de estos
y registro
2 observación con tinte
- limpiar un portaobjeto colocar sobre portaobjeto gota de agua y en
medio de mechero se extrae muestra de levadura veronae y
cereviceae con ayuda de aza dridalski
- Expandir sobre el portaobjeto y se dejó secar
- Se realizo la tinción solo con un color azul violeta para veronae y
fucsina para cereviceae dejando 1mim de acción tinte y lavado
retirado de tinte, dejar secar
 -
Se añadió gota de aceite de inmersión y observación a
microscópico con medida de 100x, registro
5. RESULTADOS Y DISCUCIONES

DISCUSIÓN
(Ing. Eduardo Santambrosio,2009) El uso de colorantes permite cambiar el color
de las células de los microorganismos y poder realizar la observación en
microscopio óptico. En laboratorio se pudo constatar que en tinción con
colorantes de fucsina y violeta las paredes celulares de las levaduras se pudieron
teñir de modo que su observación fue clara siendo veronae forma ovoide y
cervecease forma circular.
(Carlos M. Rodríguez,2001) El crecimiento microbiano puede estar influido por
una variedad de factores, tanto físicos como nutricionales. Los factores físicos
incluyen: la concentración de iones hidrógeno (pH), la temperatura, la
concentración de oxígeno, la humedad, la presión hidrostática, la presión
osmótica y la radiación. En laboratorio se pudo resaltar que el medio PDA agar
es un medio rico en nutrientes aptos para crecimiento de levaduras el cual se
tubo cuidados de no contaminarlo y su desarrollo fue muy positivo, el adecuado
en estufa.
6. CONCLUSIÓN
- Se pudo conocer la teoría y la practica de la manera de como es el
uso de el aislamiento de microorganismos teniendo la habilidad de
caracterizar y replicar mediante la técnica empleada y realizar un
cultivo puro para su posterior uso en algún producto de interés.
- Se pudo realizar la preparación del medio educado para el
desarrollo de las levaduras veronae y cereviceae del PDA.
- Se pudo realizar un análisis macroscópico de manera visual donde
la levadura veronae en las siembras tenían un aspecto blanquecino
con colonias formadas en circulares y microscópica que la forma
de la levadura veronae es ovoide y la de cereviceae son circulares.
- Con el método utilizado teneos la importancia de aislar este tipo de
levaduras ya que en el campo de vinos estos efectuaran en la
fermentación una acción de aroma (veronae) y grado
alcohólico(cereviceae).

7. CUESTIONARIO
1. Morfología de las levaduras utilizadas
Zygosacckaromyces veronae: En agar malta las células son mayores, de
forma irregular, muy punteadas, globosas y otras alargadas; muchas
provistas de un ancho canal o prolongación que, en muchas ocasiones,
conjugan. Aseas originadas por conjugación isogámica o heterogamia,
conteniendo 2 esporas. El cultivo en mosto de uva se presenta
transparente, con anillo bien formado que, al agitar el tubo ligeramente,
cae, enturbiando fuertemente el líquido, con abundante depósito en el
fondo y, a veces, sobre las paredes del tubo. La estría sobre agar malta
es abundante, de color amarillento tendiendo al marrón; lisa cuando es
joven, se hace rugosa en el centro al envejecer, apareciendo como un
reticulado muy característico. La colonia en gelatina de mosto es redonda,
gibosa, de color amarillento; no hace fluida la gelatina. La puntura en el
mismo medio se presenta en forma de clavo, con buen desarrollo y ruptura
discreta de la masa. La prueba de Rivalier-Seydel es positiva.

Saccharomyces cerevisiae: es un pequeño organismo unicelular que está

muy relacionado con las células de animales y plantas. La membrana
celular separa los componentes celulares del medio externo, mientras que
la membrana nuclear protege el material hereditario. La membrana
mitocondrial está involucrada en la generación de energía, mientras que
el retículo endoplasmático (RE) y el aparato de Golgi están involucrados
en la síntesis de lípidos y modificación de proteínas.

La vacuola y los peroxisomas encierran rutas metabólicas relacionadas

con las funciones digestivas. Mientras tanto, una compleja red de
andamiaje actúa como soporte celular y permite el movimiento celular,
realizando así las funciones de citoesqueleto. Los filamentos de actina y
miosina del citoesqueleto funcionan mediante la utilización de energía y
permiten el ordenamiento polar de las células durante la división celular.
S. cerevisiae tiene una pared celular de quitina, dándole a la levadura la
forma celular que la caracteriza.

2. Fisiología de las levaduras utilizadas

Zygosacckaromyces veronae
Caracteres fisiológicos: No asimila los nitratos ni escinde la arbutina.
Desarrollo escaso o nulo en presencia de alcohol etílico. Fermenta
glucosa, sacarosa y rafinosa 1/3. Algunas cepas fermentan ligeramente la
maltosa. Asimila glucosa, galactosa, maltosa y sacarosa.
Saccharomyces cerevisiae
Es capaz de fermentar completamente los azucares de la uva. Las
Saccharomyces son poco abundantes en los hollejos de la uva madura, y
se piensa, que las fermentaciones espontáneas proceden de las
levaduras que están en la bodega.
Es la responsable de la fermentación de la mayor parte de los azúcares
del mosto. Su poder alcohológeno es elevad y es bastante resistente al
SO2 (250 mg/l)

3. Indique y desarrolle 3 métodos de conservación para estas levaduras

- Conservación por congelación. Se congelan las células levaduras en
suspensión en un líquido con un agente crioprotector y se guardan a
temperaturas inferiores a cero grados centígrados, con lo que el agua se
congela. De esta forma, al no disponer las células de agua en forma
líquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las células así
conservadas, se recuperan subiendo la temperatura.
- Conservación por liofilización: eliminación del agua de una sustancia
congelada por sublimación del hielo bajo vacío. Este proceso consta de
tres etapas, la precongelación del producto para asegurar una estructura
completamente congelada; el secado primario con el que se elimina la
mayor parte del agua por sublimación; y el secado secundario con el que
se remueve el agua que queda ligada.
- Conservación por transferencia periódica o subcultivo. La cepa de
levaduras se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en
el que ha crecido, consiste en la transferencia del cultivo a un medio de
cultivo fresco a intervalos que aseguren la viabilidad de este.

4. Explique cómo se escalona un proceso fermentativo a nivel industrial

(ilustre también con dibujos)
Flujograma general de una fermentación industrial
CLASIFICACION DE LOS PROCESOS DE FERMENTACION
Tipo I
En este proceso el producto deriva directamente del metabolismo primario
utilizado para la producción de energía. El crecimiento, el catabolismo del
carbohidrato y la formación del producto se llevan a cabo casi en paralelo
y la trotofase y la diofase no se separan una de la otra.
Tipo II
En este caso el producto deriva también del sustrato utilizado para el
metabolismo primario, pero la producción tiene lugar en una vía
secundaria que está separada del metabolismo primario.
Tipo III
El metabolismo primario y la formación de producto se producen en
tiempos completamente separados. El producto no deriva del catabolismo
 sino de vías anfibólicas. En este tipo opera primero el metabolismo
primario, acompañado por el consumo de substrato y el crecimiento. Esta
clasificación de a los procesos dependiendo de la producción del
metabolito, la composición del medio de cultivo y la regulación en la cepa
utilizada. Muchas vitaminas y antibióticos se producen por este medio.
5. Explique los procesos y tipos de esterilización que se desarrollan en
una planta de fermentación (desde el inicio hasta el final).
- La esterilización por filtración: se utiliza frecuentemente para todos los
componentes de la solución de nutrientes que son sensibles al calor y que
serían por tanto desnaturalizados durante el proceso de esterilización por
vapor utilizado normalmente en fermentación industrial. Las vitaminas, los
antibióticos o los componentes de la sangre son ejemplos de compuestos
lábiles al calor que deben ser esterilizados por filtración
- Esterilización discontinua: La mayor parte de los medios de cultivo se
esterilizan en la actualidad en volúmenes discontinuos en el biorreactor a
121˚C. Un método de esterilización es inyectar vapor en la camisa del
fermentador o en los serpentines interiores (esterilización indirecta). Otro
método es inyectar vapor en la propia solución de nutrientes
(procedimiento directo), en cuyo caso un prerrequisito es tener vapor puro
(libre de aditivos químicos).
- Esterilización continua: Esterilización continua es la etapa preliminar
lógica en una fermentación continua a escala industrial, se lleva a cabo
normalmente en 30-120 segundos a 140° C, con inyección de vapor se
hace inyectando vapor en la solución de nutrientes
BIBLIOGRAFIA
- www.researchgate.net/publication/261983198_ESTERILIZACION
_INDUSTRIA
- www.researchgate.net/figure/Diagrama-de-flujo-general-de-un-
proceso-de-fermentacion-
- es.scribd.com/doc/15762395/Procesos-Fermentativos
- www.researchgate.net/publication/262724715_Metodos_generale
s_de_conservacion_de_microorganismos
- http://urbinavinos.blogspot.com/2014/12/levaduras-vinicas-
morfologia-fisiologia.html
- www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnol
ogia/practico4.pdf
- http://digibug.ugr.es/bitstream/handle/10481/927/1608004x.pdf;jse
ssionid=5B99E7CE70504D65CFB53FEA535E169E?sequence=1