Instituto Politécnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería

Campus Guanajuato

Laboratorio de Biorreactores
5BV1

Práctica 6
ESTERILIZACIÓN DE AIRE

​ Equipo No. 1

Integrantes:

Bueno Elizarrarás Marissa

Gaona Rodríguez Alitzel
García Magaña Alan David
Mendoza Soto Luis Antonio
Pinedo Velázquez José María

Docentes:

Juan Antonio Paniagua Luna

Juan Carlos Rodriguez Sierra
Juan Manuel Salgado Román

Silao de la Victoria, Guanajuato a 9 de octubre de 2018

RESUMEN
En esta práctica se realizó la esterilización de medios del cultivo y del aire, la
esterilización del aire mediante el diseño de un filtro el cual consiste de un tubo de
PVC empacado con algodón, el procedimiento se realizó en campana de flujo
laminar para asegurar la esterilidad del proceso, ​se inocularon cajas petri con caldo
nutritivo antes y después de esterilizar, para calcular la constante de muerte que
determina el comportamiento de muertes a través del tiempo de mantenimiento en
la esterilización, mientras que el resto de los valores se obtuvieron de manera
experimental.

INTRODUCCIÓN

La esterilización se efectúa para poder estudiar, conservar y transportar cultivos de

gérmenes puros, lo que no podría hacerse sin previa esterilización del material y los
medios de cultivo, pues sabemos que todos los ambientes están poblados de
gérmenes. También se realiza para conservación de alimentos, acondicionamiento
de materiales para cirugía y múltiples usos en donde la contaminación puede traer
aparejados problemas de distinta índole.

La esterilización es un proceso mediante el cual se destruyen todas las formas de

vida dentro del biorreactor.

Existen tipos distintos de esterilización, dentro de los cuales se conoce esterilización

con calor, con calor húmedo, con calor seco, filtración, incineración o repartición de
los medios estériles (Olivas, 2004).

● Esterilización con calor:

Las altas temperaturas inactivan muchas enzimas, desnaturalizan proteínas y la
muerte de microorganismos.

● Calor húmedo:
Se realiza por medio de vapor saturado a presión y es uno de los agentes más
utilizados, ya que favorece la penetración más rápida de calor a la célula
provocando coagulación de las proteínas.

● Calor seco:
Provoca que los componentes celulares vitales se oxiden. Se utiliza en materiales
como vidrio, cajas de petri, pipetas, instrumentos quirúrgicos, etc.

● Filtración:
El uso de filtros bacteriológicos es útil cuando se requiera esterilizar sustancias
termolábiles como vitaminas o aminoácidos.

● Incineración:
El uso es limitado como en la esterilización de asa microbiológica, cadáveres de
animales de laboratorio, desechos de hospitales, etc.
Se debe contar con un incinerador y requiere especificaciones y recursos legales
para su uso ya que genera contaminación.

● Flameado:
Se usa material inerte, generalmente metálico mediante la aplicación de alcohol al
cual se le prende fuego con lo que la llama estará durante unos pocos minutos
sobre los objetos por esterilizar.
(Olivas, 2004).

Cinética de muerte térmica de microorganismos

La esterilización térmica está basada en el hecho de que las enzimas necesarias
para mantener la vida de los microorganismos son inactivadas a altas temperaturas.
Este proceso de degradación de enzimas no es instantáneo pero se puede asumir
que se lleva a cabo, al igual que cualquier otra reacción química, a una velocidad
que está en función de la temperatura y energía de activación (Goldberg, 1997).

La muerte térmica de microorganismos se ajusta muy a menudo a una cinética de

primer orden, por lo que, la destrucción de microorganismos por acción del calor
está dada por:

ecuación 1.

Donde N es el número de microorganismos vivos en cada momento en cualquiera

de sus formas (células o células/mL) y kd es la constante cinética de muerte térmica
a temperatura T.

Con el transcurso del tiempo, la concentración de células disminuye hasta un punto

donde no hay células (cero o muy cercano al cero).
 Figura 1. Proceso térmico de destrucción microbiana a una temperatura T.

OBJETIVOS

General:
● Determinar la constante de muerte térmica, Kd a diferentes temperaturas
dentro de un periodo del tiempo.

Específicos:
● Aplicar procedimientos de esterilización para medios del cultivo
● Diseñar un filtro del aire empacado
● Aplicar procedimientos para la esterilización de filtros del aire empacados

MATERIALES, EQUIPO Y REACTIVOS.

● Campana de flujo laminar
● Balanza analitica
● Olla de esterilización
● Incubadora para placas de agar a 35° C
● Baño María a 50 °C
● 4 parrillas de calentamiento y agitación
● Agitador orbital a 35°C y 250 rpm con base para 4 matraces de 500mL
● Bomba de aire tipo pecera
● 4 micropipetas del 1000μL
● Agar nutritivo
● Caldo nutritivo
● NaCl
● 14 matraces ErlenMeyer de 500mL
● 80 cajas de Petri desechables y estÉriles
● 4 racks con punta para micropipeta de 1000μL
● 4 barras magnéticas
● 150 tubos eppendorf de 1.5mL
● 4 pliegos del papel filtro
● Gasa doble para 10 matraces
● 25 ligas amarillas
● 16 Frascos de jugo limpios y con tapa, de 250 mL
● 4 Varillas de vidrio en L (varilla y cortador de vidrio)
● 2 mecheros Fisher
● 2 mecheros de bunsen
● Agua destilada
● 4 espátulas
● 8 charolas para pesado
● 1 L de alcohol etílico al 70%
● 4 probetas de 100 mL
● 4 probetas de 250 mL
● 1 paquete de algodón y 100 g de fibra de vidrio
● 1 cerillos. cofias y cubrebocas, guantes térmicos y tijeras

METODOLOGÍA

A) Preparación del placas y agar nutritivo

B) Esterilización de medio del cultivo en matraces

C) Diseño del filtro del aire empacado

D) Esterilización de filtro del aire

Discusión y Resultados

A continuación se muestran los resultados de las cajas petri incubadas con medio
ajo diferentes condiciones: las primeras cajas petri fueron incubadas con medio
nutritivo sin esterilizar, las siguientes cajas se inocularon con medio estéril sin airear
con el filtro diseñado, y las últimas cajas tienen medio estéril y aireado después con
el filtro de aire diseñado en la práctica.

Cajas petri con medio sin esterilizar

Tabla 1.- Resultados de las UFC/mL con el medio antes de esterilizar.

Fecha Jueves 20 de Septiembre

Hora 5:00 pm aproximadamente

Temperatura de incubación 35 °C

μL sembrados 250

Observaciones de las diluciones

(núm. de lectura)
Dilución 10−3
Colonias: Incontables, contaminado.

Dilución (duplicado) 10−3

Colonias: Aplicando el criterio del
cuadrante hay aproximadamente 200
colonias.
 Dilución 10−5
Colonias: Incontable

Dilución (duplicado) 10−5

Colonias: Incontable

Resultados en UFC/ mL UFC N o. de colonias por placa * f actor de dilución

mL = mL de la muestra inoculada

→ factor de dilución: inversa de la dilución

−3
*​Dilución 10
UFC
mL = incontable

*Dilución (duplicado) 10−3

UFC 200*1000 UFC
mL = 0.25 mL = 800, 000 mL
 *Dilución 10−5
UFC
mL = incontable

*Dilución (duplicado) 10−5

UFC
mL = incontable

Cajas petri con medio estéril sin aireación

Tabla 2.- Resultados de las UFC/mL con el medio esterilizado.

Fecha Jueves 20 de Septiembre

Hora 6:15 pm

Temperatura de incubación 35 °C

μL sembrados 250

Observaciones de las diluciones

(núm. de lectura)

Dilución 100
Colonias : 2
Dilución (duplicado) 100
Colonias :1

Dilución 10−2
Colonias : 0

Dilución (duplicado) 10−2

Colonias : 0
Resultados en UFC/ mL UFC N o. de colonias por placa * f actor de diluci
mL = mL de la muestra inoculada

→ factor de dilución: inversa de la

dilución

0
*​Dilución 10
UFC 2 UFC
mL = 0.25 mL = 8 mL

*Dilución (duplicado) 100

UFC 1 UFC
mL = 0.25 mL = 4 mL

*Dilución 10−2
UFC 0*100 UFC
mL = 0.25 mL = 0 mL

*Dilución (duplicado) 10−2

UFC 0*100 UFC
mL = 0.25 mL = 0 mL
Cajas petri con medio estéril aireadas por medio del filtro diseñado en la práctica

Tabla 3.- Resultados de las UFC/mL con el medio aireado.

Fecha Jueves 20 de Septiembre

Hora 7:00 p.m.

Temperatura de incubación 35 °C

μL sembrados 250

Observaciones de las diluciones

(núm. de lectura)

Dilución 100
Colonias: 10

Dilución (duplicado) 100

Colonias: 1
Resultados en UFC/ mL UFC N o. de colonias por placa * f actor de diluci
mL = mL de la muestra inoculada

→ factor de dilución: inversa de la

dilución

0
*​Dilución 10
UFC 10 UFC
mL = 0.25 mL = 40 mL

*Dilución (duplicado) 100

UFC 1 UFC
mL = 0.25 mL = 4 mL

Los datos que se mostraron en las tablas anteriores, se compilan en la siguiente

tablas para una mejor visualización de las colonias formadas en cada condición:

Tabla 4.- Resultados de todas las placas y sus respectivas UFC/mL

Los materiales de origen biológico por lo general no son tan estables como la mayor
parte de los materiales inorgánicos y algunos de los orgánicos. Por consiguiente, es
necesario utilizar ciertos métodos de procesamiento para preservar los materiales
biológicos, especialmente los alimentos. Se pueden emplear métodos de
procesamiento físicos y químicos para la preservación, como secado, ahumado,
salado, refrigerado, congelado y calentado.

Un método importante es el procesamiento por calor o térmico, que destruye los

microorganismos contaminantes que aparecen en primer lugar en la superficie
externa de los alimentos y causan la descomposición de éstos y problemas de
salud. (Geankoplis, 2006).
Cálculo de la muerte térmica

A partir de la integración de la ecuación 1. utilizando N 0 como población inicial en el

tiempo t=0, obtenemos lo siguiente:

N t
∫ dN
N =− k ∫ dt → lnN − lnN 0 =− k t
N0 0
o también puede expresarse como:

ln NN = −kt
2.303
0

Esta última expresión es una ecuación de una línea recta, y gráficamente queda de
la siguiente manera:

Figura 2. Población microbiana en el tiempo para una temperatura T, también llamada curva de
inactivación (Olin, 2015).

donde:
k
b = lnN 0 m =− 2.303

Sin embargo, existe otra ecuación que describe el efecto de la temperatura sobre la
constante de la velocidad de reacción k, ecuación tipo Arrhenius:
 K d = A * e(−Ed / RT )
Donde:

kd = Constante de muerte [=] min^-1

A = Constante de Arrhenius (4.93x10^37 min^-1)*

Ed = Energía de activación

R = Constante universal de los gases ideales (0.0098 Kcal/mol K)

T = Temperatura (K)

−283 kJ ( 1000 mol )

mol 1 Kmol
37 ( )
−1 ) e 8.3145 KJ (398 K)
K​d =
​ ( 4.97x10 min * Kmol K

K d = 3.5936 min−1

Los microorganismos mueren rápidamente cuando son sometidos a temperaturas

superiores a su óptima de crecimiento. Esto permite utilizar altas temperaturas para
eliminar microorganismos por termodestrucción. Los métodos basados en el calor
son quizá los más utilizados para controlar el crecimiento microbiano.
La sensibilidad de los diferentes tipos de microorganismos a los tratamientos
térmicos es distinta; las esporas son la forma más termorresistente y las células
vegetativas las más sensibles, por lo que desde un punto de vista práctico, la
esterilización por calor está destinada a matar esporas bacterianas (Brock, 2004).

Para conocer el valor de Ed, ya que no se conoce qué cepa de microorganismo es

la que creció en las cajas, se hizo uso de un indicador biológico. Estos indicadores
son dispositivos preparados de esporas no patógenas y altamente resistentes a los
procesos de esterilización y por lo tanto son útiles y eficaces para establecer la
capacidad del ciclo de esterilización para destruir microorganismos específicos. En
la práctica se utilizó como indicador la espora ​Bacillus stearothermophilus, l​ a cual
tiene un valor de Ed = 283 kJ/mol​ (​ Rutala, 2002).
Un indicador biológico será positivo cuando exista un fallo en el proceso de
esterilización. Un fallo en el proceso de esterilización incluye un mal funcionamiento
del esterilizador, la calidad del vapor, si la humedad relativa del área de
procesamiento no es la adecuada, el tipo y método de empaquetado, la
configuración de la carga y si los parámetros del ciclo no son apropiados para la
carga a esterilizar (Rutala, 2002).

El autoclave esteriliza usando calor húmedo transmitido por vapor de agua

sobrecalentado debido al uso de altas presiones; el efecto del vapor de agua es
facilitar la transmisión del calor al objeto en esterilización. El procedimiento usual es
usar 121°C para lo que es necesaria una presión de 1.1 kg/cm2 . En estas
condiciones un tratamiento de 15 min es suficiente para eliminar las esporas
Gram-positivas.

CONCLUSIÓN

Con la esterilización mediante calor húmedo se obtuvo una eficacia muy alta, debido
a que sólo se presentaron 2 colonias cuando se inoculó la muestra esterilizada, esto
se debe a que ni los microorganismo más termoresistentes soportan la temperatura
a la que se expuso en la olla de presión (120 °C aproximadamente) durante 15
minutos.

Por otro lado el filtro de aire que se realizó no tuvo los mismos resultados, ya que su
única opción de esterilizar es mediante la retención de partículas debido a la
pequeños diámetros de porosidades que el mismo presenta, es decir, fueron
aquellos microorganismos y bacterias más pequeñas las que evitaron que se
obtuviera la esterilidad en el filtro de aire, por lo que se concluye que se necesita
tener un filtro más compacto para así obtener porosidades de menos tamaño
evitando fugas de aquello que no se desea en el producto final.

CUESTIONARIO POST-LABORATORIO
1.- ¿Cómo se realiza esterilización en continuo en biorreactores?
Se realiza a alta temperatura, en tiempos cortos de exposición, lo que ayuda a
reducir el daño térmico al medio comparado con la esterilización en lotes, mientras
se adquieren altos niveles de destrucción celular. Se puede realizar con la inyección
continua de vapor y un enfriador flash o con una transferencia de calor utilizado
intercambiadores de calor.

2.- Menciona cinco principales causas de contaminación de biorreactores

- Los materiales de los que está hecho el biorreactor.
- El diseño del biorreactor promueve lugares que el vapor no puede alcanzar
o lugares que promueven el crecimiento de microorganismos externos.
- Mala esterilización de aire.
- Válvulas y conexiones inadecuadas.
-Tiempos y temperaturas insuficientes para lograr un cierto grado de
esterilidad.

3.- Apoyándose en la figura, mencionar que criterios de diseño de asepsia se

aplican en cada parte de un biorreactor.

La mayoría de las partes internas del biorreactor se esterilizan con ayuda

de vapor para después agregar aire estéril para mantener la presión
interna y evitar contaminaciones por microorganismos en el aire. Las
válvulas y conexiones son diseñadas para evitar la aglomeración de
medio y de microorganismos que se puedan formar en ellas. Las partes
donde se inserta el propulsor deben de ser sellables y que resistan el
movimiento del propulsor en sus largos periodos de operación. Los
sistemas de toma de muestra también son esterilizados con vapor.
REFERENCIAS

● Brock, T. D. (2004). ​Brock biología de los microorganismos. Pearson

Educación.
● Geankoplis, C. (2006). “PROCESOS DE TRANSPORTE Y PRINCIPIOS , DE
PROCESOS DE SEPARACIÓN)”. CECSA. Cuarta edición. México.
● Olin Pachari, C. M. (2015). ​DISEÑO E IMPLEMENTACIÓN DE UN SISTEMA
PARA LA EVALUACIÓN DEL TRATAMIENTO TÉRMICO DE ALIMENTOS
ENVASADOS​. Obtenido de ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA
FÍSICA: http://cybertesis.uni.edu.pe/bitstream/uni/2541/1/olin_pc.pdf
● Rutala WA, Jones SM, Weber DJ, (2002) Comparación de una lectura rápida
de indicadores biológicos para la esterilización por vapor, con cuatro
indicadores convencionales de cinco indicadores biológicos y químicos. Infect
Control Hosp Epidemiol
1996:17:423-8.http://www.sterileservice.com.mx/files/INDICADORES.pdf