Tecnicas - Analisis - Baja Sin Ind Analitico - 0789 PDF

19.
crOMaTOGrafía líQUida de alTa

resOlUción (HPlc)
FranCisCo J. Plou GasCa
PaMela torres salas
Instituto de Catálisis y Petroleoquímica (CsiC)
19.1. inTrOdUcción
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es la técnica analítica de se-

paración más utilizada, con ventas millonarias cada año tanto de equipos como de
consumibles.
La cromatografía, descrita por primera vez en 1906 por el italiano nacido en Ru-
sia Mikhail Tswett, se utilizó inicialmente para separar pigmentos vegetales, clorofi-
las y xantofilas, mediante el empleo de un tubo de vidrio (en vertical) relleno de
carbonato cálcico en polvo (fase estacionaria) y usando éter como eluyente (fase
móvil). La solución recorrió el tubo, y los componentes individuales de la mezcla
migraron hacia abajo con diferentes velocidades; la columna quedó marcada con
bandas horizontales de distintos colores correspondientes a pigmentos diferentes. El
resultado fue llamado cromatograma, justificando el nombre que se dio a la técnica:
chroma, del griego, que significa «color», y graphein, que significa «escribir».
Casi veinte años pasaron sin que esta técnica, que prometía simplificar la separa-
ción de mezclas complejas, fuera utilizada. En 1931, Kuhn y Lederer utilizaron la
cromatografía líquida para separar muchos productos naturales. En 1952, Martin y
Synge introdujeron la cromatografía de reparto, empezando a utilizar el concepto de
la distribución y coeficiente de reparto en la separación de mezclas de aminoácidos,
lo que les valió el premio Nobel de Química en 1952. En sus comienzos, la cromato-
grafía líquida utilizaba columnas de vidrio de 50-500 cm de longitud y 1-5 cm de
diámetro, con rellenos de 150-200 µm para asegurar un caudal adecuado (del orden
de microlitros por minuto).
Stahl, en 1956, interesado en la separación de los componentes de las células, di-
señó un aparato que aplicaba capas de adsorbente en placas, llamándolo cromatogra-
fía de capa delgada o fina. En la década de los sesenta, se desarrolló la tecnología que
permite utilizar rellenos con diámetro de partícula de 3-10 µm, que generaban altas
presiones de trabajo. El avance posterior en fabricación de columnas, rellenos y de-
tectores en continuo permitió el nacimiento de la cromatografía líquida de alta pre-
sión (HPLC: high-pressure liquid chromatography), luego denominada de alta reso-
788 Técnicas de análisis y caracterización de materiales
lución (HPLC: high-performance liquid chromatography), nombre que se propuso

para distinguir esta nueva tecnología de los clásicos métodos de cromatografía líquida
a presión atmosférica, que se siguen utilizando con fines preparativos.
Desde entonces la cromatografía líquida de alta resolución viene desarrollándose a
pasos agigantados, debido principalmente a su versatilidad, alta sensibilidad, fácil
adaptabilidad, precisión, la posibilidad de utilizar especies no volátiles o inestables
térmicamente, y su gran aplicabilidad a sustancias de interés para la industria, la in-
vestigación y en general para la sociedad actual. Ejemplos significativos de aplicacio-
nes de la cromatografía HPLC los constituyen el análisis de aminoácidos, proteínas,
fármacos, biocombustibles, drogas, hidratos de carbono, grasas, pesticidas, contami-
nantes alimenticios, antibióticos, vitaminas o efluentes.
En el contexto del libro Técnicas de análisis y caracterización de materiales la
cromatografía HPLC es una técnica instrumental que puede utilizarse para, entre
otras cosas, analizar determinados componentes presentes en un material, o medir la
actividad catalítica de un material analizando el consumo de sustratos o la aparición
de los productos de reacción.
19.2. cOMPOnenTes de Un eQUiPO de HPlc
Todo equipo de cromatografía líquida de alta resolución debe disponer de, al me-
nos, los siguientes módulos (Figura 19.1):
1. Reservorios o botellas para la fase móvil.
2. Sistema de bombeo.
3. Inyector (manual o automático).
4. Columna.
5. Uno o varios detectores en serie.
6. Sistema de tratamiento de resultados.
7. Botella para residuos.
4 7
W
3
C
B 2
A 6
Figura 19.1. Principales componentes de un equipo de HPLC: (1) reservorios; (2) bomba;
(3) inyector automático con diferentes carruseles de muestras; (4) columna cromatográfica;
(5) detectores en serie; (6) sistema de tratamiento de datos; (7) botella para desechos.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) 789
Existen otros módulos complementarios, a veces necesarios para la aplicación,

como son el horno de columnas, un desgasificador, un colector de fracciones para
cromatografía preparativa, divisores de flujo, etc. así como una serie de pequeños
accesorios (soportes de la columna, restrictores de presión a la salida del detector,
filtros intermedios, etc.). A continuación se indican las principales características de
los componentes de un equipo de HPLC.
19.2.1. reservorios y fases móviles

Los reservorios utilizados para las fases móviles van desde el sencillo frasco de di-
solvente hasta los sistemas más complejos capaces de filtrar, desgasificar, mantener
una atmósfera inerte, termostatizar, agitar, etc. Su boca ha de ser lo más estrecha posi-
ble para evitar la evaporación del disolvente, especialmente cuando se emplean mez-
clas en las que no todos los componentes son igualmente volátiles, ya que puede alte-
rarse la composición de la fase móvil. El vidrio suele ser el material más utilizado. El
reservorio ha de taparse, para evitar la entrada de polvo. A través del tapón discurre el
tubo (generalmente de teflón) que conduce la fase móvil al sistema de bombeo. Este
tubo suele tener en su extremo un filtro de titanio de 10 µm de poro, que evita el paso
hacia el equipo cromatográfico de partículas sólidas que pueda contener la fase móvil.
Los equipos modernos de HPLC suelen incorporar 2-4 reservorios (con una capaci-
dad típica de 1.000 ml cada uno) que permiten la preparación automatizada de mezclas
de disolventes como fase móvil o la formación de los correspondientes gradientes.
Suelen estar provistos de un sistema para eliminar los gases disueltos (que pueden ge-
nerar nefastos efectos sobre la bomba, la columna o el detector). Lo más habitual suele
ser el bombeo de un gas inerte (típicamente Helio) en forma de pequeñas burbujas para
desplazar el aire, y en algunos casos se emplean desgasificadores automatizados en lí-
nea. En la Tabla 19.1 se resumen las principales precauciones que deben adoptarse con
respecto a la fase móvil para el correcto funcionamiento del sistema de HPLC.
Tabla 19.1. acciOnes QUe deben realizarse cOn la fase Móvil

acción cuando
Filtrar Siempre. Utilizar filtros de 0,45 µm1
Desgasificar Indispensable para equipos con gradientes en baja presión
Refrigerar Disolventes de bajo punto de ebullición.
Termostatizar Fases móviles muy viscosas
Desoxigenar Fases móviles o muestras oxidables
Agitación Fases móviles formadas por solventes poco miscibles
1
No deben emplearse filtros de acetato de celulosa cuando el disolvente es acetonitrilo
Algunos de los disolventes más utilizados en HPLC son: agua, metanol, acetonitri-
lo, tetrahidrofurano, isopropanol, diclorometano y hexano. Es muy importante elegir
disolventes con una pureza adecuada para cromatografía líquida. Además, cuando se
emplean detectores fotométricos (Uv-vIS) es fundamental conocer la longitud de
onda a partir de la cual el disolvente no interfiere con la señal del detector (UV-Cutoff).
Otras propiedades físico-químicas de los disolventes con una singular importancia en

HPLC son: su viscosidad (que afecta de manera notable a la presión de trabajo), su
polaridad (que determinará su poder de elución o fuerza elutrópica) y su miscibilidad
con otros disolventes (Figura 19.2).
n-pentano miscible
hexano
isooctano inmiscible
ciclohexano
xileno
éter isopropílico
cloroformo
diclorometano
tetrahidrofurano
acetona
dioxano
acetato de etilo
acetonitrilo
n-propanol
etanol
metanol
agua
Figura 19.2. Miscibilidad de los disolventes más comúnmente utilizados en HPLC.
19.2.2. sistemas de bombeo. Gradientes en alta y baja presión

Se denomina bomba cromatográfica al dispositivo capaz de proporcionar a la
fase móvil la presión necesaria para atravesar, al flujo seleccionado, la columna y el
resto del sistema. Las principales características que debe reunir una bomba HPLC
convencional (escala analítica) son dos: la obtención de flujos de 0,1 a 5,0 ml/min y
la capacidad de trabajar a presiones de hasta 6.000 psi (400 bar). El flujo proporcio-
nado por la bomba debe ser, como cualquier otro valor analítico, lo más exacto y
preciso posible (con una desviación estándar inferior al 0,5%). Además, es conve-
niente que los componentes de la bomba sean resistentes a la corrosión.
Las bombas en HPLC son en su mayoría de flujo constante, y operan a la presión
que sistema cromatográfico y columna determinan. En particular, se suelen utilizar
generalmente bombas de pistón y solo en algunos casos bombas de jeringa.
En las bombas de pistón, un dispositivo eléctrico actúa sobre el pistón que entra en
una cámara donde se halla el disolvente, para comprimirlo y enviarlo a presión al resto
del sistema. El flujo deseado se mide y alcanza en función del número de emboladas
por unidad de tiempo. El principal inconveniente de las bombas de pistón simple es la
aparición de oscilaciones en la línea base por cada embolada. Para evitarlo se suele re-
currir a bombas con dos pistones en paralelo, o bombas con dos pistones en serie. Ade-
más, es habitual disponer de un atenuador de pulsos (damper) a la salida de la bomba.
Los parámetros fundamentales que caracterizan una bomba HPLC son el rango y
la precisión del caudal, su capacidad de mezcla, y la precisión de la mezcla. Por otro
lado, los principales problemas que puede presentar una bomba son:
– Ruido de flujo: la línea base siempre presenta ruido, que se conoce como rizado.
Las causas de un rizado excesivo de la línea base pueden ser eventuales (bur-
bujas, fugas, mal ajuste de los pistones, compresibilidad del disolvente em-
pleado, etc.), constantes (rozamiento mecánico de las partes internas de la
bomba, holgura entre las piezas móviles de la bomba) o ajenas a la bomba
(sensor de presión, detector, sistema de registro, etc.).
– Error de flujo: esto ocurre cuando el flujo real es distinto al estipulado. Puede ser
debido a la presencia de burbujas (por no desgasificar correctamente la fase mó-
vil) o a la existencia de fugas en algún punto del sistema. También puede ser
consecuencia de la presencia de partículas sólidas en el disolvente (mal filtrado).
Cuando la composición de la fase móvil no se modifica durante el análisis, se ha-
bla de un sistema de bombeo isocrático. No obstante, suele ser conveniente disponer
de bombas capaces de proporcionar gradientes, especialmente para resolver mezclas
de sustancias de polaridad dispar. En la Figura 19.3 se muestra la separación de los
componentes de una reacción test de síntesis de biodiésel, observándose que el trigli-
cérido (trilaurina) eluye 15 min más tarde que el diglicérido (1,2-dilaurina) y el resto
de sustancias más polares de la muestra, bajo condiciones isocráticas. Este hecho su-
pone un tiempo de análisis excesivo con el consiguiente consumo de disolventes.
Para la formación de gradientes se disponen varios reservorios con distintas fases
0.10
3 1 Glicerol
2 1-Monolaurina
3 Laurato de metilo
0.08
Señal del detector (Abs 216 nm)
4 1, 2-Dilaurina
5 Trilaurina
0.06
2
1 4
0.04
0.02
5
0.00
0 5 10 15 20 25
Tiempo de retención (min)
Figura 19.3. Separación de los componentes de una reacción test de obtención de biodiésel empleando
condiciones isocráticas. Columna Mediterránea C18 Teknokroma (150 × 4,6 mm), 5 µm.
Fase móvil: metanol/H2O 95/5. Flujo: 1,2 ml/min. Temperatura: 45 °C. Detección por ELSD.
móviles, y la bomba varía la proporción relativa de los distintos componentes con el

tiempo. La elución mediante gradientes produce efectos similares a los obtenidos
con una programación de una rampa de temperatura en cromatografía de gases.
Existen dos posibilidades a la hora de realizar un gradiente en HPLC: mezcla a
alta presión y mezcla a baja presión (Figura 19.4). En alta presión, se utiliza una
bomba para cada componente de la fase móvil y una cámara de mezcla; esta cámara
está situada entre las bombas y el inyector, es decir, en el lado de alta presión de la
bomba. En baja presión, una válvula (proportioning valve) controla la composición
de la mezcla abriendo la entrada de cada eluyente durante un tiempo proporcional a
la composición deseada; la mezcla se realiza en una cámara situada entre la válvula y
la bomba, es decir, en la zona donde todavía no hay presión.
Mezcla a baja presión Mezcla a alta presión
Bomba A
Bomba Columna Columna
C D
D Inyector
C
Inyector
Cámara de Cámara de
A B
mezcla mezcla
Bomba B
A B
Figura 19.4. Formación de gradientes en alta y baja presión.
Los parámetros que hay que considerar cuando se programan gradientes son el
tiempo de equilibrado, la miscibilidad de los disolventes y su pureza, la realización
de blancos, la reproducibilidad de tiempos/áreas y la compatibilidad con el detector.
En la Tabla 19.2 se comparan las propiedades de ambos tipos de gradientes.
El volumen de sistema (dwell volume), también denominado volumen de retraso
del gradiente, es el volumen medido desde el punto de mezcla de los disolventes
hasta la entrada en la columna. Puede oscilar desde un valor típico de 50 µl para gra-
dientes en alta presión hasta 5 ml en el caso de baja presión. El volumen de sistema
es muy importante para: (1) calcular el tiempo que tardan los cambios de gradiente
en llegar a la columna, (2) calcular el volumen necesario para el equilibrado del sis-
tema entre inyecciones, y (3) ajustar un método de gradiente entre distintos equipos.
Tabla 19.2. cOMParación de GradienTes en alTa y baja Presión

Parámetro alta presión baja presión
Requerimientos técnicos Dos o más bombas Una única bomba
Calidad de la mezcla Buena Buena
Desgasificación de las fases móviles No necesaria Imprescindible
Flujos bajos No adecuado Adecuado
Porcentajes bajos de algún disolvente Adecuado No adecuado
volumen de sistema Pequeño Grande (> 1 ml)
19.2.3. inyectores
El inyector es un dispositivo hermético que se encuentra situado a la salida de la

bomba y que permite, mediante el empleo de válvulas, incorporar la muestra a la
fase móvil antes de la columna, sin pérdidas de presión que alteren el flujo constante
proporcionado por la bomba.
Los inyectores de válvulas, conocidos como inyectores de bucle (loop), se utili-
zan prácticamente en el 100% de los cromatógrafos, destacando por la precisión de
la inyección y el mantenimiento de la presión de la bomba, siendo sus partes internas
fácilmente reemplazables. Resisten presiones de hasta 7.000 psi.
Los inyectores pueden ser manuales y automáticos. En los manuales, se puede
cambiar fácilmente el bucle (loop), que es el que nos determina el volumen de mues-
tra que entra en la columna. Existen loops desde 5 µl hasta 5 ml (para HPLC semi-
preparativo). Es conveniente llenar bien el loop cargando un volumen de muestra de
al menos 3 veces su volumen. Una vez lleno, se gira la válvula 1/6 de vuelta, lo que
permite la introducción de la muestra a la columna.
Los inyectores automáticos o automuestreadores trabajan de manera similar a los
inyectores de bucles, permitiendo variar el rango de volumen inyectado. Los auto-
muestreadores suelen disponer de termostatización, y presentan una mayor precisión
que los manuales, optimizando el rendimiento del equipo HPLC. Algunos paráme-
tros importantes que deben valorarse cuando se adquiere un inyector automático son:
mínimo volumen interno, ausencia de contaminación cruzada, corto tiempo de equi-
librado, termostatización (factor importante dependiendo de la naturaleza de las
muestras a analizar). La posibilidad de utilizar placas multipocillo en lugar de viales
es otro de los aspectos a considerar.
En cuanto a los viales, existen innumerables posibilidades dependiendo del mate-
rial de fabricación (plástico, vidrio ámbar o transparente, etc.), tipo de boca (encapsu-
lable, roscada, etc.), composición del septum (silicona, PTFE —teflón—, o mezclas
de ambos), volumen (0,3-20 ml), presencia de inserto para muestras de volúmenes
reducidos, etc.
19.2.4. Tubos de conexión
Los tubos capilares que se utilizan en HPLC para conectar los distintos com-
ponentes del cromatógrafo tienen un diámetro externo de 1/16’’ (1,59 mm). Como
regla general, se recomienda utilizar tubo no muy capilar (aprox. 1 mm de diáme-
tro interno) hasta el inyector —para que ofrezca la menor resistencia al flujo—,
pero después de él, una vez que la muestra entra en contacto con el sistema cro-
matográfico, el tubo ha de ser del menor diámetro interno posible (por ejemplo,
0,2 mm de diámetro interno) para evitar la difusión de los analitos y el ensancha-
miento de los picos. El tubo ha de continuar siendo capilar entre la salida de co-
lumna y el detector, para que los picos sigan tan separados como la columna per-
mite. En la Tabla 19.3 se recogen los diámetros y volúmenes de los tubos
utilizados en HPLC.
Tabla 19.3. caracTerísTicas de lOs TUbOs UTilizadOs en HPlc
diámetro interno
Posición volumen
pulgadas mm
Antes del inyector 0,040 1,0 0,8 ml/m
Después del inyector 0,009 0,2 50 µl/m
Los tubos utilizados en HPLC pueden estar fabricados de:

1. Metal: suele ser acero inoxidable 316, que es un material estándar, fácil de
doblar, no se obtura ni quiebra, y que se puede fabricar prácticamente en cual-
quier rango de diámetros interno y externo. Otros metales utilizados son: ni-
tronic 50, níquel 200, EFNI (electroformed nickel), hastelloy C-22 (aleación
de níquel, cromo y molibdeno), inconel 600, Titanio, etc.
2. Teflón (PTFE, politetrafluoroetileno): es muy resistente químicamente, pero
no tanto frente a las altas presiones o temperaturas. Es rígido, difícil de mani-
pular, y poroso.
3. PeeK (poliéter éter cetona): es el polímero inerte y biocompatible por exce-
lencia. Presenta excelente resistencia química, térmica y a las altas presiones
(hasta 5.000 psi, 300 bar). Solo es atacado por dimetilsulfóxido, THF, dicloro-
metano y ácidos sulfúrico y nítrico concentrados.
Es conveniente utilizar uniones y tubos del mismo material; por ejemplo, al com-
binar uniones de acero con tubo capilar de PEEK se corre el riesgo de que este último
se dañe. Las uniones de acero suelen llevar una férula y un cono por separado, por lo
que necesitan herramientas para su fijación. Por el contrario, las uniones de plástico
suelen venir con la férula integrada, se enroscan a mano y son además reutilizables.
19.2.5. columnas y fases estacionarias

La columna es la parte más importante del sistema cromatográfico, aunque su
precio corresponde a no más del 1-5% del coste total del equipo. Las variables im-
portantes a considerar en una columna HPLC, además de la naturaleza química de su
fase estacionaria, son su longitud, diámetro, el tamaño de partícula, así como el diá-
metro de poro y la homogeneidad entre las partículas.
La carcasa de las columnas suele ser de acero inoxidable, ya que se trata de un
material inerte, resistente a las altas presiones y con el interior liso, aunque también
existen columnas de vidrio, PEEK e incluso de polietileno flexible.
Es importante utilizar una columna con una longitud suficiente para separar los
compuestos de interés. El empleo de una columna más larga de lo necesario implica un
mayor consumo de disolvente y de horas de trabajo. Las columnas más habituales para
HPLC analítica tienen longitudes entre 10 y 30 cm. A veces se acoplan 2 o más columnas
en serie para mejorar la resolución. En cuanto al diámetro de las columnas de HPLC,
para columnas analíticas este suele ser de 4-5 mm; este diámetro es un compromiso
entre el consumo de disolvente, el tiempo de análisis y la resolución cromatográfica.
Para el correcto almacenaje de las columnas, estas deben guardarse con sus pro-
pias tuercas en un lugar protegido de la humedad ambiental y de las temperaturas
extremas. No deben golpearse, y si se utilizaron tampones o sales en las fases móvi-
les, hay que desplazarlos antes de almacenarlas, empleando los disolventes adecua-
dos. En el caso de que se guarden en mezclas de disolventes que contengan agua, la
concentración de esta no debe ser muy alta, evitando así el crecimiento de microor-
ganismos en el interior de la columna.
Por otro lado, suele ser necesario controlar la temperatura de la columna. Así, la
mayoría de los equipos de HPLC suelen incorporar un horno que permite mantener la
temperatura de la columna en el rango 20-100 ºC. En algunos casos, el controlador de
temperatura del detector se puede utilizar como controlador de temperatura del horno.
Las primeras fases estacionarias estaban formadas por partículas de 35 a 70 µm, po-
rosas, que proporcionaban no más de 3.000 platos teóricos por metro. Hoy se alcanzan
hasta 80.000 platos teóricos por metro, con rellenos de 5 µm o menores. Una primera
exigencia para la fase estacionaria es su estabilidad y resistencia a las altas presiones. En
la década de los ochenta, se sintetizaron sílices con una mejor distribución de grupos
silanol-activos y menor cantidad de grupos silanol libres. En los noventa aparecieron
columnas específicas para resolver problemas cromatográficos complejos. También se
desarrolló la cromatografía de exclusión molecular, para purificar biomoléculas y polí-
meros. En la Tabla 19.4 se recopilan los principales proveedores de columnas de HPLC.
Tabla 19.4. PrinciPales PrOveedOres de cOlUMnas de HPlc

Proveedor dirección web
Agilent http://www.agilent.com
Alltech http://www.alltech.com
Análisis vínicos http://analisisvinicos.com
BIA Separations http://www.biaseparations.com
Bio-Rad http://www.bio-rad.com
Chiral Technologies Europe http://www.chiral.fr
Dionex http://www.dionex.com
Grace Davison http://www.discoverysciences.com
Merck http://www.merck-chemicals.com/chromatography
Metrohm http://www.metrohm.com
Phenomenex http://www.phenomenex.com
Restek http://www.restek.com
Shimadzu http://www.shimadzu.com
Supelco http://www.sigmaaldrich.com
Showa Denko (Shodex) http://www.shodex.com
Teknokroma http://www.teknokroma.es
Thermo Scientific http://www.thermo.com
Tosoh Bioscience http://www.tosohbioscience.com
varian http://www.varianinc.com
Waters http://www.waters.com
El empleo de partículas pequeñas da lugar a mayores presiones de trabajo y,

en consecuencia, a un menor tiempo de vida de la columna; sin embargo, la efica-
cia de la separación cromatográfica aumenta considerablemente. En cromatogra-
fía analítica suelen emplearse rellenos de 5 µm (aunque la tendencia actual es
usar partículas de menor tamaño, generalmente 3 μm), mientras que para croma-
tografía semipreparativa y preparativa lo más habitual es hacer uso de rellenos de
al menos 10 µm. En todos los casos es fundamental que la distribución del tama-
ño de partícula sea lo más estrecha posible. La cromatografía ultra-rápida (UPLC,
ver apartado 19.6) ha irrumpido con fuerza en el campo de la cromatografía
HPLC, haciendo uso de columnas más pequeñas que las convencionales, pero con
una gran resolución (aproximadamente 200.000 platos/metro). Suelen tener diá-
metros internos entre 1,0-4,6 mm, con partículas de menos de 2 µm y longitudes
de 3,0 a 7,5 cm. Tienen la ventaja de la rapidez de la separación y el menor consu-
mo de disolvente.
En función de su composición, las fases estacionarias que se utilizan en HPLC
suelen ser de uno de estos tipos: (1) con base de sílice, (2) poliméricas (basadas en
estireno-divinilbenceno), e (3) híbridas, formadas por una combinación de las dos
anteriores. Las características que debe reunir una sílice para ser utilizada en HPLC
son: forma esférica, tamaño de partícula homogéneo, diámetro de poro superior a
5 nm (50 Å) y una alta superficie específica. Recientemente se han desarrollado las
columnas empaquetadas con fases monolíticas de sílice, en la cuales no existe un
empaquetamiento de partículas, sino un lecho poroso que llena el volumen de la
columna. Entre las ventajas principales de estas últimas destacan el rápido transpor-
te entre la fase estacionaria y la fase móvil, el mínimo volumen muerto, así como
una menor presión, lo que permite emplear caudales más altos y reducir el tiempo
de análisis.
Las columnas basadas en polímeros de estireno-divinilbenceno son muy emplea-
das en HPLC, existiendo rellenos de este tipo para las distintas clases de cromatogra-
fía (fase reversa, intercambio iónico, exclusión molecular, etc.). Se trata de columnas
muy estables en el rango de pH 1-13. No obstante, una limitación de estos rellenos
es que no deben superarse presiones de 1000 psi (69 bar).
Finalmente, las columnas híbridas, formadas por una mezcla de sílice con mate-
riales poliméricos (por ejemplo, XTerra® de Waters, Gemini® de Phenomenex, Pre-
vail® de Alltech, etc.), combinan las ventajas de la sílice (resistencia mecánica, re-
producibilidad, alta eficacia, etc.) con las de los polímeros (estabilidad frente al pH,
baja reactividad química, etc.).
La última innovación en rellenos de columnas consiste en la tecnología fused-
core, que consiste en el empleo de partículas de aprox. 2,7 µm formadas por un nú-
cleo no poroso de sílice de aprox. 1,7 µm, rodeado por una capa porosa de sílice de
0,5 µm. De esta manera, el núcleo sólido impide que los analitos difundan hasta el
centro de la partícula (fenómeno que ocurre con partículas totalmente porosas); este
hecho reduce el ensanchamiento de las bandas y aumenta la eficacia hasta llegar a
160.000 platos teóricos por metro, es decir, una eficacia ligeramente inferior a la que
se consigue con el empleo de partículas menores de 2 µm en cromatografía ultra-rá-
pida. Además, otra ventaja radica en que con columnas rellenas de fases estaciona-
rias fused-core pueden utilizarse equipos de HPLC convencionales, a presiones mo-
deradas, mientras que con partículas de diámetros menores o iguales de 2 µm es

necesario utilizar equipos especiales de cromatografía ultra-rápida (UPLC).
Hay una serie de fenómenos que pueden indicar el deterioro de una columna
HPLC, como son el aumento de presión, el desdoblamiento de picos, cambios en
los tiempos de retención, derivas en la línea base, etc. Es posible su regeneración
(parcial o total) siguiendo determinados protocolos. No obstante, el gasto en disol-
ventes y reactivos suele aconsejar en muchas ocasiones reemplazar la columna por
una nueva.
19.2.6. Precolumnas
La columna es delicada y puede perder eficiencia y resolución, muchas veces

irrecuperables, por ejemplo cuando se emplean disolventes indebidos o incompati-
bles, incluso en proporciones pequeñas. Las columnas HPLC llevan filtros a su en-
trada y salida, y conviene filtrar disolventes y muestras. A pesar de ello, es muy
conveniente incorporar una precolumna en el sistema.
Las precolumnas se disponen antes de la columna HPLC, aumentando la vida de
la columna cromatográfica. La precolumna retiene las partículas sólidas y otros con-
taminantes presentes en la fase móvil, así como otros componentes de la muestra que
se unen irreversiblemente a la fase estacionaria. Además, la sílice —que constituye
el relleno base de la mayoría de las columnas— puede disolverse lentamente en la
fase móvil. Wehrli demostró que «la cantidad de sílice disuelta, en partes por millón,
era aproximadamente equivalente al tanto por ciento de agua en el eluyente». Al in-
corporar la precolumna, la fase móvil, queda saturada en sílice y ya no es capaz de
disolver la sílice de la columna. Además, es importante considerar que a valores ba-
jos de pH puede hidrolizarse el enlace siloxano en fases enlazadas (ver apartado
19.4.2).
Es conveniente que la composición de la precolumna sea igual o lo más parecida
posible a la de la columna. Las funciones de la precolumna son, en definitiva, de di-
versa índole:
1. físicas: al incorporar dos filtros adicionales, atenúa los pulsos de la bomba

(damper).
2. Químicas: satura la fase móvil en fase estacionaria antes de que entre en la
columna.
3. Cromatográficas: el conjunto precolumna-columna tiene más eficiencia (pla-
tos teóricos).
4. económicas: alargan la vida de la columna.
Uno de los sistemas más atractivos en precolumnas es el de los cartuchos

intercambiables. Este tipo de dispositivos se enroscan fácilmente sobre la colum-
na, sin necesidad de herramientas. Además, la carcasa (holder) puede utilizarse
para fases estacionarias de distinta naturaleza simplemente cambiando el cartu-
cho desechable.
19.2.7. detectores
El detector cromatográfico debe caracterizarse por una gran sensibilidad, preci-

sión y linealidad. Es preferible que el detector no se vea afectado por cambios en la
composición de la fase móvil (gradientes), que tenga un tiempo de respuesta infe-
rior a 0,3 segundos y un volumen de celda lo más pequeño posible, de modo que no
contribuya al ensanchamiento de los picos. El volumen de celda del detector suele
ser de unos pocos microlitros, por lo que toma la forma de un tubo estrecho capilar
con un cierto ensanchamiento en la zona de medida, llamada microcámara. Es fun-
damental no sobrepasar los límites máximos de presión y caudal para cada tipo de
detector.
Los detectores pueden clasificarse en dos grandes grupos:
1. Detectores universales, que responden a cambios de una propiedad física ge-

neral de todos los analitos (por ejemplo, dispersión de la luz en los detectores
evaporativos de dispersión de luz o light-scattering) o una propiedad de la
fase móvil que varíe en presencia de los analitos (por ejemplo, índice de re-
fracción en los detectores refractométricos).
2. Detectores selectivos, que solo son capaces de detectar los compuestos que
tienen una determinada propiedad física, por ejemplo la absorción de luz visi-
ble o ultravioleta a una determinada longitud de onda.
Otra clasificación de los detectores se puede realizar por su fundamento instru-

mental:
1. Detectores ópticos: de absorbancia UV-VIS, fluorimétricos, refractométricos,

polarimétricos, evaporativos de dispersión de luz, etc.
2. Detectores eléctricos: electroquímicos, conductimétricos.
3. Detectores específicos: radiométricos, viscosimétricos.
4. Detectores de técnicas acopladas: espectroscopía de masas (MS), aerosol car-
gado (CAD), espectroscopía infrarroja transformadora de Fourier (IRTF), ab-
sorción atómica (AA), espectroscopía de emisión por plasma (ICP), etc.
Un parámetro importante que define la calidad de un detector HPLC es el límite

de detección y el número máximo de picos detectados. En la Tabla 19.5 se recopilan
los límites de detección de los principales tipos de detectores utilizados en HPLC.
En este contexto, algunos de los detectores de masas de última generación para
HPLC alcanzan límites de detección del orden de fentogramos.
Hay un límite por encima del cual los aumentos de la concentración ya no se ven
correspondidos por los de la señal del detector, momento en que se dice que el detec-
tor ha quedado «ciego» o que está «saturado».
En ocasiones se observa la denominada deriva de la línea base, la cual se torna
ascendente, descendente o caótica, mucho más que lo esperado como ruido de flujo.
Puede ser debida a varios factores: empleo de gradientes, cambios de temperatura
del laboratorio, cambios de temperatura de la columna, cambio de viscosidad de la

fase móvil, dilatación térmica, evaporación parcial de algún componente de la fase
móvil en el propio reservorio, etc.
Tabla 19.5. caracTerísTicas de lOs PrinciPales deTecTOres

UTilizadOs en HPlc
detector Tipo límite de detección1
Absorbancia Selectivo 100 pg – 1 ng
Fluorescencia Selectivo 1 – 10 pg
Índice de refracción Universal 100 ng – 1 µg
Quimioluminiscencia Selectivo 0,1 – 1 pg
Electroquímico Selectivo 10 pg – 1 ng
Evaporativo de light-scattering Universal 1 –100 ng
Conductividad Selectivo 500 pg – 1 ng
Espectrometría de masas Universal 100 pg – 1 ng
Aerosol cargado (CAD) Universal 100 pg – 10 ng
1
El límite de detección se define como la masa de compuesto inyectada que da lugar a una relación
señal/ruido de 5/1, para un analito de masa molecular de 200 g/mol y un volumen de inyección de 10 μl.
Cuando se utilizan varios detectores en serie, se debe situar en primer lugar aquel
de menor volumen de celda; no obstante, si uno de ellos es destructivo (electroquí-
mico, evaporativo, etc.) este se pone en último lugar. En casos excepcionales, se
puede intercalar un divisor de flujo (splitter) para que los caudales que lleguen a dos
detectores en serie sean distintos.
A continuación se detallan las características de los principales detectores utiliza-
dos en cromatografía líquida. Se han seleccionado detectores tanto de tipo general
(índice de refracción, evaporativos, etc.) como selectivos (absorbancia, fluorescen-
cia, electroquímicos, etc.). Algunos de los detectores con mayores perspectivas futu-
ras, como los de masas o los de aerosol cargado, se incluyen lógicamente en dicha
recopilación.
19.2.7.1. Detectores de absorbancia o fotométricos (UV-VIS)
Los detectores fotométricos están basados en la absorción de luz Uv-vIS,

definida por la ley de Lambert-Beer. La linealidad de esta ley es su propiedad
más importante y la que justifica su utilización en detectores HPLC. Son muy
versátiles, ya que la mayoría de los compuestos orgánicos absorben en alguna
zona del espectro. En general, el detector Uv-vIS se suele utilizar con compues-
tos que poseen uno o varios dobles enlaces. Estos detectores presentan una alta
sensibilidad, y son compatibles con el empleo de gradientes de elución, siempre
y cuando los disolventes empleados no absorban radiación de dicha longitud de
onda.
Para minimizar el ensanchamiento de los picos, el volumen de la celda suele ser
muy pequeño (1-10 µl), con longitudes de celda en el rango 0,2-1,0 cm. La presión
en la celdilla Uv-vIS no debe ser nunca superior a 600 psi (40 bar) en la mayoría de
los detectores de este tipo. La banda espectral no es tan aguda como en un espectro-
fotómetro, suele ser de 10 nm.
Existen dos grandes grupos de detectores Uv-vIS: los que utilizan una o varias
longitudes de onda discretas, y los que emplean un rango espectral continuo (detec-
tores de fotodiodos o photodiode-array, PDA). Los primeros pueden incorporar un
sistema de filtros o un monocromador. Los detectores de fotodiodos son capaces de
realizar un espectro completo del contenido de la celda en aproximadamente medio
segundo. Los detectores de fotodiodos permiten estimar la pureza de un pico anali-
zando, a lo largo del mismo, el cociente de las absorbancias a dos longitudes de
onda distintas. Permiten, además, identificar algunos de los compuestos eluidos me-
diante la comparación de sus espectros Uv-vIS con los contenidos en bibliotecas
de espectros.
En la Figura 19.5 se muestra un cromatograma de una mezcla de derivados fenó-
licos empleando un detector PDA, que nos proporciona los espectros Uv-vIS de los
cuatro compuestos principales.
19.2.7.2. Detectores fluorimétricos
La fluorimetría es muy adecuada para el análisis de moléculas grandes, rígidas y

con dobles enlaces conjugados (por ejemplo, hidrocarburos aromáticos policíclicos).
Son aproximadamente 1.000 veces más sensibles que los detectores fotométricos y,
sobre todo, muy selectivos. Los factores que afectan a la señal de fluorescencia y,
por tanto, a la sensibilidad de HPLC con detección fluorimétrica, son: efecto de los
átomos pesados externos, quenching o amortiguación de fluorescencia, amortigua-
ción por formación de dímeros, efecto del filtro interno habitual en altas concentra-
ciones, interacción con disolventes y la temperatura.
Hay dos tipos de equipos: (1) fluorómetros, basados en filtros, que son dispositi-
vos baratos, sencillos y de aplicaciones concretas; (2) espectrofluorómetros, que tie-
nen monocromadores, más caros y sofisticados que los anteriores.
Cuando la molécula a analizar no es fluorescente, se puede recurrir a su derivati-
zación con un marcador o reactivo fluorogénico (por ejemplo, cloruro de dansilo o
fluoroescamina, que reaccionan con los grupos amino del compuesto).
Se trata de un detector excelente para análisis de hidrocarburos aromáticos
(contaminación ambiental) o de antibióticos (tetraciclinas). Es muy clásica la de-
terminación de aminoácidos, no fluorescentes por sí mismos, derivatizándolos con
fluorescamina, para determinar la composición de aminoácidos de una proteína
(Figura 19.6).
1 2
OH
HO OH
HO
200 250 300 350 400 200 250 300 350 400
Longitud de onda (nm) Longitud de onda (nm)
3 4
OH
OH
OH
200 250 300 350 400 200 250 300 350 400
Longitud de onda (nm) Longitud de onda (nm)
2
3
1
1. Hidroquinona 4
2. Resorsinol
3. Catecol
4. Fenol
0 5 10 15 20
Figura 19.5. Análisis de una mezcla de compuestos fenólicos empleando un detector

de fotodiodos.
20
9,86 Asp+Asn
16
11,51 Thr
12
Abs (570 nm)
21,69 Gly
12,35 Ser
16,17 Glu+Gln
37,18 Leu
8
52,70 Lys
23,31 Ala
36,24 Ile
47,84 His
40,47 Tyr
41,86 Phe
29,93 Val
34,61 Met
66,95 Arg
4
0 10 20 30 40 50 60 70
Figura 19.6. Determinación de la composición de una proteína derivatizando los aminoácidos

(resultantes de la hidrólisis ácida) con un reactivo fluorogénico.
19.2.7.3. Detectores de índice de refracción
Los detectores de índice de refracción, también denominados refractométricos,

son universales y se vienen utilizando desde los primeros desarrollos de la cromato-
grafía HPLC. En la celda de detección se mide la variación de la refracción de un
haz de luz cuando la fase móvil lleva un compuesto disuelto respecto a la fase móvil
pura (celda de referencia), como se ilustra en la Figura 19.7. Tienen la ventaja de
responder a la presencia de prácticamente cualquier tipo de soluto. Son, por tanto,
equivalentes a los detectores de llama o conductividad térmica empleados en croma-
tografía de gases.
La temperatura, la longitud de onda de la radiación empleada y la presión a la que
está sometida la sustancia son variables que afectan a la medida del índice de refrac-
ción. Una temperatura constante facilita medidas más precisas; por ello, en equipos
HPLC con detector refractométrico es muy conveniente el uso de hornos de colum-
nas. Además, la fase móvil pasa a través de un tubo capilar de acero donde se ter-
mostatiza antes de entrar en el detector.
Es importante tener en cuenta que la medida del índice de refracción no es homo-
génea utilizando diferentes fuentes de radiación, lo que impide comparar resultados
al pasar de un detector refractométrico a otro.
Referencia
Muestra
Gas
nebulizador Gotas
Tubo
evaporador Gotículas
Partículas
Fuente
de luz
Trampa de luz
y
fotomultiplicador
Figura 19.7. Esquema del funcionamiento de un detector refractométrico (izquierda)

y de un detector evaporativo de light scattering (derecha).
Su sensibilidad es limitada, aproximadamente 1.000 veces menor que la de un

detector basado en la absorbancia; no obstante, los detectores de Uv-vIS suelen
complementarse con un detector refractométrico puesto en serie. Un aspecto negati-
vo de estos detectores es su incompatibilidad con los gradientes de elución. Aplica-
ciones típicas de los detectores de índice de refracción son el análisis de carbohidra-
tos, triglicéridos y polímeros.
19.2.7.4. Detectores evaporativos de dispersión luminosa (light scattering)

Un aspecto importante en HPLC es poder detectar sustancias que no absorben la
radiación Uv. Si además carecen de propiedades conductimétricas o electroquími-
cas, el análisis queda supeditado a utilizar un detector universal refractométrico, con
sensibilidad moderada. Además, los detectores de índice de refracción son incompa-
tibles con los gradientes de elución, y muy dependientes de las variaciones de tem-
peratura externa.
La búsqueda de alternativas para analizar sustancias como azúcares, polímeros,
ácidos grasos, triglicéridos o aminoácidos, condujo al detector evaporativo de dis-
persión luminosa (evaporative light-scattering detector, ELSD) basado en los efec-
tos dispersivos que toda sustancia posee sobre un haz de luz. Se trata, por tanto, de
un detector universal, descrito por primera vez en 1978.
Este detector lleva a cabo un primer paso de nebulización del eluyente seguida de
la evaporación de la fase móvil (Figura 19.7). Los solutos no volatilizados forman
una niebla de micropartículas, que atraviesa un haz luminoso y produce en él la dis-
persión de la radiación, cuya intensidad constituye la señal del detector. El detector
consta, por tanto, de tres partes:
1. Un sistema de nebulización neumática del líquido procedente de la columna,

generalmente empleando nitrógeno como gas nebulizador. Suele tener un dis-
positivo para eliminar las gotículas de tamaño superior al óptimo.
2. Un tubo evaporador caliente, donde se produce la evaporación de la fase móvil.
3. Un detector alejado del eje de la radiación incidente, normalmente un foto-
multiplicador emplazado 90-120º de la fuente de radiación.
Al ser necesario evaporar el disolvente o mezcla de disolventes, evitando la volatili-
zación del soluto, la temperatura de evaporación juega un papel fundamental. Se prefiere
que la temperatura no sea demasiado alta, ya que se puede producir degradación térmica
de los analitos o incluso su volatilización. Algunos de los últimos modelos permiten la
evaporación de eluyentes a baja temperatura, lo que representa una gran ventaja.
Estos detectores tienen un fácil manejo, y son compatibles con el uso de modifi-
cadores y tampones sublimables (por ejemplo, ácido acético, ácido fórmico, ácido
trifluoroacético, acetato amónico, hidróxido amónico, trietilamina, etc.). Permiten
utilizar disolventes que absorban la radiación Uv, y son compatibles con los gra-
dientes de elución. Además, la respuesta másica es aproximadamente la misma para
la mayor parte de los solutos no volátiles. Su sensibilidad es superior a la de los de-
tectores de índice de refracción, incluso algunos modelos presentan una sensibilidad
comparable a los de absorbancia Uv-vIS. En la Tabla 19.6 se comparan las caracte-
rísticas de los detectores ELSD con los de índice de refracción.
Tabla 19.6. cOMParación de lOs deTecTOres elsd

cOn lOs refracTOMéTricOs
característica índice de refracción elsd
Compatibilidad con gradientes No Sí
Análisis de compuestos volátiles Sí No
Empleo de tampones no volátiles Sí No
Efecto de las impurezas en la fase móvil Serio Mínimo
Sensible a cambios de temperatura Sí No
Picos «negativos» Sí No
Linealidad Sí Respuesta logarítmica
Tiempo de estabilización Largo Corto
Necesidad de preinstalación No Sí 1
1
Se requiere una línea de nitrógeno y un tubo de evacuación de gases.
Una peculiaridad del detector evaporativo de light scattering es que su respuesta

no es lineal, viniendo definida por la fórmula:
A = amb
siendo (A) el área del pico, (m) la masa del analito y (a) y (b) coeficientes que depen-
den de varios factores, fundamentalmente del tamaño de las partículas, la naturaleza
de los analitos y la temperatura de evaporación.
Por ello suele utilizarse representación logarítmica para las rectas de calibrado (la
mayoría de los softwares para tratamiento de datos en HPLC ya incorporan dicha
opción):
log A = b log m + log a

Los valores de (b) descritos suelen estar en el rango 0,6-2,0. La Figura 19.8
muestra las curvas de calibrado de un éster metílico utilizando un ajuste lineal y lo-
garítmico.
2,00e+6 6,5
A B
1,75e+6
6,0
1,50e+6
log Área del pico

Área del pico
5,5
1,25e+6
1,00e+6 5,0
7,50e+5
4,5
5,00e+5
4,0
2,50e+5
0.00 3,5
0 2 4 6 8 10 12 14 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
[Oleato de metilo] (nM) log [Oleato de metilo] (nM)
Figura 19.8. Curva de calibrado de un compuesto (oleato de metilo) utilizando un detector

evaporativo de light-scattering: (A) ajuste lineal; (B) ajuste logarítmico.
Los campos de aplicación más importantes de estos detectores son el análisis de

azúcares, triglicéridos, ácidos grasos, lípidos, fosfolípidos, polímeros, esteroides, al-
caloides, tensioactivos, lubricantes, etc.
19.2.7.5. Detectores electroquímicos
Para el análisis de sustancias oxidables o reducibles pueden emplearse detectores

electroquímicos, que a su vez pueden ser amperométricos o coulométricos. La señal
ocasionada por un detector electroquímico amperométrico es una medida de intensi-
dad proporcional a la concentración de soluto, cuando en la celda se aplica un poten-
cial que ocasiona su reducción o bien su oxidación. Los detectores amperométricos
llevan un electrodo de referencia, normalmente plata-cloruro de plata, estableciéndo-
se una diferencia de potencial con el electrodo de trabajo (que suele ser de carbón o
de oro). En los coulométricos se utiliza un electrodo de referencia hidrógeno-iones
hidrógeno.
Con estos detectores la fase móvil debe conducir la electricidad. No basta con
metanol o acetonitrilo al 100%; la fase móvil debe contener un electrolito (puede ser
un par iónico o una sal inorgánica). La característica fundamental de los detectores

electroquímicos es su selectividad y, derivando de ella, su sensibilidad. El potencial
redox es la variable que el usuario establece en el electrodo, y debe ser suficiente
para producir la reacción de oxidación o reducción del analito.
El rango de sustancias analizadas por detección electroquímica es muy amplio,
tanto por oxidación (hidrocarburos, amidas, aminas, fenoles, etc.) como por reduc-
ción (olefinas, cetonas, aldehídos, nitroderivados, etc.). La aplicación más emblemá-
tica es la de las catecolaminas en plasma u orina. También se pueden detectar feno-
les, benzoquinona o algunas vitaminas como el ácido ascórbico (vitamina C). En
cromatografía de intercambio iónico es interesante la aplicación de los detectores
amperométricos de pulsos para el análisis de carbohidratos.
19.2.7.6. Detectores de radioactividad
Se trata de contadores de centelleo en continuo. Se utilizan para detectar compues-

tos radioactivos marcados, especialmente en el caso de fármacos, pesticidas, donde se
requiere una alta sensibilidad que no pueden ofrecer los detectores convencionales.
Los isótopos que se analizan son: emisores beta de baja energía (3H, 14C, 35S), emiso-
res beta de alta energía (32P), emisores gamma (125I, 131I) y emisores alfa.
19.2.7.7. Detectores de conductividad
Estos detectores se encuentran íntimamente ligados a la cromatografía iónica y

miden la conductividad del eluyente, que es proporcional a la fuerza iónica. Su sen-
sibilidad disminuye a medida que aumenta la conductividad de la fase móvil, por lo
que suele ser necesario incorporar las denominadas columnas supresoras que redu-
cen el ruido de fondo. Como la conductividad es muy dependiente de la temperatura,
estos detectores suelen llevar un sistema de compensación automática de la tempera-
tura. Un inconveniente de los detectores de conductividad es que el rango de lineali-
dad es bastante corto.
19.2.7.8. Detectores viscosimétricos
El parámetro de medida básico de estos equipos es la viscosidad relativa, definida

como el cociente de la viscosidad de la solución entre la viscosidad del disolvente.
Son especialmente útiles para el análisis de polímeros mediante cromatografía de
exclusión molecular (GPC). Existen varias posibilidades: detector viscosimétrico de
cuatro capilares (que permite la medida de factores estructurales del polímero, como
la ramificación y conformación, además del peso molecular), de dos capilares (de
menor sensibilidad que el anterior) y de un solo capilar (que requiere de numerosos
atenuadores de pulsos en el sistema de bombeo).
19.2.7.9. Detectores de quimioluminiscencia

La mayor ventaja de la quimioluminiscencia es que no requiere haz de excitación,
elemento esencial en fluorimetría (puede provocar un importante ruido de fondo).
Son detectores de muy alta sensibilidad, y permiten la detección de trazas de lípidos,
nucleótidos, óxidos nitrosos y catecolaminas. La instrumentación es bastante sencilla;
no obstante, una desventaja importante es que necesitan una bomba peristáltica para
hacer la reacción post-columna.
19.2.7.10. Detectores de dispersión luminosa (light scattering)

no evaporativos
También es muy interesante la aplicación de detectores de light-scattering no

evaporativos para la determinación de masas moleculares en polímeros y macromo-
léculas biológicas (GPC/SEC). Existen tres tipos de detectores de light scattering en
flujo continuo para GPC/SEC: LALLS (low angle laser light scattering system),
MALLS (multiple angle laser light scattering system) y RALLS (right angle laser
light scattering system). Estos detectores permiten la determinación absoluta de
masa molecular, ramificaciones, etc. y suelen estar acoplados a un detector de índice
de refracción y a otro viscosimétrico.
19.2.7.11. Detectores de masas
La combinación de la cromatografía líquida con espectrometría de masas (LC-

MS, liquid chromatography-mass spectrometry) tiene gran potencial, y se aplica
cada vez a más campos, con el objetivo de separar, identificar y cuantificar compo-
nentes de bajos pesos moleculares, y caracterizar productos de altos pesos molecula-
res (péptidos, proteínas, etc.). Las técnicas de ionización a presión atmosférica han
revolucionado la detección en LC-MS.
Un espectrómetro de masas para HPLC cuenta con varios componentes instru-
mentales: (1) una interfase con el sistema cromatográfico mediante la que el eluyente
entra en el detector, (2) una cámara de ionización, (3) una cámara de aceleración de
iones, (4) un selector que analiza ordenadamente los iones (cuadrupolo, trampa ióni-
ca, tiempo de vuelo TOF, etc.), (5) un detector de los iones y, por último, (6) un soft-
ware de adquisición y procesado de datos.
Existen diferentes tipos de ionización: impacto electrónico (Therma-Beam), elec-
trospray (ESI, electrospray ionisation), ionización química a presión atmosférica
(APCI, atmospheric pressure chemical ionisation), FAB (fast atom bombardment),
MALDI (matrix-assisted laser desorption). Es importante conocer qué tipos de ana-
litos se van a encontrar y qué fase móvil se va a utilizar para poder elegir la mejor
configuración. La ionización por electrospray es más adecuada para compuestos des-
conocidos o que requieran confimación.
Existen diversos sistemas para «filtrar» los iones formados respecto a su rela-
ción masa/carga. Los más empleados son los de triple cuadrupolo (TQ) y los de
tiempo de vuelo (time of flight, TOF). El sistema de cuadrupolos es el más indica-

do para cuantificación, mientras que el TOF es el preferido para la identificación
de compuestos desconocidos. Este último tiene mayor resolución de masa molecu-
lar (en el orden de diezmilésismas de Dalton para el TOF frente a un Dalton para
el TQ).
19.2.7.12. Detectores de aerosol cargado
Los detectores de aerosol cargado (Charged Aerosol Detection, CAD, tam-

bién denominados Corona) se han desarrollado recientemente, y combinan ele-
mentos de los detectores evaporativos de light scattering con otros de los detec-
tores de masas. En primer lugar, se produce la nebulización con nitrógeno
de la fase móvil y la selección de las gotas más pequeñas. Se lleva a cabo la
evaporación del disolvente; a continuación, el N2 es ionizado en una cámara de
ionización y se adsorbe sobre las partículas de analito. Las partículas cargadas
llegan a una caja Faraday, donde se produce la transferencia de cargas y la detec-
ción de estas, siendo su intensidad proporcional a la concentración de analito en
la muestra.
Estos detectores son universales, con una sensibilidad similar a la de un detector
de absorbancia Uv-vIS, compatibles con los gradientes de elución, muy reproduci-
bles y de fácil manejo.
19.3 ParáMeTrOs crOMaTOGráficOs
Los principales parámetros de una separación cromatográfica, así como su signi-

ficado, se resumen en la Tabla 19.7.
19.4 TiPOs de crOMaTOGrafía HPlc
En el proceso cromatográfico intervienen un conjunto de fuerzas que compiten

de manera selectiva por un compuesto (analito o soluto) para: (1) o bien fijarlo al
relleno de la columna o fase estacionaria; (2) o bien llevarlo disuelto en el eluyen-
te de la columna (fase móvil). Los distintos tipos de fuerzas entre fase estaciona-
ria y solutos definen los distintos tipos de cromatografía HPLC (Tabla 19.8).
Como se indicó en el apartado 19.2.5, la mayor parte de los rellenos en HPLC
están basados en sílice, seguidos por los que utilizan la resina sintética estireno-
divinilbenceno.
A diferencia de la cromatografía de gases, en HPLC la elección de la fase móvil
es determinante en la separación obtenida; en cambio, el gas portador en cromato-
grafía de gases no contribuye de manera importante al proceso de separación, siendo
su principal función transportar los componentes de la mezcla a través de la fase es-
tacionaria.
Tabla 19.7. siGnificadO de lOs PrinciPales ParáMeTrOs

crOMaTOGráficOs
Parámetro fórmula Significado
Tiempo de Suma del tiempo que el analito permanece en
retención tR la fase móvil y el tiempo que interacciona con
la fase estacionaria
Factor de t R − to Cociente del tiempo en que el analito está en
capacidad k = interacción con la fase estacionaria (tR – to) y el
to que permanece en la fase móvil (to)
Selectividad Cociente del factor de capacidad de dos picos
(factor de k2 adyacentes. Es una medida del potencial del
α=
separación) k1 sistema cromatográfico para separar dos
compuestos.
velocidad lineal L Se calcula dividiendo la longitud de la columna
de la fase móvil u= (L) entre el tiempo que necesita la fase móvil
t0 para pasar a través de la columna (to)
Resolución La resolución de dos picos adyacentes es el
t2 − t1 cociente entre la distancia que hay entre los
R=
máximos de ambos picos y la media aritmética
1
2
( w1 + w2 ) de sus anchuras respectivas (w). Determina la
calidad de la separación de dos picos
Número de platos Este nombre refleja el origen del concepto de la
teóricos t 2 teoría de destilación: una cierta longitud de la
N = 16 ⋅  R  columna es ocupada por un plato teórico. Se
 w  calcula, para un determinado pico, considerando
el tiempo de retención y su anchura.
Altura equivalente L Se calcula dividiendo la longitud de la
de platos teóricos HETP = columna entre el número de platos teóricos.
N
Ecuación de van Indica que para cada sistema cromatográfico
Deemter existe un flujo (definido por la velocidad
B lineal) para el cual la altura equivalente de un
HETP = A + +C ⋅u plato teórico es mínima. En la ecuación, A es la
u contribución de la difusión de Eddy, B
corresponde a la difusión longitudinal y C a la
transferencia de masa
Tabla 19.8. TiPOs de crOMaTOGrafía HPlc

Proceso cromatográfico Tipos
Adsorción –
Partición Fase normal
Fase reversa
Cromatografía quiral
Intercambio iónico Intercambio aniónico
Intercambio catiónico
Exclusión por tamaño SEC (size exclusion chromatography)
GPC (gel permeation chromatography)
19.4.1. cromatografía HPlc de adsorción

La cromatografía de adsorción o cromatografía líquido-sólido (LSC, liquid-solid
chromatography) es el método cromatográfico más antiguo. Está basada en el mismo
principio que la cromatografía en capa fina (TLC, thin-layer chromatography) y la
cromatografía de columna en gel de sílice, utilizada con fines preparativos. Se em-
plean fases estacionarias polares (sílice, alúmina, hidroxiapatito) y fases móviles
apolares (mezclas de hexano, ciclohexano, isooctano, tetracloruro de carbono, cloro-
formo, acetato de etilo, etc.). Resulta especialmente útil para la separación de com-
puestos apolares que presenten alguna insaturación o algún grupo funcional. El ori-
gen de la retención es la interacción de los grupos polares de los analitos con los
grupos polares de la fase estacionaria. En dicha adsorción participan enlaces de hi-
drógeno, enlaces π e interacciones dipolo-dipolo. El orden de elución es, por tanto,
de menos polar a más polar.
La sílice es el material más utilizado; los grupos OH de su superficie son los res-
ponsables de su interacción con la parte polar del analito, que compite con la interac-
ción de la fase móvil con los grupos funcionales de la sílice. Para reducir la retención
de los compuestos es conveniente aumentar la polaridad de la fase móvil (p. ej. cam-
biar hexano por cloroformo). Las principales ventajas y desventajas de este tipo de
cromatografía se recogen en la Tabla 19.9.
Tabla 19.9. venTajas e incOnvenienTes de la crOMaTOGrafía HPlc

de adsOrción
ventajas desventajas
– Muy útil para compuestos de polaridad – Limitada a compuestos solubles en
intermedia. disolventes apolares.
– Se obtienen cambios en selectividad (α) a – Es difícil regenerar las columnas.
partir de cambios primarios en la fase
móvil. – El agua adsorbida puede afectar a la
cromatografía (utilizar disolventes secos).
– Fácil recuperación de compuestos en
HPLC preparativa. – La fase estacionaria no distingue entre
moléculas de distinta longitud de cadena
– Amplia gama de eluyentes disponibles con el mismo grupo funcional.
para ajustar la selectividad de una
separación.
La cromatografía de adsorción está especialmente indicada para compuestos de

masa molecular por debajo de 5 kDa, que sean solubles en medios de baja polaridad.
Algunos de los compuestos que pueden ser analizados mediante cromatografía
HPLC de adsorción (enumerados en orden creciente de interacción con la fase esta-
cionaria y, por tanto, en orden creciente de tiempo de retención) son: olefinas < hi-
drocarburos aromáticos < haluros, sulfuros < éteres < nitroderivados < ésteres, alde-
hídos, cetonas < alcoholes, aminas < sulfóxidos < amidas < ácidos carboxílicos. En
la Figura 19.9 se muestra la separación de una mezcla de isómeros de la vitamina E
(tocoferoles) mediante cromatografía de adsorción.
4
1
2
0 2 4 6 8 10 12 14 min.
Figura 19.9. Separación de tocoferoles presentes en aceite de soja (1: α-tocoferol; 2: β-tocoferol;
3: γ-tocoferol; 4: δ-tocoferol) mediante cromatografía HPLC de adsorción. Columna
Pinnacle II Silica (150 × 4,6 mm), 5 µm, 110 Å. Fase móvil: hexano/isopropanol (99,5/0,5). Flujo:
0,6 ml/min. Temperatura: 30 °C. Detección Uv (295 nm).
Fuente: catálogo de Restek/Teknokroma 2008/2009.
19.4.2. cromatografía HPlc de partición

De los cuatro tipos principales de cromatografía HPLC (Tabla 19.8), la cromato-
grafía de partición es, con diferencia, la más utilizada actualmente. La fase estacio-
naria se liga o embebe sobre partículas inertes (generalmente de sílice) para que per-
manezca fija en la columna. Inicialmente, la fase estacionaria líquida era retenida
sobre la superficie de las partículas de relleno mediante adsorción. No obstante, y a
fin de favorecer la estabilidad de la fase estacionaria, esta metodología fue reempla-
zada por la denominada cromatografía en fase ligada (BPC, bonded-phase chroma-
tography), en la que los grupos funcionales se fijan mediante enlace químico a las
partículas de relleno, lo que permite a la fase estacionaria resistir las altas presiones
aplicadas en HPLC (Figura 19.10).
La mayor parte de los soportes de cromatografía de partición en fase ligada están
preparados a partir de sílice de tamaño de partícula entre 3 y 10 µm. La superficie de
la sílice está compuesta de grupos silanol (con una densidad aproximada de 8 µmol/
m2), que son muy reactivos. La mayoría de las fases estacionarias utilizadas en este
tipo de cromatografía se preparan mediante reacción de la sílice con un derivado or-
ganoclorosilano (Figura 19.10). La naturaleza de la cadena R de dicho derivado de-
termina el tipo de cromatografía: normal, reversa o quiral.
CH3 CH3
Si OH + Cl Si R Si O Si R
CH3 CH3
Figura 19.10. Derivatización de la sílice para cromatografía de partición.
19.4.2.1. Fase normal. Cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC)

Cuando el grupo R es de naturaleza polar, se habla de cromatografía en fase nor-
mal. Ello es debido a razones históricas, ya que los primeros trabajos utilizaron fases
estacionarias polares, soportando trietilenglicol sobre sílice o alúmina. Esta cromato-
grafía, de manera similar a lo que ocurre en la cromatografía de adsorción, se basa
en la interacción de los analitos con los grupos funcionales polares de la fase estacio-
naria ligada, que alcanza su intensidad máxima cuando se utilizan eluyentes de baja
polaridad. Sin embargo, muchos analistas han dejado de utilizarla debido a su com-
plejidad y falta de reproducibilidad.
Las columnas comerciales en fase normal contienen estructuras en las que R es
un grupo ciano (–C2H4CN), diol (–C3H6OCH2CHOHCH2OH), amino (–C3H6NH2) o
dimetilamino (–C3H6N(CH3)2).
En la cromatografía en fase normal, la fase móvil suele estar formada por uno o
varios disolventes apolares, siendo los más frecuentes diclorometano, cloroformo o
hexano. En la Figura 19.11 se muestra la separación de una serie de ésteres del ácido
ftálico mediante HPLC con una columna con fase ciano.
4 6 1 di-n octilftalato
3 2 bis(2-ethilexil)ftalato
1 5 3 butilbencilftalato
2 4 di-n butilftalato
5 dietilftalato
6 dimetilftalato
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 min
Figura 19.11. Separación de ésteres de ftalato mediante cromatografía HPLC en fase normal
con columnas ciano. Columna Luna CN (150 × 4,6 mm), 5 µm. Fase móvil: A/B 99/1 siendo A:
Hexano; B: cloruro de metileno/metanol (80/20). Flujo: 1,0 ml/min. Temperatura ambiente.
Detección Uv (254 nm). Fuente: catálogo de Phenomenex 2008/2009.
Una desventaja de los rellenos de fase normal es que son menos resistentes a la
hidrólisis que los de fase reversa, por lo que es importante controlar el pH del elu-
yente y vigilar el sangrado de la columna. Una particularidad de las columnas con
fase estacionaria ciano es que pueden comportarse como rellenos tanto de fase nor-
mal como fase reversa, en función de las condiciones de análisis.
La cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC, hydrophilic interaction chroma-

tography) se puede considerar una extensión de la cromatografía de partición en fase
normal, cuando se utilizan fases móviles acuosas, concretamente mezclas de agua o so-
lución tampón (<40%) con disolventes orgánicos polares (por ejemplo, acetonitrilo).
Aunque este tipo de cromatografía lleva realizándose bastante tiempo, ha sido en los
últimos años cuando el término HILIC ha empezado a utilizarse de forma generalizada.
La cromatografía HILIC es especialmente útil para compuestos muy polares como car-
bohidratos o péptidos. Este tipo de sustancias no pueden ser analizadas en cromatogra-
fía de adsorción debido a que su interacción con la fase estacionaria es demasiado fuer-
te; además, se trata de sustancias poco solubles en los disolventes comúnmente
utilizados en cromatografía de adsorción o de partición en fase normal, como el hexano
o el cloroformo. Por otro lado, los compuestos muy polares no son retenidos en colum-
nas de fase reversa, por lo que suele producirse su coelución con el frente. Afortunada-
mente, el empleo de columnas de fase normal (fundamentalmente columnas amino) y
fases móviles acuosas permite abordar el análisis de este tipo de sustancias, como se
ilustra en el cromatograma de la Figura 19.12 en el que se separan una serie de azúcares.
En los últimos años se han desarrollado nuevos rellenos para cromatografía HILIC;
así, por ejemplo, fases estacionarias de sílice modificada con grupos fenilo, pentafluo-
rofenilo o amida han mostrado una extraordinaria afinidad y selectividad por compues-
tos fenólicos.
5 6
4
9
7
8
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Figura 19.12. Separación de una mezcla de carbohidratos (1 mg/ml) mediante cromatografía de

interacción hidrofílica (HILIC) con columnas amino. Columna Luna NH2 (250 × 4,6 mm), 5 µm.
Fase móvil: acetonitrilo/agua (80/20). Flujo: 1,0 ml/min. volumen de inyección: 5 µl.
Temperatura: 40 °C. Detección ELSD (92 °C, caudal N2 3 l/min). Compuestos analizados:
1: glucosa; 2: fructosa; 3: sacarosa; 4: maltosa; 5: 1-kestosa; 6: rafinosa; 7: maltotriosa;
8: panosa; 9: nistosa.
Tanto en cromatografía en fase normal como en su variante HILIC, el componen-

te menos polar eluye en primer lugar. El comportamiento es el mismo que tenía lugar
en la cromatografía de adsorción. Al aumentar la polaridad de la fase móvil, dismi-
nuye el tiempo de retención de los componentes de la mezcla.
19.4.2.2. Fase reversa

La cromatografía de fase reversa es, con gran diferencia, la técnica de separación
por cromatografía líquida más utilizada actualmente en los laboratorios. Se habla de
fase reversa cuando la cadena funcional R tiene carácter apolar (hidrófobo). El grupo
R suele ser una cadena C8 (n-octil) o C18 (n-octadecil). Dichas cadenas alifáticas se
orientan paralelas unas a otras, perpendicularmente a la superficie de las partículas (a
modo de peine). La fase móvil suele tener un marcado carácter polar, siendo habitual
utilizar mezclas de agua con distintas concentraciones de metanol, acetonitrilo o te-
trahidrofurano. Es importante no utilizar eluyentes con valores de pH superiores a
7,5 para evitar la hidrólisis de los grupos siloxano.
La polaridad de los grupos funcionales de los analitos es determinante en el orden
de elución de los compuestos. El orden de elución en fase reversa es de más polar a
menos polar (Figura 19.13); por tanto, los tiempos de retención de los analitos siguen
el orden: alcoholes < aminas < amidas < aldehídos < cetonas < ésteres < éteres < hi-
drocarburos. Además, para aumentar el tiempo de retención de los analitos, se debe
aumentar la polaridad de la fase móvil, es decir, disminuir su fuerza elutrópica. Esto
suele conseguirse aumentando el porcentaje de agua en la mezcla.
Cromatografía de adsorción y en Cromatografía en fase reversa

fase normal
a. Fase móvil de polaridad baja a. Fase móvil de polaridad alta
C B A A B C
Tiempo Tiempo
b. Fase móvil de polaridad media b. Fase móvil de polaridad media
C B A A B C
Tiempo Tiempo
Polaridad de los solutos: A> B> C
Figura 19.13. Relaciones entre polaridad y tiempo de retención para cromatografía de adsorción,
cromatografía de partición en fase normal y cromatografía de partición en fase reversa.
En fase reversa, la cantidad de fase hidrocarbonada enlazada al soporte de la

sílice se define como «carga de carbono». Se mide como el porcentaje de C en
peso respecto a la masa de sílice. Suele oscilar entre el 5% y el 20%. Al aumentar
la carga de carbono aumenta la retención de los analitos. No obstante, la densidad
del material de relleno es también un factor importante a la hora de predecir la re-
tención de una columna. Así, por ejemplo, la fase Novapak C18, con una densidad
de 0,91 g/l y una carga de carbono del 7%, retiene más los compuestos que la fase
µBondapak, que tiene mayor carga de carbono (10%) pero una menor densidad
(0,45 g/l).
Otro término importante es el end-capping, proceso que implica una derivatiza-
ción adicional de la sílice con trimetilclorosilano para bloquear los grupos hidroxilo
libres, haciéndolos inaccesibles a los solutos. De esta manera aumenta la carga de
carbono y, por tanto, la retención de los analitos.
En los últimos años se ha dedicado gran esfuerzo al desarrollo de nuevas fases
estacionarias para fase reversa con el fin de mejorar la eficacia de las columnas y su
estabilidad frente al pH, así como proporcionar selectividades distintas. Las colum-
nas de fase reversa actualmente en el mercado se pueden clasificar en tres categorías:
– Basadas en sílice, que pueden funcionar en un intervalo de pH 2,0-7,0. En este

capítulo, existen sílices de distinto grado de pureza, con o sin tratamiento de
end-capping, y libres de metales en mayor o menor medida.
– Híbridas, formadas por una combinación de polímero (estireno-divinilbence-
no) y sílice. Presentan un rango de pH más amplio (1,0-12,0).
– Específicas de la aplicación. Por ejemplo, para la separación de mezclas com-
plejas en las que están presentes compuestos muy polares y apolares, se han
desarrollado columnas (Synergi®, Atlantis®) en las que la sílice, además de
cadenas hidrocarbonadas, incorpora grupos polares, lo que provoca una ma-
yor retención de moléculas polares y por tanto una mejor separación de estas
últimas.
En algunos casos, es necesario separar mezclas que contienen uno o varios com-
puestos ionizables. Mediante la estrategia de supresión iónica es posible separar es-
tos compuestos iónicos, suprimiendo (o reduciendo) su estado iónico en solución a
través del control del pH, de manera que quedan más retenidos en rellenos de fase
reversa. Funciona bien para ácidos débiles y bases débiles. Como modificantes de la
fase móvil se suelen utilizar ácidos como el acético, el fórmico o el fosfórico, o bien
bases como alquilaminas o fosfatos alcalinos.
Con algunos solutos iónicos, otra posibilidad para analizar en fase reversa consis-
te en utilizar una fase móvil polar que contenga un contraión de carga contraria a la
de los analitos, de modo que entre ambos se forma una especie neutra (par iónico).
Concretamente, se suele añadir a la fase móvil un catión o anión hidrofóbico, que
interacciona con el analito formando un par iónico (Tabla 19.10). Es una metodolo-
gía que permite analizar ácidos y bases fuertes (pKa < 2, pKb > 8) en condiciones de
fase reversa. variando la longitud del grupo alquilo se puede conseguir mayor o me-
nor retención en la columna.
Tabla 19.10. aGenTes MOdificanTes UTilizadOs

en crOMaTOGrafía de Pares iónicOs
Para bases Para ácidos
alQUilsUlfOnaTOs: alQUilaMinas:
1-Pentano sulfonato (B5) Tetrabutilamina
1-Hexano sulfonato (B6) Trietilamina
1-Heptano sulfonato (B7)
Dodecil sulfato sódico (SDS)
Un ejemplo representativo del empleo de pares iónicos se muestra en la Figura

19.14, en la que se separan cuatro aminas biogénicas con actividad neurotransmiso-
ra. Su separación mediante cromatografía en fase reversa es difícil, ya que sus tiem-
pos de retención son muy similares y además se producen interferencias debido a su
carácter catiónico. Mediante la adición de 1-heptanosulfonato de sodio a la fase mó-
vil y la consiguiente formación de los pares iónicos, se consigue la separación efi-
ciente de los cuatro compuestos.
H
HO HO N
+
+
NH2 H3N
HO +
NH3 OH
HO
OH H3N
+
1 Adrenalina 2 Dopamina 3 Tiramina 4 Triptamina
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 18,0 20,0 22,0 25,0
Figura 19.14. Separación de aminas biogénicas mediante cromatografía HPLC en fase reversa
con par iónico. Columna Discovery C18 (250 × 4 mm), 5 µm. Fase móvil acetonitrilo: tampón
ácido 1-heptanosulfónico pH 2,4. Flujo: 1,5 ml/min. Gradiente de acetonitrilo: t = 0 min, 6%;
t = 5 min, 6%; t = 18 min, 25%. Temperatura ambiente. Detección Uv (220 nm).
Fuente: boletín Analytix de Sigma-Aldrich.
La cromatografía de partición es la más universal de las técnicas de cromatogra-

fía líquida. Las fases móviles polares permiten cromatografiar una amplia variedad
de compuestos de interés bioquímico, farmacológico o químico (Tabla 19.11). Más
del 90% de las aplicaciones de compuestos de bajo peso molecular se hacen en cro-
matografía de partición de fase reversa. Es una técnica de análisis muy versátil, ya
que, por ejemplo, variando tan solo la composición de la fase móvil es posible lograr
la separación de mezclas complejas. Así, la Figura 19.15 muestra la separación de
una serie de derivados del ácido oleico, y en la Figura 19.16 se presenta un cromato-
grama de una mezcla de explosivos, ambos realizados con columnas de octadecilo
(C18).
Tabla 19.11. caMPOs de aPlicación de la crOMaTOGrafía HPlc

de ParTición
campo de aplicación ejemplos
Farmacia Antibióticos, analgésicos, esteroides
Medio ambiente Pesticidas, herbicidas, fenoles, PCBs
Industria química Detergentes, polímeros
Alimentación Edulcorantes, emulgentes, antioxidantes
Bioquímica Proteínas, hidratos de carbono, lípidos
Clínica y Diagnóstico Análisis de orina y sangre, dopaje, hormonas
1
2
3
4 5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Figura 19.15. Separación de derivados del ácido oleico mediante cromatografía HPLC en fase
reversa. Columna Nucleosil 100-C18 (250 × 4,6 mm), 5 µm. Fase móvil metanol/acetona/agua.
Gradiente empleado: t = 0 min, 95/0/5; t = 6 min, 95/0/5; t = 7 min, 100/0/0; t = 9 min, 100/0/0;
t = 11 min, 50/50/0; t = 17 min, 50/50/0. Flujo: 1,2 ml/min. Temperatura: 45 °C. Detección ELSD
a 60 °C. Compuestos analizados: 1, ácido ascórbico; 2, oleato de ascorbilo; 3, 2-monooleina;
4, ácido oleico; 5, 1,2-dioleina; 6, trioleina.
1. HMX 10. 2-A-4, 6-DNT

2. RDX 11. 4-A-4, 6-DNT
5, 6 3. 1, 3, 5-TNB 12. 2, 4-DNT
4. 1, 3-DNB 13. 2, 6-DNT
5. 3, 5-DNA 14. 2-NT
1 3 6. NB 15. 4-NT
7. Tetryl 16. 3-NT
7 8. 2, 4, 6-TNT 17. PETN
9. NG
2 8, 9
4 10
1112
14 16
13
15
17
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Figura 19.16. Análisis de explosivos mediante cromatografía HPLC en fase reversa. Columna
Ultra-C18 Teknokroma (250 × 4,6 mm). Fase móvil: metanol/agua 56/44. Temperatura: 30 ºC,
Flujo: 1,0 ml/min. Detector Uv (210 nm). Inyección de 10 µl con 50 mg/ml de cada componente.
Fuente: catálogo de Restek/Teknokroma 2008/2009.
19.4.2.3. Cromatografía quiral

Las separaciones de compuestos quirales son muy importantes en los sectores
farmacéutico, biotecnológico y de compuestos naturales. Los isómeros ópticos
(enantiómeros) se pueden separar por HPLC, siempre que el sistema cromatográfico
(fase móvil y/o fase estacionaria) sea asimétrico (quiral). Para estas separaciones es
preferible utilizar HPLC que cromatografía de gases, ya que las altas temperaturas
que requiere esta última suelen producir racemización de la fase estacionaria quiral
y/o de los analitos. Existen dos posibilidades en cromatografía HPLC quiral:
– La fase móvil es quiral pero la fase estacionaria no lo es. Se utilizan fases mó-
viles a las que se les adiciona algún reactivo que proporciona quiralidad; este
compuesto forma un complejo, aducto o par iónico con los dos enantiómeros,
de manera que los diastereómeros formados interaccionan de forma diferente
con la fase estacionaria, lo que permite su separación.
– La fase estacionaria es quiral pero la fase móvil no lo es. En este caso existen
diferentes columnas en el mercado, formadas por una base de partículas de síli-
ce de 5-10 µm funcionalizadas con: (1) pequeñas moléculas con grupos
π-activos, básicamente de naturaleza aromática (véase en Figura 19.17 la sepa-
ración de los dos enantiómeros del naproxeno); (2) polímeros helicoidales basa-
dos en celulosa o amilosa modificada químicamente; (3) ciclodextrinas o éteres
corona, que proporcionan cavidades quirales; (4) proteínas, dada su naturaleza
quiral al estar formadas exclusivamente por L-aminoácidos.
10,1
S
12,5
R
10 20 min
Figura 19.17. Separación de los enantiómeros (R y S) del antiinflamatorio naproxeno

mediante cromatografía HPLC quiral. Columna Chirex 3005 Teknokroma (250 × 4,0 mm),
formada por sílice modificada con (R)-1-naftilglicina y ácido 3,5-dinitrobenzoico.
Fase móvil: 30 mM de acetato amónico en metanol. Flujo: 0,8 ml/min. Detector Uv (254 nm).
Fuente: catálogo de Phenomenex 2008/2009.
19.4.3. cromatografía HPlc de intercambio iónico

La cromatografía de intercambio iónico (IEC, ion exchange chromatography) per-
mite separar compuestos de naturaleza iónica (aniones o cationes). La fase estaciona-
ria está formada por una resina o un gel que contiene grupos cargados, que son neu-
tralizados por los iones de la fase móvil (contraiones, counter ions, por ejemplo, Na+).
De esta manera, si el analito contiene grupos de carga opuesta a la fase estacionaria
este se retiene en la columna. Si se hace pasar una fase móvil que contenga una sal, el
aumento de la fuerza iónica del medio permite eluir los analitos de la columna de for-
ma diferencial, aunque el orden de elución es con frecuencia difícil de predecir.
Las columnas de intercambio iónico suelen tener base de sílice (con capacidad
máxima de intercambio de 1 meq/g) y estireno-divinil-benceno (3 meq/g). No obs-
tante, como la densidad de la sílice es mayor, la capacidad de intercambio de ambos
sistemas es similar.
Los intercambiadores pueden ser aniónicos (atraen aniones) o catiónicos (atraen
cationes). Existen intercambiadores fuertes (están ionizados a cualquier pH, por
ejemplo, los que contienen grupos sulfato o aminas cuaternarias) o débiles (su estado
de ionización depende del pH, por ejemplo, los que contienen grupos carboxílicos).
La retención se basa en la afinidad de los diferentes iones por los puntos de inter-
cambio. Se utilizan fases móviles tamponadas que proporcionan contraiones, permi-
ten controlar el pH y variar la fuerza iónica del medio. En general, para disminuir la
retención de un analito existen varias estrategias:
– Cambiar el pH de la fase móvil para formar especies neutras.
– Aumentar la fuerza iónica de la fase móvil.
– Aumentar la temperatura.
La retención de un compuesto en una columna de intercambio catiónico se ve

afectada por el catión (contraión) elegido en la fase móvil. La capacidad de despla-
zamiento de los cationes sigue el orden: Li+ < H+ < Na+ < NH4+ < K+ < Rb+ < Cs+ <
Ag+ < Mn2+ < Mg2+ < Zn2+ < Co2+ < Cu2+ < Cd2+ < Ni2+ < Ca2+ < Sr2+ < Pb2+ < Ba2+.
En el caso de las columnas de intercambio aniónico, la capacidad de desplazamien-
to de los aniones sigue la secuencia: fluoruro < OH- < acetato < cloruro < tiocianato
< bromuro < cromato < fosfato < nitrato < borato < yoduro < oxalato < sulfato <
citrato.
Se trata de una técnica muy útil para cromatografiar iones inorgánicos y orgáni-
cos, proteínas, etc. En la figura 19.18 se muestra la separación de una mezcla de
aniones mediante cromatografía de intercambio iónico. Ejemplos representativos de
este tipo de cromatografía son la determinación de aniones en agua de bebida, de ni-
tratos en vegetales, de fluoruros en pasta de dientes, de amonio y nitratos en fertili-
zantes, o de sodio y potasio en muestras clínicas (transfusiones). Con iones más
grandes, y muy especialmente con tensioactivos iónicos, la cromatografía de par ió-
nico da mejor resultado que la de intercambio, debido fundamentalmente a una me-
jor difusión interna y a una menor adsorción irreversible de los analitos (que impide
su elución).
1. Fluoruro (2 ppm) 6. Bromato (5 ppm) 11. Clorato (10 ppm)

2. Acetato (5 ppm) 7. Cloruro (3 ppm) 12. Carbonato (20 ppm)
3. Propionato (5 ppm) 8. Nitrito (5 ppm) 13. Sulfato (5 ppm)
6 4. Formato (5 ppm) 9. Bromuro (10 ppm) 14. Oxalato (5 ppm)
5. Clorito (5 ppm) 10. Nitrato (10 ppm) 15. Fosfato (10 ppm)
13
10
14
4 7
mS 1 8 9 15
11
5
2
6
12
0 5 10 15
Minutes
Figura 19.18. Análisis de una mezcla de aniones inorgánicos mediante cromatografía HPLC
de intercambio iónico. Columna IonPac AG17-C AS17-C Dionex (250 × 4 mm). Fase móvil:
hidróxido potásico (1 mM de 0 a 3 min, 1-12 mM de 3 a 10 min, 12-35 mM de 10 a 14 min).
Flujo: 1,5 ml/min. Temperatura: 30 °C. Detección de conductividad con columna supresora.
Fuente: catálogo de Dionex.
Para eliminar el ruido en el detector que supone el empleo de una fase móvil con
una alta fuerza iónica, se recurre al empleo de la denominada supresión química. Se
trata de un sistema de eliminación de los iones de la fase móvil entre la columna y el
detector mediante la incorporación de una columna «supresora».
Los detectores más utilizados para cromatografía de intercambio iónico son los de
conductividad, para el análisis de aniones, cationes, ácidos orgánicos, aminas, sulfona-
tos, etc. También se emplean detectores electroquímicos, generalmente de tipo ampe-
rométrico, para el análisis de cianuros, sulfitos, sulfuros, ioduro, etc.
En este contexto, la cromatografía iónica acoplada a un detector amperométrico
de pulsos (high performance anionic exchange chromatography coupled to pulse am-
perometric detection, HPAEC-PAD) se utiliza para el análisis de carbohidratos como
alternativa a la cromatografía de partición en fase normal (en su variante HILIC, ver
apartado 19.4.2.1), con detectores de índice de refracción o ELSD. La cromatografía
HPAEC-PAD permite la cuantificación directa de monosacáridos, oligosacáridos y
polisacáridos a escala de picomoles con mínima preparación de muestras. Esta técni-
ca se basa en la naturaleza débilmente ácida de los carbohidratos que permite una se-
paración muy selectiva a alto pH (>13) empleando una columna de intercambio anió-
nico. La Figura 19.19 muestra el análisis por HPAEC-PAD de la inulina de achicoria,
en la que se aprecia la separación nítida de fructanos con un grado de polimerización
(DP) de hasta 50.
DP10
G
DP20
DP30
Figura 19.19. Análisis de inulina de achicoria mediante cromatografía HPAEC-PAD. Columna

PA100 Dionex (250 × 4 mm). Programa de gradiente utilizando las siguientes fases móviles:
(A) 160 mM NaOH; (B) 160 mM NaOH + 1 M acetato sódico; (C) 1 M NaOH. Flujo: 1,0 ml/min.
volumen de inyección: 25 µl, con una concentración de 0,8 g/l. G: glucosa; F: fructosa;
S: sacarosa; DP: grado de polimerización. Reproducción con permiso de Elsevier a partir
de referencia (Ronkart et ál. 2007, Anal Chim. Acta 604, 81-87).
19.4.4. cromatografía HPlc de exclusión
También es posible separar los analitos en función de su tamaño molecular. Se

utilizan rellenos porosos para que los solutos penetren más o menos en la matriz se-
gún su tamaño molecular. Se emplean fundamentalmente dos tipos de fases estacio-
narias: materiales poliméricos (poliestireno-divinilbenzeno) y materiales basados en
sílice. Se han desarrollado rellenos basados en gel de sílice, con poros desde 60 Å
hasta 20.000 Å (6-2.000 nm), adecuados para disolventes polares y apolares. A me-
nor tamaño molecular, más penetración y mayor tiempo de residencia en la columna,
es decir, mayor retención.
Esta técnica se conoce abreviadamente como SEC (size exclusion chromatogra-
phy) cuando se aplica a proteínas y otros compuestos biológicos o GPC (gel permea-
tion chromatography) cuando se aplica a polímeros sintéticos (plásticos) con fases
móviles orgánicas.
El principal inconveniente es que se trata de un método de baja resolución, ya que la
separación tiene lugar en el volumen total de líquido de la columna (Vt), por lo que el
número de picos que pueden resolverse es bastante limitado (Figura 19.20). No obstan-
te, es muy útil para la separación de proteínas y otras moléculas de alto peso molecular,
como los polímeros. Es importante comprobar que no haya interacción (adsorción) en-
tre la muestra y la fase estacionaria, ya que este hecho alteraría el orden de elución.
Vo Vt
0 5 10 15 20 25
Figura 19.20. Separación de dos compuestos (A y B) mediante cromatografía de exclusión

molecular. Se indican el volumen de exclusión (vo, void volume) y el volumen total
(vt, total volume).
Una aplicación típica de esta cromatografía es la separación de sustancias natura-

les de elevado peso molecular (cuando están contaminadas con sales y especies de
bajo peso molecular). Otra aplicación es la separación de series homólogas de oligó-
meros (por ejemplo, ácidos grasos, oligosacáridos, etc.). En general es recomendable

una diferencia del 10% en el peso molecular de los distintos compuestos de la serie
para obtener una buena resolución. En ocasiones la fase móvil elegida puede afectar
al tamaño de un analito.
También es muy útil para la determinación del peso molecular (o la distribución
de pesos moleculares) de polímeros o sustancias naturales (por ejemplo, proteínas),
como se muestra en la Figura 19.21. Para ello los volúmenes de elución de la mues-
tra se comparan con los volúmenes de elución de una serie de patrones que tienen la
misma naturaleza que los componentes a analizar.
1
1. Poliestireno 34500
4. Poliestireno 580
5. Poliestireno 162 5
3
2
4
0 25
Figura 19.21. Análisis de una mezcla de patrones de poliestireno mediante cromatografía HPLC
de exclusión molecular. Columna Chrompack Microgel 3 Mix varian (250 × 7,7 mm).
Fase móvil: tetrahidrofurano. Flujo: 1,0 ml/min. Detector de índice de refracción.
19.5. escalas de aPlicación de crOMaTOGrafía HPlc
Aunque lo más habitual es utilizar la cromatografía HPLC en escala analítica, las

posibilidades de aplicación son muy variadas, tanto en escala micro (con flujos muy
bajos) como en escala preparativa (para la obtención de productos puros). En la Ta-
bla 19.12 se recogen las distintas escalas a las que se puede trabajar en HPLC, inclu-
yendo los diámetros típicos de las columnas empleadas y los flujos habituales de
trabajo.
Las técnicas HPLC a escala micro y capilar permiten mayor sensibilidad, efica-
cia, velocidad de análisis y menor consumo de disolvente que la cromatografía con-
vencional (analítica). Su mayor limitación es no disponer de tanta instrumentación
como en HPLC analítica, sobre todo en bombas y formadores de gradientes. En rea-
lidad puede considerarse una miniaturización de HPLC analítica en cuanto a flujos,
volumen de inyección, celda del detector, tubos, etc.
Tabla 19.12. escalas UTilizadas en crOMaTOGrafía HPlc

escala diámetro columna flujos
Industrial, Planta Piloto 77-150 mm 100-1000 ml/min
Preparativa 41-77 mm 20-100 ml/min
Semipreparativa 10-21 mm 2-20 ml/min
Analítica 3,0-4,6 mm 0,45-2,0 ml/min
HPLC microbore 2,0-2,1 mm 150-250 μl/min
Micro-LC 1,0 mm 20-100 μl/min
LC capilar 0,5 mm 1-20 μl/min
Nano-LC 0,1 mm 0-1 μl/min
La teoría cromatográfica (ver apartado 19.3) indica que la eficiencia de una sepa-
ración (definida por el número de platos teóricos, N) es independiente del diámetro
interno, viniendo definida básicamente por la longitud de la columna y del tamaño de
partícula. Es por ello por lo que a escala micro se logran del orden de 100.000 platos
teóricos o más por metro. No obstante, para obtener esa misma eficacia al disminuir el
diámetro, es necesario reducir el flujo de manera significativa (Tabla 19.12).
La cromatografía HPLC microbore, también denominada cromatografía de baja
dispersión, suele utilizar columnas de 2,1 mm de diámetro interno y rellenos de
5 μm, con las ventajas de ahorro de disolvente y más sensibilidad. Concretamente, se
suelen lograr aumentos de sensibilidad de aproximadamente 5 veces con las técnicas
microbore respecto a las analíticas. La instrumentación es la misma que en HPLC
analítica, aunque es muy conveniente minimizar los volúmenes extra-columna (re-
duciendo las longitudes de los tubos entre inyector y detector) para evitar ensancha-
miento de los picos; además, es muy importante ajustar las condiciones del gradiente
para tener la misma separación y tiempo de análisis que con la columna analítica.
Las técnicas capilares en HPLC son especialmente indicadas en situaciones de
poca cantidad de muestra y escasa concentración. La cromatografía capilar y nano-
LC se emplean fundamentalmente en biotecnología (especialmente en proteómica),
ya que además de la alta eficiencia se obtiene una gran sensibilidad para muestras
diluidas. Otra de las aplicaciones típicas de la cromatografía líquida capilar es la se-
paración de estereoisómeros empleando fases móviles quirales (especialmente cuan-
do todavía no se habían desarrollado ampliamente las fases estacionarias quirales),
ya que los modificantes quirales de las fases móviles tienen un alto precio y en esca-
la capilar su consumo se reduce de manera significativa. Para convertir un sistema
analítico convencional en capilar se puede emplear un divisor de flujo, aunque en
este caso el ahorro de disolvente no es tan notable.
Una técnica de gran aplicación es la cromatografía semipreparativa y preparati-
va. Las técnicas preparativas en HPLC son excelentes y más rentables que otras
técnicas (cromatografías planares, extracción líquido-líquido, precipitación, etc.).
Proporcionan elevada resolución y alta capacidad. Requieren un equipo más sofisti-
cado (y por tanto más caro que uno analítico) que incluye bombas de flujos altos,
células de detectores que permitan pasar flujos elevados, colectores de fracciones,
divisores de flujo, etc. Las columnas son más voluminosas en todo: mayor tamaño
de partícula (10-40 µm), mayores dimensiones (≥ 30 cm), mayor diámetro interno
(> 10 mm). Para optimizar la separación y aumentar el rendimiento del proceso se
suele adoptar alguna de las siguientes soluciones: reciclar los picos no resueltos,
haciéndolos pasar de nuevo por la columna; sincronizar un colector de fracciones
con el detector para colectar solo picos; hacer ciclos repetitivos de todo el proceso
cromatográfico, etc.
Generalmente la fase estacionaria que se utiliza es la misma que la de la columna
analítica, ofreciendo por tanto la misma resolución cromatográfica. Esta estrategia
permite el ahorro en el desarrollo de métodos, ya que el método analítico puede ser
directamente aplicado a escala en fase semipreparativa o preparativa, sin cambio en
la resolución cromatográfica.
Para escalar una cromatografía analítica a una preparativa usando una columna
con el mismo relleno y poder así obtener cromatogramas idénticos es necesario calcu-
lar el denominado factor de escalado X. Para ello se aplica la siguiente fórmula:
X = (Lpreparativa /Lanalítica) (dpreparativa/danalítica)2
siendo L las longitudes de las columnas utilizadas y d sus respectivos diámetros.

Este factor X se multiplica por el flujo y el volumen de muestra, obteniendo así
las nuevas condiciones de análisis que deben emplearse en la cromatografía semipre-
parativa.
19.6. crOMaTOGrafía UlTra-ráPida (UPlc)
En los últimos años, con objeto de reducir el tiempo de análisis y así poder reali-
zar un mayor número de ensayos por unidad de tiempo, se ha desarrollado de manera
espectacular la cromatografía ultra-rápida (ultra-performance liquid chromatogra-
phy, UPLC), que permite aumentar la velocidad de análisis manteniendo la resolu-
ción. Para ello se han desarrollado columnas de pequeña longitud (< 10 cm) con fa-
ses estacionarias cuyo tamaño de partícula es inferior a 2 µm, que permiten
separaciones con una gran eficiencia (> 200.000 platos/m). Estas columnas requie-
ren unos equipos de HPLC especiales, capaces de soportar las altas presiones que se
generan (> 10.000 psi). Además, los tubos de conexión están minimizados al máxi-
mo, para evitar dispersión de los analitos y las celdas de los detectores tienen un vo-
lumen mínimo, por el mismo motivo.
En la conocida ecuación de van Deemter que rige las separaciones cromatográfi-
cas, y que relaciona la eficiencia de la columna con el caudal de trabajo, una de las
variables importantes es el tamaño de partícula de la fase estacionaria. Así, al dismi-
nuir el tamaño de partícula de 10 µm a 5 µm, y luego a 2,5 µm, se produce un au-
mento de la resolución cromatográfica; además, esta eficacia se obtiene a flujos su-
periores en el caso de partículas pequeñas, lo que permite reducir el tiempo de
análisis. La Figura 19.22 demuestra cómo al reducir el tamaño de partícula de 5 µm
a 3,5 µm disminuye el tiempo de análisis considerablemente manteniendo la resolu-
ción cromatográfica, simplemente por un aumento del caudal utilizado.
Utilizando partículas todavía más pequeñas (< 2 µm) todavía es posible mejorar
la eficacia de la separación, incluso empleando flujos de 5 ml/min. Al flujo óptimo
de trabajo, una columna de 15 cm empaquetada con un relleno de 1,7 µm, genera
una presión de 15.000 psi. Además, la anchura de pico en estas condiciones suele ser
inferior a 1 segundo, lo que implica que el detector debe cumplir unas especificacio-
nes muy determinadas.
A) 0,06 1
0,04
AU 3
0,02 2
4 5 6
0,00
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
Minutos
B) 0,10 1
0,08
0,06
AU 3
0,04 2
6
0,02 4 5
0,00
0,10 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 1,80 2,00
0,08 Minutos
0,06
AU
0,04
0,02
0,00
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
Minutos
Figura 19.22. Ejemplo de escalado HPLC a cromatografía ultra-rápida: A) separación de

6 analitos en una columna XTerra C18 Waters (150 × 4,6 mm), 5 µm, 1,4 ml/min, ciclo de 25 min;
B) columna XTerra C18 Waters (20 × 4,6 mm), 3,5 µm, 3 ml/min, ciclo de 3 min.
Compuestos separados: 1, cafeína; 2, anilina; 3, N-metilanilina; 4, 2-etilanilina; 5, 4-nitroanisol;
6, N,N-dimetilanilina. Figura adaptada (con permiso) de Screening 4, 30-31 (2003).
Las columnas de UPLC suelen utilizar fases híbridas (polímeros-sílice). Algunos

de los parámetros determinantes en cromatografía ultra-rápida son el volumen del
sistema, la velocidad del inyector y la respuesta del detector. En particular, el sistema
de inyección debe eliminar las caídas de presión, evitar la contaminación cruzada y
acortar al máximo el ciclo de inyección.
bibliOGrafía
1. Pavia, D. L. et ál. Introduction to organic laboratory techniques, Saunders Col-

lege Publishing, 1999.
2. SubraManian, G. Preparative and process-scale liquid chromatograph, Ellis
Horwood Series in Chemical Engineering, 1991.
3. FonG, G. W.; LaM, S. K. HPLC in the pharmaceutical industry, Marcel Dekker
Inc., 1991.
4. Dean, j. A. Analytical Chemistry Handbook, Mc Graw-Hill, New York, 1995.
5. GoodinG, K. M.; ReGnier, F. E. HPLC of Biological macromolecules, Marcel
Dekker Inc., 1990.
6. Lloyd, R. et ál. Practical HPLC Method Development, Wiley-Interscience, 2.a ed.,
2002.
7. Meyer, v. R. Practical High-Performance Liquid Chromatography, Wiley-
Interscience, 3.a ed., 1999.
8. DonG, M. W. Modern HPLC for practicing scientist, Wiley-Interscience, 2006.
9. MCMaster, M. HPLC: A practical user’s guide, Wiley-Interscience, 2006.
10. Snyder, L. R. Introduccion to Modern Liquid Chromatography, Wiley-Inter-
science, 2009.
11. LC/GC EUROPE. Europe solutions for separation scientists. Publicada men-
sualmente por Advanstar, Cheste (UK): http://www.lcgceurope.com.

Tecnicas - Analisis - Baja Sin Ind Analitico - 0789 PDF

Hochgeladen von

Dokumentinformationen

Originaltitel

Copyright

Verfügbare Formate

Dieses Dokument teilen

Dokument teilen oder einbetten

Freigabeoptionen

Stufen Sie dieses Dokument als nützlich ein?

Sind diese Inhalte unangemessen?

Copyright:

Verfügbare Formate

Tecnicas - Analisis - Baja Sin Ind Analitico - 0789 PDF

Hochgeladen von

Copyright:

Verfügbare Formate

19.

crOMaTOGrafía líQUida de alTa

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es la técnica analítica de se-

lución (HPLC: high-performance liquid chromatography), nombre que se propuso

19.2. cOMPOnenTes de Un eQUiPO de HPlc

Existen otros módulos complementarios, a veces necesarios para la aplicación,

19.2.1. reservorios y fases móviles

Tabla 19.1. acciOnes QUe deben realizarse cOn la fase Móvil

Otras propiedades físico-químicas de los disolventes con una singular importancia en

Figura 19.2. Miscibilidad de los disolventes más comúnmente utilizados en HPLC.

19.2.2. sistemas de bombeo. Gradientes en alta y baja presión

móviles, y la bomba varía la proporción relativa de los distintos componentes con el

Figura 19.4. Formación de gradientes en alta y baja presión.

Tabla 19.2. cOMParación de GradienTes en alTa y baja Presión

El inyector es un dispositivo hermético que se encuentra situado a la salida de la

19.2.4. Tubos de conexión

Tabla 19.3. caracTerísTicas de lOs TUbOs UTilizadOs en HPlc

Los tubos utilizados en HPLC pueden estar fabricados de:

19.2.5. columnas y fases estacionarias

Tabla 19.4. PrinciPales PrOveedOres de cOlUMnas de HPlc

El empleo de partículas pequeñas da lugar a mayores presiones de trabajo y,

deradas, mientras que con partículas de diámetros menores o iguales de 2 µm es

La columna es delicada y puede perder eficiencia y resolución, muchas veces

1. físicas: al incorporar dos filtros adicionales, atenúa los pulsos de la bomba

Uno de los sistemas más atractivos en precolumnas es el de los cartuchos

El detector cromatográfico debe caracterizarse por una gran sensibilidad, preci-

1. Detectores universales, que responden a cambios de una propiedad física ge-

Otra clasificación de los detectores se puede realizar por su fundamento instru-

1. Detectores ópticos: de absorbancia UV-VIS, fluorimétricos, refractométricos,

Un parámetro importante que define la calidad de un detector HPLC es el límite

del laboratorio, cambios de temperatura de la columna, cambio de viscosidad de la

Tabla 19.5. caracTerísTicas de lOs PrinciPales deTecTOres

19.2.7.1. Detectores de absorbancia o fotométricos (UV-VIS)

Los detectores fotométricos están basados en la absorción de luz Uv-vIS,

19.2.7.2. Detectores fluorimétricos

La fluorimetría es muy adecuada para el análisis de moléculas grandes, rígidas y

Figura 19.5. Análisis de una mezcla de compuestos fenólicos empleando un detector

Figura 19.6. Determinación de la composición de una proteína derivatizando los aminoácidos

19.2.7.3. Detectores de índice de refracción

Los detectores de índice de refracción, también denominados refractométricos,

Figura 19.7. Esquema del funcionamiento de un detector refractométrico (izquierda)

Su sensibilidad es limitada, aproximadamente 1.000 veces menor que la de un

19.2.7.4. Detectores evaporativos de dispersión luminosa (light scattering)

1. Un sistema de nebulización neumática del líquido procedente de la columna,

Tabla 19.6. cOMParación de lOs deTecTOres elsd

Una peculiaridad del detector evaporativo de light scattering es que su respuesta

log A = b log m + log a

log Área del pico

Figura 19.8. Curva de calibrado de un compuesto (oleato de metilo) utilizando un detector

Los campos de aplicación más importantes de estos detectores son el análisis de

19.2.7.5. Detectores electroquímicos

Para el análisis de sustancias oxidables o reducibles pueden emplearse detectores

un par iónico o una sal inorgánica). La característica fundamental de los detectores

19.2.7.6. Detectores de radioactividad

Se trata de contadores de centelleo en continuo. Se utilizan para detectar compues-

19.2.7.7. Detectores de conductividad

Estos detectores se encuentran íntimamente ligados a la cromatografía iónica y

19.2.7.8. Detectores viscosimétricos

El parámetro de medida básico de estos equipos es la viscosidad relativa, definida

19.2.7.9. Detectores de quimioluminiscencia

19.2.7.10. Detectores de dispersión luminosa (light scattering)

También es muy interesante la aplicación de detectores de light-scattering no

19.2.7.11. Detectores de masas