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1. ABSTRACT ............................................................................................................ 7
2. OBJETIVOS ......................................................................................................... 98
3. INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 10
3.1 LA MITOCONDRIA: generalidades ..................................................... 10
3.2 GENOMA MITOCONDRIAL HUMANO ............................................. 10
3.2.1 Organización y estructuraEstructura y organización del ADN
mitocondrial ............................................................................. 10 Formatted: Font: Times New Roman
3.2.2 Secuencia de referencia de ADN mitocondrial humano .. 14
3.3 CARACTERISTICAS DEL ADNmt HUMANO Formatted: Font: Times New Roman
3.32.13 Herencia del ADN mitocondrial humano..................... 15 Formatted: Normal, Indent: Left: 0"
3.32.24 Alto número de copias.................................................. 16
3.32.35 Tasa de mutación del ADN mitocondrial ..................... 16
3.32.46 Heteroplasmia............................................................... 17 Formatted: Font: Times New Roman, Font color:
Custom Color(RGB(13,13,13))
3.43 ADNmt Y GENÉTICA DE POBLACIONES ............................................. 19
3.43.1 Polimorfismos del ADN mitocondrial .......................... 19
3.43.2 Haplogrupos ................................................................... 20
3.5 APLICACIONES DEL ADNmt Formatted: Font: Times New Roman, Italic, Font
color: Custom Color(RGB(13,13,13))
3.64 BASES DE DATOS DE ADNmt .................................................................... Formatted: Font: Times New Roman, Font color:
Custom Color(RGB(13,13,13))
3.64.1 Clasificación de las bases de datos.....................................
3.64.2 Bases de datos .................................................................... Formatted: Indent: Left: 0.49", First line: 0.49"
3.75 REINO DE GRANADA ................................................................................. Formatted: Font: Times New Roman, Italic, Font
color: Custom Color(RGB(13,13,13))
3.75.1 Introducción .......................................................................
3.75.2 Territorio del Reino Nazarí de Granada ............................. Formatted: Font: Times New Roman, Italic, Font
color: Custom Color(RGB(13,13,13))
3.75.3 Una época de prosperidad ..................................................
Formatted: Normal, Indent: Left: 0.49", First line:
3.75.4 La edad dorada nazarí (S.XIV) .......................................... 0.49", Line spacing: single, Tab stops: Not at 6.3"
3.75.5 Decadencia y caída del Reino ............................................
4. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................. 28
4.1 PROTOCOLO GENERAL .................................................................... 29
4.2 ANÁLISIS GENÉTICO MOLECULAR................................................. 29
4.2.1 MuestrasProtocolo general de trabajo .......................... 29
4.2.2 Proceso de eExtracción del ADN ................................. 30
4.2.3 Proceso de cCuantificación del ADN ...............................
4.2.4 Proceso de amplificación del ADNPurificación del producto
de PCR ..............................................................................
4.2.5 Purificacion del producto de PCRSecuenciación del ADN
mitocondrial ......................................................................
4.2.6 Purificación del producto de Ssecuenciación ...................
4.2.7 Purificacion del producto de secuenciaciónElectroforesis
capilar ...............................................................................
4.2.8 Electroforesis capilar
Formatted: Font: (Default) Calibri, 16 pt, Bold, Font
color: Custom Color(RGB(52,90,138))
4.
Left + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.5"
................................................................................................................ 5 .
ABSTRACT .................................................................................................................. 7 Formatted: Font: Times New Roman, Bold, Font
color: Custom Color(RGB(49,132,155))
5. OBJETIVOS 8
6. INTRODUCCIÓN 10 Formatted: Indent: Left: 0.5", Line spacing: single,
No bullets or numbering, Tab stops: Not at 6.3"
3.1 LA MITOCONDRIA: generalidades 10
3.2 GENOMA MITOCONDRIAL HUMANO 10 Formatted: Indent: Left: 0.5", Line spacing: single,
3.2.1 Estructura y organización del ADN mitocondrial 10 Tab stops: Not at 6.3"
3.4.1 Clasificación de las bases de datos Formatted: Font color: Custom Color(RGB(13,13,13))
3.4.2 Bases de datos Formatted: Indent: Left: 0.5", Line spacing: single,
3.5 REINO DE GRANADA Tab stops: Not at 6.3"
3.5.1 Introducción
3.5.2 Territorio del Reino Nazarí de Granada Formatted: List Paragraph, Indent: First line: 0", Line
3.5.3 Una época de prosperidad spacing: single, Tab stops: Not at 6.3"
3.5.4 La edad dorada nazarí (S.XIV) Formatted: Indent: Left: 0.5", Line spacing: single,
3.5.5 Decadencia y caída del Reino No bullets or numbering, Tab stops: Not at 6.3"
4. MATERIALES Y MÉTODOS Formatted: Normal, Indent: Left: 0.49", No bullets or
4.3 PROTOCOLO GENERAL numbering
4.4 ANÁLISIS GENÉTICO MOLECULAR
Formatted: Font: Times New Roman, Bold, Font
4.4.1 Protocolo general de trabajo color: Custom Color(RGB(49,132,155))
4.4.2 Extracción del ADN
Formatted: Numbered + Level: 1 + Numbering Style:
4.4.3 Cuantificación del ADN 1, 2, 3, … + Start at: 7 + Alignment: Left + Aligned at:
4.4.4 Purificación del producto de PCR 0.49" + Indent at: 0.74"
4.4.5 Secuenciación del ADN mitocondrial
4.4.6 Purificación del producto de secuenciación
4.4.7 Electroforesis capilar
9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL ADN MITOCONDRIAL
RESULTADOS
10. ...................................................................................................................... 6.
ABREVIATURAS
A José Antonio Lorente, Juan Carlos Álvarez y María Saiz Guinaldopor la confianza
depositada en mí para formar parte de su equipo de investigación. Gracias José por darme
la oportunidad de entrar en tu grupo, de otro modo no podría haber realizado uno de mis
grandes sueños. Gracias Juan Carlos director de este trabajo, por depositar tu confianza en
mi persona y por poner todos los medios disponibles a mi alcance. Gracias María por
permitirme trabajar y aprender contigo y adentrarme en el mundo de la genética forense, por
mostrarme tu amistad y valiosos consejos.
A mis amigos, en especial a mis grandes amigas, “Mis florecillas”, Cristina, Inma, y Laura,
por escucharme, aconsejarme, comprenderme y apoyarme tanto en los momentos
gratificantes como en los difíciles. Por ser la parte de la familia que uno escoge. A mi
pequeña Maite porque la distancia nunca ha sido problema para tener su apoyo y su
cariño.A Ale por estar dispuesto a escucharme, tranquilizarme y a disfrutar conmigo, por
estar ahí día a día. A Javi por confiar siempre en mí, escucharme, alegrarme y poder contar
con el siempre que lo he necesitado. A mis compañeros demáster porque durante este año,
siempre han estado apoyándome y animándome.
A mi familia, que siempre se preocupa de cómo me va, por su amor, por sus palabras de
alientoy por soportar mis largas ausencias.
A mis padres, José y Montse, por confiar en mí, por vuestro cariño, porque siempre estáis
apoyándome, sin dejarme retroceder y dándome el apoyo necesario para seguir hacia
delante y no rendirme nunca en alcanzar mis metas. Por ser mi ejemplo de constancia,
perseverancia y esfuerzo. Gracias por estar siempre y por poder contar con vosotros para
todo.
A mi hermana y mi cuñado, Delaya y Álvaro, por estar siempre a mi lado, por saber
aguantarme en los momentos difíciles, por su paciencia,por su ayuda incondicional y por
hacerme ver que en todo momento debía hacer aquello que me gustase, por ello hoy estoy
aquí.
A mis abuelos, por transmitirme sus valores y su filosofía de vida, en especial a mi abuelo
Antonio, “Mi sheriff”, por creer siempre que podría llegar a donde quisiera en la vida y
porque sé que estés donde estés, siempre estarás conmigo ayudándome a seguir adelante.
Gracias a todos
Abstract
7
Acuarela de la sala de las dos hermanas. Granada. La Alhambra. (EduardGerhardt)
8
1. Caracterización de las líneas mitocondriales a través de la secuenciación de la región
control completa del ADN mitocondrial de muestras del Reino de Granada.
9 8
Acuarela de la sala de la justicia. Granada. La Alhambra. (Trevor Haddon).
3 Introducciónn
3.1 LA MITOCONDRIA: generalidades
Las mitocondrias son orgánulos intracelulares cilíndricos y alargados, que presentan
un tamaño similar al de las bacterias, pero es variable según su origen y estado metabólico
(miden aproximadamente 1 x 2 μm). Están presentes en prácticamente todas las células
eucariotas, hay aproximadamente 2000 mitocondrias por célula, aunque las células con
mayor actividad metabólica tienen un mayor número en comparación con las de menor
actividad [1].
En cuanto a su estructura, se encuentran rodeadas por una membrana externa (MME)
y una membrana interna (MMI), que separan el espacio intermembranal [2]. La membrana
mitocondrial externa, lisa, se encuentra en contacto con el citoplasma, mientras que la
membrana mitocondrial interna, muy plegada, presenta invaginaciones hacia la matriz
mitocondrial, denominadas crestas mitocondriales.
La función de estos orgánulos se basa en suministrar la mayor parte de la energía
necesaria para la actividad celular; ya que, sintetizan ATP a expensas de glucosa, ácidos
grasos y aminoácidos por medio de la fosforilación oxidativa [2,3].
En relación al origen de las mitocondrias, actualmente, se acepta la teoría
endosimbionte presentada por Lynn Margulis en el año 1967, según la cual, las mitocondrias Formatted: Highlight
3.2 GENOMA MITOCONDRIAL HUMANO Formatted: Font: 16 pt, Italic, Font color: Custom
Color(RGB(75,172,198))
10
forense como en antropología molecular. Formatted: Font: Times New Roman
Figura 1: Comparación de la organización del genoma nuclear y mitocondrial. Fuente propia. Formatted: Font: Times New Roman
11
En relación a la organización del ADNmt, podemos decir que se encuentra dividido en dos Formatted: Indent: Left: 0", Space After: 12 pt
La región no codificante del genoma, denominada región control, es la Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.49", Space
After: 12 pt, Bulleted + Level: 1 + Aligned at: 0.25" +
responsable de la regulación del ADNmt. Contiene fundamentalmente los promotores de la Indent at: 0.5"
ARNtPro
ARNtPhe ARNtThr
OH
Citocromo b
ARNr 12s ARNtGlu
ARNtVal
ARNtTrp
Genes ATP sintasa
ARNtAla
ARNtAsp
Región control
ARNtCys
ARNtTyr ND4L
ARNtArg
ARNtGly
Citocromo-oxidasa II
Citocromo-oxidasa III
ARNtLys
ARNtSer Citocromo-oxidasa II
ARNtLeu
Figura 2: Ilustración del Genoma mitocondrial humano. Se observa la cadena pesada (H) representada mediante la
línea exterior y la cual contiene una mayor cantidad de residuos de A y G que la cadena ligera (L). Fuente propia.
12
Formatted: Indent: Left: 0", Space After: 12 pt
La región codificante, que representa el 90% del genoma mitocondrial, contiene 37 Formatted: No bullets or numbering
genes, altamente empaquetados. Éstos se corresponden con dos ARN ribosómicos (rARN)
componentes de los ribosomas mitocondriales (ARNr 12S y 16S), 22 ARNs de transferencia
(ARNt) necesarios para la traducción dentro del orgánulo, y 13 polipéptidos [12,18] muchos
de los cuales son subunidades de complejos multiméricos localizados en la membrana
mitocondrial interna y que se encargan de catalizar la fosforilación oxidativa y participar en
la producción de ATP [19]. Los 13 polipéptidos codificados por el ADNmt incluyen 7 de las
48 subunidades del complejo I (ND1-6 y ND4L), 1 de las 11 subunidades del complejo III
(citocromo b), 3 de las 13 subunidades del complejo IV (COXI-III) y 2 de las 14 subunidades
del complejo V (ATPasa 6 y 8) [20].
Se estableció una nomenclatura para referirse a las posiciones en el genoma siguiendo
un criterio arbitrario, así: la posición 1 se encuentra en una región intermedia de la región
control y se continúa en sentido 5’ – 3’ hasta la posición 16 569 [6].
Figura 3: Región control completa: posiciones de las tres regiones hipervariables dentro de la región control..
Fuente propia.
De modo que, la región control se extiende desde la posición 16 024 hasta la 16 569 y
desde la 1 hasta la 576 y es muy polimórfica. Dentro de ésta región, distinguimos dos
regiones hipervariables bien caracterizadas, y conocidas como la región hipervariable I, HVI,
(16 024-16 365) y la región hipervariable II, HVII (73-340) [21], y una tercera región
hipervariable, menos utilizada, HV3, (440-560) [22]. Además, existen otras regiones que
presentan menor grado de variabilidad conocida como región variable 1 (VR1), que se
localiza desde la posición 16 366 hasta la 71 y la región variable 2 (VR2) que se encuentra
13
entre las posiciones 341 y 576 [6].
14
14368 ND6 G C Error
de copias por célula. El ADN nuclear se encuentra en dos copias por célula en organismos
diploides, mientras que un oocito maduro se estima que tiene miles de mitocondrias y más de
100 000 copias de ADN mitocondrial [34]. En células somáticas esta cantidad varía de 200 a
1700 copias de ADNmt dependiendo del tipo de tejido [9]. Esta característica permite que sea
mucho más sencillo obtener ADN mitocondrial de una muestra que obtener ADN nuclear, lo
que le confiere una gran utilidad en muestras de restos mínimos y/o antiguos.
cuales desempeñan una función protectora del ADN nuclear), no dispone de un sistema de Formatted: Highlight
reparación del ADN, no presenta intrones (lo que aumenta la probabilidad de que las
mutaciones afecten a las secuencias codificantes) y se encuentra altamente expuesto a los
radicales libres de oxígeno generados por la fosforilación oxidativa [16]. Esta peculiaridad
hace que el ADN mitocondrial sea muy útil para diferentes estudios en genética evolutiva y
genética forense [35].
La tasa de evolución varía en función de la frecuencia con la surgen nuevas
16
mutaciones en la molécula y la probabilidad de que estas nuevas mutaciones se fijen en la
población (tasa de fijación). Para estimar la tasa de mutación del ADNmt pueden utilizarse
diferentes aproximaciones: a través del estudio de pedigríes o a través del estudio de la
filogenia. Para entender las diferencias existes en cada una de los tipos de aproximación, hay
que considerar que existen posiciones dentro de la región control conocidas como “puntos
calientes de mutación” cuya tasa de mutación es 4 o 5 veces mayor que la media [37].
Pero hay que destacar que la tasa de mutación no es igual en todas las regiones del
ADN mitocondrial, ya que la región control se caracteriza por presentar una tasa de mutación
más elevada que la región codificante, donde la tasa de mutación estimada es de 2-4%
[38,39]. Los primeros estudios realizados sugieren datos cercanos a una tasa de mutación en
el ADNmt de uno de cada treinta generaciones [40,41], pero a pesar de la herencia materna y
de la ausencia de recombinación, las mutaciones posibilitan que se puedan encontrar una o
más diferencias en la secuencia de ADNmt en la rama materna de una familia. Se ha
estimado que entre dos individuos de origen europeo no relacionados por vía materna, hay
una media de 8 diferencias en la secuencia de su ADNmt [42].
3.3.4 Heteroplasmia
Se denomina heteroplasmia a la presencia de diferentes subpoblaciones de ADNmt en
una mitocondria, célula, tejido, órgano o individuo [43,44]. Se produce debido(a causa) a la Formatted: Highlight
17
193 en HV1 y 303-310 en HV2 [52,53].
Cuando una célula heteroplásmica se divide, la herencia mitocondrial de las células Formatted: Font: 8 pt
hijas es una cuestión de azar. Tras varios ciclos de división, el ADNmt puede derivar hacia el
mutante puro o hacia el normal puro (homoplasmia) en un proceso conocido como
segregación replicativa. Este proceso puede suceder durante la replicación de la célula
somática o durante la proliferación de las células germinales femeninas.
Formatted: Underline
Formatted: Not Highlight
Formatted: Not Highlight
Figura 6: Posiciones de la secuencia del genoma mitocondrial donde se puede observar heteroplasmia de longitud.
Imagen tomada y modificada de Butler, … (REF) 2012.
18
3.4 ADNmt Y GENÉTICA DE POBLACIONES Formatted: Font: 16 pt
Hay varias características de ADNmt que lo convierten en una herramienta útil para la
investigación en genética de poblaciones. La primera y más importante es su estricta herencia
materna [38,54–57]. Otro atributo del ADNmt es que las moléculas de ADNmt no sufren
recombinación, de manera que las mutaciones son la única fuente de diversificación genética
[37]. En relación con los estudios de genética de poblaciones, la tasa de mutación elevada de
ADNmt es importante porque conduce a una fijación de polimorfismos de nucleótido único
(SNPs) en y entre las poblaciones [35,58]. La variación en los perfiles de mutación del
ADNmt es muy importante en los estudios filogeográficos de dispersiones humanas e
interacciones, ya que permiten determinar el origen geográfico del genoma matrilineal de un
individuo.
La caracterización del ADNmt en poblaciones humanas, en los últimos años ha
ayudado a aclarar cuestiones centrales sobre la evolución humana [59], siendo muy útil como
herramienta filogenética [55,60–64]. Las variaciones presentes en el ADN mitocondrial
pueden contribuir para la construcción de árboles filogenéticos o varios árboles alternativos
dispuestos en red [65–68], que describen la relación entre secuencias individuales. La
estructura de este árbol contiene información demográfica que, junto con una tasa de
mutación calibrada para la secuencia en estudio, puede ser utilizada para estimar la datación
de eventos prehistóricos. Actualmente aporta datos muy significativos en los estudios
relacionados con la caracterización genética e inferencia del origen e historia demográfica de
poblaciones antiguas y modernas de diferentes continentes.
19
“RFLP” usando cinco o seis enzimas de restricción [70]. Rápidamente, se incorporaron un
mayor número de enzimas (12 o 14), aumentando con ello la resolución de la técnica (RFLPs
de alta resolución) [38,54,71,72]. A principios de los 90, el análisis de secuencia de ADNmt a
partir de porciones de la región de control comenzó a ser altamente aceptado.
Finalmente con la introducción de la PCR [73] empezó a ganar importancia la
secuenciación del ADNmt, posibilitando una nueva aproximación al estudio molecular de las
poblaciones humanas. La resolución proporcionada por los nuevos análisis de secuenciación
permitió realizar una disección más detallada de los tipos mitocondriales individuales.
Inicialmente, los análisis se centraron en la región control o D-loop mitocondrial,
ampliándose posteriormente a otras regiones no codificantes del genoma mitocondrial.
La combinación de ambos procedimientos, RFLPs y la secuenciación de las regiones
hipervariables, ha proporcionado ,buenas estimaciones filogenéticas, que han sido
posteriormente confirmadas mediante la secuenciación del genoma mitocondrial completo
[70]. De esta forma, los estudios filogeográficos del ADNmt humano han revelado una
correlación significativa entre los linajes del ADNmt y los orígenes geográficos de las
poblaciones humanas. Estos linajes se establecen sobre la base de grupos de secuencias de
ADNmt individuales (o haplotipos) relacionadas, conocidos como haplogrupos.
3.43.2 Haplogrupos
El análisis molecular de las secuencias de ADN mitocondrial ha revelado que la
variación de las mismas se ha acumulado secuencialmente a partir de algunos linajes
fundadores, durante el proceso de colonización humana de las regiones geográficas, por lo
cual es posible establecer grupos de secuencias que se pueden asociar geográfica o
étnicamente [74]. A partir del análisis filogenético de los linajes mitocondriales, se ha
observado que los individuos a menudo se agrupan en haplogrupos. Se define haplogrupo
como la agrupación de haplotipos que comparten ciertas sustituciones diagnósticas y que
presentan un origen común. Algunos de ellos pueden ser definidos por los polimorfismos de
un solo nucleótido [75,76] y son específicos para los Africanos, Europeos, Asiáticos o
Amerindios [77].
Estos haplogrupos fueron definidos originalmente a finales de los años 80 y principios
de los 90 mediante la agrupación de las muestras con patrones iguales o similares cuando se
sometieron a una serie de enzimas de restricción que se utilizaron para separar los distintos
tipos de ADN mitocondrial de poblaciones diversas de todo el mundo.
20
En 1996, Torroni muestra que existe una correlación entre los haplogrupos definidos
por RFLPs y las secuencias para HVI y HVII. Así, Wallace y Torroni [78] propusieron una
nomenclatura que identifica los clústeres principales designándolos con una letra mayúscula
(Ej.: A, B, C, D, H, I, L, U, V). Los clústeres se dividen en sub-clústeres que se designan por
su letra correspondiente seguida de un número (Ej.: L2). Las subdivisiones al nivel siguiente
se realizan alternando letras minúsculas y números (Ej.: U5a1b).
De este modo se definió que los haplogrupos A, B, C, D, E, F, G y H estaban
típicamente asociados con poblaciones asiáticas, mientras que la mayoría de las poblaciones
nativo americanas pertenecen a los haplogrupos A, B, C, y D, siendo el más frecuente en los
grupos étnicos mesoamericanos el A [79,80]. Los haplogrupos L0, L1, L2 y L3 son
exclusivamente africanos, y los haplogrupos H, I, J, K, T, U, V, W, y X están típicamente
asociados con poblaciones europeas [75], siendo el haplogrupo mayoritario en la población
española, el haplogrupo H [81,82].
Figura 7: Expansión de las poblaciones humanas siguiendo la distribución de haplogrupos de ADNmt. Fuente
propia
21
Basándose en la teoría del reloj molecular [83–85] se estableció que la historia de la
migración humana tendría su origen en África, continente en el que el Homo sapiens pudo
surgir hace unos 150 000-200 000 años con el primer haplogrupo africano específico, L0
[60,86], y fue evolucionando dando lugar a la aparición de los linajes L1, L2 y L3.
En el nordeste de África, L3 habría generado dos nuevos linajes, M y N, los cuales
marcarían la salida del hombre moderno fuera de África, y por tanto, constituirían los
antecesores de todos los linajes de ADNmt de Europa, Asia, América y Oceanía. Se estima
que estos linajes pudieron haber colonizado Eurasia hace unos 65 000 años. Mientras que en
Europa, N daría lugar a los haplogrupos H, I, J, U, K, T, U, V, W y X; en Asia, M y N
originarían un diverso rango de haplogrupos. Finalmente, a partir de N surgirían A, B, F, C,
D, y el haplogrupo G a partir de M [60,75,87–89].
3.5 APLICACIONES DEL ADNmt Formatted: Font: 16 pt, Italic, Font color: Accent 5
Formatted: Left, Indent: First line: 0", Line spacing:
single, Widow/Orphan control, Adjust space between
Latin and Asian text, Adjust space between Asian text
Las características que presenta el DNAmt permite que pueda ser muy útil en and numbers
cuenta con familiares de primer grado y se ha de recurrir al estudio de familiares Formatted: Font: Not Bold
lejanos o bien cuando se ha de realizar identificación de restos óseos contando con Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt
22
o muy baja [6]. Este estudio del ADNmt complementa el análisis de polimorfismos Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt
del ADN nuclear, proporcionando información adicional. Formatted: Font: (Default) Times New Roman
Evolución y genética de poblaciones: Destaca por sus aplicaciones en Antropología Formatted: Font: Times New Roman
Física o Biológica. La caracterización del ADNmt en poblaciones humanas, tanto Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt
Formatted: List Paragraph, Justified, Space Before:
actuales como antiguas, en otros primates, y en fósiles del género Homo, ha ayudado 0 pt, After: 0 pt, Line spacing: 1.5 lines, Bulleted +
Level: 1 + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.5", No
a lo largo de los años a aclarar cuestiones centrales de la evolución humana [59]. widow/orphan control, Don't adjust space between
Latin and Asian text, Don't adjust space between
El ADNmt se puede usar para el cálculo de los polimorfismos genéticos de la Asian text and numbers
población, estimando las distancias genéticas entre individuos, y construyendo un
Formatted: Font: Times New Roman
árbol filogenético [55,60–64]. Se puede trazar el ancestro de un grupo particular de Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt
personas y encontrar relaciones genéticas entre las poblaciones, reconstruyendo así, la Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt
historia genealógica y demográfica de la población. Además estos estudios son muy Formatted: Font: Times New Roman
Formatted: Font: Times New Roman, 12 pt
útiles para conocer la historia de las migraciones de poblaciones humanas.
Formatted: Font: Times New Roman, 12 pt
Estudios asociados a enfermedades: El estudio del DNAmt puede ayudar a asociar
Formatted: Font: 12 pt, Not Bold
las enfermedades con haplogrupos o incluso con haplotipos particulares, para así Formatted: Font: Times New Roman, 12 pt
poder realizar un perfecto diagnóstico de los pacientes a la hora de realizar un panel
de marcadores genéticos . Formatted: Font: Times New Roman, 12 pt
Se ha demostrado por ejemplo, que el haplogrupo mitocondrial J es un factor Formatted: Font: Times New Roman
Formatted: Font: Not Bold
protector frente al desarrollo de la artrosis de rodilla y de cadera. Otros estudios
Formatted: Font: Not Bold
proporcionan información sobre el efecto protector de los clústeres UK y TJ sobre la
Formatted: Font: Not Bold
enfermedad de Parkinson [90], mientras que, parece ser que el clúster HV y el Formatted: Font: Not Bold
haplogrupo H otorga una mayor predisposición a algunas enfermedades Formatted: Font: Not Bold
neurodegenerativas como el Parkinson y el Alzheimer [91,92]. Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt
Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt
Además, también se ha encontrado relación entre los haplogrupos y la
Formatted: Indent: Left: 0.5", First line: 0.44"
probabilidad de padecer diferentes tipos de cáncer (mama, colorectal y tiroideo) [93]
Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt
o incluso la asociación de los haplogrupos con el envejecimiento [94]. Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt
Formatted
23
Debido a la acumulación de datos de ADN, en la actualidad, en genética forense, se
pueden clasificar de las bases de datos en base a su contenido y su finalidad:
Clasificación según el contenido: las bases de datos solo pueden contener resultados y
datos, es decir, solo se consideran bases de datos aquellas que en un soporte de papel
o informático, contienen letras y números que identifican a una persona de entre todas
las demás.
Clasificación según su finalidad: pueden ser generales (comprenden a toda una
población o país), profesionales (archivo biológico que incluye a profesionales de
riesgo), judiciales o forenses: forenses criminales (acumulan datos de personas que
han sido condenadas o procesadas) y forenses civiles (identificación de personas
desaparecidas).
El ascendente número de secuencias de ADNmt poblacionales que se han ido
incorporando a la literatura y a las bases de datos, ha permitido mejorar nuestro conocimiento
sobre la filogenia mundial del ADNmt, pero dicha cantidad de información también ha
supuesto una serie de obstáculos para los laboratorios a la hora de su manejo. La
interpretación de las secuencias de ADNmt puede ser complicada, y tanto las etapas de
secuenciación como de documentación de los datos obtenidos pueden ser importantes fuentes
de errores [96–99].
Actualmente existen bases de datos de más de 1000 individuos no relacionados que
han sido recopiladas de varios grupos de población [42,100–103]. Unas de ellas son bases de
datos activas y otras muchas en desarrollo.
24
La base de datos EMPOP(EDNAP mtDNA Population Database),Esta base de Formatted: Font: Not Italic
erróneos en la medida de lo posible e intenta cubrir todas las poblaciones del mundo, donde
la mayoría de los perfiles incluidos pertenecen a poblaciones de países del oeste de
Europa[103]. Actualmente almacena 5173 secuencias forenses repartidas de la siguiente Formatted: Font: Times New Roman
forma[104]: 4476 haplotipos del oeste de Europa, 162 haplotipos del este de Asia, 187 Formatted: Font: Times New Roman
Formatted: Font: Times New Roman
haplotipos del sureste de Asia y 348 haplotipos de África.
Formatted: Font: Times New Roman
C. DNAmt Manager
Esta base de datos Ccontiene 9294 secuencias de la región de control del ADNmt
agrupados en cinco subconjuntos: África (1496), de Eurasia occidental (3673), de Asia
oriental (2326), de Oceanía (114), y se mezcla (1685). Muchas de estas secuencias son
compartidas entre las bases de datos del FBI y EMPOP y por tanto no son de haplotipos
"únicos" de individuos no relacionados [105].
Formatted: Justified
D. MitoVariome
Se trata de una base de datos que se compone de más de 5000 secuencias humanas Formatted: Justified, Indent: First line: 0.49"
completas de ADN mitocondrial [106]. Los datos se han obtenido desde GenBank,
MITOMAP y MTDB, de modo que proporciona asignación de haplogrupo propocionada por Commented [MSG1]: q significan estas siglas?
E. PhyloTree
Muchas aplicaciones requieren un conocimiento altamente detallado acerca de la
relación filogenética de variantes del ADN mitocondrial. La resolución filogenética de la
diversidad de ADNmt humano mundial ha mejorado en gran medida por los avances en
secuenciación de genomas completos de ADN mitocondrial. Para facilitar la información
para el uso de la variación de ADNmt, se ha construido una filogenia integral actualizada de
la variación de ADN mitocondrial humano, basada en datos de codificación y de la región
control, incluyendo la nomenclatura del haplogrupo universal, y proporcionando referencias a
los documentos consultados. PhyloTreeRecoge ha recopilado información de 55
25
publicaciones basadas en las variaciones en la secuenciación del ADN mitocondrial completo
para la realización de una versión actualizada y completa de un árbol filogenético . Para los
casos en los cuales la información relativa a un mismo haplogrupo, phylotree elaboró una
filogénia comparando el número máximo de secuencias de ADNmt disponibles del
haplogrupo en particular, para obtener una imagen a tamaño real actualizada. Además
utilizaron otras secuencias de ADNmt completo publicados, los cuales no han sido
incorporados en los esquemas filogenéticos[64].
Se trata de una base de datos, queFfue creada para abordar cuestiones específicas
sobre los orígenes evolutivos y la bioquímica de los orgánulos, así como la relación entre la
estructura del genoma y las funciones además de otras cuestiones de biología comparativa
[107,108]. Proporciona datos sobre la secuencia, estructura secundaria del ARN e
información bioquímica y taxonómica sobre la mitocondria y el cloroplasto . La versión 6
(2002) presenta secuencias analizadas y comentadas derivadas de GenBank[108] y contiene
más de 130 000 secuencias mitocondriales, de las cuales 408 pertenece a genomas completos,
un aumento del 37% con respecto a la versión anterior. Esta base de datos utiliza un sistema
java para la verificación de datos de la población denominado GoPOP [109].
Formatted: Justified
G. HmtDB
Es un recurso bioinformático destinado a apoyar la genética de poblaciones y los
estudios de enfermedades mitocondriales, gracias a un nuevo enfoque basado en SNPs y la
estimación de la variabilidad de aminoácidos. Contiene más de 17.000 genomas
mitocondriales humanos. Se compone de 24 cuadros que almacenan secuencias del genoma
mitocondrial humano y sus datos característicos tales como geográfica, étnica y / o de la
población y la información lingüística, así como información acerca de la fuente de la que se
extrajo el ADN y el método utilizado para extraer y la secuencia de la misma[105].
26
3.53.7 REINO DE GRANADA Formatted: Font: 16 pt
Formatted: Indent: Left: 0", Hanging: 0.49", Outline
numbered + Level: 2 + Numbering Style: 1, 2, 3, … +
Start at: 7 + Alignment: Left + Aligned at: 0.49" +
3.74.1 Introducción Indent at: 0.99"
La dinastía Nazarí se formó en el S. XII debido a una situación histórica y unas
circunstancias políticas que se produjeron tras un proceso de declive y desestructuración de
Al-Andalus (derrota de las Navas de Tolosa, 1212), que precipitó la caída de las principales Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt
ciudades del Guadalquivir [111,112]. La dinastía Nazarí Ffue la última dinastía musulmana Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt
que dominó el Reino de Granada desde el año 1238 hasta Enero del año 1492 [113,114].. Su
caída dio lugar al final de Al-Andalus.
El creador del Reino de Granada fue La fundacióndel Reino Nazarí de Granada en el
siglo XIII no habría sido posible sin una personalidad como la de su fundador, el emir
Muh ̣ammad Ibn Yusuf Nars Ibn I (m. 1273), que hasta el año 1232 había sido solo señor de
Arjona y el cual en poco tiempo, logró extender su autoridad a Jaén, Porcuna, Córdoba,
Guadix y Baza. Fue conocido como “hijo del rojo”, el cual dio lugar al nombre de la alcazaba
que escogió como residencia en Granada: “La Roja”, “La Alhambra” [115].
27
Figura 8: Mapa territorio del Reino Nazarí de Granada. Fuente propia
del reino, la alianza con los mariníes y el recrudecimiento de la guerra contra Castilla Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt,
Not Bold, No underline
centrada principalmente en la posesión de Gibraltar. se debe el mérito de apuntalar y
desarrollar los logros conseguidos por su padre y de organizar este incipiente emirato,
dotándolo de estructuras administrativas propias. Posteriormente, su hijo Muhammad III,
conocido como erudito, poeta y constructor de la Gran Mezquita de la Alhambra, gobernó Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt,
Not Bold, No underline, Font color: Auto
desde el año 1302 a 1309 y , fue reconocido como señor de Ceuta. y se preocupó de dotar a
la Alhambra de unas dependencias apropiadas para una ciudad palatina.En Marzo de 1309
Nasr destronó a su hermano y accedió al trono en un momento de crisis que no consiguió
resolver, incluso incrementándola debido a las batallas por el dominio del estrecho de
Gibraltar.
28
de Isma‘il I, sobrino de Nasr, por lo que se se da un cambio de rama familiar reinante dentro Formatted: Highlight
enesmitad existente entre el visir y ´Utman b. Abi l-Ula, lo cual casi da lugar a una guerra Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt,
Not Bold, No underline
civil en Granada, Alfonso XI se apoderó de alguna plaza y castillos en la frontera. Ante estos Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt,
Not Bold, No underline
acontecimientos Muhammad IV solicitó ayuda a los meriníes y se hizo con Cabra y Priego,
Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt,
pero a su regreso de Gibraltar a Granada sufrió una emboscada y fue asesinado por dos hijos Not Bold, No underline
de ´Utman b. Abi l-Ula. Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt,
Not Bold, No underline
De este cambio sería heredero su hijo Yusuf I, hijo menor del sultán Ismail I, fue al
Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt,
ser proclamado emir en 1333, con tan sólo 15 años de edad, y su reinado fue uno de los más Not Bold, No underline
fructíferos, ya que tuvo un gran apogeo político, cultural y económico.. Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt,
Not Bold, No underline
El reinado de Yusuf I fue, uno de los más fructíferos.Se caracterizó por la firma de
Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt,
pacíficos tratados con los reinos de su tiempo, tanto cristianos (Castilla y Aragón) como Not Bold, No underline
Yusuf III, al cual arrebató el trono su primo Muhammad VIII.Hacia el S.XV, con el sultán Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt,
Not Bold, No underline
Muhammad VII (1392-1408) se reemprendió la ofensiva contra Castilla. Este hecho debilitó
su ejércitoque junto con la creciente estabilidad cristiana y su aumento de recursos y
población, produjo una leve pero constante deriva en el Emirato Nazarí.
En 1417 con la llegada al trono de Muhammad IX, se rompe de nuevo la línea de Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt,
Not Bold, No underline
sucesión. Éste formó alianza con los reyes de Aragón y Navarra desencadenando una guerra
Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt,
contra Castilla. Not Bold, No underline
29
Esta dinastía tuvo un total de 20 sultanes o emires granadinos. Muley Hacén (que dió
nombre al pico más alto de Sierra Nevada), el Zagal y Boabdil (conocido como “el Rey
Chico”), fueron los últimos soberanos de la dinastía nazarí. Los tres se vieron implicados en
la llamada "Guerra de Granada", que abarcó desde 1481 (con la toma de la plaza de Zahara,
cerca de Ronda) hasta principios de 1492, cuando Boabdil entregó Granada a los Reyes
Católicos. Este hecho puso fin a más de 260 años de reinado nazarí [117].
Figura 8: Mapa territorio del Reino Nazarí de Granada. Fuente propia Formatted: Underline
30
Litografía de acuarela del patio de los leones. La Alhambra, Granada. (Parcerisa, F. J.).
4 Materiales y
métodos
4.1 PROTOCOLO GENERAL DE TRABAJO
Una vez conocidaos las características y peculiaridades del los conceptos básicos del
ADNm,tasí como y su útil las características de los fragmentos del ADN que se utilizan
enaplicación en Genética Forense y Antropología Molecular, es necesario saber es destacable
indicar que las estructuras de ADNmt se pueden extraer a través de muestras de piel, uñas,
sangre, saliva, cabellos, huesos…, dientes…
El procedimiento analítico en el laboratorio, siempre sigue unos unas pautas o pasos
comunes:
a. Proceso de extracción del ADN.
b. Cuantificación del ADN extraído.
c. Amplificación del ADN
d. Proceso de electroforesis
e. Análisis de los resultados
Figura 9: Proceso de evaluación de una muestra de ADNmt. Fuente propia Formatted: Underline
Se varían Llos protocolos se varían en los distintos pasos en función del tipo, calidad
y cantidad de la muestra.
Formatted: Normal, Line spacing: single
4.2ANÁLISIS GENÉTICO MOLECULAR
4.2.1 Muestras
Para el desarrollo de este trabajo se ha procedido al análisis de marcadores de ADN
mitocondrial en muestras no emparentadas, con fines genético-poblacionales.
Para la realización de los estudios poblacionales se han utilizado muestras de Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.49", Tab
stops: Not at 0.15" + 0.5"
empleado67 individuos de la provincia de Granada, 58 individuos de la provincia de Málaga
y 60 individuos de la provincia de Almería. Todos los donantes fueron informados del
32
propósito de este estudio, aceptaron su participación y firmaron un consentimiento informado
según la guía ética de la declaración de Helsinki.
Formatted: Indent: Left: 0", Tab stops: Not at 0.15" +
0.5"
4.2.2 Proceso de extracción del ADN
Se tomaron muestras del epitelio bucal de todos los individuos mediante hisopos Formatted: Indent: First line: 0.49"
33
4.2.3 Proceso de cuantificación del ADN
Una vez que se ha realizado la extracción de ADN, en mayor o menor cantidad y más
o menos purificado, se debe comprobar la integridad y la cantidad del mismo. Se ha realizado Commented [MSG2]: Es mejor que pongas esta imagen
en la cuantificación de la ampli o la comprobación de la
mediante la separación por electroforesis en geles de agarosa al 0,8%, utilizando el colorante amplificación
Gel Red para teñir el gel y comparando las muestras con los distintos controles según la Formatted: Font: Times New Roman
Formatted: Normal (Web), Justified, Indent: Left:
intensidad de la fluorescencia que emiten al someterlos a luz ultravioleta. 0.5", Line spacing: 1.5 lines
Es importante determinar correctamente la concentración del ADN ya que, tanto un Formatted: Normal (Web), Justified, Line spacing:
1.5 lines
defecto como un exceso de ADN en la reacción de PCR pueden dar lugar a resultados
Formatted: Justified, Indent: First line: 0.49", Line
negativos o a problemas a la hora de interpretar de los resultados. spacing: 1.5 lines
Figura 10: Gel de agarosa al 0,8%. Formatted: Widow/Orphan control, Adjust space
between Latin and Asian text, Adjust space between
Asian text and numbers
Formatted: Font: 11 pt
4.2.4 Proceso de amplificación del ADN Formatted: Font: 11 pt, Italic, No underline
En este trabajo se ha llevado a cabo Lla amplificación de las muestras se ha llevado a Formatted: Font: 11 pt, Italic
Formatted: Left, Indent: Left: -0.25", Bulleted + Level:
cabo mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR (Polymerase Chain Reaction) 1 + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.5"
[118]. En todas las reacciones realizadas, se han amplificado un control positivo, con el cual Formatted: Font: 11 pt, Italic, No underline
podemos (para verificar que la reacción de amplificación ha sido correcta, ) y un control Formatted Table
Formatted: Font: 10 pt
negativo, (para poder descartar posibles contaminaciones [119], además, todas ellas se han
Formatted: Font: 10 pt, Font color: Custom
llevado a cabo dentro de la campana de Color(RGB(49,132,155))
). La amplificación por PCR de ADNmt se hace generalmente con 34 a 38 ciclos. Algunos Formatted: Font: 10 pt, Font color: Custom
Color(RGB(49,132,155))
protocolos para muestras de ADN que están altamente degradadas piden 42 ciclos [111].En Formatted: Font: 10 pt
este proyecto, se han utilizado las siguientes condicionespara realizar el trabajo: Formatted: Font: 10 pt, Font color: Custom
Color(RGB(49,132,155))
Formatted: Font: 10 pt
Formatted: Font: 10 pt, Font color: Custom
Tabla 2x: Cebadores empleados en la amplificación Color(RGB(49,132,155))
La amplificación se ha llevado a cabo utilizando los siguientes primers: Formatted: Font: 10 pt
Formatted: Font: 10 pt
A1 (Cebador directo)L15997 5’-CACCATTAGCACCCAAAGCT-3’
Formatted: Font: 10 pt
H17 (Cebador inverso) 5’-CCCGTGAGTGGTTAATAGGGT-3’
Formatted: Font: 10 pt
L165555(Cebador directo) 5’-CCCACACGTTCCTTAAAT-3’
Formatted: Font: 10 pt, Font color: Custom
Color(RGB(49,132,155))
34
H619 (Cebador inverso) 5’-GGTGATGTGAGCCCGTCTAA-3’
Formatted: Left
Tabla 3X: Componentes del kit de amplificación Formatted: Font: 11 pt, Bold
Formatted: Font: 11 pt
Cebador 0,3 μl
ADN (1-3ng) 1 μl
Volumen final 15 μl
35
Figura 10: Condiciones de amplificación. Fuente propia Formatted: Underline
flanquean el ADN blanco. Sobre la base de esta información se diseñan dos oligonucleótidos
(primers)de alrededor de 15 a 25 pares de bases de longitud. Estos oligonucleótidos actúan
como cebadores para la síntesis in vitro de ADN la cual está habitualmente catalizada por una
36
doble cadena se desnaturalicen por calor; la temperatura, entre 92-95ºC, rompe los puentes de
hidrogeno que mantiene unidas las dos cadenas complementarias y se separan entre si como
cadenas sencillas de ADN que servirán de moldes para la amplificación.
2. Hibridación: Es la fase de “annealing” o de emparejamiento. Una vez que el ADN
está desnaturalizado, dos tipos de moléculas cebadoras (primers), cuyas secuencias son
complementarias a los extremos de las secuencia a amplificar en el ADN, hibridan
específicamente con las secuencias presentes en las moléculas de ADN molde
desnaturalizadas anteriormente. La temperatura de fusión o annealing depende de varios
factores y es relativamente específica para cada primer, por lo que varia entre 60-40ºC. Una
vez hibridadas las moléculas de los cebadores al ADN molde se generan cortos fragmentos
de ADN de doble banda que sirven como puntos de partida para la posterior polimerización.
3. Extensión: Durante este paso la Taq polimerasa incorpora nucleótidos en el extremo
3' del primer utilizando como molde la cadena de ADN previamente desnaturalizada. La
temperatura a la que se lleva a cabo este paso suele ser de 72ºC ya que es la temperatura a la
que la Taq polimerasa alcanza su máxima actividad. Normalmente una extensión de 20
segundos es suficiente para fragmentos menores de 500 pb, y 40 segundos para fragmentos
por encima de 1.2Kb.
Formatted: Font: Times New Roman, Underline
Formatted: Font: Times New Roman, 11 pt, Italic,
Una vez finalizada la reacción de amplificación se han comprobado mostodas las la Underline
37
podido quedar libres en la reacción de amplificación y puedan interferir negativamente en la Formatted: Justified, Indent: First line: 0.49", Line
spacing: 1.5 lines
reacción de secuenciación, se ha de purificar el producto resultante de la amplificación.. Formatted: Font: Times New Roman
Una vez que se ha llevado a cabo la amplificación, para realizar la reacción de Formatted: Font: Times New Roman
38
Figura 121: Condiciones de la reacción de secuenciación. Fuente propia Formatted: Underline
Formatted: Underline
- 5,51,5μl de agua estéril.
El programa utilizado en el termociclador fue: 96ºC durante 1 minuto, Formatted: Font: 8 pt
seguidos de 35 ciclos de 96ºC durante 10 segundos, 50ºC durante 5 segundos y Formatted: Indent: Left: 0.98"
39
Una vez que las secuencias están purificadas se han separado por electroforesis
capilar mediante un secuenciador ABI PRISM 3130® Genetic Analyzer (AB).
Los diferentes fragmentos de ADN se han separado en función del tamaño,
dependiendo de la velocidad de migración de las moléculas cargadas bajo la acción de un
campo eléctrico. La separación se lleva a cabo en un capilar de sílice fundido de pequeño
diámetro y longitud variable. El capilar se encuentra cubierto por poliamida opaca excepto
por una pequeña zona denominada “ventana del capilar” la cual es atravesada por el láser y
permite que las muestras sean excitadas a su paso por la misma.
Finalmente los datos analizados son enviados al ordenador el cual los transforma en
secuencias de ADN. Las secuencias se han visualizado con el programa Sequencing Analysis
(AB), que se encarga de asignar los nucleótidos en cada posición en las secuencias obtenidas.
Posteriormente han sido comparadas con la Secuencia de Referencia de Cambridge revisada
(rCRs) utilizando el programa SeqScape 5.2 (AB).
- Todas los datos de los perfiles genéticos de los individuos que han participado en el
estudio poblacional se han representado en tablas de Excel de forma anónima, es decir
mediante su un código para cada individuo y su perfil genético.
- Cada uno de los polimorfismos encontrados mediante la comparación de las
secuencias con la Secuencia de Referencia de Cambridge revisada (rCRs) utilizando
el programa SeqScape 5.2 han sido introducidos en la aplicación MITOMAP;
disponible en www.mitomap.org/MITOMAP; en la que se ha comprado la frecuencia
con la que se han encontrado los diferentes polimorfismos en base a referencias
bibliográficas.
- En el programa EMPOP; disponible en empop.org; se han analizado los posibles
errores en el recuento de polimorfismos.
- Las frecuencias de los haplotipos encontrados se han calculado mediante hojas de
cálculo, donde se han introducido los diferentes polimorfismos y haplotipos
encontrados en las poblaciones de Granada, Málaga y Almería. Además también han
sido calculadas mediante Arlequin 3.5.2.1. [122].
- Para determinar la subestructura genética de las poblaciónes del Reino de Granada, se
testó la hipótesis de una distribución aleatoria de los individuos entre parejas de
poblaciones mediante un test exacto de diferenciación de la población y el análisis de
40
la varianza molecular (AMOVA) con 10.000 repeticiones experimentales mediante
Arlequin 3.5.2.1. Además, se utilizó STRUCTURE 2.3.4 [123,124]para inferir grupos
de individuos a partir de los datos genéticos de loci no ligados. Para todas las
simulaciones y cálculos, se asumieron los modelos de mestizaje y no mestizaje,
incluyendo información poblacional y asumiendo un modelo de frecuencias alélicas
independientes. Se estableció un periodo de burn-in de 50.000 iteraciones seguido de
100.000 iteraciones adicionales, estimando de 1 a 10 contribuciones (K). Cada carrera
se repitió 10 veces y se calcularon las probabilidades para cada K en cada grupo de
carreras.
- El calculo de los haplogrupos se obtuvo mediante la aplicación on-line: Haplogrep Formatted: Font: Times New Roman
(haplogrep.uibk.ac.at/) basado en Phylotree.org; disponible en www.phylotree.org, en Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt
Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt
la cual al introducir los diferentes polimorfismos muestra el haplogrupo al que
Formatted: Font: Times New Roman
corresponde.
41
Acuarela del Generalife. Granada. La Alhambra. (EduardGerhardt)
6 Resultados
37
y discusión
H5'36 1,19
H7a2 2,38
L2a1 1,19
H2a2a 15,47
H1b1+16362 1,19
U5a2a1+152 1,19
V+@72 3,57
H20a 1,19
U5a2 1,19
K1a 2,38
H10+(16093) 1,19
J2b1a 2,38
H1+16189 2,38
U4a2 2,38
H5 1,19
H3z 2,38
43
H3v+16093 1,19 Formatted: Font: 12 pt
T2b 2,38 6.1 Análisis de ADN
T2c1+146 1,19
HV4b 1,19 mitocondrial
J1c2e2 2,38 Para este trabajo se ha analizado la
región control completa de un total de 185 muestras, pertenecientes a 67 individuos de la
provincia de Granada, 58 individuos de la provincia de Málaga y 60 individuos de la
provincia de Almería. Todas ellas fueron cuantificadas correctamente, 141 se amplificaron de
manera eficaz, pero finalmente se ha conseguido la secuencia completa de la región control,
de 33 muestras de la población de Granada, 38 muestras de la población de Almería y 13
muestras de la población de Málaga.
Para todas las muestras se ha considerado el rango de posiciones 16024-16569 de
RC1 y 1-560 de RC2.
44
(7,96%), A73G (4,77%), T152C (3,18%), A263G (12,10%), y las inserciones -309.1C
(7,32%) y -315.1C (11,46%).
En la población de Málaga se encontraron 39 polimorfismos, entre los cuales más
frecuentes fueron las sustituciones T16311C (5,26%), T16519C (9,47%), A73G (6,31%),
A263G (13,68%) y la inserción -315.1C (13,68%).
En GMA se encontraron un total de 124 polimorfimos siendo los mas frecuentes
T16519C (9,93%), A73G (5,82%), A263G (10,95%), y las inserción -315.1C (10,95%) al Formatted: Font color: Yellow
Total de individuos 38
Probabilidad de coincidencia 0,03185
Diversidad Haplotípica 0,9786
Capacidad de discriminación 92,10%
45
Diversidad Haplotíipica 1
Capacidad de discriminación 100%
Formatted: Indent: First line: 0"
Tabla 5.4: Estudio haplotípico de GMA Formatted: Indent: First line: 0", Line spacing: single
46
A263G, -315.1C
G11 1 0,0119 H1+16189 A16183C, T16189C, T16519C, A263G, - Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
315.1C
A26 1 0,0119 H10+(16093) T16093C, G16129A, T16519C, G121C, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
A263G, -315.1C
G46 1 0,0119 H1a1 A16162G, T16209C, T16519C, A73G, A263G, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
-315.1C
G66 1 0,0119 H1aj1 C16192T, T16519C, A263G, -309.1C, -309.2C, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
-315.1C
A10 1 0,0119 H1b1+16362 T16189C, T16356C, T16362C, T16519C, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
A263G, 315.1C, A523DEL, C524DEL
A47 1 0,0119 H1ba C16270T, T16519C, A263G, -315.1C Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
M18 1 0,0119 H1ba A16051G, C16270T, T16311C, T16519C,
A263G, -315.1C Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
G9 1 0,0119 H1e+16129 G16129A, T16519C, T146C, A263G, -315.1C Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
G68 1 0,0119 H1e+16129 G16129A, T16519C, T195C, A263G, -309.1C,
-309.2C, -315.1C Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
A53 1 0,0119 H1e1a1 T16189C, T16311C, T16519C, A93G, A263G, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
-309.1C, -309.2C,
-315.1C
G7 1 0,0119 H1e1a1 C16169T, T16519C, A93G, A200G, A263G, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
T279C, -315.1C
G51 1 0,0119 H1e1a4 T16311C, C16327T, T16519C, A263G, - Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
309.1C, -309.2C, -315.1C
M6 1 0,0119 H1e1a6 T16519C, C150T, A263G, -315.1C Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
A22 1 0,0119 H20a T16136C, C16218T, C16328A,T16362C,
A249DEL, A263G, T292C, -315.1C Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
A59 1 0,0119 H2a2a A16181G, T16519C, A263G, -315.1C Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
M53 1 0,0119 H2a2a 16188G, T16519C, A263G, -315.1C
G14 1 0,0119 H2a2a T16519C, A263G, -309.1C, -309.2C, -315.1C Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
A43 1 0,0119 H32 G16145A, T16519C, A73G, T152C, A263G, - Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
315.1C
A36 1 0,0119 H3v+16093 T16093C, T16519C, T152C, C182T, A263G, - Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
309.1C, -315.1C, T408A Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
A34 1 0,0119 H3z T16136C, T16519C, G207A, A263G, T293C, -
309.1C, -315.1C Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
A50 1 0,0119 H3z T16519C, A263G, T293C, -315.1C Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
A33 1 0,0119 H5 T16304C, A263G, -309.1C, -315.1C, C456T
A1 1 0,0119 H5'36 T16189C, A263G, -309.1C, -309.2C, -315.1C, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
C456T Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
A45 1 0,0119 H57 T16519C, C64T, T152C, A263G, -309.1C, -
315.1C Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
G19 1 0,0119 H6 T16093C, T16362C, A16482G, 239C, A263G, - Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
309.1C, -315.1C
M8 1 0,0119 H74 T16311C, T72G, A263G, -315.1C Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
A3 1 0,0119 H7a2 T16519C, C16176T, T152C, A263G, -309.1C, -
309.2C, -315.1C Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
A58 1 0,0119 H7a2 C16176T, T16519C, T152C, A263G, -309.1C, - Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
315.1C
A51 1 0,0119 HV0 G16129A, T16298C, T72C, A263G, -309.1C, - Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
309.2C, -315.1C,
-524.1A, -524.2C
G25 1 0,0119 HV0 T16189C, T16298C, T16362C, T72C, A263G, - Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
315.1C
G49 1 0,0119 HV0 A16220C, T16298C, T16519C, T72C, A200G, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
A263G,
-309.1C, -315.1C
M23 1 0,0119 HV17 C16111T, T16519C, T152C, A263G, -315.1C, - Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
524.1A, -524.2C
A40 1 0,0119 HV4b C16069T, T16519C, T152C, A263G, -309.1C, - Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
47
315.1C, A523DEL, C524DEL
A56 1 0,0119 I5a4 G16129A, C16223T, T16311C, G16391A, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
T16519C, A73G, T199C, T204C, A263G,
T250C, -309.1C, -315.1C, A574C
G69 1 0,0119 I5a4 G16129A, C16223T, T16519C, A73G, T199C, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
T204C, T250C, A263G, -315.1C, A574C
G29 1 0,0119 J1c1 C16069T, T16126C, T16519C, A73G, G185A, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
G228A, A263G, C295T, -309.1C, -315.1C,
C462T, T482C, T489C
A48 1 0,0119 J1c3e C16069T, T16126C, G163690A, A73G, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
G185A, G228A, A263G, C295T, -309.1C, -
315.1C, C462T, T489C
A42 1 0,0119 J2a1a1a C16069T, T16126C, G16145A, T16231C, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
C16261T, T16519C, A73G, C150T, T152C,
T195C, A215G, A263G, C295T, -310.1T,
-315.1C, T319C, T489C, G513A
A25 1 0,0119 K1a C16278T, T16311C, T16519C, A73G, A263G, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
-315.1C, C497T
M17 1 0,0119 K1a G16129A, T16224C, T16311C, T16519C, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
A73G, A263G, -315.1C, C497T, -524.1A, -
524.2C
A6 1 0,0119 L2a1 T16189C, C16278T, C16294T, T16309G, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
T16362C, G163690A, A73G, T146C, C150T
T152C, T195C, A263G, -309.1C, -
315.1C
M2 1 0,0119 L2a1+143 C16223T, C16278T, C16294T, T16309G, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
G163690A, A73G, G143A, T152C, T195C,
A263G, -309.1C, -315.1C, A523DEL,
C524DEL
G61 1 0,0119 M5a1 G16129A, C16223T, C16291T, T16298C, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
T16362C, T16519C, A73G, A263G, -309.1C, -
309.2C, -315.1C, T489C, -524.1A, -524.2C
A49 1 0,0119 T1 T16126C, A16163G, T16189C, C16294T, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
T16519C, A73G, A263G
A37 1 0,0119 T2b T16126C, C16294T, C16296T, T16304C, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
T16519C, A73G, A263G, -309.1C, -315.1C
M38 1 0,0119 T2b T16126C, C16294T, C16296T, T16304C, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
T16519C, A73G, A263G, -315.1C
G63 1 0,0119 T2b13a A16051G, T16126C, A16146G, C16294T, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
T16304C, T16519C, A73G, T195C, A263G, -
315.1C
A39 1 0,0119 T2c1+146 T16126C, C16292T, C16294T, C16296T, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
T16422C, T16519C, A73G, T146C, A263G, -
315.1C, C518T, A523DEL, C524DEL
G28 1 0,0119 U3 A16343G, A73G, C150T, A263G, -315.1C Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
G60 1 0,0119 U3 C16260T, A16343G, A73G, C150T, A263G, -
315.1C Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
G65 1 0,0119 U4a1 C16134T, C16266T, T16325C, T16356C, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
T16519C, A73G, T152C, T195C, A263G, -
315.1C, G499A, -524.1A, -524.2C
A30 1 0,0119 U4a2 T16356C, T16519C, A73G, T195C, A200G, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
A263G, T310C, G499A, -524.1C, -524.2A, -
524.3C, -524.4A
G33 1 0,0119 U4a2 T16356C, T16519C, A73G, A153G, T195C, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
A263G, T310C, G499A
G57 1 0,0119 U4a3a A16265G, C16294T, T16356C, T16362C, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
T16519C, A73G, T195C, G247A, A263G, -
309.1C, -315.1C, G499A, -524.1A, -524.2C, -
524.3A, -524.4C, -524.5A, -524.6C
G53 1 0,0119 U5a1+@16192 G16129A, C16256T, C16270T, A16369G, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
48
A73G, A263G, -315.1C
A23 1 0,0119 U5a2 C16192T, C16256T, C16270T, G16526A, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
A73G, A263G, -309.1C, -315.1C
A13 1 0,0119 U5a2a1+152 C16114A, C16192T, C16256T, C16270T, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
C16294T, T16311C, G16526A, A73G, T152C,
A263G, -309.1C,
-315.1C
G22 1 0,0119 U5b1b1+@16192 A16183C, T16189C, C16270T, T16519C, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
G71DEL, A73G, C150T, A263G, -309.1C, -
309.2C, -315.1C
G52 1 0,0119 U5b2a1a2 G163690A, T16519C, C150T, A263G, -315.1C, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
A73G
M46 1 0,0119 U5b2b3 T16224C, C16270T, T16362C, T16519C, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
A73G, C150T, A263G,
-309.1C, -315.1C, A517T
M19 1 0,0119 U6a T161T72C, A16129G, C16278T, C16290T, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
A73G, A263G,
-315.1C
M39 1 0,0119 U6a'b'd+16311 T16172C, A16129G, T16311C, A73G, T152C, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
G207A, A263G,
-309.1C, -315.1C
M21 1 0,0119 V10a C16261T, T16298C, T16311C, T16362C Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
T16519C, T72C, A263G, -309.1C, -
315.1C
G20 1 0,0119 W C16223T, C16292T, G16346A, T16519C, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
A73G , A189G, T195C, C198T, T204C,
G207A, A263G, -309.1C, -315.1C
G62 1 0,0119 X3a A16182C, A16183C, T16189C, C16223T, Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto
C16278T, T16519C, A73G, T146C, A153G,
C256T, A263G,
-309.1C, -309.2C, -315.1C
49
A16183C A16343G
C16188G G16346A
T16189C T16356C
C16192T T16362C
C16193T C16366T
T16209C G16390A
Formatted: Indent: First line: 0.49"
C16218T G16391A
A16219G A16399G Formatted: Font: Not Bold
A16220C T16422C Formatted: Justified, Indent: First line: 0.49"
C16223T A16482G
Formatted: Font: Not Bold
T16224C T16519C
T16231C G16526A Formatted: Font: 11 pt
C16256T Formatted: Font: 11 pt
C16260T
Formatted: Font: 11 pt
C16261T
Formatted: Font: 11 pt
de ellos los mas frecuentes observados fueron las sustituciones T16519C (9,93%), A73G Formatted: Font: 11 pt, Bold, Font color: Custom
Color(RGB(49,132,155))
(5,82%), A263G (10,95%), y las inserción -315.1C (10,95%). Formatted: Font: 11 pt
En la población de Granada se encontraron un total de 82 polimorfismos diferentes, y Formatted: Font: 11 pt, Bold, Font color: Custom
Color(RGB(49,132,155))
de ellos los mas frecuentes observados fueron las sustituciones T16126C (2,22%), T16519C
Formatted: Centered
(7,96%), A73G (4,77%), T152C (3,18%), A263G (12,10%), y las inserciones -309.1C
Formatted Table
(7,32%) y -315.1C (11,46%). Formatted: Font: 11 pt, Bold, Font color: Custom
Color(RGB(49,132,155))
En la población de Málaga se encontraron 39 polimorfismos, entre los cuales más
Formatted: Font: 11 pt, Bold, Font color: Custom
frecuentes fueron las sustituciones T16311C (5,26%), T16519C (9,47%), A73G (6,31%), Color(RGB(49,132,155))
A263G (13,68%) y la inserción -315.1C (13,68%). Formatted: Font: 11 pt, Bold, Font color: Custom
Color(RGB(49,132,155))
6.3 Estructura de la población.
Formatted: Font: 11 pt, Bold, Font color: Custom
Para determinar si el estudio de los polimorfismos permite establecer una Color(RGB(49,132,155))
subestructura de la población de estudio en función de las tres provincias de las que proceden Formatted: Centered
Formatted: Font: 11 pt
las muestras, se realizaron estudios de AMOVA y STRUCTURE.
Formatted: Font: 11 pt, Not Bold
Formatted: Font: 11 pt, Font color: Accent 5
Fuente de Suma de Componente Porcentaje de Formatted: Font: 11 pt
Diseño d.f
variación cuadrados de varianza fijación Formatted: Font: 11 pt, Not Bold
50
Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
6.3 Calculo de Haplogrupos Formatted ...
Formatted Table ...
Los haplogrupos determinados mediante el programa Haplogrep, se han detallado en
Formatted ...
las tablas 8, 8.1, 8.2 y 8.3 con sus respectivas frecuencias en cada una de las poblaciones.
Formatted ...
El haplogrupo predominante en GMA, en la población de Almería y en la población Formatted ...
de Granada es el haplogrupo H2a2a. Este haplogrupo es común entre las tres poblaciones, y Formatted ...
es predominante en la población de Armería y en la población de Granada pero en la Formatted ...
Formatted ...
población de Málaga todos los haplogrupos se encuentran en la misma frecuencia.
Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
Tabla 8: Frecuencia de los haplogrupotipos en GMAlas tres poblaciones
Formatted ...
Formatted ...
A2+(64)+1612 H1+16189 H10+(1609 H1a1 H1aj1 H1b1+16362 H1ba Formatted ...
9 3)
1,19% 2,38% 1,19% 1,19% 1,19% 1,19% 2,38% Formatted ...
Formatted ...
H1e+16129 H1e1a1H1e H1e1a4H1 H1e1a6H1e H20aH1e1 H2a2aH20a H32H2
+16129 e1a1 1a4 a6 a2a Formatted ...
2,38% 2,38%2,38% 1,19%2,38 1,19%1,19% 1,19%1,19% 15,47%1,19% 1,19%15
% ,47% Formatted ...
H3v+16093H3 H3zH3v+16 H5H3z H5’36H5 H57H5’36 H6H57 H74H6 Formatted ...
2 093
1,19%1,19% 2,38%1,19% 1,19%2,38 1,19%1,19% 1,19%1,19% 1,19%1,19%
1,19%1, Formatted ...
% 19% Formatted ...
H7a2H74 HV0H7a2 Hv17HV0 HV4bHv17 I5a4HV4b J1c1I5a4 J1c2e2J
1c1 Formatted ...
2,38%1,19% 3,57%2,38% 1,19%3,57 1,19%1,19% 2,38%1,19% 1,19%2,38% 2,38%1, Formatted ...
% 19%
J1c3eJ1c2e2 J2a1a1aJ1c J2b1aJ2a1 K1aJ2b1a L2a1K1a L2a1+143L2a1 M5a1L2 Formatted ...
3e a1a a1+143 Formatted ...
1,19%2,38% 1,19%1,19% 2,38%1,19 2,38%2,38% 1,19%2,38% 1,19%1,19% 1,19%1,
% 19% Formatted ...
T1M5a1 T2bT1 T2b13aT2 T2c1+146T U3T2c1+146 U4a1U3 U4a2U4 Formatted ...
b 2b13a a1
1,19%1,19% 2,38%1,19% 1,19%2,38 1,19%1,19% 2,38%1,19% 1,19%2,38% 2,38%1, Formatted ...
% 19% Formatted ...
U4a3aU4a2 U5a1+@161 U5a2U5a U5a2a1+152U5 U5b1b1+@ U5b2b3
92U4a3a 1+@16192 a2 16192U5a2a U5b2a1a2U5 U5b2a1a Formatted ...
1+152 b1b1+@1619 2 Formatted ...
2
1,19%2,38% 1,19%1,19% 1,19%1,1 1,19%1,19% 1,19%1,19% 1,19%2,3 Formatted ...
9% 2,38%1,19% 8% Formatted ...
U6aU6a U6a’b’d+163 V+@72V+ V10V10 WW X3a
11U6a’b’d+1 @72 Formatted ...
6311 Formatted ...
1,19%1,19 1,19%1,19% 3,57%3,57 1,19%1,19% 1,19%1,19% 1,19%
% % Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
Tabla 8.1: Frecuencias de los haplogrupotipos en la población de Almería Formatted ...
Formatted ...
Formatted ...
51
Formatted ...
Formatted ...
H5'36 H7a2 L2a1 H2a2a H1b1+163 U5a2a1+1 V+@72 H20a U5a2 Formatted: Indent: Left: 0", Hanging: 0.02"
62 52
0,02633 0,0526 0,0263 0,1052 0,0263 0,02631 0,0789 0,0263 0,0263 Formatted Table
596 Formatted: Indent: Left: 0", Hanging: 0.02"
K1a H10+(16093 J2b1a H1+161 U4a2 H5 H3z H3v+1 T2b Formatted: Indent: Left: 0", Hanging: 0.02"
) 89 6093
0,0263 0,0263 0,0263 0,0263 0,0263 0,0263 0,0526 0,0263 0,0263 Formatted: Indent: Left: 0", Hanging: 0.02"
T2c1+1 HV4b J1c2e2 J2a1a1a H32 H57 H1ba J1c3e T1 Formatted: Indent: Left: 0", Hanging: 0.02"
46
0,0263 0,0263 0,0263 0,0263 0,0263 0,0263 0,0263 0,0263 0,0263 Formatted: Indent: Left: 0", Hanging: 0.02"
Formatted Table
52
Formatted: Font: (Default) Times New Roman
Formatted: Font: 12 pt
Formatted: Right
Formatted: Right
7 Discusión Formatted: Normal
7 Discusión
Formatted: Indent: First line: 0"
7.1 Estudio poblacional genético de polimorfismos del ADNmt
P
ara
pode
r
enten
der
bien
como
se
distri
buye
n los
poli
morfi
smos
en
cada
una
de
las
Figura 132: Distribución de polimorfismos y haplogrupos en las Formatted: Font: Bold, Underline
mues muestas de Málaga. Formatted: Underline
tras de las poblaciones de estudio se han construido arboles filogenéticos indicando los
polimorfismos que dan lugar a cada haplogrupo.
56
57
Formatted: Indent: First line: 0"
58
59
Formatted: Indent: First line: 0", Line spacing: single
7.2 Estudio de Haplogrupos
El estudio de los haplogrupos presentes en las poblaciones de Almería, Granada y
Málaga nos revela que el haplogrupo H es el mayoritario en la población del Reino de
Granada con un 46,4%. Aparte de este haplotipo mayoritario, se observan otros haplotipos
que también son frecuentes, como el Haplotipo U con un 16,6%.
El haplogrupo H es el más frecuente en la población Europea. Este haplogrupo ha
debido ser introducido desde Oriente Medio en diferentes sub-haplogrupos, siendo en este
caso el mas frecuente observado el H2a2a con un 15,47 %.
El Haplogrupo U es característico de Eurasia occidental y es descendiente del
macrohaplogrupo R. Entre los sub-haplogrupos observados correspondientes a este
haplogrupo, los máas frecuentes fueron U3, U4a2 y U5b2a1a2 con un 2,38%.
A H HV I J K L M T U V W X
1,19% 46,4% 5,95% 2,38% 8,33% 2,38% 2,38% 1,19% 5,95 16,6% 4,76% 1,19% 1,19%
Figura 142: Gráfico de sectores de haplogrupos presentes en las 3 poblaciones y sus frecuencias.. Fuente propia Formatted: No underline
60
Figura 14: Gráfico de sectores de los sub-haplogrupos del haplogrupo H presentes en las 3 poblaciones y sus
frecuencias.
Figura 15: Gráfico de sectores de los sub-haplogrupos del haplogrupo U presentes en las 3 Formatted: Font: 11 pt
poblaciones y sus frecuencias.
Formatted: Font: 11 pt
61
62
Acuarela del peinador de la reina. Granada. La Alhambra. (Trevor Haddon).
7 Conclusiones
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Acuarela del patio de la lindaraja. Granada. La Alhambra. (Trevor Haddon)
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