U.C.S.M. P.P. Ing.

Biotecnológica
I Semestre
Prácticas de Introducción a la Ing. Biotecnológica
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PRACTICA Nº 9.

PRODUCCIÓN DE ETANOL POR SACCHAROMYCES

CEREVISIAE INMOVILIZADA EN AGAR
1. MARCO TEÓRICO:

El uso de biocatalizadores para llevar a cabo biotransformaciones es un

área de la Biotecnología en continua expansión. Un aspecto clave del
proceso es el uso de catalizadores: células o enzimas en un sistema
continuo que permite extender el uso del mismo en el tiempo dando
como resultado una disminución de los costos del proceso y otras
ventajas como una mayor pureza del producto y mayor productividad.
Para lograr este objetivo los biocatalizadores se inmovilizan, según la
European Federation of Biotechnology (1983) define a los
biocatalizadores inmovilizados como enzimas, células u organelos (o
combinación de ellos) confinados o localizados en cierta región definida
del espacio, con retención de su actividad catalítica y, si es necesario,
de su viabilidad, y que pueden ser usados de modo repetido y
continuo.
Las levaduras del género Saccharomyces cerevisiae han sido utilizadas
tradicionalmente en la industria de la producción de etanol, además de
la obtención de éste metabolito, las propias células de levaduras, por
su contenido en proteínas y vitaminas, se han utilizado en la
alimentación animal y, ocasionalmente, en la alimentación humana,
como un subproducto industrial.
Con el propósito de incrementar los niveles productivos uno de los
procedimientos biotecnológicos más útiles es inmovilizar las levaduras
en diferentes soportes como agar, alginato de calcio, astillas de madera
de bálsamo, etc.
El objetivo es incrementar la producción de etanol, simultáneamente
con el mantenimiento del nivel proteico mediante la utilización de las
técnicas de inmovilización.

2. OBJETIVOS:

2.1. Inmovilizar Saccharomyces cerevisiae en soporte de agar.

2.2. Obtener etanol a partir de levaduras inmovilizadas.
2.3. Evaluar por refractometría el grado alcohólico del producto de la
fermentación.

3. MATERIALES:
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3.1. Material biológico:

• Levadura, Saccharomyces cerevisiae.
• Mosto de uvas.

3.2. Reactivos:
• Agar-agar
• Solución de glucosa 5%

3.3. Material de vidrio:

• Balones de 250 mL.
• Beakers de 250, 400 y 600 mL.
• Matraces de 250 mL.
• Probetas de 50 y 100 mL.
• Pipetas de 5 mL y 10 mL.
• Baguetas.

3.4. Otros:
• Agujas Hipodérmicas descartables de 20 mL.
• Papel toalla.
• Espátulas.
• Picetas.

3.5. Equipos:
• Balanza analítica.
• Refractómetro.
• Baño María.

4. PROCEDIMIENTO:

4.1. Acondicionamiento de materiales:

• Solubilizar 5 g de levadura comercial de
panificación en 50 mL de agua destilada.
• En un balón disolver 2.5 g de agar en 125 mL de
agua destilada, con calentamiento y agitación constante.
• Calibrar el Baño María a 40ºC, para mantener el
agar licuado.
• Colocar en una probeta 50 mL de aceite vegetal y
ponerla en refrigeración (aproximadamente 4ºC) por 30
minutos.

4.2. Inmovilización de la enzima:

• Mezclar 50 mL de la suspensión de levaduras y 50
mL de agar- agar licuado. Homogenizar.
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• Tomar en una aguja hipodérmica 20 mL de la

mezcla y dejar caer gota a gota en la probeta que contiene el
aceite refrigerado.
• Repetir el paso anterior hasta agotar la mezcla.
• Decantar los pellets y lavarlos tres veces con agua
destilada con movimientos rotatorios suaves.
• Secar los pellets en papel toalla.

4.3. Obtención del mosto de uva:

• Obtener por prensado 100 mL de mosto de uva.
• Filtrar con una gasa el jugo obtenido.
• Tomar una alícuota y leer los grados Brix o
porcentaje de azúcar en el refractómetro.

4.4. Obtención de etanol:

• Colocar los pellets en un beaker con 50 mL de
mosto de uva o una solución de glucosa al 5%. Tomar una
alícuota, considerando la muestra a tiempo cero y leer los
grados Brix o porcentaje de azúcar en el refractómetro.
• Agitar la mezcla en un hot plate por 45 min. Tomar
alícuotas cada 15 min. Leer los grados Brix en el
refractómetro.

5. PROCEDIMIENTO DETALLADO:

Prensando la uva Mosto de uva

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Medida en grados Brix de azúcar del mosto y mezcla de agar y la

levadura.

Formación de Pellets en aceite helado y posterior secado de los

mismos.
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Sellado del mosto con los pellets y paso al hot plate para el
agitado de la mezcla.

Grados Brix de azúcar media hora después y 17 horas después.

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN:

- La primera medida de azúcar realizada nos da como resultado 12

grados Blix.
- La segunda medida realizada luego de media hora nos da como
resultado 10,6 grados Blix.
- La tercera medida realizada al día siguiente, luego de 17 horas, nos
da como resultado 8,8 grados Blix.
- Al parecer en un primer momento se consumió gran cantidad de
azúcar y se produjo etanol, pero en determinado momento este
consumo se redujo.

7. CONCLUSIONES:

- Los pellets producidos en el laboratorio favorecen la fermentación.

- Al medir la cantidad de azúcares consumidos podemos determinar la
cantidad de alcohol etílico producido.

8. CUESTIONARIO:

1. ¿Por qué es importante la inmovilización de

células?

La inmovilización de células es la unión o su incorporación en un

sistema de fase sólida específica que permite el intercambio de
sustratos, productos, inhibidores, etc. Pero, al mismo tiempo, separa la
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biomasa celular catalítica de la fase que contiene los sustratos y

productos.
La tecnología de inmovilización celular disminuye la mayoría de los
problemas que plantea la fermentación utilizando células libres. Este
sistema tiene la ventaja de poder manejar la densidad celular, previa al
inicio de la fermentación. Además, facilita el sistema de operación del
proceso de fermentación continua, evitando el paso de eliminar las
células del fermentador. La inmovilización celular desacopla el
crecimiento microbiano de los procesos metabólicos de interés
industrial. Es así, que diversos grupos de investigación han empleado
este sistema de células inmovilizadas para la obtención de variados
productos de interés industrial, como asimismo, en el tratamiento de
desechos de residuos líquidos y sólidos.

2. ¿Qué otros método se utiliza para inmovilizar

células?

- Adsorción superficial
- Autoagregación
- Confinamiento mediante una barrera
- Atrapamiento en una matriz porosa

3. ¿Cuál es el fundamento de la inmovilización

de levaduras en agar?

Por sus propiedades de acción protectora, su textura, elasticidad,

transparencia relativa y reversibilidad es muy empleado como agente
de suspensión, estabilización y espesamiento.
Por existir muy pocos microorganismos que metabolizan el Agar-Agar o
que elaboran enzimas capaces de degradarlo, le confiere una mayor
estabilidad, con respecto a geles de otros coloides naturales, que lo
hacen muy útil cuando es usado como mezcla con otros geles,
polisacáridos y proteínas, en el sentido que la degradación marcada no
ocurre cuando sus dispersiones son mezcladas. Un gel con una
concentración de 1,5% en peso, funde entre 60ºC y 97ºC.
Una característica muy importante en la calidad del Agar-Agar, es su
resistencia a ser vencido, en estado de gel, por la presión. Esta fuerza
de gel debe ser medida bajo ciertas condiciones y se define como la
presión en gr/cm2 de superficie que resiste un gel, de concentración
1,5% en peso y durante 20 segundos a 20ºC.

4. ¿En qué consiste la fermentación alcohólica?

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Es un proceso biológico de fermentación en plena ausencia de aire,

originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan
los hidratos de carbono (por regla general azúcares: como pueden ser
por ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el almidón, etc.) para
obtener como productos finales: un alcohol en forma de etanol, dióxido
de carbono en forma de gas y unas moléculas de ATP que consumen
los propios microorganismos en su metabolismo celular energético
anaeróbico.

5. ¿Cuál es el fundamento del refractómetro?

Lo que hace el refractómetro es utilizar una muestra (en nuestro caso

de mosto) para proyectar la curva que produce la luz en una retícula
que contiene una escala permitiendo determinar el ángulo que forma la
luz. Este valor está representado en grados Brix y nos indica el
porcentaje de sacarosa presente en la muestra.

9. BIBLIOGRAFÍA:

http://espanol.answers.yahoo.com
http://www.google.com.pe
http://es.wikipedia.org
http://html.rincondelvago.com
https://www.u-cursos.cl