Curso de Micropropagación y

Proyectos de Producción
2008
Universidad de la República – Facultad de Agronomía
Área de Biología Vegetal – Laboratorio de Biotecnología
Docentes:
Ing. Agr. Silvia Ross M.Sc.
Ing. Agr. Mónica Krause
Ing. Agr. Gabriela Pagliano M.Sc.
 OObjetivos generales
Se espera que el participante logre:

1. Adquirir los conocimientos teóricos que fundamentan el

uso del cultivo “in vitro” en la producción vegetal.

2. Desarrollar la capacidad de observación, análisis y

discusión mediante la confrontación teórico-práctica.

3. Conocer las diferentes técnicas de cultivo “in vitro” y su

aplicación a la resolución de problemas productivos.
 Objetivos Específicos

1. Conocer los fundamentos teóricos de la propagación vegetativa

y los principios biológicos básicos que fundamentan el uso del
cultivo in vitro en la producción vegetal.

2. Realizar las operaciones básicas de laboratorio que permitan el

establecimiento de cultivos in vitro.

3. Analizar metodologías de micropropagación en diferentes

cultivos (hortícolas, frutales, forestales, ornamentales).
 Unidades Temáticas
1. Introducción al cultivo in vitro de tejidos vegetales. Reseña histórica, principales
aplicaciones de las técnicas de cultivo in vitro, asepsia-esterilización,
composición y preparación de medios.

2. Morfogénesis in vitro. Posibles vías morfogénicas y factores que la controlan.

Organogénesis y embriogénesis somática.

3. Micropropagación como alternativa a la propagación vegetativa convencional en la

producción frutícola, hortícola, forestal y ornamental. Etapas del proceso de
micropropagación. Principales problemáticas asociadas. Sistemas de cultivo en
medios líquidos, empleo de bioreactores.

4. Obtención de material de sanidad controlada en especies propagadas en forma

vegetativa. Cultivo de meristemas. Programa de Certificación. Microinjerto en
Citrus para la creación de un banco de yemas saneadas. Métodos de indexaje y
control del material saneado.

5. Análisis de factibilidad de proyectos empresariales y análisis de costos de la

micropropagación.
 Metodología

1. Clases teórico-práctico (8 clases semanales de 3hs. de duración)

(24hs).

2. Seminarios (3 clases de 2hs. de duración y 6hs. Presenciales y 6hs de

trabajo grupal). Los estudiantes presentarán y discutirán un artículo científico
entregado con anticipación por la cátedra sobre uno de los temas tratados.
(12hs.)

Visitas a Laboratorios de cultivo in vitro: Unidad de Biotecnología INIA, Las Brujas y

Empresa Sta. Rosa (2 excursiones de 6 hs cada una). (12 hs.) Posible visita a
Biosur.

3. Sistema de evaluación
El curso se evaluará con la presentación del seminario (40%) y una prueba escrita
(60%) y se requiere un 60% de los puntos para su aprobación.

El exámen se exonera con el 80% de los puntos.

 Laboratorio de Biotecnología
Antecedentes del Grupo de Investigación en Especies Forestales
Proyectos ejecutados
• Contribución de asociaciones ectomicorríticas en árboles
forestales de importancia económica en Uruguay (1995–1997).
Financiado por IFS (International Foundation for Science).

• Estudios sobre la embriogénesis somática de Eucalyptus

grandis (Hill) Maiden (1995–1997). Financiado por CSIC (Comisión
Sectorial de Investigación Científica).

• Micropropagación de árboles adultos de Eucalyptus grandis

(Hill) Maiden (1992 – 1994). Financiado por INIA– Facultad de Agronomía.
• Estudio sobre las técnicas de conservación de germoplasma
en Eucalyptus grandis (Hill) Maiden (1997–1999). Financiado por
CSIC.

• Estudio del comportamiento in vitro de especies de

Lauráceas nativas de interés maderero. Financiado por CSIC.
•Obtención y validación de la sonda del viroide del Peach
Latent Mosaic del duraznero. Convenio Fac. Agronomía-INIA. Financiado por
Fac.Agr.-INIA (2004)
 Laboratorio de Biotecnología
Antecedentes del Grupo de Investigación- CITRUS
Proyectos ejecutados

•Desarrollo de biotecnologías de diagnóstico de virus y

viroides patógenos de cítricos. Financiado por BID-CONICYT.
Instituciones participantes: División Biología Molecular – IIBCE, Laboratorio de
Biotecnología – Facultad de Agronomía y Servicios de Protección Agrícola – MGAP.
(1995-1999).

•Saneamiento de virus y viroides de germoplasma de citrus de

MILAGRO S.A. Financiado por MILAGRO S.A.

•Desarrollo de un kit de diagnóstico rápido para la detección

de viroides de citrus en el Uruguay. Financiado por INIA (2000 – 2002).

•Métodos moleculares de diagnóstico de viroides para su

aplicación en cuarentena y producción vegetal. Financiación: Fondo
Clemente Estable. (2000-2002).
•Producción de plantas de cítricos resistentes a Psorosis y
Tristeza mediante silenciamiento génico. Financiación :CSIC (2002-
2004).

•Obtención de las construcciones de Psorosis y Tristeza para

la obtención de portainjertos de citrus silenciados. Tesis de
Maestría Lic.Juan Pablo Gallino.

•Obtención y validación de la sonda de los virus de Psorosis y

Tristeza para su diagnóstico. Tesis de grado de Rosana Michelazzo. (2006)

•Obtención de un kit de diagnóstico para todos los viroides

presentes en las plantaciones citrícolas de Uruguay. Financiado
por PDT. Tesis de Maestría de Carolina Palavé.

•Obtención de un kit de diagnóstico para todos los viroides

cuarentenarios en las plantaciones citrícolas de Uruguay.
Financiado por PDT. Tesis de Maestría de Lic.Rodolfo Umaña.
•Estudio preliminar de caracterización de la diversidad
genética y comportamiento in vitro de Acca sellowiana (Berg)
Burret. Financiado por CSIC (2004-2006)
•Validación de la sonda del viroide del tubérculo ahusado de la
papa para su detección en análisis masivos. Convenio Facultad de
Agronomía-MGAP. Financiado por MGAP (2004-2006) Tesis de grado de Carolina Palavé.

•Evaluación de sistemas avanzados de cultivo in vitro para

propagación clonal de especies leñosas y semileñosas de
interés productivo. Tesis de Maestría de la Ing.Agr. Silvia Ross.
 Unidad I

Micropropagación y Proyectos de
producción

Cultivo “in vitro” de vegetales

Principales Aplicaciones de la Biotecnología

Resolución de problemas productivos

Estudio de procesos fisiológicos y bioquímicos.

-Ingeniería genética en plantas y animales.

-Producción de inoculantes para leguminosas.
-Fermentaciones microbianas.
-Producción de reactivos de diagnóstico de enfermedades
de plantas y animales.
-Conservación de germoplasma.
-Fertilización in vitro
-Transplante de embriones.
-Producción de hormonas.
-Producción de enzimas para la industria láctea.
 Institutos de Biotecnología Vegetal y Empresas
Privadas que emplean cultivo de tejidos

FACULTADES, IIBCE.
INIA
SEMILLAS SANTA ROSA S.A. (SESAR)
VIVERO “CIUDAD JARDIN”
ALDABE HERMANOS
VIVERO UDAGAWA
BIOSUR Ltda.
EMPRESAS FORESTALES
NIDETEC
Historia del cultivo de tejidos
 Historia

Década del 30. Primer regulador descubierto, la auxina.

1952. Morel y Martin. Primera Aplicación del Microinjerto.

1955. Miller et al. Descubrieron las citokininas.

1960. Kanta. Propagación vegetativa de orquídeas por

cultivo de meristemas.

1962. Muirashige y Skoog. Desarrollo del medio MS.

1969. Erickson y Jonasesen. Aislamiento de protoplastos.

1980. Alfermann et al. Utilizaron células completas para

biotransformación.
 Unidad II

Organización, funcionamiento y
equipos del laboratorio.

Equipos
Asepsia y Esterilización
Organización y
Funcionamiento del
Laboratorio
1- Área de oficinas
2- Área de observación y
examen.
3- Área de preparación de
medios de cultivos.
4- Área de lavado y
esterilización.
3- Almacén.
4- Área de incubación o de
crecimiento “in vivo”.
7- Área de flujos laminares o
de transferencia.
1- Área de
preparación

Material de
vidrio e
instrumentos
Balanza de precisión
Productos químicos, máscara y guantes
Agitador Magnético y Shaker
2-Área de lavado y esterilización
3- Área de transferencia
Cámara de flujo laminar horizontal
Instrumentos,
materiales y equipos
en el área de
transferencia.
4- Área de incubación
5- Área de observación y examen.
Establecimiento y condiciones de crecimiento del el
cultivo “ in vitro”
Para tener éxito en los cultivos “in vitro” es necesario:

1- ASEPSIA Y ESTERILIZACIÓN
2- ELECCIÓN DE LOS EXPLANTES
3- ELECCIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO
4- BUENAS CONDICIONES DE CRECIMIENTO

1- Asepsia:
- Ausencia de microorganismos patógenos
- Es una condición esencial en el éxito del cultivo “in vitro”
Para trabajar con cultivos asépticos es necesario:
-Trabajar en ambientes adecuados.
- Esterilización de instrumentos y medios de cultivo
- Esterilización de recipientes de cultivo
- Precaución del operario
 ESTERILIZACIÓN
Proceso mediante el cual cualquier material, sitio o superficie
se libera de cualquier microorganismo vivo o espora.
Procedimientos de esterilización
1- Calor seco (170°C 2 o 3 horas)

2- Vapor bajo presión.

- 121°C, 20 minutos.
- Sacarosa → Glucosa + Fructosa
- Cambio de pH → baja 0,3 a 0,5 unidades
- Caramelización de los azúcares (160°C) y formación de
compuestos tóxicos.
- Precipitación de sales.
- Depolimerización del agar.

3- Calor húmedo a 100°C.

4- Filtración
2- Preparar y desinfectar los explantos
Preparación de los explantos agua,fertilización,etiolación,
sanidad,pulverizaciones periódicas)
Desinfección de los explantes (etanol 70%,hipoclorito de sodio 1-
3%,hipoclorito de calcio 6 a 12 %,cloruro de mercurio 0,1 a 1,5 %).

3-Elección del medio de cultivo

•Composición química: agua, sales minerales, vitaminas, agar, carbohidratos,
aminoácidos, reguladores de crecimiento y otros.

•El éxito de la utilización de un medio es lograr las concentraciones lo más cercanas al óptimo
de las células o plantas para su crecimiento y diferenciación.

4- Buenas condiciones de crecimiento

•Para tener éxito en los cultivos “in vitro” es necesario:
cámara de crecimiento (temperatura , luz y humedad).
Temperatura
1- constante 25°, rango 17-32°C.
clima tropicales algodón, arroz ,citrus 28°C
clima templado 22°C

especies bulbosas 18°C

2- diferencias de temperatura de la cámara y recipientes

3- Problemas: altas y bajas temp. disminuye el crecimiento

4- tratamientos de frio - bulbillos- dormancia 1-10°C.

- plantas leñosas-dormancia→ GA3 o frío 2-4°C

Luz
Requerimientos “in vitro”
Fotoperiodo 16hrs luz/8hrs oscuridad
tubos fluorescentes 1000-5000lux (luz blanca fría)
HUMEDAD RELATIVA
Cantidad de vapor de agua contenida en la atmósfera gaseosa

Tapado y tipo de los recipientes

Importancia: desecación e infecciones

•Tapones: aluminio, rollo pack, plástico, algodón.
•Tener en cuenta: intercambio gaseoso, humedad en el recipiente, pasaje de luz
4- Área de incubación