Extracción L-L

Destilación

Precipitación

Cristalización
Cromatografía: Chroma - graphein

Son un conjunto de técnicas de separación de compuestos con

usadas en diferentes áreas de la ciencia. Identificación y
cuantificación de componentes en mezcla complejas.

Fue inventada por el botánico Mikhail Tswett, tras separar

pigmentos vegetales.
Fase móvil o eluente: líquido o gas que transporta el
analito o interactúa con este durante el procesos de
separación.

Fase estacionaria (adsorbente): sólido o líquido fijo en

una columna o en una superficie sólida, debe ser
inmiscible en el solvente de elución.
Soportes para fases estacionarias

Alúmina
Silica gel
Carbonato de Calcio o Magnesio
Celulosa
Almidón
 ADSORCIÓN

CROMATOGRAFÍA EN REPARTO
COLUMNA

EXCLUSIÓN POR
TAMAÑO

MÉTODOS INTERCAMBIO

CROMATOGRÁFICOS IÓNICO

PAPEL
CROMATOGRAFÍA EN PLANO

CAPA FINA (TLC)

 CROMATOGRAFÍA DE
GASES

MÉTODOS CROMATOGRAFÍA DE
CROMATOGRÁFICOS LÍQUIDOS

CROMATOGRAFÍA DE
FLUIDOS SUPERCRÍTICOS
 TR: tiempo de retención
Equilibrios de los analitos: TS: tiempo en al fase
estacionaria
TM: tiempo muerto

TR = TS +TM
Gran cantidad de analito

Poca cantidad de analito

 Factor de retención o capacidad: compara la velocidad
de migración de los solutos en la columna.

<1

1< < 10
Sabiendo que:
Selectividad: compara la velocidad de migración de los
solutos en la columna.

A: analito con menor

retención

B: analito con mayor

retención
Platos teóricos: mide la eficiencia de una columna
cromatográfica.
N: número de platos
L: longitud de la
columna
H: altura de plato
 Resolución: medida cuantitativa de la capacidad de una
columna para separar dos analitos.

Considerando WA = WB por lo tanto:

Ejercicio
Las sustancias A y B tienen tiempos de retención de 16,40 y
17,63 min, en una columna de 30 cm. Una especie que no es
retenida pasa por la columna en 1,30 min. Los anchos de los
picos son para A y B 1,11 y 1,21 min respectivamente. Calcule:

a) La resolución de la columna
b) El número de platos promedio de la columna
c) La altura de plato
d) La longitud de la columna necesaria para conseguir una
resolución de 1,5
e) El tiempo necesario de B para alcanzar una resolución de
1,5
f) La altura necesaria para alcanzar una resolución de 1,5 con
la columna de 30 cm y los tiempos dados al inicio.
Ejercicio

En la figura se muestra el proceso de separación de dos compuestos, en una

columna de 25cm, la tasa de flujo fue de 0,4 ml/min. Determine:

a) El tiempo que los componentes A y B pasan en la fase estacionaria.

b) Los factores de retención para los dos componentes.
c) Calcule la resolución de los dos picos.
d) El número promedio de platos teóricos y de altura de plato de la columna.
e) La longitud de la columna necesaria para obtener un resolución de 1,75.
Ejercicio

Una especie que no es retenida tienen un tiempo de elución de 1,06

min. La columna tiene 30 m de longitud y 0,53 mm de diámetro.
Calcule:

a) El factor de capacidad de los 4 compuestos.

b) La selectividad entre el benceno y el pentafluorobenceno, la
selectividad ente el difluorobenceneo y el heptano.
c) La resolución entre el benceno y el pentafluorobenceno, la
resolución entre el difluorobenceneo y el heptano.
d) La longitud de la columna necesaria para conseguir una
resolución de 1,5 entre los dos primeros compuestos eluidos.
Ejercicio

Los siguientes datos se obtuvieron para un proceso de separación en una

columna de 40 cm:
a) El número de platos teóricos y la altura de plato promedio.
b) La resolución para:
Metilciclohexeno y Metilciclohexano
Metilciclohexeno y tolueno
Metilciclohexano y tolueno.

c) El número de platos y longitud de la columna para obtener una resolución de

1,5 entre el Metilciclohexeno y Metilciclohexano.¿Cual sería el tiempo de
retención para el metilciclohexeno?
d) El factor de retención de cada compuesto
e) La selectividad entre el Metilciclohexeno y Metilciclohexano
f) La selectividad ente el Metilciclohexeno y el tolueno
Modos de elución

Isocrático: se conserva la misma proporción de la fase

móvil durante el proceso de separación

MeOH 100% Hx:AcOEt 90:10

ACN: H2O: AcOH 80:18:2

Gradiente: se modifican las proporciones de los

componentes a medida que transcurre el proceso de
separación
Cromatografía de adsorción

Equilibrios del analito entre la fase móvil y el adsorbente

debido a diferencias de polaridades. Se compite por los sitios
de adsorción entre la F.M y la F.E

De acuerdo a la fase estacionaria utilizada se divide en:

Fase normal (fase estacionaria polar)

Fase reversa (fase estacionaria no polar)

Cromatografía en fase normal

La fase estacionaria está formada compuesto polar (gel de sílice,

alúmina) con diferente tamaño de partícula.
Cromatografía en fase reversa

Fase estacionaria poco polar, sílica modificada con

grupos apolares. C8, C18, fenilo.
Cromatografía de reparto

Equilibrios del analito entre la fase móvil y la fase

estacionaria debido a la solubilidad del analito por uno de
ellos.

La fase estacionaria es un líquido soportado en un sólido,

la fase móvil puede ser un líquido o un gas.
Fase móvil
Cromatografía de exclusión molecular o filtración en gel

Se da un proceso de separación
por tamaño.

Difusión de las moléculas de

menor tamaño.

De gran utilidad en la separación

de macromoléculas
Sephacryl

Polímero con carácter hidrofílico

Se utiliza en rangos de pH de 3-11

Sephadex
Polímero con carácter mixto
Se pueden utilizar solventes polares
o mezclas con agua.
Sepharosa

Polímero con carácter hidrofílico

Se utiliza con agua o soluciones
salinas.
Rango de pH: 4-9
Cromatografía de intercambio iónico

Interacción electrostática de los analitos cargados + o - con la fase

estacionaria iónica.

Intercambio
aniónico

Intercambio
catiónico
 Cromatografía en capa delgada o capa fina (TLC o CCF)

El adsorbente está
soportado en una placa
de vidrio o aluminio

Cámara de elución
Siembra de la
Muestra
Elución

Rf: factor de retención

TLC analítica: pequeña cantidad de muestra (algunos mg)

TLC preparativa: Aumenta el tamaño de muestra (50-

400mg)
Tomado de: Macherey Nagel – Brochure chromatography. Columns and supplies
Tomado de: Macherey Nagel – Brochure chromatography. Columns and supplies
Es una técnica cromatográfica usada para análisis de
componentes volátiles.

Sólidos líquidos o gases.

Permite una alta resolución y una separación de mezclas
muy complejas.
Compuestos orgánicos o inorgánicos

Se divide en dos categorías de acuerdo a la fase estacionaria:

CGL Cromatografía gas – líquido. (Mayor uso)

CGS: cromatografía gas – sólido.

Curvas de van Deemter
Componentes instrumentales
Gas de arrastre
Debe ser compatible con el detector
Gas inerte (no degradar los analitos)
Mantener los límites de detección
Alta calidad (impurezas degradan la FS)

Helio (mayor uso)

Argón
Nitrógeno (disminuye el LD, pero tiene baja difusión)
Hidrógeno (satura los dobles enlaces), degrada el aceite del
detector de masas y la mezclarse con aire puede ser explosivo)
Sistemas de inyección

Procesos de inyección lentos y cantidades de muestra

grande generan ensanchamiento de banda.
Alta temperatura para evitar fraccionamiento de los
analitos (degradación)
 Modos de inyección

Split: división de flujo

Los analitos son mayores al 0,1 % de la
muestra. (poca cantidad de muestra
mejor resolución).
Proporciones comunes del Split son 1:50
o 1:600

Splitless: sin división de flujo

Análisis de trazas.
Menor T°, flujos menores.
Horno y rampas de temperatura
Columnas
35% difenil - 65%
dimetilpolisiloxano

50% fenil - 50%

metilpolisiloxano

50% fenil - 50%

metilpolisiloxano
50% trifluoropropil
50%metilpolisiloxano
50% cianopropilmetil
50%fenil
metilpolisiloxano
33% cianopropilmetil
67%dimetilpolisiloxano

Polietilenglicol

Polietilenglicol
2-nitrotereftalato
Detectores

Sensibilidad adecuada
Buenas estabilidad y reproducibilidad
Respuesta similar para diferentes analitos
Intervalo de temperatura: Tamb – 400°C
Tiempo corto de respuesta independiente del flujo.
Detector de ionización por llama (FID)

Pirólisis de los analitos con H2 y aire

Se aplica una descarga (medición de
corriente)
Número de carbonos es proporcional a la
cantidad de iones generados
Los cambios en la tasa de flujo de la FM
no afecta significativamente la respuesta
dada.
Detector de captura de electrones (ECD o μECD)

EL efluente de la columna pasa por un

emisor de Ni 63
Los iones del gas portador generan e-
Se genera una corriente constante que
disminuye cuando se atrapan los e por los
grupos funcionales electronegativos
(nitro, halógenos, peróxidos, quinonas)
Muestras ambientales (PCBs, plaguicidas)
Espectrómetro de masas (GC-MS)
Ventajas:
Análisis rápidos (min)
Alta resolución (eficiencias)
Alta sensibilidad (ppm o ppb)
Costo menor al HPLC
No destructivo (permite el acoplamiento a EM)
Requiere pequeñas cantidades de muestra μL

Desventajas
Muestras volátiles
No es apto para compuestos termolábiles
Agilent

Shimadzu

Hewlett
Packard
Menor tamaño de partícula mayor
eficiencia y mejor resolución

Menor partícula mayor uniformidad

del flujo.

Límites de cuantificación más bajos.

Altas presiones.
Componentes instrumentales

Solventes
Tuberías
Sistema de bombeo
Sistema de inyección
Columna
Detector
Sistema de adquisición de
datos
Desechos
Componentes instrumentales
Sistemas modulares
Desgasificación y filtración de la fase móvil
Sistema de filtración FM

Buzos: sistema de filtración (2-10μm) de la fase móvil para

remover material particulado (polvo).
Bombas

Bombas reciprocantes
Bombas de jeringa

Emiten caudales de 0,1 – 10 mL/min

El flujo no debe depender de la
presión para evitar inconvenientes en
el modo gradiente
Deben almacenar poco solvente para
que el flujo sea rápido.
 Sistemas de inyección

Debe soportar altas presiones.

Debe ser inerte y resistente a diversas sustancias químicas.
Precisión en la entrega del volumen seleccionado.

Válvula de 6 vías.
Loop (5-2000 μL).

Loop

Video: https://www.youtube.com/watch?v=OyRepISEmaM
Sistema de inyección automatizada
Precolumnas

Sirven para alargar el tiempo de vida útil de las columnas

Protección de contaminantes
Protección de compuestos precipitados
Columnas
Columnas
Modo isocrático VS Modo gradiente
 ADSORCIÓN

REPARTO
CROMATOGRAFÍA EN
COLUMNA
EXCLUSIÓN POR
TAMAÑO

INTERCAMBIO
IÓNICO
Sistemas de filtración (muestra)

Muestra filtrada por 0,45μm o 0,22μm

PDVF PTFE NYLON

Detectores

Respuesta debe ser dada en un flujo continuo para muestras

liquidas.
Alta sensibilidad.
Generar poco ruido.
Robustez
Detector todos los analitos de la muestra
Volumen celda (10mm)
 UNIVERSALES
USO
SELECTIVOS

DESTRUCTIVO
EFECTO SOBRE LAS
MUESTRA NO
DESTRUCTIVO
PDA/FOTMÉTRICO
DETECTORES POLARIMÉTRICOS
REFRACTOMÉTRICOS
ÓPTICOS FLUORIMÉTRICOS

FÍSICO - ELECTROQUÍMICOS
ELECTRICOS
INSTRUMENTAL CONDUCTIMÉTRICOS

EM
HÍBRIDOS RMN
FTIR
PDA (Detector de arreglo de fotodiodos)
Índice de refracción
Se bombea fase móvil (referencia)
Un sistema de calentamiento evapora la fase móvil
Se toma la señal de la muestra
La diferencia entre las señales genera un cambio en el ángulo
de dirección y se detecta en la fotocelda
Espectrómetro de masas (LC-MS)
Ventajas:
Análisis rápidos (min)
Alta resolución (eficiencias)
Alta sensibilidad (ppm o ppb)
No destructivo (permite el acoplamiento a EM)
Uso de muestras termolábiles y no volátiles

Desventajas

Mayor costo que GC

Alto consumo de solventes grado HPLC
Análisis de herbicidas
sintéticos en aguas

Modo gradiente
Aplicaciones

Industria de alimentos

Industria farmacéutica

Análisis forenses

Determinación de proteínas

Productos Naturales

Análisis ambientales
Bibliografía

García A., Yusá D. HPLC instrumental. Edit. Universidad politécnica de Valencia.

España. 2016

Skoog D., West D., Holler F.J., Crouch S. Fundamentos de Química analítica.
Novena edición. Edit Cengage Learning. México. 2015.

Snyder L. Kirkland J. Dolan J. Introduction to Modern liquid chromatography.

Tercera edición. Jhon wiley and sons. Estado Unidos. 2010.

Skoog D., West D., Holler F.J., Crouch S. Principios de análisis instrumental.
Sexta edición. Edit Cengage Learning. México. 2008

Harris D. Quantitative Chemical Analysis. Séptima edición. Edit. Freeman and

company. Estados Unidos. 2007.
Bibliografía

Macherey Nagel – Brochure chromatography. Columns and supplies. Alemania.

Amersham Pharmacia biotech. Gel filtration principles and methods. Octava edición.

Meyer Veronika. Practical High Performance Liquid Chromatography. Cuarta edición. Reino
Unido. 2004

McNair H., Miller J. Basic gas chromatograhy. Edit. Jhon Wiley and Sons. Estados unidos. 1997.

Quattrocchi O., Andrizzi S., Laba R. Introducción a la HPLC. Edit. Artes gráficas Farro. Argentina.
1992.

Los videos utilizados como complemento pueden verse en los siguientes enlaces:

https://www.youtube.com/watch?v=OyRepISEmaM
https://www.youtube.com/watch?v=q3fMqgT1do8
https://www.youtube.com/watch?v=E3z1wIImvHI&t=22s