Contenido

1 ¿Qué es la célula?..........................................................................................................................................................2
2 ¿Qué es un cultivo de células?......................................................................................................................................2
2.1 Tipos de cultivo......................................................................................................................................................2
2.2 Cultivo Primario.....................................................................................................................................................2
2.3 Cultivo secundario.................................................................................................................................................3
2.4 Clasificación en función del medio o el tipo de célula...........................................................................................3
2.5 Linaje celular.........................................................................................................................................................3
2.5.1 Linaje continuos o transformados..................................................................................................................4
2.5.2 Linaje finito....................................................................................................................................................4
2.6 Consideraciones al elegir un linaje celular.............................................................................................................4
2.7 Cultivo in vitro.......................................................................................................................................................5
2.7.1 Ventajas.........................................................................................................................................................5
2.7.2 Desventajas....................................................................................................................................................5
2.8 Condiciones que debe tener un cultivo (3)............................................................................................................5
2.9 Influencia del medio ambiente en cultivos de células depende de:......................................................................5
3 Suspensión celular.........................................................................................................................................................5
3.1 ¿Qué es un callo?..................................................................................................................................................5
3.2 ¿Qué son las células inmovilizadas?......................................................................................................................5
3.2.1 Selección del material para inmovilizar células..............................................................................................6
3.2.2 Matrices utilizadas.........................................................................................................................................6
3.2.3 Tipos de inmovilización..................................................................................................................................6
3.3 ¿Qué son los protoplastos?...................................................................................................................................6
3.3.1 Uso de protoplastos.......................................................................................................................................6
3.3.2 Métodos de aislamiento de protoplastos......................................................................................................6
3.3.3 Aislamiento exitoso.......................................................................................................................................6
3.3.4 Fusión somática.............................................................................................................................................7
3.3.5 Mezcla de protoplastos..................................................................................................................................7
1 ¿Qué es la célula?
Unidad morfológica y básica para la vida.

2 ¿Qué es un cultivo de células?

Es la propagación de células fuera del organismo de origen

2.1 Tipos de cultivo

Medios de
cultivo

Primarios

Secundario

Suspensión Monocapa

Adherentes o No adherentes o
monocapa en suspensión

Linaje celular

Transformadas o
Finitas
continuas

2.2 Cultivo Primario

Cultivos preparados a partir de un tejido u órgano. Pueden iniciarse con o sin fraccionamiento previo para separar los
distintos tipos celulares.

Conservan sus características originales y su proliferación es limitada. Pueden ser removidas del recipiente de cultivo
para formar cultivos secundarios.

Se lleva acabo un proceso de disociación de células donde es más fácil hacerlo con embriones a diferencia de tejidos
adultos. Se efectúa con una enzima proteolítica, como la tripsina (fría o caliente) y colagenasa. O mecánicamente.
Se requiere un nuevo explante (tejido separado de su órgano de origen y transferido a un medio artificial) para cada
experimento.

2.3 Cultivo secundario

Es llevado a cabo con el objetivo de…

 Cuando las células en cultivo adherentes ocupan todo el sustrato disponible o cuando las células en cultivos en
suspensión superan la capacidad de proliferar.
 Para mantener la densidad celular optima
 Para llevar un crecimiento continuo
 Estimular su proliferación

2.4 Clasificación en función del medio o el tipo de célula.

Celulas del tipo

Monocapa o
fibroblasticas. celulas
adherentes
de tipo epiteleal

Función
No requieren del uso
de superficies
Independientes o
suspension
Confluencia de celulas
mas grandes
Nutrientes insuficientes

2.5 Linaje celular

Conjunto de células especializadas que proceden de una célula troncal original.

Están formadas por células que se diferencian genética y morfológicamente de las células de origen. Pueden provenir de
células tumorales o de un proceso de transformación.

Tiene características como:

 Ser aneuploides,
 no tener inhibición por contacto
 Crecimiento indefinido

2.5.1 Linaje continuos o transformados

Evitan la senescencia, creciendo indefinidamente, pueden surgir de forma espontanea o induciéndolas, son el resultado
de un cambio genotípico denominado transformación.
  Son inmortales
 Son malignas: Invaden el tejido y dan lugar al crecimiento de tumores
 Genéticamente inestables: Aberraciones cromosómicas
 Crecimiento aberrante

2.5.1.1 Transformación
Puede inducirse fisiológicamente a través de hormonas como la hidrocortisona o inductores no
fisiológicos dimetilsulfoxido (DMSO).

El primer linaje reportado y aún vigente en investigación son las células HeLa, el linaje al cual pertenecen estas células
deriva de una muestra de cáncer cérvico uterino obtenida el 8 de febrero de 1951 de una paciente llamada Henrietta
Lacks (de allí el acrónimo He[nrietta] La[cks]) quien falleció el 4 de octubre de ese mismo año debido al cáncer.

2.5.2 Linaje finito

Tienen vida limitada que va entre 20 a 80 generaciones.

2.5.2.1 El papel de la telomerasa en este linaje

La línea celular HeLa fue derivada para su uso en la investigación del cáncer. Estas células proliferan
anormalmente rápido, aún comparadas con otras células cancerígenas. En el libro The Immortal Life of
Henrietta Lacks de Rebecca Skloot, la autora explica que las células HeLa tienen una versión activa de la
telomerasa durante la división celular, que previene el acortamiento gradual de los telómeros,
implicados en el envejecimiento y eventual muerte de las células. De este modo, las células HeLa eluden
el límite de Hayflick, que es el número limitado de divisiones celulares que la mayoría de las células
normales pueden llevar a cabo antes de morir en el cultivo celular.

En el linaje finito la telomerasa en cada división celular se provoca un desgaste que la limita del
crecimiento infinito.

2.6 Consideraciones al elegir un linaje celular

 Células normales o transformadas
 Especie
 Fuente del tejido
 Características del crecimiento
 Disponibilidad
 Validación
 Expresión fenotípica
 Línea celular central
 Estabilidad

2.7 Cultivo in vitro

Definiendo “in vitro” el cual alude al significado de “fuera del organismo” consiste en el aislamiento de órganos, tejidos o
células vegetales y el ajuste de las condiciones necesarias para favorecer su crecimiento en un medio artificial.
 2.7.1 Ventajas
 Fácil manipulación durante condiciones controladas
 Alternativa al uso de animales
 Permite trabajar en pequeña, mediana y gran escala.
 Congelación de células con mínima perdida de viabilidad
 Fácil acceso a múltiples líneas celulares

2.7.2 Desventajas
 El fenotipo puede que no sea el correcto debido a cambios en el ambiente
 Menor heterogeneidad
 Perdida de arquitectura tridimensional
 No se encuentran los mismos estímulos hormonales y nutricionales que en el lugar de origen.

2.8 Condiciones que debe tener un cultivo (3)

 Asepsia
 Nutrientes
 Gases

2.9 Influencia del medio ambiente en cultivos de células depende de:

 Naturaleza del sustrato
 Composición fisicoquímica y fisiología del medio de cultivo
 Constitución gaseosa
 Temperatura de incubación
 Proveer el ambiente apropiado

3 Suspensión celular
Consiste en células libres y agregados celulares distribuidos en un medio en movimiento.

 El mejor inóculo para una suspensión de células es un callo friable con alto ritmo de división celular.
 Presentan un rápido decaimiento en su actividad catalítica

3.1 ¿Qué es un callo?

Masa desorganizada dividiéndose activamente. Son células no diferenciadas. Consiste en células somáticas de espécimen
de planta adulta.

3.2 ¿Qué son las células inmovilizadas?

Células o enzimas físicamente confinadas o localizadas en una cierta región definida en el espacio donde se encuentran.
Pueden ser inmovilizadas de forma temporal o permanente.

3.2.1 Selección del material para inmovilizar células

 Material estable e inerte, biocompatible y sin reacción
 Generar protección contra deterioro microbiano
 No degradables, aptos para condiciones de pH y temperatura baja
 Accesibilidad al sustrato
 Tener alto factor de inmovilización para una eficiente bioconversión
 3.2.2 Matrices utilizadas
 Pellets de gluten
 Pectato
 Carragenina
 Poliacrilamida
 Resina
 Celulosa

3.2.3 Tipos de inmovilización

 Pasiva:
 Activa:

3.3 ¿Qué son los protoplastos?

Son células vegetales que se han desprovisto de su pared celular.

3.3.1 Uso de protoplastos

 Mejoramiento genético
 Investigación viral de plantas
 Cultivos de un medio

3.3.2 Métodos de aislamiento de protoplastos

Estos métodos se encargan de degradar la pared celular con el fin de obtener una célula desnuda, con la
característica de solo contener todos los organelos dentro de su membrana.

 Químicos
 Enzimáticos (Pectinasa, celulosa, hemicelulosa y mezcla de ellas)
 Mecánicos

3.3.3 Aislamiento exitoso

Contraer la pared celular, plasmolisando las células con sales, azucares, y alcoholes azucarados como el
manitol. La concentración osmótica rompe a pared y protege la célula.

3.3.4 Fusión somática

O hibridación somática, consiste en la fusión de dos células protoplastos. Células somáticas de diferentes
especies y la posterior regeneración de plantas híbridas a partir de los protoplastos fusionados. De las cuales
se describe a continuación el tipo de fusión que se pueda dar entre estas células.

3.3.5 Mezcla de protoplastos

 Homocarion: Fusión de protoplastos de la misma planta
 Intraespecífica: Fusión de protoplastos de plantas de la misma especie
 Interespecífica: Fusión de protoplastos de diferentes especies

Exposiciones – Protoplastos
4 Cassava Mesophyll protoplass: Isolation, proliferation and shoot formation
4.1 Introducción
 Cassava es un cultivo de gran importancia en la alimentación humana y de animales.
 La regeneración de plantas por medio de callos y/o protoplastos de planta ha sido descrita únicamente en
pocos cultivos.
 El desarrollo de un sistema de regeneración en la planta de cassava había sido poco explorado hasta ese
entonces, únicamente se habían reportado regeneración por medio de cultivos por meristemo y callo.
 El cultivo de protoplastos puede ser de gran importancia en los estudios que involucren el mejoramiento de la
planta.

4.2 Objetivo
 Desarrollar un procedimiento para el aislamiento, cultivo, proliferación y formación de brotes a partir de
protoplastos obtenidos de tejido mesófilo de la planta Cassava.

4.3 Medios de cultivo utilizados en el experimento

 Desarrollados por J.F Shepard.
 Involucran diversos componentes químicos necesarios en cada fase de desarrollo del cultivo.
 Medio Cl y R necesarios para la replicación de los protoplastos dentro de cajas Petri.
 Medio C para formación del tejido, gracias a la BAP y NAA.
 Presencia de auxinas y citoquininas en medio D promueve la generación de brotes, diferenciación celular,
retardo de envejecimiento y enraizamiento.
 Alta concentración de ácido gilbérico en medio E da paso al crecimiento del tallo y enraizamiento.

4.4 Método
Crecimientos de plantas

 Plantas con secciones de 3 nodos fueron sembradas en frascos con vermiculita.

 Condiciones ambientales controladas (28°C , 90% HR ,12h 3000lux y humedecidas con agua desionizada).
 Hojas de entre 7-9 cm de largo se colectaron y remojaron en solución con 1mM de CaCl2, 1mM NH4NO3,
1ppm ácido naftaleneacético y 5 ppm benzilaminopurina.
 Incubadas, esterilizadas, cepilladas suavemente y remojadas durante toda la noche en soluciones salinas.

Preparación de protoplastos

 Se prepararon los protoplastos en una solución enzimática (Macerozima 0.5% y Celulasa 1.0%), incubados a
25°C durante 5 h.
 Se centrifugó y recolectaron los protoplastos para colocarlos en una solución con medio-CL.
 Se volvió a centrifugar y se mantuvieron en la solución hasta por una hora antes de ser cultivados.

Cultivo de protoplastos y formación de callos

 Los protoplastos se cultivaron en cajas con medio Cl y medio-R dentro de cajas Petri con cuadrantes, a 24°C a
400 lux de forma continua, durante 3 semanas.
 Se removieron los protoplastos y se ubicaron en cajas Petri con medio-C.
 Dentro de las siguientes dos semanas, después de la aparición de callos, fueron transferidas individualmente
a medio fresco-C durante 14 días y posteriormente a medio-D con una intensidad lumínica de 4000 lux y un
día de 16 horas.
 Se transfirieron a medio D y medio-MS con intensidad lumínica de 4000 lux y un día de 16 horas.
4.5 Resultados
 Formación de protoplastos esféricos con diámetros de 38 um.
 Rendimiento promedio de protoplastos 5.6 x10^6 /g con una alta apariencia vial.
 Alcoholes de azucares, en adición de sacarosa, como estabilizador osmótico en medio-CL fue indispensable
para la división de los protoplastos.

 Mas del 90% de los protoplastos formaron pared celular e incrementaron de tamaño.
 Formación de colonias visibles después de 3 semanas de iniciar el cultivo.

 Crecimiento acelerado y aparición de callo verde entre las dos primeras semanas después de ser transferidas
al medio-C.
 El mejor resultado se obtuvo del medio-C, que contenía 0.5 mg/l BAP, 0.1mg/l NAA, 0.25% sucrosa y 2.46%
manitol con mejores características físicas.
  La formación de brotes se dio cuando las plantas fueron puestas en medio MS suplementadas con 0.045
mg/l BAP, 0.25 mg/L IAA y 0.014 mg/L GA, después de 8 días se pasó a medio SH con 10mg/l 2,4-D y 1uM de
quitenina.

4.6 Conclusiones
El desarrollo de técnicas que den paso a la formación de tejido ha sido de gran utilidad a la hora de transformar células
ya que hacen posible la regeneración de la pared celular, desarrollo de raíces y brotes, dando como resultado la
propagación de una planta modificada.

5 Cinta – Sandwich de Arabidopsis: Un método de aislamiento de protoplastos

de arabidopsis más simple

6 Glosario
Meristemos: Región de crecimiento de las plantas. Se sitúan en el extremo de sus órganos, raíces y tallos, así como en
algunos puntos concretos dentro de algunos tejidos como las hojas, que no solamente crecen desde la punta o el xilema,
lo que permite el crecimiento en grosor de las plantas vasculares.

Mesófilo:

Auxinas, gibérilinas y citocininas: Son hormonas vegetales importantes para el crecimiento y desarrollo de la planta,
estas hormonas regulan las etapas de desarrollo.

Vermiculita: Es un mineral proveniente de la familia de las micas, está compuesto de silicatos de hierro, magnesio y
aluminio, es utilizado como sustrato para la propagación de diversidad de plantas, ayuda a la retención de nutrientes que
favorecen al crecimiento y desarrollo de las plantas.

Sucrosa: Azúcar de mesa, es sinónimo de sacarosa o dextrosa.

Explante: Tejido vivo separado de su órgano propio y transferido a un medio artificial de crecimiento.