INFORME DE AISLAMIENTO DE LINFOSITOS

Presentado por : Adriana mendoza arrieta

Danna hernandez quintero
María José Galeano martinez

Para: karina susana pastor sierra

Univeridad de cordoba
Facultad de ciencias basicas
Programa de biologia
Departamento de cordoba
08/03/2018
 INTRODUCION
La sangre periférica es la fuente primaria de obtención de células mononucleares (linfocitos
y monocitos). El proceso de separación de células mononucleares del resto de los elementos
formes de la sangre, se basa en la diferencia de densidad existente entre ambos. Aislamos
células mononucleares de sangre periférica o PBMCs (Peripherial Blood Mononuclear Cells),
utilizando un reactivo llamado Lymphoprep para crear un gradiente de densidad. Cuando
ponemos la sangre sobre el Lymphoprep, y lo sometemos a centrifugación, se separan las
distintas especies celulares en función de su densidad. Si tenemos en cuenta que los
hematíes y los granulocitos (salvo los basófilos) tienen una densidad mayor a la del
Lymphoprep, éstos caerán al fondo. Por el contrario, las células mononucleares al tener
menor densidad quedarán por encima del Lymphoprep. Las plaquetas tienen una densidad
menor que los monocitos, por lo que flotan con el plasma, en la parte superior del tubo.
 OBJETIVOS
 Retirar los linfocitos que se encuentran en la muestra después que se llevó a
centrifugación
 Identificar que papel importante juega el reactivo empleado en la práctica de
separacion de linfocitos
 MARCO TEORICO

El estopaquete es una solución estéril probada con endotoxina, de polisacáridos y

diatrizoato de sodio, ajustada a una densidad de 1077g/ml. Este medio listo para usar
facilita la recuperación rápida de linfocitos a partir de pequeños volúmenes de sangre
completa.
La solución de cloruro de sodio es de 0,9 comúnmente conocido como suero fisiológico es
una disolución acuosa de sustancias compatibles con los organismos vivos debido a sus
características de definidas de osmoticidad, ph y fuerzas iónicas. Esta solución es isotónica
es por ello que se usa en esta técnica ya que no de formar ni hará inviables a los
componentes celulares de la sangre.
La centrifugación preparativa se utiliza para separar partículas según la velocidad de
sedimentación centrifugación diferencial, la masa (centrifugación zonal) o la densidad
(centrifugación isopicnica. En el primer caso se obtiene un liquido sobrenadante y un
material sedimentado. Las partículas se pueden separar en función de la centrifugación
isopicnica constituyen ejemplos de centrifugación mediante un gradiente de densidad.
En la centrifugación por gradientes de densidad, la separación de una muestra se logra por
sedimentación a través de un gradiente de densidad, esto es, una solución que incrementa
en densidad desde la parte superior hacia la inferior del tubo de centrifuga. Dos
aproximaciones distintas son posibles usando esta técnica; centrifugación zonal y
centrifugación de equilibrio en gradiente.
 MATERIALES Y REACTIVOS
 Muestra: sangre total por venosa anticoagulada con heparina o EDTA
 Pipetas
 Tubos de 10ml
 Guantes látex
 Lymphoprep
 PBS
 PROCEDIMIENTO
1. Diluir la sangre en una proporción 1:1 de tal forma que cojamos 3ml de sangre y 3ml de PBS en
un tubo de

10ml (o RPMI en condiciones de esterilidad).

2. Añadimos 4ml de Lymphoprep en un tubo de 10ml.

3. Añadimos en el tubo anterior la sangre diluida con la ayuda de una pipeta Pasteur, de modo que
caiga por las paredes del tubo con un flujo continuo. Para ello dejaremos resbalar la primera gota
con el tubo inclinado levemente para que sea más difícil que se mezclen las fases.

4. Centrifugamos durante 30’ a 2000 rpm (ó 900 g). La ecuación que relacione el rpm y las g es la
siguiente: g = 11.17 x r (cm) x (rpm / 1000)2 Æ r= radio del rotor de la centrífuga

5. Después de la centrifugación, observamos varias capas: (Fig. 2).

6. Con la ayuda de una pipeta Pasteur, recogemos la nube de mononucleares con cuidado de no
mezclar las fases y de no coger Lymphoprep. OJO!!!!!!! Aspiramos con la pipeta previamente
apretada antes de introducirla en el tubo.

7. Llevamos las células a un tubo de 10ml y añadimos PBS hasta completar el tubo con el fin de lavar
las células y centrifugamos durante 10’ a 1400 rpm, para lavar y eliminar las plaquetas.
 RESULTADOS Y ANALISIS
El Cuadro 2 muestra una serie de valores relativos y absolutos de linfocitos T, descritos en
la literatura por diversos investigadores, utilizando la técnica de rosetas E. En él se observa
considerable heterogeneidad en los resultados. Esto sugiere que ligeras modificaciones
técnicas entre los diversos laboratorios pueden conducir a resultados no necesariamente
idénticos. Al comparar los valores obtenidos en el presente estudio con los resumidos en el
cuadro 2, puede decirse que, en general, nuestros valores relativos (porcentaje) son más
bajos que la mayoría de los descritos. Por otro lado, las cifras absolutas concuerdan con la
mayoría de las referencias investigadas (Cuadro 2). Nuestros resultados demuestran la
importancia de establecer valores de referencia propios, para evitar errores de
interpretación causados por la aceptación indiscriminada de valores descritos en la
literatura, como lo ha señalado Stites (38). Además, debe considerarse que la gran mayoría
de valores de referencia para esta clase de parámetros inmunológicos se ha establecido con
base en poblaciones de países desarrollados, sujetas a factores ambientales y genéticos
diferentes a los que prevalecen en países como el nuestro. Al respecto, se ha demostrado
claramente que los valores de inmunoglobulinas séricas en países subdesarrollados son
significativamente mayores que las de países industrializados de alto nivel socioeconómico
(26). Dichas diferencias pueden deberse no sólo a factores genéticos sino también
ambientales, es decir, una mayor estimulación antigénica (26).
La separaci6n física de los distintos tipos de células sanguíneas es una práctica biomédica que exige
prontitud y destreza para asegurar mayor viabilidad celular. Esto es posible con el protocolo descrito
ya que permite que, una vez obtenida la muestra de sangre, esta pasa de inmediato a ser
centrifugada. S610 hay que reemplazar la aguja de la jeringa por la cámara receptora 0 porta células
(eritrocitos), esquematizada en la Figura 2, la cual ha sido previamente Ilenada con la soluci6n
separadora de ficoll-hypaque. Durante la centrifugaci6n este medio de separaci6n, cuya densidad
inicial es de 1.077, va siendo gradual mente desplazada de la cámara b3 (Figura I-B), por la entrada
gradual de los eritrocitos comenzando por los más densos. La velocidad de entrada de estas células
está determinada por dos elementos: a) La fuerza centrífuga, la cual a su vez depende de la
velocidad angular de rotaci6n (1.000- 2.500 rpm), y del radio de giro. Para fines practicas se célula
la fuerza centrífuga relativa como: FCR = K x R X N' x 10' 5; siendo: K = 1,118; R = radio de giro en
centímetros; N = rpm. Durante la centrifugaci6n a la velocidad máxima (2.500 rpm), la FCR para la
capa superior de la sangre es de 5162xG, y en el fondo los eritrocitos tienen un valor de 12.537xG
(Figura 2-B), (15). b) La entrada gradual de los eritrocitos a la cámara es isoc6rica e induce el
desplazamiento del ficoll-hypaque hacia la jeringa, 10 cual a su vez hace que vaya cambiando la
densidad del medio separador. Los eritrocitos arrastran asociados a sus 128 - 160 micras cuadradas
de superficie celular (16), solutos/solventes plasmáticos, que no pueden ser removidos por la
turbulencia hidrodinámica durante la centrifugación
 CONCLUSION

Por medio de esta práctica logramos observar y realizar todo el proceso que conlleva la observación
de un cariotipo humano, desde la toma demuestra para obtener las células necesarias para la
obtención de los cromosomas (en este caso linfocitos), su proceso de cultivación para madurarlos
(ya que cuando se encuentran en circulación ya dejan de madurar y reproducirse) y de esta manera
obtenerlos en metafase que es en la que se observan mejor a los cromosomas por medio de la
ruptura de las células para que estos salieran de los núcleos; Se realizó la tinción cromosómica para
hacer visibles a los cromosomas y de esta manera poderlos identificar. Se puede decir que estos
procedimientos son muy laboriosos y dependen de la dedicación y la experiencia que se tenga para
realizar el procedimiento de manera adecuada y así lograr obtener mayor cantidad de cariotipos y
de mejor calidad de los que obtuvimos, ya que como todo con la práctica se realiza mejor. Por otra
parte ya que no tenemos el equipo necesario para realizar la identificación específica de los
cromosomas, se realizó un ejercicio de cariotipos humanos en los que se identificaron por bandas y
tamaños los cromosomas para de esta manera tener una idea de cómo se realiza la identificación
cromosómica de los cariotipos humanos
 BIBLIOGRAFIA
1. Asma G. E. M., Van Der Bergh R., Vossen J. M. Use of monoclonal antibodies
in a study of the development of T lymphocytes in the human Fetus.
2. Bentwich Z., Douglas S. D., Skutelsky E., Kunker H. G. Sheep red cell binding
to human lymphocytes treated with neuraminidase: enhacement of T cell
binding and identification of a subpopulation of B cells. J. Exp. Med, 1973;
137:1532-1537.
3. Berger B. M., Schuman R. M., Daniele R. P., Nowell P. C. E rosette Formation
4. Bernego M., Capella G., De Matteis A., Tovo P., Zina G.