Curso de Fluorimetría

Dr. Jorge Peón Peralta

Instituto de Química, UNAM

Mayo, 2018
 4’3’ Primer estado
2’
1’ excitado
0’

Energía 43 Estado basal

2
1
0

rAB

04’ 03’
05’ 02’ 30’ 40’
Intensidad

01’
06’ 10’ 20’ 50’
07’ 00’ 60’
08’

Debido a la distribución de Boltzmann, todas las moléculas se

encentran en el menor nivel vibracional de su estado electrónico
basal y por ello, la absorción siempre se realiza desde dicho nivel.
 S2

Relajación vibracional
S1

Intensidad
S0
7 6 5 4 3 2 1 4’ 3’ 2’ 1’
Excitación Emisión 7 6 5 4 3 2 1 1’ 2’ 3’ 4’
λ
Debido a que la conversión entre los estados superiores y la relajación
vibracional es casi instantánea, toda la fluorescencia se emite desde el
nivel vibracional inferior del primer singulete excitado S1 (REGLA de
KASHA).
S1

Regla de la imagen especular

S0
 Lámpara

Esquema básico de un
Monocromador
fluorímetro
M1
de excitación

M2 Detector

Muestra Monocromador
del detector
Espectro Excitación:
Fijar la longitud de onda de detección.
Escanear la longitud de onda de excitación.
Produce un perfil idéntico al de absoción.
… Entre otras cosas, permite asignar la emisión observada a la
molécula que es responsable de la misma.

Espectro Emisión:
Fijar la longitud de onda de excitación.
Escanear la longitud de onda de detección.
La longitud de onda de excitación es menor que la de emisión.
…animación: M. en C. Rafael López Arteaga.
Parámetros de un experimento de fluorimetría:

Espectro de emisión
1. Longitud de onda de excitación
2. Intervalo de longitudes de onda de emisión
(“escan” del monocromador de emisión)

Espectro de excitación
1. Longitud de onda de detección (emisión)
2. Intervalo de longitudes de onda de excitación
(“escan” del monocromador de excitación)

Además:

1. Tamaños (en Dl de las ranuras de salida de los

dos monocromadores)
2. Uso de filtros para ambos monocromadores
3. Voltaje aplicado al PMT (detector)
4. Velocidad de adquisición del espectro (lo
determina el tiempo en el que el equipo
permanece en cada longitud de onda). Mientras
más rápido, mas ruido
5. Empleo de funciones de corrección
El espectro de excitación reproduce exactamente el perfil del espectro de absorción:

…Siempre y cuando todos los eventos de excitación produzcan al estado Fluorescente con el
mismo rendimiento, y la absorbancia en todo el espectro sea suficientemente baja como
para que la intensidad de emisión sea proporcional a la absorbancia.

El espectro de absorción (unidades de absorbancia) se reproduce del

Espectro de excitación simplemente “escalando” el espectro de excitación (un único factor
para todo el espectro).

Esto es útil para verificar sí la emisión que estamos observando en efecto proviene de la
molécula con el espectro de absorción dominante.
Un fluorómetro real necesita seguir la intensidad de la fuente de luz (lámpara)
ya que ésta no emite de manera constante en todo el espectro (se requiere
corregir esto para tener buenos espectros de excitación).

Señal corregida respecto a las diferentes intensidades de la fuente (lámpara) :

𝐼𝑠𝑒ñ𝑎𝑙
𝐼𝑟𝑒𝑓

Señal corregida final que toma en cuenta la sensibilidad espectral del detector
de referencia:
𝐼𝑠𝑒ñ𝑎𝑙 𝜆
𝑓(𝜆)
𝐼𝑟𝑒𝑓 𝜆
donde f(λ) es la “función de corrección del detector de referencia”.
 Separador
shutter de haz
filtro polarizador
muestra

Referencia y

Referencia

Iref(λ)

Seguimiento de la intensidad de
la lámpara a las diferentes
longitudes de onda en un
Iseñal(λ) espectro de excitación.
 Considerar siempre la posible
presencia del segundo orden
de difracción.

Radiación
incidente 300 nm
1er orden 600 nm
1er orden

300 nm
2° orden

600 nm
2° orden
 Para eliminar la luz de lexc/2 (en 2° orden),
colocar aquí un filtro que corte las
longitudes de onda menores a Iexc.

muestra

lámpara Monocromador de excitación

Para eliminar la luz de ldet/2 (en

2° orden, en particular Iexc),
Monocromador colocar aquí un filtro que corte
de detección las longitudes de onda menores
a ldet menor del espectro.

detector
Espectro Tomado sín filtros en el La longitud de onda donde se
monocromador de emisión y que espera la señal Raman se
abarca desde antes de la longitud de calcula restando a la
onda de excitación hasta más allá del frecuencia de excitación, la
doble de la longitud de onda de
excitación. energía de la transición Raman
( p. ej. Para etanol, 2910 cm-1 ).

Fluorescencia

2° orden de esparcimiento Rayleigh

2° orden de Fluorescencia
2° orden de esparcimiento
Rayleigh
𝜆𝑒𝑥
𝜆𝑅 =
Raman (MeOH)
1 − 𝜆𝑒𝑥 Δ𝜈ҧ

Raman (MeOH)
𝜆𝑒𝑥 2 Δ𝜈ҧ
Δ𝜆𝑅 = 𝜆𝑅 − 𝜆𝑒𝑥 =
1 − 𝜆𝑒𝑥 Δ𝜈ҧ

Se observa tanto la señal de

esparsimiento elástico (Rayleigh), como el
esparsimiento Raman o inelástico.
 Filtros
Filtro de “longpass”
banda ancha Filtros usados para eliminar la presencia
de algunos artefactos (2° orden de
difracción).

Filtros de
interferencia Los filtros del Cary Eclipse son de este
tipo (el rango que indica el equipo
corresponde a las longitudes de onda
donde el filtro transmite casi el 100 %,
fuera de este rango indicado, la
transmitancia es casi cero.)
En los espectros de emisión también suele ser necesario considerar que el
detector del monocromador de emisión (PMT) tiene diferente
sensibilidad en diferentes regiones del espectro.

Esto se corrige, multiplicando por una función de corrección

𝐼𝑐𝑜𝑟𝑟 𝜆𝑑𝑒𝑡 = 𝐼𝑑𝑒𝑡 𝜆𝑑𝑒𝑡 ∗ 𝑓𝑐𝑜𝑟𝑟 (𝐼𝑑𝑒𝑡 )

… la fcorr(λdet) la debe traer el equipo. En el Cary Eclipse, esta

multiplicación se hace al indicar que se desea un espectro “corregido”.
Efecto de usar concentraciones demasiado altas (efecto de absorción al
frente de celda).

Esto cambiaría la forma de los espectros de excitación y alteraría

mediciones de rendimiento de fluorescencia. En principio también podría
alterar mediciones cinéticas.

→ Usar concentraciones que produzcan absorbancias en el rango lineal

del aparato a las longitudes de onda de excitación.
Efecto de usar concentraciones muy altas: reabsorción. Este problema es
mayor si hay bandas de absorción que coincidan con el espectro de
emisión (p. ej. Ftalocianinas, cianinas, etc).

Muestra
diluida

Absorción

Este efecto se minimiza si se usan soluciones con absorbancia menor a ≈ 0.1

→ Abs= 0.05 (media celda) → I/I0 = 10-0.05 ≈ 1.

La perdida de la linealidad de la señal de intensidad de fluorescencia como
función de la absorbancia depende de la longitud de onda de detección y
excitación

Intensidad de fluorescencia vs
absorbancia CARY ECLIPSE

Para estas longitudes de onda de

excitación y detección, puede haber
tanto reabsorción como efecto de
frente de celda
Diferentes tipos y disposiciones de celdas que minimizan efectos de tener
que tomar espectros de emisión de soluciones muy concentradas o
sólidos:

La reflexión especular puede ser peligrosa para el detector.

 Efecto de cambiar la apertura de la ranura (slit) de salida del
monocromador de emisión:

SI se abre demasiado esta ranura, se pueden perder detalles de la forma

del espectro. En principio lo mejor es tomar el espectro variando las
ranuras hasta que se note que no hay variación en la forma del espectro.
Esto es más importante en espectros muy “estructurados”.
Errores comunes en la preparación de muestra:
1. Concentración de fluoróforo muy elevada
usar soluciones diluidas OD ≤ 0.5
Slit de detección

2. Disolvente o celda contaminados

fluoróforo
Verificar siempre la posible emisión del
Fluoróforo +
disolvente
disolvente
Disolvente contaminado
contaminado

3. Luz esparcida
Usar λexc, y/o filtros adecuados.

4. Partículas en solución

Filtrar la solución con un filtro de

tamaño de poro adecuado
En proteínas, el efecto de la selección de la longitud de onda de excitación
(considerar la absorbancia y fluorescencia de la tirosina cuando se desea
observar la emisión del triptófano).
Cambio de escala de longitud de onda a número de onda:

1 1
Δ𝜈ҧ = 𝜈ҧ2 − 𝜈1ҧ = −
I λ1 λ2 𝜆2 𝜆1
𝜆1 − 𝜆2 Δ𝜆
= ≅ 2
𝜆1 𝜆2 𝜆
λ

Relación entre la resolución espectral en longitud de onda (λ) y en

número de onda (𝜈). ҧ

𝐼 𝜈ҧ = 𝜆2 𝐼 𝜆
 Cálculo de Rendimiento Cuántico de Fluorescencia.
𝐼 ⋅ 𝐴𝐸 ⋅ 𝑛 2 Estándar: Rodamina B en etanol, ΦE = 0.7
Φ𝐹 = ΦE
𝐼𝐸 ⋅ 𝐴 ⋅ 𝑛𝐸2 Muestra: DEANF en acetonitrilo

𝐼𝐷𝐸𝐴𝑁𝐹 = 450.82 𝐴𝑅𝑜𝑑𝑎𝑚𝑖𝑛𝑎 𝐵 400 𝑛𝑚 = 0.004 𝑛𝐴𝑐𝑒𝑡𝑜𝑛𝑖𝑡𝑟𝑖𝑙𝑜 = 1.34

𝐼𝑅𝑜𝑑𝑎𝑚𝑖𝑛𝑎 𝐵 = 4584.51 𝐴𝐷𝐸𝐴𝑁𝐹 400 𝑛𝑚 = 0.04 𝑛𝐸𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 = 1.36

450.82 ⋅ 0.004 ⋅ 1.342

Φ𝐹 = 0.7 = 0.0084
4584.51 ⋅ 0.04 ⋅ 1.362

Rodamina B

DEANF
EXPERIENCIAS SUGERIDAS CON EL EQUIPO DE FLUORESCENCIA

1) Tomar con la celda de solo disolvente (etanol), un espectro de emisión desde

250 hasta 900 nm, usando una longitud de onda de excitación de 600 nm.
No usar ningún filtro ni de excitación ni de detección. Se debe ver el
esparcimiento Rayleigh y el Raman de 1er orden en la λexc y en la λexc/2 (que
sale como luz de 2º orden de difracción del monocromador de excitación).
Usar slit de excitación de 5 nm y de emisión de 5 nm. Voltaje del PMT en
medio, y velocidad de adquisición rápido.

2) Tomar de nuevo el espectro de (1), pero ahora, colocar un filtro en el

monocromador de excitación que elimine las longitudes de onda de 450 nm
para abajo (filtro de 550 a 1100 nm). Se eliminan las señales asociadas a la
λexc/2.

3) Tomar con la celda solo con disolvente (etanol), un espectro de emisión con
la λexc de 350 nm. Escanear el intervalo de 370 nm a 900 nm. Colocar el filtro
automático para excitación, y no usar ningún filtro para la emisión. Se debe
ver el 2º orden de difracción de la luz de excitación (y quizá el Raman en 2º
orden), en λexc x 2.
4) Tomar de nuevo el espectro del inciso 3, pero ahora, colocar un filtro en el
monocromador de emisón que abre de 450 a 1100 nm. Debe desaparecer
las señales de en λexc x 2. Ya que la luz que se detectaba a esta longitud de
onda es en realidad de 350 nm.

5) Colocar la solución de antraceno. Esta solución tiene una absorbancia menor

a 0.1 en las longitudes de onda de la 1ª transición. Tomar un espectro de
emisión con λexc de 350 nm. Escanear de 360 nm a 900 nm. Usar slits de
5 nm de excitación y 2.5 nm de emisión. Indicar que se desea el espectro
“corregido” (es decir se multiplica la señal del detector por una función de
corrección espectral). Al tomar este espectro se puede mostrar tanto el
espectro corregido como el no corregido. Nótese que si no se usa un filtro en
el monocromador de emisión, quizá se pueda ver el segundo orden de
difracción de la fluorescencia.

6) Con la solución de antraceno, tomar un espectro de excitación. Usar una

longitud de onda de detección de 423 nm y escanear de 300 a 400 nm. Usar
la selección automática del filtro de excitación y luego, intentar con algún
otro filtro. Indicar que se desea el espectro corregido.