OBJETIVOS

1. Utilizar técnicas sencillas para extraer el ADN de un tejido animal y vegetal, por el
aspecto que presenta, confirmar su estructura fibrilar.

2. Confirmar a partir de la longitud enorme de las fibras en el núcleo que el ADN se

encuentra replegado.

RESULTADOS

 Se observó en el ADN animal una formación amarilla y fibrosa entre las

fases del alcohol y el material genético, estas fibras se recolectaron de la punta de
un agitador.
 En el material genético vegetal se observó que al contacto con el alcohol se
inicia la formación de una banda blanca de aspecto fibrilar y de algodón mojado,
esta banda se ubicó en la interface entre las soluciones.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Todo organismo vivo

está formado por
moléculas de ADN.
Éstas form an parte de
todas las células, y
contienen la información
genética utilizada en el
desarrollo y
funcionamiento
de los seres vivos. (Watson,
J. D. y Crick, F. H. C,
1953). Ahora bien, dentro de la morfología celular, se conoce que las membranas de las
células animales están formadas por dos capas de lípidos con proteínas transmembranales
que permiten el transporte de sustancias a través de éstas. En el caso de las células
vegetales, existe una pared celular que se compone del polímero carbohidrato llamado
celulosa (ver figura 1) (Solari, 2011).

EsFigura 1

Figura 1. Estructura de la pared celular en células vegetales.

Para extraer el ADN de las células, es necesario romper las membranas y paredes celulares,
acceder al núcleo y destruir su envoltorio nuclear sin causar daño al ADN. Esto se logra
gracias a la acción conjunta de dos soluciones hipertónicas, una de ellas compuesta por
cloruro de sodio y champú (primer tampón) y la segunda, usada para el ADN vegetal, está
compuesta por bicarbonato de sodio, cloruro de sodio y detergente líquido (segundo
tampón). Estas disoluciones rompen las paredes celulares y la bicapa de fosfolípidos de las
membranas plasmáticas, facilitando el estallido de la envoltura nuclear.

El primer tampón provocó la lisis celular de los hepatocitos liberando su contenido

citoplasmático. Estos organelos, ya extraídos de las células, quedaron suspendidos en la
solución, tras de lo cual se realizó un lavado con 50ml de agua destilada. En el líquido
resultado del filtrado se recuperaron los fragmentos celulares de interés como los núcleos.

La función del segundo tampón es provocar el estallido de las paredes celulares, apoyados
en la solución hipertónica. Por acción del detergente se eliminan los fragmentos proteicos
asociados al ADN vegetal, quedando solamente las hebras de material genético en
suspensión.

El tejido hepático fue escogido debido a su gran densidad celular y porque carece de células
adiposas que puedan intervenir en el experimento. Además de ser la estructura funcional del
hígado, el hepatocito posee algunas funciones como la filtración sanguínea, la
desintoxicación de moléculas nocivas por medio de las enzimas Citocromo P450 y funciona
como la primera barrera de absorción de medicamentos. (Lewis R. 2011)

La cebolla cabezona (Allium Cepa) fue escogida debido a que sus células son de un tamaño
lo suficientemente grande como para obtener una cantidad considerable de ADN de sus
núcleos (Strachan y Read 2006). También, gran parte de sus células se encuentran en
interfase, lo que permite apreciar la cromatina en su máxima condensación.

Se midió el volumen del extracto de ADN animal, y este mismo se tomó para extraer
cloruro de sodio al 2M para crear una disolución 1/1. Al mezclar el cloruro de sodio con el
filtrado de hígado se produjo un cambio de tonicidad en la solución, quedando ésta
hipertónica y forzando a que las estructuras del núcleo aumenten de tamaño y se estallen,
liberando así el contenido de cromatina, dejándola suspendida en la disolución. 1

Cada ingrediente que se utilizó luego, tiene su propia función, la solución de sal y jabón
sirve para romper la membrana plasmática y nuclear e incluso la pared celular, y el alcohol
etílico sirve para precipitar el ADN, como se evidencia en la siguiente gráfica:

(DIBUJO SOLUCIÓN HIPOTÓNI/HIPERTÓNICA)

Primero, al ADN filtrado se le añadió 1cm 3 de detergente líquido, con el propósito de

destruir las bicapas fosfolipídicas que desarman las membranas celulares, al tiempo que
separan el ADN de los fragmentos proteicos más grandes. Estas proteínas que se asocian al
ADN como las histonas, le permiten al ADN enrollarse y aumentar su longitud y cantidad
de nucleótidos. (Starr y Taggart, 2004).
j

Se requería que la temperatura del

tampón fuera lo suficientemente baja para detener la actividad de las proteasas que
degradan el ADN, para conservar la estructura genética intacta. Para ello se congeló el
tampón durante 10 minutos y se le extrajeron 10ml, que se mezclaron con 5 ml de extracto
de ADN vegetal, con la finalidad de convertir la solución de isotónica a hipertónica y,
1 Este mismo resultado fue evidenciado en un experimento realizado por Rubén E. Zapata y Rubén D. Osorio
(2005).
mediante el cloruro de sodio, provocar el estallido de los núcleos según lo dicen Jorde,
Lynn, Carey y Bamshad, (2011). El champú logra crear micelas con las proteínas que
complementan el ADN y el bicarbonato de sodio que contiene el tampón actúa como
amortiguador químico. Finalmente, el cloruro sódico neutraliza las cargas negativas del
fosfato del ADN. Según análisis de Martín (2015) en un procedimiento similar, concluyó
que cuando la molécula de ADN se pone en contacto en un medio salado y con alcohol frío,
esta se vuelve insoluble y precipita. Por lo tanto, el agua salada ayuda a la precipitación en
el alcohol, mientras que el champú ayuda a separar el ADN de las histonas.

Los lípidos de la membrana celular se destruyeron debido al detergente, que deshizo las
uniones que mantienen la membrana junta. Cuando el detergente se puso en contacto con
los lípidos, éstos se separaron de la membrana rompiéndola. La estructura de los lípidos es
similar a la del detergente y eso hace que se combinen, formando una burbuja de detergente
y lípidos llamada micela.

A diferencia del ADN vegetal, el ADN animal no requiere centrifugado debido a que los
grandes fragmentos se eliminaron mediante las filtraciones y las micelas de prótidos
formadas con el detergente, quedando el ADN listo para ser extraído y observado.

(DIBUJO MICELAS DE PROTEINAS)

Al separar prótidos y lípidos del ADN, las fibras de cromatina quedaron libres para ser
extraídas y observadas, para ello se utilizó un método de separación donde se utilizó
alcohol al 96% buscando que, cuando el ADN se encuentre con el alcohol, se desenrolle y
precipite en la interfase entre el alcohol y el agua. El alcohol permite visualizar de mejor
manera el ADN y separarlo de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la
solución acuosa (Karp, 2007). El alcohol, al entrar en contacto con la cromatina, pasa de
una coloración rojiza a un amarillo pálido y, con ayuda de un agitador, se revuelve para
facilitar el contacto entre el alcohol y el ADN.

Luego de un reposo de 10 minutos, se observó que la interfase entre las capas se cubrió de
una espuma amarilla clara, esta espuma podía ser recolectada con el agitador formando un
copo donde estaba contenido el ADN.

(DIBUJO DE DOS FASES ALCOHOL Y ADN)

El ADN es una molécula polar, pero la reacción con el etanol a muy baja temperatura hace
que se vuelva apolar e insoluble en el etanol formándose un precipitado justo entre la capa
con etanol líquido y la capa con el extracto pues el ADN es el único componente de la
solución que no es soluble en el etanol (T.F. Lee, 2000).

La cromatina se hace visible porque las diferentes cadenas se van aglutinando entre sí al
precipitar debido a la acción de fuerzas físicas. El alcohol es menos denso que el agua del
extracto y por eso flota sobre la capa del extracto (De Robertis, 2004).

Para facilitar el sedimento de los fragmentos celulares más grandes hacia el fondo, se
realizó el centrifugado de la disolución de ADN vegetal y el tampón a 1500g durante 5
minutos. El ADN, por su bajo peso molecular, quedó suspendido en el sobrenadante. Al
entrar en contacto lentamente con alcohol al 96% se observaron dos capas, el alcohol arriba
y el material que contiene ADN abajo. Al cabo de unos segundos se observó una banda
blanca en la interfase de los líquidos, esta banda de fibrillas blancas era la prueba de que se
extrajo material genético. La banda puede ser removida con un agitador y adquiere un color
blanco grisáceo.

En el proceso de investigación se encontró que la UAB (Universidad Autónoma de

Barcelona) realizó un proceso de extracción de ADN con el objetivo de aislar y observar el
material genético de un plátano con reactivos caseros, al igual que en el experimento
presente se realizó lisis celular pero, en el caso de los españoles, utilizaron además zumo de
piña que contiene bromelina, una enzima capaz de hidrolizar las proteínas y separar el ADN
de las histonas. Este proceso ayudó a que el ADN se desenrollara y fuera más fácil su
extracción. El material que recolectaron en la interfase entre los dos líquidos fue de color
amarillo intenso, debido a la tinción de los carotenos presentes en la piña. Por otra parte, la
extracción de ADN vegetal en su caso, no fue tanta la recuperada como la obtenida en este
experimento utilizando el material genético animal.

El baño frio es un requerimiento cuando se trabaja con material muy expuesto a la

degradación ya que protege el ADN de enzimas como las desoxirribonucleasas que pueden
destruirlo, ya que la refrigeración ralentiza las reacciones enzimáticas. (Peitsch, Polzar
Stephan, Crompton, MacDonald, Mannherz, et.al, 1993).

Al final de la práctica se obtuvo ADN impuro, ya que, entremezclado con él, hay
fragmentos de ARN. Una extracción minuciosa se realiza añadiendo enzimas que
fragmentan las moléculas de ARN que impiden que la unión de estas al ADN.

CONCLUSIONES

Mediante elementos cotidianos es posible realizar la extracción de ADN de manera

didáctica, económica y artesanal, logrando obtener un resultado que, aunque no sea muy
profesional es capaz de demostrar la recuperación de ADN a partir de materiales no muy
costosos.

En las fibras de ADN recolectadas se pueden observar sin ayuda de un microscopio las
hebras de cromatina dispuestas en hilos y, utilizando sencillos procedimientos para lograr
acceder al ADN que se encuentra condensado, ocupar la mayor longitud en el menor
espacio.

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[PDF] La química del jabón y algunas aplicaciones

JIR CONTRERAS, EV Vélez, DHC AMAYA, AC NERI - 2014 -