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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA

PARA INSTRUMENTACIÓN QUIRÚRGICA

Dr. MIGUEL A. MIYARES CALÁS.

Doctor en Medicina. Universidad de Oriente. Cuba.
Especialista de Segundo Grado en Bioquímica Clínica
Doctor en Ciencias Biológicas
Profesor de Bioquímica de UNIBOYACÁ

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA DE BOYACÁ

CENTRO DE INVESTIGACIONES PARA EL DESARRO-
LLO
TUNJA
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PRESENTACIÓN

La enseñanza de la Bioquímica en las distintas áreas de Ciencias de la

Salud requiere de una metodología específica con énfasis en los aspectos
propios de cada una, orientados a dar una formación más profunda, es el
caso de la Carrera de Instrumentación Quirúrgica para la cual el profesor
Miguel Miyares ha preparado el presente manual que permitirá a nuestros
estudiantes contar con un instrumento práctico y didáctico para coadyuvar
en el proceso enseñanza-aprendizaje.

El manual, fruto del trabajo docente tanto teórico como práctico presenta
en forma clara el desarrollo de los laboratorios y los ejercicios que debe
realizar cada estudiante para un mejor resultado académico.

El presente aporte se halla enmarcado dentro de las líneas de Investigación

de la Facultad de Ciencias de la Salud y avalado por el Centro de Investi-
gación para el Desarrollo – CIPADE – a la vez responde a la política
institucional de que nuestros docentes respalden su tarea con los resulta-
dos de la búsqueda permanente de nuevas metodologías y nuevos desarro-
llos científicos.

ROSITA CUERVO PAYERAS

Asesora Centro de Investigaciones para el Desarrollo
CIPADE.
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PRÁCTICA # 1
INDUCCIÓN AL LABORATORIO
El desarrollo de la asignatura de Bioquímica sería extraordinariamente árido y de difícil
comprensión si no se acompañara de algunas actividades complementarias que permitan
ilustrar algunos de los complejos eventos moleculares que transcurren en el interior de las
células y tejidos, por lo que se hace necesario instrumentar algunas prácticas de laboratorio
que cumplan con esta función.

Desgraciadamente la realización de las prácticas de bioquímica son usualmente de larga

duración, gran complejidad y requieren de importantes recursos materiales, por lo que resul-
ta difícil adecuar estas necesidades con la realidad que impone el tiempo curricular, la habi-
lidad y destreza de los estudiantes en estos momentos iniciales de su formación y los recur-
sos de que dispone el centro de altos estudios. De aquí se desprende que seleccionar experi-
mentos que puedan ilustrar eficientemente los conocimientos de bioquímica a los estudian-
tes de Ciencias de La Salud resulta una tarea difícil, aunque imprescindible.

De cualquier forma e independientemente del grado de complejidad y actualización de los

procedimientos empleados en esta tarea, se hace necesario que el estudiante rote por el labo-
ratorio de bioquímica y que conozca toda una serie de normas y cuidados que requiere esta
dependencia.

En UNIBOYACÁ existe un laboratorio de Bioquímica, por donde pasan los estudiantes que
cursan estas asignaturas en las diferentes carreras de la universidad y que cuenta con un
reglamento que debe ser conocido antes de iniciar el trabajo en esta instalación, por lo cual a
continuación pasamos a transcribirlo textualmente:

REGLAMENTO INTERNO DEL LABORATORIO.

El laboratorio es un sitio exclusivo de trabajo, en él se aprende observando, ensayando,

compartiendo las dudas e inquietudes con los compañeros y el profesor; es un lugar que
requiere un comportamiento muy especial y cuidadoso, porque cualquier error, imprevisión,
mal manejo o descuido pueden ocasionar graves perjuicios personales a los compañeros o a
la Institución.

Se presentan a continuación las normas que los estudiantes deberán seguir al asistir a esta
dependencia:

1.- El estudiante debe ser puntual en su práctica y disponer adecuadamente de su tiempo en

el laboratorio, para no trastornar las prácticas de los grupos siguientes. Es indispensable
leer, analizar y despejar dudas e inquietudes sobre la guía de trabajo correspondiente
antes de ingresar al laboratorio.
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2.- Siempre se debe usar la bata blanca de trabajo, de manga larga y mantenerla totalmente
abotonada durante toda la práctica; el estudiante que no porte debidamente la bata no será
admitido en el laboratorio. La bata es de uso exclusivo de esta dependencia.

3.- Colocar en el sitio asignado, por el personal del laboratorio, los útiles, sacos y demás objetos
personales. Nunca colocarlos sobre las mesas de trabajo. No utilizar las mesas de trabajo
como asientos.

4.- Revisar el material asignado antes de iniciar la práctica, verificar si está completo y en buen
estado. Los estudiantes deben firmar la hoja de control y entregarla al Coordinador o al
Laboratorista. TODO EL SUBGRUPO O EQUIPO DE TRABAJO ES RESPONSA-
BLE DEL MATERIAL ASIGNADO Y TODO EL GRUPO ES RESPONSABLE DEL
MATERIAL DE USO GENERAL Y DE LA INSTALACIÓN. Después de entregar fir-
mada la hoja de control no se acepta ninguna reclamación.

5.- Localizar las duchas de emergencia, el extintor de incendios y el botiquín de primeros auxilios.
Conocer y hacer uso correcto de ellos.

6.- Se prohibe fumar, ingerir alimentos sólidos o líquidos dentro del laboratorio y durante la
práctica.

7.- El laboratorio es un sitio de trabajo serio, donde las bromas y los juegos pueden ocasionar
graves accidentes. Se debe mantener cordura, disciplina y un tono de voz adecuado.

8.- Durante la práctica mantener ORDEN Y LIMPIEZA, en las mesas de trabajo, así como en el
sitio asignado para materiales y reactivos de uso general.

9.- Antes de usar un reactivo o solución LEER LAS ETIQUETAS E INTERPRETAR LOS
SÍMBOLOS DE SEGURIDAD, evitar el contacto con la piel, los ojos o la ropa. Utilizar los
medios de protección existentes, entre ellos las caretas asignadas para evitar la inhalación de
gases o vapores tóxicos.

10.- Utilizar adecuadamente pipetas, pipeteadores o espátulas asignadas para cada uno de los
reactivos o soluciones preparadas, evitar contaminaciones y por ende la pérdida total de los
reactivos. NO SE DEBEN RETIRAR LOS REACTIVOS Y/O LAS SOLUCIONES
DEL SITIO ASIGNADO, taparlos después de su uso.

11.- Manejar cuidadosamente los equipos siguiendo las indicaciones dadas por el Profesor, el
Laboratorista o el Coordinador del laboratorio. No descuidar los equipos que se encuentren
en funcionamiento. Los equipos eléctricos enciéndalos únicamente cuando sea necesario.

12.- Rotular adecuadamente con Nombre, código estudiantil, grupo, carrera y materia los monta-
jes y ensayos realizados que requieran de un seguimiento por varios días. Ubicarlos en el
sitio asignado dentro del laboratorio. No interferir ni alterar dichos ensayos.
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EN EL LABORATORIO EXISTE UN PROGRAMA PARA MANEJO Y DISPOSI-

CIÓN DE RESIDUOS SÓLIDOS Y LÍQUIDOS. PARA ELLO TENGA EN CUENTA
LAS SIGUIENTES NORMAS:

13.- No arrojar desechos sólidos, papeles, fósforos, agujas, lancetas, etc. al lavabo, al piso o
a las mesas de trabajo, deséchelos en forma adecuada y en los recipientes asignados para
tal fin:

* Canecas de basura.
* Recipiente para desecho de agujas y lancetas.
* Recipiente para desecho de material de vidrio.
* Recipiente para desecho de materia orgánica como filtrados, vísceras, sangre, etc. y los
que se necesiten en cada una de las prácticas.

Los reactivos químicos se deben desechar en los COLECTORES dispuestos para tal fin; al
terminar la práctica el estudiante debe diluir en agua los reactivos utilizados y verterlos en los
colectores según la naturaleza química de estos. Al iniciar la práctica el Profesor o Laboratorista
advertirán en cuales de los colectores que se mencionan a continuación deben ser dispensa-
dos los residuos líquidos resultantes:

* COLECTOR A: Disolventes orgánicos y soluciones de sustancias orgánicas exentas de

halógenos.

* COLECTOR B: Disolventes orgánicos y soluciones de sustancias orgánicas que con-

tengan halógenos.

* COLECTOR C: Soluciones salinas.

De esta forma se evitará el deterioro de tuberías de desagüe, la contaminación del sitio de

trabajo y de los cuerpos de agua receptores,

14.- Al finalizar la práctica y después de disponer correctamente de los residuos, lavar el

material con precaución, limpiar el sitio de trabajo y ubicar las butacas debajo de las
mesas de trabajo; organizar el material y entregarlo a la persona encargada, para reci-
bir el visto bueno de entrega. LOS ESTUDIANTES NO SE DEBEN RETIRAR
DEL LABORATORIO SIN HABER REALIZADO CORRECTAMENTE LA
ENTREGA.

15.- En caso de pérdida, ruptura de materiales o contaminación de algún reactivo, los estu-
diantes responsables deberán retornarlo al laboratorio antes de la práctica siguiente, de
lo contrario no podrán ingresar al laboratorio y su paz y salvo será retenido. El material
repuesto debe tener las mismas condiciones o especificaciones del perdido y debe pre-
sentarse la factura correspondiente.

16.- Verificar las llaves de gas, grifos de agua e instalaciones eléctricas utilizadas. Disponer
de ellas únicamente cuando sea necesario.
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«PARA CUALQUIER ORIENTACION Y/O DUDA EN SU TRABAJO PRÁCTICO,

DIRÍJASE A SU PROFESOR, LABORATORISTA O MONITOR, ASÍ EVITARÁ EL
INCUMPLIMIENTO DE LAS NORMAS DISPUESTAS EN ESTE REGLAMENTO.
DE SU RESPONSABILIDAD FRENTE AL LABORATORIO DEPENDE EL ÉXITO
O EL FRACASO DE LAS PRÁCTICAS».

La incidencia en las faltas de disciplina y negligencia dará lugar a sanciones que se notifica-
rán a las respectivas Direcciones de Carrera.

Las normas generales anteriormente expuestas son aplicables a cualquier asignatura que tra-
baje en el laboratorio de Química y Bioquímica de UNIBOYACÁ. En particular la asignatu-
ra de Bioquímica y Laboratorio de la Carrera de Instrumentación Quirúrgica tiene caracterís-
ticas propias que deben ser normadas adicionalmente:

NORMAS ADICIONALES DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE

BIOQUÍMICA PARA LOS ESTUDIANTES DE LA CARRERA DE INSTRUMEN-
TACIÓN QUIRÚRGICA.

1.- Los estudiantes podrán asistir a la práctica sólo en el día y hora asignados en la programa-
ción del semestre. Si un alumno se ausentara a una práctica, aún por motivos muy justifi-
cados, NO PODRÁ RECUPERARLA EN NINGÚN OTRO HORARIO. Si la ausen-
cia fuera injustificada su evaluación será de 0, en caso contrario se desestimará en el
momento de sacar el promedio de calificación de las actividades de evaluación periódica.

2.- La entrada al laboratorio será a la hora exacta, NO SE PERMITIRÁ LA ENTRADA

AL MISMO DESPUÉS DE CERRADA LA PUERTA DE ACCESO, y se considerará
consecuentemente como una ausencia injustificada.

3.- Para poder realizar la práctica el estudiante debe llevar su MANUAL DE PRÁCTICAS
DE BIOQUÍMICA, caso contrario no se le permitirá su ingreso al laboratorio y se con-
siderará como ausencia injustificada.

4.- El estudiante no podrá abandonar injustificadamente el laboratorio durante el transcurso

de la práctica, so pena de que se le considere ausencia injustificada. Si por cualquier
motivo de causa mayor tuviera que abandonar el local, se le considerará como ausencia
justificada. Una vez que se abandone el local, por cualquier causa, el estudiante no se
podrá reintegrar al mismo.

5.- Para el desarrollo del trabajo práctico los estudiantes se agruparán en equipos de trabajo
integrados por un máximo de 5 estudiantes. Los equipos de trabajo se conformarán en la
primera práctica mediante la asociación voluntaria de sus integrantes. Una vez conforma-
dos los equipos no se aceptarán modificaciones

6.- Durante el desarrollo del trabajo práctico el estudiante debe ir haciendo los apuntes que se
le orientan en el cuaderno de trabajo e ir respondiendo las preguntas que se le postulan en
el mismo.
7.- En la siguiente actividad académica, posterior al laboratorio, el profesor seleccionará uno
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de los Manuales de Prácticas por cada equipo para realizar su revisión y calificación. Esta
calificación será extensible al resto de los integrantes del equipo. El profesor devolverá el
Cuaderno ya calificado el próximo día hábil después de entregados los Cuadernos. Caso
contrario deberá asignarle la máxima calificación a todos los estudiantes que realizaron
el trabajo práctico. Los estudiantes recogerán su cuaderno en el propio laboratorio o en el
salón de clases.

8.- Los estudiantes, también por equipos de trabajo, entregarán en el modelo correspondien-
te el informe de la práctica. La fecha de entrega será siempre en la primera actividad
docente de la semana siguiente a la realización de la práctica. Caso de no entregarse en
fecha este informe la calificación será de 0. El profesor debe entregar el resultado de la
calificación del informe de práctica en la próxima actividad evaluada que tenga el estu-
diante. Caso contrario deberá asignarle a los estudiantes la máxima calificación de este
aspecto.

9.- En Bioquímica se trabaja con sustancias tóxicas, cáusticas y con material biológico de
alto riesgo, como son tejidos animales, sangre animal y humana y saliva humana. LA
MANIPULACIÓN DE TODO ESTE MATERIAL DEBE REALIZARSE TOMANDO
TODAS LAS MEDIDAS DE PRECAUCIÓN NECESARIAS.

10.- La mayor parte de los llamados «accidentes de laboratorio» son el resultado del incumpli-
miento de alguna de las normas de trabajo o a negligencias, por lo que cualquier accidente que
se produzca en el laboratorio será analizado y si resultara de este análisis que fuera responsa-
bilidad directa de algún estudiante o grupo de estudiantes, los mismos serán sancionados con
la obtención de 0 en la práctica correspondiente o la desaprobación de la asignatura, de acuer-
do con la magnitud de los daños ocasionados. Esta medida se aplicará independientemente de
las sanciones legales y/o resarcimiento económico que deriven de los hechos producidos.

11.- Cualquier repercusión en la salud de un estudiante o grupo de estudiantes, como conse-

cuencia de faltar al presente reglamento, especialmente en cuanto a la manipulación de
sustancias tóxicas, cáusticas y contaminantes, es responsabilidad exclusiva del estudian-
te o grupo de estudiantes y exime a la Institución de cualquier perjuicio que de ello
derive.

12.- Al finalizar la última práctica del semestre los estudiantes entregarán el Manual de Prác-
ticas para su calificación. El profesor los calificará en el transcurso de la semana siguien-
te y entregará el resultado a los estudiantes en el propio laboratorio o lugar que previa-
mente se acuerde.

13.- La calificación integral del Manual de Prácticas tendrá un valor de 0,5 puntos de la nota final
de la asignatura, y será informada a los estudiantes mediante la publicación de una lista dos
días antes de la celebración del acto del examen final.

14.- Las calificaciones de cada uno de los trabajos prácticos de laboratorio serán promediadas
y tendrán un valor total de 2,0 puntos para cada uno de los informes de las evaluaciones
periódicas. Los otros 3,0 puntos serán determinados por el promedio de las calificacio-
nes de los "quizes".
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A continuación se desglosa la forma en que será evaluado cada uno de los trabajos prácticos:

CALIFICACIÓN DEL TRABAJO PRÁCTICO.

Todos los trabajos prácticos serán calificados sobre la base de una escala que va de 0,0 a 5,0
y de acuerdo con la siguiente distribución:

1.- Exposición y análisis de los resultados obtenidos en la

realización de los experimentos durante la práctica. 3,0 puntos

3.- Informe de la práctica. 2,0 puntos.

_________
TOTAL 5,0 puntos

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA.

1.- Organización del trabajo del laboratorio.

2.- Creación de los equipos de trabajo.

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA.

1.- Recepción de los estudiantes por parte del personal del laboratorio. Presentación de los mis-
mos.

2.- Formación de los equipos de trabajo. Los estudiantes se agruparán en equipos de hasta 6
alumnos que conformarán el grupo de trabajo durante todo el semestre. Esta asociación será
voluntaria. Caso de no llegar a acuerdo el Profesor designará los equipos. Cada equipo será
numerado y responderá por el material que se le asigne en cada práctica, así como por el
material general de trabajo de forma rotativa.

3.- Asignación del puesto de trabajo. Cada equipo de trabajo será ubicado en un lugar que será su
puesto fijo de trabajo durante todo el semestre.

4.- Análisis del reglamento general del laboratorio. El Profesor o el Laboratorista impondrán a los
estudiantes de las cláusulas del reglamento general y harán las aclaraciones pertinentes al
respecto tanto de oficio como a instancia de los estudiantes.

5.- Análisis de las normas adicionales para Bioquímica. El Profesor impondrá a los estudiantes de
las normas adicionales que deben ser cumplidas durante las prácticas de Bioquímica y hará las
aclaraciones pertinentes al caso.

6.- Despedida de la práctica. Los estudiantes deberán organizar su puesto de trabajo y abandonar
el local.

NOTA: ESTA PRIMERA PRÁCTICA NO TIENE CALIFICACIÓN. ES SÓLO IN-

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FORMATIVA.
INFORME DE LA PRÁCTICA

INSCRIPCIÓN

Nombre del Estudiante____________________________________. Código:_____________

Semestre Académico _____________________________________. Grupo______________

Día de la semana en que se efectúa la práctica: _____________

Hora en que se efectúa la práctica: _____________

Número del Equipo de Trabajo asignado: _____________

Nombre del resto de los integrantes del equipo de trabajo.

1.- _______________________________________________________________________

2.- _______________________________________________________________________

3.- _______________________________________________________________________

4.- _______________________________________________________________________

Hago constar que me han sido leídos los reglamentos generales de trabajo en el laboratorio y
las normas particulares para Bioquímica, por lo que estoy impuesto de todas sus cláusulas y
me someto a ellas:

______________________________________.
Firma del Estudiante.

NOTA: ESTE PRIMER INFORME CONSTITUYE UNA CONSTAN-

CIA Y NO SE DEVUELVE.
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PRÁCTICA # 2
PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LOS
AMINOÁCIDOS

INTRODUCCIÓN.

Los aminoácidos son importantes compuestos químicos que cumplen un número variado de
funciones dentro de la célula. Entre ellas tenemos:

1.- Constituyen las unidades monoméricas de las proteínas.

2.- Representan la única fuente de nitrógeno metabólicamente utilizable.

3.- Aportan entre un 10 y un 20 por ciento de la energía que utiliza diariamente la célula.

Desde el punto de vista químico pueden definirse como aquellos compuestos químicos orgá-
nicos que poseen al menos un grupo amino y otro carboxilo. Sin embargo esta definición tan
amplia debe restringirse, pues en la célula eucarionte no existen sino los denominados
aminoácidos proteínicos, que serían aquellos que tuvieran enlazados sus grupos amino y
carboxilo a un mismo átomo de carbono (alfa) y que además pertenecen a la serie estérica L,
toda vez que su síntesis es estereoespecífica.
Insertar AA
De lo anteriormente expuesto se desprende que en estos compuestos existe
una parte constante representada por el carbono alfa, el grupo amino y el
grupo carboxilo; por consiguiente todos los aminoácidos tendrán propie-
dades físico-químicas comunes que derivan de esta característica estruc-
tural. Sin embargo en ellos existe también una cadena lateral o grupo R,
de estructura variable, que identifica a cada aminoácido particular, pero
que además se emplea para efectuar su clasificación, toda vez que entre estas cadenas latera-
les de los aminoácidos se pueden encontrar rasgos comunes. Por supuesto que este grupo R
le estará confiriendo a cada aminoácido características físico-químicas diferenciales.

Entre los diversos criterios que se pueden utilizar para establecer una clasificación de los
aminoácidos hemos seleccionado, para la presente práctica, el que considera la polaridad de
la cadena lateral de los aminoácidos, pues es el que más aplicación tendrá de acuerdo con los
objetivos que nos proponemos en el presente trabajo. Así tenemos que los aminoácidos,
siguiendo este criterio, pueden subdividirse en:

1.- Aminoácidos no polares.

2.- Aminoácidos polares.

a.- Sin carga eléctrica apreciable
b.- Con carga eléctrica apreciable: ácidos.
básicos
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La presencia de los elementos estructurales invariantes en los aminoácidos le confieren a

estos compuestos características físicas y químicas comunes, tales como: ser sustancias pola-
res y por consiguiente presentar un elevado punto de fusión y de ebullición y ser solubles en
solventes también polares. En cuanto a sus características químicas manifestarán las reaccio-
nes propias de los grupos químicos que poseen - de hecho los aminoácidos experimentan
todas las reacciones posibles de los grupos amino y carboxilo- por lo que estas reacciones no
pueden ser utilizadas para caracterizar a los aminoácidos.

Sin embargo en la presente práctica se aprovechará la reacción de los aminoácidos con la

ninhidrina, en la que participan tanto el grupo carboxilo como el amino, para la identifica-
ción de la presencia de estos compuestos y su utilización en el revelado de la cromatografía.

Desde el punto de vista químico la ninhidrina no es más que el hidrato de tricetohidrindeno:

Esta ninhidrina, como ya se ha mencionado, en presencia de com-

puestos que posean al menos un grupo amino y otro carboxilo reac-
ciona formando un derivado coloreado, generalmente de azul, y con
desprendimiento estequiométrico de dióxido de carbono, lo que per-
mite que esta reacción sea a la vez un método general para la estima-
ción cuantitativa y cualitativa de los aminoácidos.

La presencia de color permitiría la detección cualitativa de los aminoácidos; y aunque tam-

bién se utiliza ampliamente en la estimación cuantitativa, su utilidad queda limitada por la
dificultad que implica el hecho de que no todos los aminoácidos expresan igual tonalidad de
color con este reactivo, incluso la prolina y la hidroxiprolina desarrollan una coloración
amarilla en vez de azul. Por lo tanto la medición de la intensidad de luz absorbida por el
desarrollo del color no resulta una magnitud exacta y este método debe ser preferentemente
utilizado con fines cualitativos.

Si se deseara emplear esta técnica con fines cuantitativos lo mejor sería la medición
manométrica del dióxido de carbono liberado. Sin embargo las mediciones manométricas
hacen que la manipulación sea de mucho mayor complejidad técnica y por ello en el trabajo
clínico diario, en el que no se requiere de extraordinaria exactitud, se prefiere utilizar el
método colorimétrico. Si se tratara de un trabajo de investigación básica o fundamental sí
resulta imprescindible el uso de la técnica manométrica.
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CARACTERÍSTICAS PARTICULARES DE LOS AMINOÁCIDOS.

La presencia de la cadena lateral (R) variable en los aminoácidos le estará confiriendo a cada
uno de ellos características muy particulares que permitirán realizar su diferenciación en el
laboratorio por medio de diferentes procedimientos tanto químicos como físicos.

De hecho, la variabilidad existente en estos grupos posibilitará que el aminoácido particular

reaccione de modo diverso ante la presencia de reactivos que sean específicos para determi-
nados grupos; por ejemplo si el aminoácido presentara un grupo fenilo en su cadena R reac-
cionaría con el ácido nítrico.

Desde el punto de vista de su solubilidad, aunque en sentido general todos los aminoácidos
son solubles en agua debido a la presencia de su estructura invariante, su solubilidad variará
de acuerdo con la polaridad que presente su cadena lateral de manera que los aminoácidos
clasificados como polares iónicos serán mucho más solubles en agua que aquellos que po-
sean grupos hidrofóbicos en su cadena R. Esta propiedad permitió aplicarle a los aminoácidos
una técnica de separación basada en la diferente solubilidad que presentan las sustancias ante
una mezcla de solventes de diferente polaridad. A este método analítico se le denominó
CROMATOGRAFÍA, por haber sido descrito por primera vez al separar colorantes vegeta-
les.

CROMATOGRAFÍA

En 1906 el botánico ruso Tswett hizo un descubrimiento que en su momento resultó

intranscendente; pero que con el decursar de los años dio origen a uno de los métodos más
utilizados y eficientes de la química analítica actual. Tswett empleando una bureta llena de
carbonato de calcio logró la separación de la clorofila y la xantofila aplicando una solución
de las mismas en el extremo superior de la bureta y dejando fluir continuamente un solvente
apropiado. Para su gran regocijo, comenzaron a aparecer en la columna de carbonato de
calcio una serie de bandas verdes, azules y amarillas que correspondían a los distintos
pigmentos de la mezcla, con lo cual comprendió que había logrado separarlos entre sí. Tswett
publicó su hallazgo en una revista científica; pero su descubrimiento pasó prácticamente
inadvertido y se le consideró como una curiosidad de laboratorio.

Varios años después comenzó a surgir la idea de que el cromatograma de Tswett podía utili-
zarse, haciéndole las adaptaciones y modificaciones oportunas, como un procedimiento sen-
cillo y rápido para la separación de sustancias complejas, cosa que por métodos químicos
resultaba muy lento y engorroso. Con el trabajo de numerosos investigadores, el procedi-
miento cromatográfico se ha desarrollado enormemente y hoy día es uno de los métodos
analíticos más empleados.

En los años de trabajo y de desarrollo de esta técnica, la misma se ha ido modificando y

ganando en complejidad; pero al mismo tiempo en exactitud y precisión, por lo que ya es
posible su utilización con fines cuantitativos. Sin embargo para nuestros efectos prácticos de
formación del instrumentador quirúrgico no consideramos oportuno pasar a describir las
múltiples variantes que han surgido a partir de la idea original y nos limitaremos solamente a
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describir una de ellas, la cromatografía de partición en soporte de papel.

CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN EN SOPORTE DE PAPEL

Este método se basa en la propiedad que tienen ciertos compuestos de ser solubles, aunque
en magnitud diferente, en dos o más solventes que son inmiscibles entre sí y que se hallan en
contacto. Cuando se permite que pase un tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio, el
compuesto se encuentra distribuido entre las dos fases líquidas de un modo característico. La
expresión numérica de esta propiedad es el llamado «coeficiente de partición» (o de «distri-
bución») K, que se define como la relación que existe entre la concentración [A] del com-
puesto en el solvente A y su concentración [B] en el solvente B, lo cual se expresaría de la
siguiente forma:
[A]
K=
[B]

Como puede deducirse , K resulta característica para un determinado compuesto químico, un

sistema de solvente y todo otro conjunto de condiciones, dentro de las cuales se incluyen las
ambientales, ya que su valor quedará influenciado por cualquier factor que afecte la solubilidad
en cada uno de los solventes utilizados. Algunos de los factores más importantes serían: la
temperatura, la presión atmosférica y la presencia de otros solutos; podríamos seguir enun-
ciando otros factores, pero entonces la lista se haría muy extensa y se excederían los objeti-
vos trazados.

En este método uno de los dos solventes permanece estacionario y se le denomina fase fija,
en tanto que el otro se desplaza continuamente, por lo que se le denomina la fase móvil. Uno
de los sistemas de solventes más sencillos que puede aplicarse es el de fenol saturado en
agua. En este caso concreto se utilizaría un soporte de papel de filtro donde se aplicaría la
mezcla de sustancias a separar y comoquiera que el papel tiene una película invisible de agua
que lo recubre en toda su superficie, esta agua estaría constituyendo la fase estacionaria, en
tanto que el fenol aplicado a uno de los extremos del papel comenzaría a desplazarse, por
capilaridad, a lo largo del mismo y se constituye así en una fase móvil. Por supuesto que las
sustancias más solubles en agua se irán quedando más cerca del punto de aplicación, en tanto
que las que sean más solubles en el fenol, que es un compuesto relativamente apolar, irán
avanzando junto con este solvente y por lo tanto se irán separando.

Comoquiera que el tiempo que transcurre para la realización de este tipo de cromatografía en
la que la fase móvil se desplaza en contra de la fuerza de gravedad, demora mucho tiempo, en
nuestra práctica preferimos hacer la llamada cromatografía circular, en la que un papel de
filtro se coloca horizontalmente y así se evita el efecto anteriormente mencionado. Luego se
coloca el papel de filtro sobre una placa de Petri que contenga el solvente, se le adiciona un
sistema capilar que posibilite que el solvente alcance el papel de filtro, se tapa y se deja que
la fase móvil alcance el borde del papel.

Este procedimiento tiene la ventaja de ser muy simple (no necesita de equipos especiales) y
rápido, por lo que resulta ideal para que el personal inexperto obtenga resultados que sean
demostrativos.
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Otra de las ventajas de la cromatografía en papel es que si se mantienen la condiciones

estables, es decir que se emplee el mismo
tipo de papel, los mismos solventes y las
mismas condiciones ambientales, la movi-
lidad de una mancha correspondiente a una
sustancia pura es constante y por lo tanto es
posible identificar esa mancha por compa-
ración directa con una mancha patrón. Es
más, aún en ausencia de patrones es posi-
ble la identificación a partir de los llamados
valores Rf, que es la relación que existe entre
la distancia recorrida por la mancha y la re-
corrida por el solvente.

Distancia de la mancha
Rf =
Distancia del solvente

En el esquema mostrado anteriormente se ha representado un cromatograma donde se mues-

tra en tres de sus cuadrantes la corrida de una aminoácido puro y en el otro cuadrante se
aprecia la separación obtenida al aplicar una mezcla de los aminoácidos anteriores.

REACCIONES QUÍMICAS DE LOS AMINOÁCIDOS

Entre las múltiples reacciones químicas que pueden experimentar los aminoácidos hemos
escogido tres representativas, que permiten efectuar la diferenciación y/o identificación de
algunos de ellos.

REACCIÓN DE ADAMKIEWICS.
La reacción de Adamkiewics es específica para los grupos indoles.

Se basa en la propiedad que tiene este grupo químico de reaccionar con

gran número de aldehídos, entre ellos el formaldehído, a través de una
reacción de condensación mediada por la presencia de un agente deshidratante como el ácido
sulfúrico y generando así un derivado coloreado característico. Esta reacción es propia del
triptófano.
Insertar Adam

Debe señalarse que las proteínas que contengan a este aminoácido también darían positiva la
reacción, pues el ácido sulfúrico presente provocaría la desnaturalización de la proteína con
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la subsiguiente exposición al medio de los grupos indólicos existentes en las cadenas latera-
les de los aminoácidos, entre ellos las del triptófano.
Además la acción del sulfúrico es tan enérgica que provocaría la hidrólisis proteica y la
liberación del susodicho aminoácido

REACCIÓN XANTOPROTEICA:

La reacción xantoproteica es específica para los grupos fenilos sustituidos.

Insertar fenilo
En ella ocurrirá la nitración del grupo fenilo que posea una molécula orientadora
para posiciones orto del anillo cuando se ponga en contacto con el ácido nítri-
co. La nitración de este anillo determinará que el compuesto resultante tenga
un color amarillo; si en este estado se procede a modificar el pH del medio
tornándolo básico mediante la adición de un hidróxido de alguno de los meta-
les alcalinos se obtendría la sal correspondiente que tomaría color naranja.
Insertar Xanto

De acuerdo con lo postulado anteriormente todos los aminoácidos que presenten en su es-
tructura grupos fenilo sustituídos, como la tirosina y el triptófano darían positivo con la
reacción xantoproteica.

En esta reacción el ácido nítrico producirá la desnaturalización e hidrólisis parcial de las

proteínas y por lo tanto las proteínas que contengan a los aminoácidos mencionados anterior-
mente también darían positivo con esta reacción.

REACCIÓN DE LOS TIOGRUPOS:

La presencia de grupos -SH (sulfihidrilo o tiol) en un compuesto orgánico permite que

transcurra una reacción en presencia del acetato de plomo en medio alcalino en la cual se
obtendrá un precipitado negro de sulfuro de plomo de acuerdo con la siguiente secuencia
Insertar tio

Entre los tres aminoácidos azufrados que existen: cisteína, cistina y metionina, sólo los dos
primeros darán positiva la reacción de los tiogrupos, mientras que la metionina daría nega-
tivo al tener bloqueado su grupo tiol por la presencia del metilo.

OBJETIVOS

En la presente práctica nos proponemos los siguientes objetivos:

1.- Demostrar la utilidad de la reacción de la ninhidrina para la identificación de los

aminoácidos.
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2.- Realizar la separación de los aminoácidos contenidos en una mezcla por medio de la
cromatografía circular en papel.
3.- Comprobar la efectividad de la reacción de Adamkiewics para la identificación de los
grupos indoles e identificar el aminoácido que contiene este grupo funcional.

4.- Ratificar la utilidad de la reacción xantoproteica en la detección de grupos fenoles

sustituidos e identificar los aminoácidos que contienen este grupo funcional.

5.- Demostrar que la reacción de los tiogrupos identifica a los grupos sulfihidrilos y com-
probar su utilidad en la detección de aminoácidos que posean este grupo funcional.

DESARROLLO

EXPERIMENTO # 1. REACCIÓN DE LA NINHIDRINA:

Prepare 4 tubos de ensayo según Tubo

se muestra
# en el cuadro siguiente:
Reactivo 1 2 3 4
Albúmina de huevo 0,5 ml - - -

Solución de aminoácidos - 0,5 ml - -

Sacarosa - - 0,5 ml -

Agua destilada - - - 0,5 ml

Ninhidrina 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

Agite todos los tubos de ensayo y colóquelos en un baño de agua en ebullición durante 5
minutos.

Dibuje en el espacio siguiente los resultados obtenidos:

Insertar tubos4

¿Qué conclusiones puede Ud. sacar de estos resultados?

 20

EXPERIMENTO # 2. CROMATOGRAFÍA CIRCULAR EN PAPEL.

Para la realización de esta experiencia Ud. debe utilizar guantes quirúrgicos o de labo-
ratorio de látex, ya que en sus manos se encuentran presentes diversos aminoácidos
que contaminarían todo el material; además el sistema de solventes utilizado contiene
una elevada concentración de fenol que es altamente cáustico.

Después de colocados los guantes y utilizando un lá-

piz y regla, divida el papel de filtro que tiene en su
puesto de trabajo en 4 cuadrantes simétricos, tal como
se le muestra en la figura siguiente y proceda a apli-
car lo más próximo al orificio central y en forma de
bandas finas las soluciones de aminoácidos de acuer-
do a la distribución que se le orienta en la propia figu-
ra.

Cuando termine de realizar la aplicación proceda a

colocar el capilar que se encuentra en su puesto de
trabajo en contacto con el centro del papel de filtro y
ubique dicho papel sobre la placa de Petri que contie-
ne el sistema de solventes. Inmediatamente tape la placa de Petri y deje correr el solvente
hasta alcanzar el borde del papel.

Al terminar la corrida cromatográfica extraiga el papel de filtro de la placa de Petri y déjelo

secar mediante su exposición al calor en contacto directo con una resistencia eléctrica. Debe
tener cuidado de no quemar el papel de filtro. Finalizado este procedimiento de secado, dele
a su profesor el papel de filtro para que éste proceda a sumergirlo en un vidrio reloj en el que
previamente se coloca suficiente cantidad del reactivo de la ninhidrina. Se saca de inmediato
el papel de filtro del vidrio reloj y se coloca en el horno a 120°C durante 5 minutos o hasta
que aparezcan en el mismo las manchas azul-violáceas características de los aminoácidos
´ con la reacción de la ninhidrina.

Represente en el dibujo siguiente el resultado obte-

nido y calcule el valor de Rf de cada uno de los
aminoácidos conocidos así como el de o los que se
encuentran en la mezcla de aminoácidos.
Insertar cromato2

Una vez calculados estos valores de Rf, proceda a

identificar las diferentes manchas que se obtuvieron
de la corrida cromatográfica de la mezcla de
aminoácidos, considerando como # 1 la que se en-
cuentra más cerca del orificio central del papel:

1.-

2.-

3.-
 21

Explique la razón por la cual se produce esta separación de los aminoácidos:

Tubo #
EXPERIMENTO # 3. REACCIÓN1DE ADAMKIEWICS.
Reactivo 2 3 4

Gelatina 0,5 ml - - -
Prepare 4 tubos de ensayo según se muestra en el cuadro siguiente:
Albúmina de huevo - 0,5 ml - -
Triptófano - - 0,5 ml -
Agua destilada - - - 0,5 ml
Formaldehído 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotas
Ácido sulfúrico 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Debe tomar en cuenta dos medidas imprescindibles para que la técnica funcione correcta-
mente:

1.- Después de añadir el formaldehído Ud. debe agitar los tubos de ensayo.

2.- Añadir el ácido sulfúrico muy lentamente y por las paredes del recipiente y no agitar el
tubo de ensayo.

Recuerde que la reacción de deshidratación mediada por el ácido sulfúrico es altamen-

te exotérmica y si lo adiciona muy rápido la solución puede ebullir e incluso saltar y
producirle quemaduras.

La positividad se expresará mediante la formación de un anillo de color violeta que se apre-

ciará en la interfase del sulfúrico y el resto de la solución.

A continuación dibuje en el espacio siguiente los resultados obtenidos:

Insertar tubos4

Explique brevemente estos resultados:

 22

Precise por qué existen diferencias entre el resultado obtenido con la albúmina de huevo y
con la gelatina.

Tubo # 1 2 3 4 5
Reactivo
EXPERIMENTO # 4.
Albúmina de REACCIÓN
huevo 2 ml XANTOPROTEICA.
- - - -
Fenol - 2 ml - - -
Prepare 5 tubos de ensayo
Triptófano según se muestra
- en el
- cuadro siguiente:
2 ml - -
Fenilalanina - - - 2 ml -
Agua destilada - - - - 2 ml
Ácido nítrico. 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Llevar los tubos al baño de agua hirviente y mantenerlos ahí durante un minuto, ¿Qué obser-
va?

Enfríe los tubos de ensayo y añádale a todos ellos 5 ml de solución de hidróxido de sodio al
20 %. ¿Qué observa?

Dibuje en el espacio siguiente los resultados obtenidos:

Insertar tubos5
 23

Explique brevemente los resultados obtenidos y diga a qué conclusión se puede llegar.

Compare los resultados obtenidos con el triptófano y la fenilalanina. Explique la diferencia

observada.

Tubo # 1 2 3
Reactivo
Albúmina de huevo 1 ml - -
EXPERIMENTO # 5. REACCIÓN DE
Cisteína - LOS 1TIOGRUPOS.
ml -
Agua destilada - - 1 ml
Prepare tres tubos de ensayo de la forma siguiente:
Hidróxido de potasio al 40 % 1 ml 1 ml 1 ml
Acetato de plomo al 10 % 3 gotas 3 gotas 3 gotas

Llevar al baño de agua hirviente y mantenerlo ahí por espacio de 10 minutos. Transcurrido
este tiempo proceda a comparar el resultado del experimento.

Dibuje los resultados obtenidos:

Insertar tubos3

Explique por qué la albúmina manifiesta este resultado.

24
 25

INFORME DE LA PRÁCTICA

PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LOS

AMINOÁCIDOS
EQUIPO #____________DÍA_________________HORA_____________.

INTEGRANTES:
1.-___________________________________________________________________
2.-___________________________________________________________________
3.-___________________________________________________________________
4.-___________________________________________________________________
5.-___________________________________________________________________

1.- ¿Por qué se utiliza agua destilada en todos los experimentos químicos de esta práctica?

2.- ¿Por qué la albúmina de huevo tiene diferente resultado cuando se realiza la reacción de
la ninhidrina con relación al resto de los resultados?

3.- De acuerdo con sus resultados diga qué aminoácidos se encuentran formando parte de la
albúmina de huevo.

4.- Sobre la base de la estructura química de los aminoácidos utilizados, explique por qué se
produce diferente migración en la cromatografía
26
 27

PRÁCTICA # 3
PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LAS PROTEÍ-
NAS

INTRODUCCIÓN

Las proteínas son macromoléculas compuestas por unidades de L-α-aminoácidos que se

unen entre sí mediante enlaces peptídico y que alcanzan un peso molecular igual o superior
a 5 000 D.

El enlace peptídico, característico de estos compuestos, resulta de la reacción del grupo

carboxilo de un aminoácido con el grupo amino de otro aminoácido, lo cual da lugar a un
enlace covalente de tipo carbamida y que tiene algunas características peculiares como son:

1.- El enlace C-N tiene cierto carácter de doble enlace, por lo cual le confiere rigidez a la
molécula

2.- El oxígeno y el nitrógeno quedan en posición trans.

3.- Todos los elementos que componen el enlace se encuentran ubicados en el mismo plano.

4.- La rotación de la molécula formada queda restringida a los carbonos α.

El gran número de aminoácidos que componen a la molécula proteica determina que su

estructura sea extraordinariamente compleja, y que para poder estudiarla nos veamos preci-
sados a dividirla artificialmente en los llamados «niveles de organización de la estructura
proteica», de los cuales se describen habitualmente 4, aunque algunos autores llegan a des-
cribir 5 y más.

Por supuesto que toda organización estructural que implique determinado orden requiere de
la presencia de una fuerza estabilizadora, que en el caso de las proteínas estaría constituida
por diferentes tipos de enlaces o interacciones físicas y químicas que se enuncian en el cua-
dro siguiente:

Nivel de organización Enlaces que lo mantienen.

Primario Enlace peptídico
Secundario Puentes de hidrógeno entre los elementos del enlace peptídico
Puentes de hidrógeno entre las cadenas laterales de los
Terciario aminoácidos, interacción hidrofóbica, interacción electrostática,
puente disulfuro, enlace éster.
Cuaternario Los mismos que para el nivel terciario más las fuerzas de Van der Walls
 28

La complejidad estructural de las proteínas se manifiesta desde el punto de vista funcional en

una gran diversidad de funciones biológicas. A pesar de ello y llevado hasta las últimas
instancias, las funciones biológicas de estas macromoléculas pueden comprenderse basadas
en una sola propiedad inherente a estos compuestos, la de poseer características
informacionales.

En las macromoléculas informacionales la estructura del compuesto lleva implícita la pre-

sencia de una codificación con sentido biológico. Esta información contenida en la estructu-
ra puede ser de dos grandes tipos: la información secuencial y la conformacional.

La información secuencial depende exclusivamente del modo en que se organizan las dife-
rentes unidades monoméricas que componen a la macromolécula; en otras palabras, depende
del orden en que se ubican los aminoácidos dentro de la cadena proteica. En tanto que la
información conformacional residirá en la estructura tridimensional de la molécula. Lógica-
mente la información conformacional dependerá de la secuencial y el cambio de tan sólo un
aminoácido por otro en la estructura de las proteínas puede implicar por tanto una modifica-
ción de su estructura tridimensional y por ende una alteración de la información conformacional

Como resultado de la existencia de la información conformacional, en las proteínas aparece

una característica fundamental para su funcionamiento que es el reconocimiento molecular.
El reconocimiento molecular es la propiedad que tienen las proteínas de poder unirse
selectivamente con otras moléculas gracias a la existencia de una complementaridad eléctri-
ca y estérica que le permiten interactuar con dichas moléculas. Esta propiedad citada, por
consiguiente, depende fundamentalmente de las cadenas laterales de los aminoácidos que
como ya ha sido mencionado representan la parte variable de la estructura de los aminoácidos,
y de ahí el hecho de la gran variabilidad de funciones de las proteínas y su posibilidad real de
reconocer un número prácticamente infinito de compuestos.

Por supuesto que para que se produzca el reconocimiento molecular la estructura tridimensional
de la proteína tiene que estar intacta y deben existir en el medio circundante condiciones de
pH que le confieran a esta macromolécula un estado iónico compatible con la molécula a
reconocer.

De lo anteriormente expuesto se deduce que el estado iónico de la proteína experimentará

modificaciones en dependencia del pH del medio. Esto se debe a la presencia de los grupos alfa
aminos, alfa carboxilos y a la existencia en la cadena lateral de los aminoácidos de diferentes
grupos ionizables, cuya forma iónica variará de acuerdo a las condiciones del medio.

Como podrá apreciar existe una forma en cada uno de los aminoácidos que al sumar el
número total de cargas positivas y negativas el resultado será igual a 0, y por consiguiente si
se colocara bajo la influencia de un campo eléctrico no migraría hacia ninguno de los polos.
A este valor del pH en el que un aminoácido en solución colocado bajo la influencia de un
campo eléctrico no migra ni hacia el ánodo ni hacia el cátodo porque sus cargas eléctricas
están compensadas se le denomina PUNTO ISOELÉCTRICO (pI). Cuando el aminoácido
 29

se encuentra en un pH por debajo de su punto isoeléctrico su carga será positiva, en tanto que
si el valor del pH del medio es superior al punto isoeléctrico su carga neta será negativa y
migrará hacia el ánodo.

En las proteínas también se reconoce la existencia del pI el cual se define como el valor del
pH en el cual una proteína en solución colocada bajo la influencia de un campo eléctrico no
migra ni hacia el ánodo ni hacia el cátodo porque sus cargas eléctricas están compensadas.

Para el caso de las proteínas los grupos α amino y α carboxilo de los aminoácidos consti-
tuyentes no tienen prácticamente ninguna influencia en la determinación del pI puesto que
los mismos se encuentran comprometidos en el establecimiento de los enlaces peptídicos.

Lo determinante en la aparición del estado iónico de las proteínas serán, por tanto, funda-
mentalmente las cadenas laterales de los aminoácidos ionizables constituyentes y de ahí que
se haya mencionado con anterioridad que la función de reconocimiento molecular de las
proteínas dependiera de ellos en gran medida, puesto que serían los que estarían establecien-
do la compatibilidad o incompatibilidad eléctrica con la sustancia a reconocer.

El otro aspecto a considerar en relación con el reconocimiento molecular, como ya se men-

cionó, es la complementaridad estérica que dependerá de la integridad de la estructura
tridimensional de las proteínas. Si se produjera la desnaturalización de las mismas, por con-
siguiente se estaría no sólo cambiando las propiedades físicas y químicas de las proteínas,
sino que también se perdería su función biológica.

Se entiende por desnaturalización el cambio de la conformación proteica como resultado de

la acción de agentes físicos o químicos y trae como consecuencia la modificación de las
propiedades físicas, químicas y biológicas de las proteínas.

En la presente práctica nos proponemos estudiar un método de reconocimiento o identifica-

ción de las proteínas, así como determinar el pI de una proteína y verificar que la
desnaturalización modifica las propiedades físico-químicas de las mismas.

Para dar cumplimiento al primer propósito utilizaremos la reacción del biuret; mientras que
para los otros dos emplearemos las características de solubilidad de las proteínas.

REACCIÓN DEL BIURET.

El biuret es un compuesto químico resultante del calentamiento de la urea, según se muestra

en la reacción siguiente.
Insertar biuret1
FORMACIÓN DEL BIURET A PARTIR DE UREA
La reacción del biuret también dará positiva con todos aquellos compuestos que como los
 30

que se muestran a continuación posean grupos carbamidas (-CONH2) consecutivos o separa-

dos por un átomo de nitrógeno o de carbono.

COMPUESTOS SIMILARES AL BIURET

Insertar biuret1b

Las proteínas, al tener los enlaces peptídicos separados por el carbono α tienen una estructu-
ra similar a la de la malonamida y por tanto darán positivo con este reactivo. Cabe destacar
que en el reactivo del biuret no se encuentra presente la sustancia que le da el nombre a la
reacción, sino que este nombre deriva del hecho de haber sido esta sustancia la que se descu-
brió históricamente como la primera que desarrolló color al ponerla en contacto con los iones
cúpricos. Posteriormente se comprobó que otros compuestos, como la malonamida y la
examida, de estructura química similar también daban positiva la reacción.

El reactivo del biuret consiste, en esencia, en una solución de sulfato cúprico a la que se le
adicionan otros compuestos que evitan que los iones cúpricos puedan reducirse, ya que se
fundamenta en la formación de un complejo órgano metálico con el ion cúprico, que en
medio alcalino toma una coloración violeta. Este complejo se muestra en el dibujo siguiente,
donde se ve como el ion cúprico forma un complejo de coordinación con el agua y con los
nitrógenos de enlaces peptídicos consecutivos.

COMPLEJO DE COORDINACIÓN ORGANO-METÁLICO RESUL-

TANTE DE LA REACCIÓN DEL BIURET.
Insertar biuret2

La reacción del biuret tiene también importancia cuantitativa, pues el color resultante de la
formación del complejo de coordinación sigue las leyes de Lambert y Beer y por lo tanto
resulta de utilidad práctica para conocer el contenido de proteínas en una solución, siempre y
cuando la concentración de la misma sea relativamente elevada, pues la sensibilidad del
método no permite discriminar pequeñas variaciones del contenido proteico. Esta técnica es
muy empleada en la práctica médica para la cuantificación de proteínas en diferentes líqui-
dos biológicos como son la sangre y el líquido cefalorraquídeo.
SOLUBILIDAD DE LAS PROTEÍNAS.
 31

En términos generales las proteínas son solubles en agua y en soluciones diluidas de ácidos,
bases y sales; sin embargo esto es muy variable pues dependerá de la composición
aminoacídica de la misma. Mientras mayor sea el número de aminoácidos polares más solu-
ble será la proteína en soluciones acuosas; pero a medida que se incremente el contenido de
aminoácidos apolares esta solubilidad irá disminuyendo y se irán haciendo cada vez más
solubles en solventes orgánicos.

La solubilidad en agua de las proteínas depende en primera instancia de la interacción que

ejercen los grupos polares de las cadenas laterales de los aminoácidos constituyentes con el
agua, de manera que mientras más polar es la proteína mayor será su interacción con el agua
del medio y logrará crearse una capa de moléculas de agua que recubren a la macromolécula,
a la que se denomina agua de solvatación; por consiguiente cualquier efecto o agente que
excluya el agua de solvatación provocará la precipitación de las proteínas.

De esta manera si se modifica el pH del medio hasta alcanzar el valor del pI de la proteína,
aunque no se eliminan las cargas de la proteína, ésta sí estará en un estado eléctricamente
neutro y la interacción agua-proteína será más débil y por lo tanto las mismas precipitarán. A
este procedimiento se le denomina precipitación isoeléctrica de las proteínas y además de per-
mitir estimar el pI de una proteína, con él también se podrá efectuar la purificación parcial de
las mismas. Está metodología será utilizada en esta práctica con el fin de determinar el pI de la
caseína.

La adición de sales neutras a una solución de proteínas tendrá un efecto diferente de acuerdo
con la concentración en que se adicione la sal. Si la concentración de la sal es baja, la misma
constituirá un puente entre la proteína y el agua de solvatación que permitirá que la solubilidad
de la macromolécula se incremente; sin embargo si se añade sal en exceso la misma provoca-
rá la sustracción del agua de solvatación de la proteína y estas últimas precipitarán. A este
procedimiento de disminuir la solubilidad en agua de las proteínas se le denomina «salting
out» o precipitación salina.

La desnaturalización de las proteínas también traerán como consecuencia la disminución de

la solubilidad de las mismas, siempre que esta desnaturalización se haga irreversible gracias
a la acción de un agente desnaturalizante muy enérgico como serían las altas temperaturas o
los ácidos y las bases fuertes. Este efecto será el resultado de la liberación de los grupos
apolares de las proteínas que normalmente se encuentran localizados en el interior de las
proteínas globulares; pero que al distorsionarse su estructura tridimensional quedarían ex-
puestos al medio, además, en estas condiciones las proteínas se encuentran con más grupos
reactivos disponibles, e interactuarán unos con otros provocando la formación de agregados
proteínicos (coágulos) que no podrán mantenerse en solución.

Combinando la acción de la desnaturalización proteica y la precipitación salina, en esta prác-

tica demostraremos la posibilidad de extraer todas las proteínas de una solución, conservan-
do los otros componentes. Este proceder es extraordinariamente importante en la práctica
médica en la determinación de compuestos diferentes a las proteínas en los líquidos biológi-
cos, ya que las proteínas en muchas ocasiones interfieren con el desarrollo de la técnica que
se debe emplear y por lo tanto deben ser eliminadas. También se emplea cotidianamente en la
esterilización del instrumental quirúrgico y es la base de algunas maniobras de asepsia y
antisepsia del área quirúrgica y de las manos del personal que participa en la cirugía.
OBJETIVOS
 32

En la presente práctica nos hemos propuesto los objetivos siguientes:

1.- Demostrar la utilidad de la reacción del biuret en la detección cualitativa de las proteínas.

2.- Determinar el pI de la caseína mediante el estudio de su solubilidad a diferentes valores

de pH.

3.- Realizar un filtrado libre de proteínas utilizando el método de Nelson.

4.- Demostrar que al realizar el filtrado libre de proteínas no se pierden las otras sustancias
presentes en la solución.

DESARROLLO.

EXPERIMENTO # 1. REACCIÓN DEL BIURET.

Prepare 3 tubos de ensayo según se muestra en el cuadro siguiente:

Tubo # 1 2 3
Reactivo
Caseína 1 ml - -
Aminoácidos - 1 ml -
Caseína+aminoácidos - - 1 ml
Reactivo del Biuret 4 ml 4 ml 4 ml
Espere 10 minutos y observe los resultados. Dibuje en el espacio siguiente los resultados
obtenidos:
Insertar tubos3

¿Cuáles fueron las soluciones que dieron positivo con la reacción?

Considera Ud. que los aminoácidos interfirieron con el desarrollo del color de la reacción.

EXPERIMENTO # 2. OBTENCIÓN DE UN FILTRADO LIBRE DE PROTEÍNAS.

 33

Prepare tres tubos de ensayo siguiendo las orientaciones del cuadro siguiente:

Tubo # 1 2 3
Reactivo
Caseína 1 ml - -
Aminoácidos - 1 ml -
Caseína + aminoácidos - - 1 ml
Hidróxido de Bario 4,5 % 4,5 ml 4,5 ml 4,5 ml
Sulfato de Zinc 5 % 4,5 ml 4,5 ml 4,5 ml
Para que los resultados sean confiables, Ud. debe agitar cada uno de los tubos de ensayo
vigorosamente después de añadir cada uno de los reactivos.

Describa qué ha sucedido en cada uno de los tubos de ensayo.

Proceda ahora a filtrar cada uno de los tubos de ensayo anteriores y describa en el siguiente
espacio cómo es el aspecto de cada uno de estos tubos. Guarde los filtrados libres de proteí-
nas (FLP) para utilizarlos en el próximo experimento.

EXPERIMENTO # 3. CARACTERIZACIÓN DE LOS FILTRADOS LIBRES DE PRO-

TEÍNAS.

Prepare 6 tubos de ensayo según se describe en el siguiente cuadro:

Lleve los tubos del 4 al 6 al baño de agua en ebullición y manténgalos ahí durante 5 minutos
Tubo # 1 2 3 4 5 6
Reactivo
FLP caseína - - 1 ml 1 ml - -
FLP aminoácidos. - 1 ml - - 1 ml -
FLP caseína+aminoácidos 1 ml - - - - 1 ml
Reactivo de Biuret 4 ml 4 ml 4 ml - - -
Ninhidrina - - - 1 ml 1 ml 1 ml
 34

Observe los resultados obtenidos y dibújelos en el espacio siguiente.

Insertar tubos6

¿Qué ha sucedido con la reacción del biuret?

¿Qué ha sucedido con la reacción de la ninhidrina?

¿Interfirió la obtención del FLP con la detección de los aminoácidos? ¿Por qué?

EXPERIMENTO # 4. DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LA

CASEÍNA

En el cuadro que se le muestra a continuación se describe la forma en que Ud. debe preparar
los 9 tubos de ensayo necesarios para este experimento.

Debe tener cuidado de agitar cada uno de los tubos de ensayo cada vez que añade un reactivo.
Tubo # 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Reactivo
Agua 8,4 ml 7,7 ml 8,8 ml 8,5 ml 8,0 ml 7,0 ml 5,0 ml 1,0 ml 7,4 ml
Ac. acético 0,01 N 0,6 ml 1,3 ml - - - - - - -
Ac. acético 0,1 N - - 0,2 ml 0,5 ml 1.0 ml 2,0 ml 4,0 ml 8,0 ml -
Ac. acético 1,0 N - - - - - - - - 1,6 ml
Caseína 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml
pH resultante 5,9 5,6 5,3 5,0 4,7 4,4 4,1 3,8 3,5
 35

La aparición de turbidez estará manifestando la insolubilidad de las proteínas, luego donde

mayor turbidez exista menor solubilidad tendrá la proteína.

Describa los resultados de la experiencia anterior inmediatamente después de terminada.

Espere 5 minutos y vuelva a describir los resultados observados.

Escriba el valor del punto isoeléctrico de la caseína y explique por qué llegó a esa conclu-
sión.
36
 37

INFORME DE LA PRÁCTICA

PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LAS PROTEÍ-

NAS
EQUIPO #_____________DÍA_______________HORA_____________.

INTEGRANTES:
1.- _____________________________________________________________________
2.- _____________________________________________________________________
3.- _____________________________________________________________________
4.- _____________________________________________________________________
5.- _____________________________________________________________________

1.- ¿Cuáles de las soluciones ensayadas dio positiva con la reacción del biuret? ¿Por qué?

2.- ¿Por qué cambia el aspecto de las soluciones que tienen proteínas cuando se adiciona el
reactivo de Nelson?

3.-¿Por qué cambia nuevamente su aspecto después que se filtran?.

4.- Describa el procedimiento que se usó para determinar el pI de la caseína. Explique por qué
38
 39

PRÁCTICA # 4
CINÉTICA ENZIMÁTICA

INTRODUCCIÓN

Las enzimas son catalizadores biológicos de naturaleza proteica, gran eficiencia catalítica,
elevada especificidad y susceptibles de ser regulados en su acción.

Como proteínas que son, su funcionamiento transcurre mediante el reconocimiento molecular.

De esta manera, las enzimas poseen un lugar de la proteína enzimática que se une íntima-
mente con el sustrato y al que se le denomina SITIO ACTIVO o CENTRO ACTIVO. Todas
las propiedades de la enzima dependerán entonces de la estructura del sitio activo.

Para el estudio de la estructura del sitio activo, éste se ha dividido artificialmente en diferen-
tes componentes:

1.- El esqueleto covalente.

2.- Los grupos de fijación del sustrato.

3.- Los grupos catalíticos

4.- Los grupos ambientadores.

El esqueleto covalente del sitio activo estará formado por aquellos sectores de la cadena
peptídica, no necesariamente consecutivos, que le dan forma y que frecuentemente se en-
cuentran formando un dominio de la molécula proteica. Por supuesto que de la conformación
del sitio activo dependerá en gran parte el reconocimiento molecular pues es el que estará
determinando la posibilidad de la complementaridad estérica entre la enzima y el sustrato.

Los grupos de fijación del sustrato son los otros elementos que participan en el reconoci-
miento molecular, ya que son cadenas laterales de aminoácidos presentes en el centro activo
y que se interrrelacionarán con el sustrato por medio de atracciones electrostáticas, puentes
de hidrógeno u otras interacciones, incluso enlaces covalentes, que garanticen la más íntima
unión con el sustrato y que éste quede colocado con la orientación óptima para el funciona-
miento de los grupos catalíticos. En lo anteriormente expuesto queda implícito que del esta-
do de ionización de las cadenas laterales de estos aminoácidos que constituyen los grupos de
fijación del sustrato dependerá la complementaridad eléctrica entre la enzima y el sustrato.
Por supuesto que los grupos catalíticos también serán cadenas laterales de los aminoácidos
ubicados en el centro activo y a ellos corresponde la actividad catalítica de la enzima.

Los grupos ambientadores del sitio activo son por regla general cadenas laterales de
aminoácidos hidrofóbicos que están garantizando la exclusión del agua del espacio interno
del sitio activo de manera que ésta no interfiera con la reacción y que sólo pueda entrar a este
espacio cuando se necesite como sustrato y por lo tanto exista algún grupo fijador para ella.
 40

De las características del centro activo dependerán todas las funciones de la proteína
enzimática, en otras palabras: su acción, su eficiencia y su especificidad.

Entre las propiedades más importantes de las enzimas encontramos a la especificidad, enten-
diéndose como tal a la característica que tienen estos compuestos de actuar sobre un sustrato
o sobre un grupo estructuralmente parecido de sustratos, catalizando una y sólo una de las
posibles transformaciones que pueda experimentar dicho sustrato.

CINÉTICA ENZIMÁTICA.

La cinética química es la rama de la química que se ocupa de estudiar la velocidad y los

mecanismos de las reacciones. Al aplicar esta rama general a la acción de las enzimas se
habla entonces de la cinética enzimática.

Se considera a la velocidad de la reacción como una expresión de la rapidez conque transcu-

rre la misma y se puede calcular, bien como la cantidad de sustancias reaccionantes que
desaparecen en la unidad de tiempo o como la cantidad de productos que se forman en la
unidad de tiempo. Para los efectos de la presente práctica se va a utilizar para expresarla la
desaparición del producto.

Entre los diferentes factores que modifican la velocidad de la reacción enzimática tenemos:

1.- Concentración de la enzima.

2.- Concentración del sustrato.

3.- Concentración de coenzimas.

4.- pH

5.- Temperatura.

6.- Inhibición enzimática.

De todos ellos el 1,2 y 6 tendrán gran repercusión en la regulación del metabolismo celular
en tanto que los otros estarán directamente vinculados con el proceso de salud y enfermedad.

En el momento de estudiar cada uno de estos factores debe tenerse en cuenta un aspecto
importante que es el de mantener constantes todos los otros factores que modifican a la
velocidad de la reacción enzimática, pues de otra forma las variaciones que se encontraran
serían imposibles de explicar. Evidentemente resulta fácil o relativamente fácil controlar
factores como pH y temperatura; sin embargo, el hecho de que la reacción implica necesaria-
mente una modificación permanente de la concentración del sustrato, este último factor re-
sulta imposible de mantener constante y por lo tanto tiene que utilizarse un artificio que
garantice al menos que su variación de concentración pueda considerarse despreciable para
los efectos prácticos. Esto se realiza midiendo la llamada velocidad inicial (V0) que se define
como la velocidad que alcanza la reacción cuando no se ha consumido más del 10 % del
sustrato inicialmente añadido; por supuesto que trabajando con sustrato en exceso, esta va-
riación es despreciable y da margen de tiempo para hacer las mediciones necesarias
 41

Otro aspecto importante para realizar con calidad el trabajo a desarrollar con las enzimas es
el de garantizar su pureza, es decir, que no exista en el medio ninguna otra enzima que
pudiera actuar simultáneamente con la que se desea investigar. Este trabajo de purificación
enzimática constituye, sin lugar a dudas, una de las tareas más difíciles que puede enfrentar
un investigador ya que conlleva diferentes pasos que requieren de mucho cuidado. En primer
lugar se debe seleccionar adecuadamente el organismo y tejido en el que la enzima se en-
cuentre en elevada concentración, posteriormente tiene que producirse la ruptura de la célula
evitando que se pierda, mediante desnaturalización, la actividad de la enzima y una vez
logrado esto comenzar a eliminar por diversos procedimientos el resto de las proteínas exis-
tentes en el material de trabajo. Dentro de los métodos de purificación más utilizados se
encuentran: la precipitación isoeléctrica y salina, la electroforesis, la cromatografía y la
ultracentrifugación preparativa.

Para evitarnos todos estos trabajos en la presente práctica se ha seleccionado a la enzima

α-amilasa salival, antiguamente denominada ptialina, como el objeto de estudio, ya que esta
enzima es de fácil adquisición, pues se encuentra directamente suspendida en una solución
de muy fácil obtención y es prácticamente la única enzima existente en la saliva. Por otra
parte el sustrato natural de esta enzima, el almidón, también se consigue fácilmente y resulta
relativamente económico y muy estable.

Otro de los cuidados que se deben mantener al trabajar la cinética enzimática o al manipular
cualquier muestra de enzimas es el de garantizar que durante todo el tiempo en que se esté
trabajando no se vaya a producir la inactivación de estas proteínas. Existen múltiples facto-
res que pueden inactivar a una enzima mediante su desnaturalización que incluyen desde un
material de laboratorio sucio y por consiguiente contaminado con sustancias que puedan ser
agentes desnaturalizantes o inhibidores de la enzima hasta el poco control de la temperatura
y el pH. Otra gran ventaja en la utilización de la α-amilasa salival es que la misma es relati-
vamente termoestable y no se desnaturaliza sino a temperaturas elevadas.

INHIBICIÓN ENZIMÁTICA

La inhibición enzimática es el mecanismo mediante el cual algunas sustancias químicas de-

nominadas inhibidores producen una supresión de la actividad enzimática o al menos una
disminución de su velocidad de reacción, al afectar la eficiencia catalítica de la enzima, su
afinidad por el sustrato o ambos parámetros cinéticos simultáneamente.

Resulta importante el estudio de la inhibición enzimática porque la de tipo no competitiva es

la responsable de gran parte de las intoxicaciones que sufre el ser humano y la competitiva,
además de poseer el efecto anterior, también constituye un mecanismo importante que parti-
cipa de la regulación metabólica.

FUNDAMENTACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA α-AMILASA

SALIVAL

Como se mencionó anteriormente en esta práctica se utilizará la α-amilasa salival como

enzima demostrativa, por lo tanto a continuación se procederá a explicar someramente el
efecto catalítico de esta enzima.
 42

La α-amilasa salival es una enzima del grupo de las hidrolasas y específicamente de las
endohidrolasas, es decir que va a catalizar la hidrólisis de un enlace que se encuentra situado
interiormente en una macromolécula y no afecta en absoluto a los enlaces que se encuentran
en los extremos del sustrato. Más específicamente esta enzima se cataloga como una
α-endoglicosidasa porque cataliza la hidrólisis de los enlaces glicosídicos.

El sustrato natural de esta enzima lo constituye el almidón, aunque también puede actuar
sobre algunos otros polisacáridos que como en el caso del glucógeno posean los mismos
enlaces y estructura parecida.
Insertar glucosa
El almidón es un polisacárido derivado de la unión de múltiples unidades de α-D-glucosa.

En la figura que se representa a continuación aparece la estructura de la glucosa, así como la

numeración de sus átomos :

En el almidón las unidades de α-D-glucosa que lo componen, se unen entre sí mediante el

establecimiento de enlaces α-1-4-O-glicosídicos y como es un compuesto que presenta ra-
mificaciones, el establecimiento de estas ramificaciones se hace por intermedio de enlaces
α-1-6-O-glicosídicos. La estructura de ambos tipos de enlaces se representa a continuación.
Insertar glicosídico

En el almidón existen dos tipos de cadenas diferentes, una que no se encuentra ramificada
llamada amilosa y otra que se encuentra muy ramificada y que se denomina amilopectina.
 43

IAmbas moléculas se imbrican entre sí para

dar lugar a la aparición del gránulo de al-
midón que constituye la reserva de com-
bustible biológico en los vegetales.

Existen dos elementos que posibilitan la

imbricación del gránulo de almidón: uno
es la propia estructura de la amilopectina,
que como se aprecia a continuación per-
mite que entre sus múltiples ramificacio-
nes se entrelacen las distintas moléculas,
y la otra es la característica que tiene la molécula de amilosa de presentar una conformación
helicoidal con seis unidades de glucosa por cada vuelta de la espira, que le permite interactuar
con otras moléculas de su mismo tipo y con las ramificaciones de la amilopectina.

La glucosa que forma el almidón tiene la propiedad de ser un monosacárido reductor debido
a la presencia en su estructura del denominado carbono anomérico; sin embargo el almidón
pierde esta característica de ser un agente reductor porque en su estructura todos los carbo-
nos anoméricos de sus glucosas constituyentes se encuentran comprometidos en la forma-
ción de los enlaces glicosídicos, excepto unos pocos que forman los escasos extremos
reductores de la molécula; sin embargo la mayor parte de los extremos de esta molécula son
no reductores.

La propia estructura de la amilosa permitió diseñar una reacción para la identificación del
almidón que se puede hacer fácil y rápidamente en el laboratorio mediante la adición de iodo,
el cual formaría con la hélice del polisacárido un complejo de inclusión de color azul, tal
como se muestra en el siguiente esquema:
I n - sertar
Lugol

El proceso de digestión del almidón transcurre mediante reacciones sucesivas de fragmenta-

ción de sus moléculas constituyentes, tal como se muestra en la figura de la página siguiente.

DIGESTIÓN ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN POR LA α-AMILASA

Insertar amilasa 1
Como se aprecia en esa figura, la fragmentación sucesiva del almidón determina que vayan
apareciendo compuestos que presentan diferente coloración con el reactivo de lugol, lo cual
constituye un excelente indicador que permite seguir el curso de la reacción. Cabe destacar
que los productos finales obtenidos en este proceso son los disacáridos maltosa e isomaltosa
y el trisacarido isomaltotriosa, sin que pueda alcanzarse la formación de la glucosa, pues el
enlace glicosídico existente en estos disacáridos es un enlace externo y la enzima no es
específica para él.
 44

OBJETIVOS

Los objetivos de la presente práctica son:

1.- Demostrar que en la saliva existe actividad de la enzima α-amilasa.

2.- Comprobar el efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción.

3.- Determinar el pH óptimo de la enzima α-amilasa salival.

4.- Comprobar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.

5.- Identificar un inhibidor de la enzima α-amilasa salival.

DESARROLLO

RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA DE SALIVA Y PREPARACIÓN DE LA SOLU-

CIÓN DE ENZIMA.

Lo primero que se debe hacer es recolectar la muestra de saliva para obtener una solución de
enzima. Para ello enjuáguese la boca varias veces con agua corriente y proceda a recoger en
un beaker de 50 ml limpio aproximadamente 2 ml de saliva. Adiciónele a la saliva recogida
10 ml de agua destilada y mézclela bien. Filtre esta solución de saliva y rotule a este tubo de
ensayo como solución de enzima.

EXPERIMENTO # 1. DEMOSTRACIÓN DE LA ACTIVIDAD α-AMILÁSICA EN

LA SALIVA.

Prepare 5 tubos de ensayo con 0,5 ml de ácido tricloroacético (TCA) cada uno y rotúlelos del
0 al 4. Prepare además un tubo de ensayo según se muestra en el cuadro siguiente. A este
tubo de ensayo le llamaremos tubo de reacción:
 45

Reactivos Cantidad
Almidón 1,0 ml
Agua destilada 4,9 ml
Cloruro de Potasio 1,0 ml
Buffer fosfato pH 6,9 0,1 ml

Agite bien este tubo de ensayo y proceda a adicionarle 1 ml de solución de enzima e inmedia-
tamente, sin perder tiempo proceda a agitar y a extraer 1 ml de este tubo y adicionarlo
rápidamente al tubo rotulado 0 y al mismo tiempo comience a medir el tiempo. Cada minuto
subsiguiente Ud. debe repetir el paso anterior, es decir extraer una porción alícuota de 1ml
del tubo de reacción e irla adicionando a los tubos que contienen el TCA hasta alcanzar el
tubo marcado 4 minutos. RECUERDE AGITAR EL TUBO DE ENSAYO CADA VEZ
QUE AÑADA LA PORCIÓN ALÍCUOTA.

De inmediato adiciónele a cada uno de los tubos de ensayo 2 gotas del reactivo de lugol.

A continuación dibuje en el espacio correspondiente los resultados obtenidos con cada uno
de los tubos de ensayo después de haber añadido el lugol.
Insertar tubos5

¿Qué función desempeña el TCA?

Explique los resultados obtenidos.

 46

EXPERIMENTO # 2. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA SO-

BRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN

Prepare 4 tubos de ensayo de la forma siguiente:

Tubo # 1 2 3 4
Reactivo
Buffer pH 6,9 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml
KCl 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml
Almidón 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
Agua destilada 1,2 ml 1,1 ml 1,0 ml 0,9 ml
Enzima 0,1 ml 0,2 ml 0,3 ml 0,4 ml
Recuerde que el tiempo de reacción es necesario controlarlo cuidadosamente de manera
que la enzima actúe en todos los tubos de ensayo de igual manera; para ello no adicione la
enzima hasta no haber preparado todos los tubos de ensayo y haberlos agitado. Comien-
ce el trabajo añadiéndole al tubo # 1 la solución de enzima y agite nuevamente, mida el
tiempo en ese momento, transcurridos 30 segundos añada la enzima al tubo # 2, al cabo
de otros 30 segundos se le adiciona al tubo # 3 y al tubo # 4 se le adicionará la enzima
después de otros 30 segundos. Recuerde que siempre debe agitar los tubos de ensayo.

Para detener la reacción añada 0,2 ml de TCA a cada tubo de ensayo después de haber
transcurrido 4 minutos de reacción. Es decir se procederá en la misma forma secuencial
conque se añadió la enzima, de esta manera a los 4 minutos de haber adicionado la enzima al
tubo # 1 será que se debe agregar el TCA a ese tubo y a los restantes se les adicionará el ácido
en intervalos de 30 segundos.

Después de haber detenido la reacción en todos los tubos de ensayo, proceda a agregarle a
todos los tubos 2 gotas del reactivo de lugol y observe los resultados obtenidos reflejándolos
en el dibujo que debe pintar a continuación.
Insertar tubos4

Explique los resultados obtenidos.

 47

EXPERIMENTO # 3. DETERMINACIÓN DEL pH ÓPTIMO DE LA α-AMILASA

SALIVAL.

Prepare 5 tubos de ensayo de acuerdo a las indicaciones siguientes:

Tubo # 1 2 3 4 5
Reactivo
Buffer pH 4,9 0,1 ml - - - -
Buffer pH 6,3 - 0,1 ml - - -
Buffer pH 6,9 - - 0,1 ml - -
Buffer pH 7,5 - - - 0,1 ml -
Buffer pH 8,9 - - - - 0,1 ml
KCl 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml
Almidón 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
Agua destilada 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml
Enzima 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

Para agregar la enzima tiene que tener los mismos cuidados que con la reacción anterior en el
control del tiempo, es decir irla adicionando secuencialmente cada 30 segundos y de igual
forma se debe agregar el TCA para detener la reacción a los 4 minutos exactos de haber
añadido la enzima.

Una vez concluido todos los pasos anteriores adicione 2 gotas de lugol a cada uno de los
tubos de ensayo y dibuje los resultados en el espacio siguiente.
Insertar tubos5

Escriba el valor del pH óptimo de la enzima y explique cómo llega Ud. a esa conclusión.
 48

EXPERIMENTO # 4. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD

DE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA.

Prepare tres tubos de ensayo de acuerdo con las indicaciones siguientes:

Tubo # 1 2 3
Reactivo
Agua destilada 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml
Buffer pH 6,9 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml
KCl 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml
Almidón 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml
Enzima 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

Después de preparados los tubos de ensayo; PERO ANTES DE ADICIONAR LA ENZI-

MA, coloque el tubo # 1 durante 5 minutos en el baño de hielo y el tubo # 3 en el baño de
agua en ebullición. Transcurridos estos 5 minutos y sin sacar los tubos de sus respectivos
baños de incubación, añada la solución de enzima y controle que el tiempo de reacción sea de
4 minutos, adicionando el TCA en el momento apropiado.

Agréguele a cada tubo de ensayo 2 gotas de lugol, observe los resultados y dibújelo en el
espacio siguiente.
Insertar tubos3

¿Qué explicación le da Ud. a los hallazgos encontrados.

 49

EXPERIMENTO # 5. IDENTIFICACIÓN DEL COFACTOR Y DE UN INHIBIDOR

DE LA ENZIMA α-AMILASA SALIVAL.

La enzima α-amilasa salival requiere como cofactor de la presencia de los iones cloruros; sin
embargo los iones fluoruros constituyen un inhibidor de la enzima y los bromuros no afectan
la velocidad de la reacción. Sobre esta base se han preparado tres soluciones en las que en
cada una de ellas se encuentra uno de los iones mencionados, en forma de su sal de potasio.
Siguiendo las instrucciones que se brindan en el cuadro siguiente prepare 3 tubos de ensayo.
Tubo # 1 2 3
Reactivo
Solución KCl 0,2 ml - -
Solución KBr - 0,2 ml -
Solución KF - - 0,2 ml
Buffer pH 6,9 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml
Almidón 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
Agua destilada 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml
Enzima 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

Recuerde adicionar la enzima de forma secuencial para controlar el tiempo y detener la reac-
ción con el TCA a los 4 minutos exactos de haberse iniciado la misma.

Añada a cada tubo de ensayo 2 gotas de lugol y observe los resultados. Expréselos mediante
un dibujo en el espacio siguiente:
Insertar tubos3

¿Cuál es la solución que se comportó como inhibidora?

¿Cuál es la solución que se comportó como activadora?

¿Cuál es la solución que se comportó como inerte?

¿Cómo pudo Ud. diferenciarlas?

50
 51

INFORME DE LA PRÁCTICA

CINÉTICA ENZIMÁTICA

EQUIPO #_____________DÍA_______________HORA_____________.

INTEGRANTES:
1.- _____________________________________________________________________
2.- _____________________________________________________________________
3.- _____________________________________________________________________
4.- _____________________________________________________________________
5.- _____________________________________________________________________

1.- ¿Por qué se utiliza la saliva como material biológico en esta práctica?

2.- ¿Cómo detectó Ud. la actividad enzimática de la saliva?.

3.- ¿Qué factores estudiados afectaron la velocidad de la reacción enzimática ?. ¿Por qué?

4.- ¿Cuál es el pH óptimo de la enzima?. ¿Cómo Ud. lo determinó?

5.- ¿Cuál fue la sustancia activadora y cuál la inhibidora?. ¿Cómo Ud. lo determinó?
52
 53

PRÁCTICA # 5
REACCIONES COLOREADAS DE MONO Y
DISACÁRIDOS
INTRODUCCIÓN

Los glúcidos constituyen un importante grupo de compuestos que garantizan la realización

de diversas funciones de la célula.

Conceptualmente se conocen como glúcidos a los compuestos químicos que respondan a las
características de ser aldehidos o cetonas polihidroxilados, sus productos de oxidación, re-
ducción, sustitución, acetalización y polimerización.

De acuerdo con el número de sus unidades constituyentes los glúcidos pueden ser clasifica-
dos en tres grandes grupos:

1.- Monosacáridos.
2.- Oligosacáridos
3.- Polisacáridos.

Los monosacáridos son las unidades más sencillas de los glúcidos y representan a su vez a
los monómeros que constituirán a los otros grupos clasificatorios.

Desde el punto de vista estructural los monosacáridos con más de 4 átomos de carbono
experimentarán una reacción de hemiacetalización interna que les confiere características
cíclicas. Las aldopentosas y las cetohexosas adoptarán una forma furanósica en tanto que las
aldohexosas y las cetoheptosas se presentarán en forma piranósica.

Como resultado de la hemiacetalización de los monosacáridos aparece en su estructura el

denominado carbono anomérico. Este carbono tiene características especiales que determi-
nan entre otras cosas la aparición de un tipo de isómeros (los anómeros) y le confiere a estas
moléculas la propiedad de polimerizarse y así constituir los oligosacáridos y los polisacáridos.

Cuando se produce la unión de dos monosacáridos a través de un enlace glicosídico se obtie-

nen los denominados disacáridos, de gran importancia en el metabolismo de los glúcidos y
particularmente en su proceso de digestión, por lo que resulta necesario conocer a los princi-
pales representantes de este grupo de compuestos.
Insertar disacáridos
 54

Al observar estas estructuras se aprecia que al menos uno de los carbonos anoméricos ha
quedado comprometido en la formación del enlace glicosídico, en tanto que es común que
otro de estos carbonos quede libre y permita que la molécula vaya creciendo hasta alcanzar
dimensiones que permitan considerarla como un polisacárido. En todo este proceso los enla-
ces glicosídicos que van apareciendo irán comprometiendo a los carbonos anoméricos de
manera que sólo uno, el de uno de los extremos permanecerá libre. Debido a las característi-
cas reductoras que posee el carbono anomérico a ese extremo se le denominará extremo
reductor, en tanto que al otro extremo de la molécula, al no presentar dicho carbono anomérico
se le denomina extremo no reductor. Esta nomenclatura será de gran utilidad cuando se pase
a estudiar el metabolismo de los polisacáridos y en particular el del glucógeno.

De lo anteriormente expuesto se deduce que algunos de los glúcidos presentarán la propie-

dad de reducir a algunas sustancias y de ahí que los glúcidos serán también clasificados
como reductores o no reductores; para lograr comprender esta nueva clasificación debe pasar
a estudiarse las propiedades químicas de los monosacáridos.

PROPIEDADES QUÍMICAS DE LOS MONOSACÁRIDOS.

Los monosacáridos, como aldehídos o cetonas polihidroxilados, presentarán todas las pro-
piedades químicas propias de los grupos carbonilos primarios o secundarios así como de los
alcoholes. Comoquiera que éstas son muy extensas, limitaremos su estudio a las que tienen
relación directa con las reacciones que desarrollaremos en la presente práctica, es decir las
reacciones de reducción y las furfurálicas.

REACCIONES DE REDUCCIÓN.

Los monosacáridos como es sabido presentan un equilibrio entre las formas α, β y su estruc-
tura lineal y por lo tanto como todos los compuestos que presentan carbonos carbonílicos
experimentan una reacción de tautomerización cuando se encuentran en solución, lo que
determina la aparición de otro equilibrio de su forma lineal en que aparecen tres estructuras
diferentes: la aldehídica, la enólica y la cetónica, tal y como se muestra en la figura siguiente:
Insertar cetoenol

ALDEHIDO ENOL CETONA

TAUTOMERISMO CETO-ENÓLICO

La forma enólica resultante de este equilibrio tiene la propiedad de poder oxidarse fácilmen-
te y por lo tanto manifiesta poder reductor. Existen múltiples sustancias que pueden ser redu-
cidas por este grupo, entre las que se encuentran las sales de plata, el hidróxido de bismuto y
las sales cúpricas. Todos estos compuestos han sido utilizados para la identificación de los
monosacáridos basados en sus propiedades reductoras; sin embargo gracias a la estabilidad
del reactivo y a la facilidad de su realización se ha impuesto la utilización de las sales cúpricas
y especialmente el reactivo de Benedict.
 55

El reactivo de Benedict está compuesto por una solución de sulfato cúprico y de citrato y
carbonato de sodio, que le confieren a la solución un pH alcalino y evitan que los iones
cúpricos se reduzcan espontáneamente en presencia del oxígeno ambiental. El medio alcalino
hace que la reacción transcurra con mayor facilidad y por lo tanto todas aquellas sustancias
que posean poder reductor darán positivo con este reactivo, y entre ellas por supuesto todos
los monosacáridos y algunos disacáridos. La reacción se muestra en la siguiente figura:
Insertar Benedict

MONOSACÁRIDOS

REACCIONES DE ÓXIDO-REDUCCIÓN
En ella se aprecia que los iones cúpricos son reducidos a óxido cuproso que es una sustancia
insoluble de color rojo ladrillo característica de la positividad de esta reacción. La transfor-
mación de los monosacáridos no se representa puesto que el mecanismo íntimo de la reac-
ción es extraordinariamente complejo y a partir del glúcido se ha podido comprobar que se
obtienen más de 93 compuestos diferentes como resultados de enolizaciones, epimerizaciones
y polimerizaciones que se producen posteriores a la oxidación del compuesto.

Si se cambia el pH de la solución de manera que resulte ácido, se logrará también que las
sustancias reductoras más potentes mantengan la positividad; pero aquellas que sólo tienen
un débil poder reductor no lograrán reducir al cobre. Esta propiedad posibilitó desarrollar
una reacción de diferenciación de los monosacáridos y los disacáridos. Un científico llamado
Barfoed utilizó un reactivo compuesto por acetato cúprico y ácido acético, con lo que sólo
los monosacáridos eran capaces de reducir al cobre, en tanto que los disacáridos que tienen
menor poder reductor al tener comprometido uno de sus carbonos anoméricos en el estable-
cimiento del enlace glicosídico, no reaccionan y por lo tanto dan un resultado negativo. Por
supuesto que al tener la solución un pH ácido resulta necesario controlar rigurosamente el
tiempo de la reacción, pues si éste se prolongara se produciría la hidrólisis ácida del enlace
glicosídico con la consiguiente liberación del carbono anomérico y la aparición de nuevos
grupos reductores que falsearían el resultado.

REACCIONES FURFURÁLICAS.

Los otros tipos de reacciones que analizaremos son las que se derivan de la propiedad que
tienen los ácidos orgánicos fuertes de deshidratar a la molécula de los monosacáridos de
manera que se obtiene un aldehído cíclico denominado furfural, el cual a su vez es capaz de
condensarse con algunos compuestos aromáticos y rendir complejos coloreados que permi-
ten visualizar la reacción. La reacción de deshidratación se muestra en la figura siguiente:
Insertar FURFU
En ella se ha modificado la estruc-
tura lineal de los monosacáridos de
forma que se puedan apreciar los
grupos que originan las tres molé-
culas de agua; de igual forma sólo
se han representado las reacciones
que tendrían lugar con las aldosas;
en el caso de las cetosas la reacción
sería igual, pero el grupo aldehído
que se ha representado debe ser
sustituído por una cetona. De esta
 56

manera se puede concluir que para que se produzca la formación del furfural se requiere que
las aldosas tengan al menos 5 átomos de carbono, en tanto que con las cetosas sólo reaccio-
narán aquellas que tengan 6 o más átomos de carbono.

De acuerdo con el tipo de ácido que se use como deshidratante y del compuesto aromático
que se emplee para la reacción de condensación se describen las diferentes reacciones
furfurálicas. En la presente práctica realizaremos tres de ellas que se describen a continua-
ción:

Reacción de Molisch.

Esta reacción se considera como una reacción general de los monosacáridos puesto que uti-
liza al ácido sulfúrico como agente deshidratante y este ácido es un deshidratante muy enér-
gico y por lo tanto todos los monosacáridos que tengan suficiente número de átomos de
carbono como para formar el furfural darán positivo con la reacción. Además, la fortaleza
del ácido sulfúrico determina que los enlaces glicosídicos presentes en los di y polisacáridos
que existan en la solución se hidrolicen y se descompongan en sus monosacáridos constitu-
yentes, por lo que también darán positivos con este reactivo.

El agente condensante que posibilita la aparición del color es el α-naftol, el cual además, en
presencia del ácido sulfúrico se sulfona dos veces y aparece un complejo coloreado de viole-
ta. Esta reacción se representa a continuación.
Insertar Molisch

Reacción de Sellivanoff:

Esta reacción es típica de las cetosas, puesto que se aprovecha la característica que tiene el
ácido clorhídrico de ser un mejor agente deshidratante de éstas que de las aldosas, por lo que
si se controla rigurosamente el tiempo el furfural se obtendrá solamente a partir de los
monosacáridos que presenten grupos carbonilos secundarios en su estructura.

El agente condensante empleado en la reacción es el resorcinol y la representación del com-

 57

plejo obtenido se muestra a continuación.

Insertar Sellivanoff

Otra precaución que hay que tomar al realizar este ensayo es el de la concentración utilizada
de los monosacáridos, puesto que concentraciones superiores al 2 % también harán que la
reacción dé positiva con las aldosas.

Reacción de Bial.
En esta reacción también se usa como agente deshidratante al ácido clorhídrico; pero en
presencia de cloruro férrico, de manera que en estas condiciones se deshidratan primero las
pentosas que las hexosas y por lo tanto constituye una reacción de identificación de las
primeras. El agente condensante es el orcinol, que al reaccionar con el furfural rinde un
complejo coloreado de verde que se puede apreciar en la siguiente figura:
Insertar Bial REACCIÓN DE BIAL.

De esta manera, en la presente práctica realizaremos 5 reacciones coloreadas de mono y

oligosacáridos que nos permitirán, si no identificar a los monosacáridos, al menos conocer
las características generales de estos que nos permitan realizar su clasificación. De esta ma-
 58

nera los objetivos que nos trazamos en esta práctica se enuncian a continuación:
OBJETIVOS

1.- Identificar la presencia de glúcidos en una solución mediante la aplicación de la reacción

de Molisch.

2.- Comprobar la especificidad para las cetosas de la reacción de Sellivanoff.

3.- Ratificar que la reacción de Bial es característica de las aldopentosas.

4.- Verificar el poder reductor de los monosacáridos mediante la reacción de Benedict.

5.- Reconocer la presencia de monosacáridos en solución usando la reacción de Barfoed.

DESARROLLO

EXPERIMENTO # 1. REACCIÓN DE MOLISCH.

Prepare 5 tubos de ensayo de acuerdo con el siguiente cuadro:

Tubo # 1 2 3 4 5
Reactivo
Glucosa 2 ml - - - -
Sacarosa - 2 ml - - -
Ribosa - - 2 ml - -
Almidón - - - 2 ml -
Albúmina de huevo - - - - 2 ml
Molisch 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas
Ácido sulfúrico 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Al preparar los tubos de ensayo debe tomar la precaución de añadir cada uno los reactivos
excepto el sulfúrico. Una vez que haya vertido todos los reactivos en el tubo de ensayo
proceda a agitarlo y entonces y sólo entonces, añada el sulfúrico muy lentamente y por las
paredes y no vuelva a agitar el tubo de ensayo. La positividad aparecerá como la presencia de
un anillo de color violeta en la interfase formada.

Recuerde que el sulfúrico es altamente cáustico y que si se le derrama produce quema-

duras. de igual forma la reacción de deshidratación es altamente exotérmica y si se
añade el sulfúrico rápidamente ebullirá y puede producirse la expulsión del líquido que
producirá quemaduras. ¡Tenga mucho cuidado !.

Deje reposar los tubos durante 5 minutos y proceda a dibujar los resultados obtenidos:
 59

Insertar tubos5
¿Qué puede concluir sobre los resultados obtenidos ?

¿Por qué la albúmina de huevo que es una proteína da un resultado positivo ?

EXPERIMENTO # 2. REACCIÓN DE SELLIVANOFF.

Para la realización de esta experiencia se deben de preparar 4 tubos de ensayo siguiendo las
instrucciones que aparecen a continuación.
Tubo # 1 2 3 4
Reactivo
Glucosa 1 ml - - -
Fructosa - 1 ml - -
Galactosa - - 1 ml -
Sacarosa - - - 1 ml
Sellivanoff 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml

Lleve los tubos a un baño de agua hirviente durante 10 minutos exactos, al cabo de los cuales
proceda rápidamente a enfriar los tubos de ensayo bajo el flujo de agua corriente.

¿Por qué hay que controlar el tiempo y por qué se deben enfriar los tubos de ensayo ?

Dibuje los resultados obtenidos:

Insertar tubos4

¿Por qué la sacarosa resultó positiva en la reacción ?

 60

EXPERIMENTO # 3. REACCIÓN DE BIAL.

Para realizar esta experiencia se requiere de la preparación de 3 tubos de ensayo de acuerdo

con las siguientes instrucciones:
Tubo # 1 2 3
Reactivo
Glucosa 1 ml - -
Ribosa - 1 ml -
Arabinosa - - 1 ml
Bial 1 ml 1 ml 1 ml

Mantenga todos estos tubos en baño de agua en ebullición durante 10 minutos y proceda a
leer los resultados y a dibujarlos a continuación.
Insertar tubos3

¿A qué conclusión puede Ud. llegar con respecto a la arabinosa ?

¿Por qué a estos dos últimos experimentos hubo que darles calor ?

EXPERIMENTO # 4. REACCIÓN DE BENEDICT.

Prepare 5 tubos de ensayo de acuerdo con lo descrito en el próximo cuadro:

Tubo # 1 2 3 4 5
Reactivo
Glucosa 1 ml - - - -
Fructosa - 1 ml - - -
Sacarosa - - 1 ml - -
Maltosa - - - 1 ml -
Lactosa - - - - 1 ml
Benedict 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
 61

Mantenga los tubos de ensayo durante 5 minutos en el baño de agua hirviente y luego proce-
da a ver los resultados y dibujarlos a continuación.
Insertar tubos5

¿Por qué la sacarosa dio negativo con esta reacción ?

¿Qué diferencia observó entre los resultados de los monosacáridos y los disacáridos ?

EXPERIMENTO # 5. REACCIÓN DE BARFOED.

Prepare 5 tubos de ensayo de acuerdo con lo descrito en el próximo cuadro:

Tubo # 1 2 3 4 5
Reactivo
Glucosa 1 ml - - - -
Fructosa - 1 ml - - -
Sacarosa - - 1 ml - -
Maltosa - - - 1 ml -
Lactosa - - - - 1 ml
Barfoed 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml

Mantenga los tubos de ensayo durante 5 minutos en el baño de agua hirviente. Recuerde
 62

tener sumo cuidado con el control del tiempo que debe ser muy exacto.
Pasado este tiempo proceda a observar los resultados y dibujarlos a continuación.
Insertar tubos5

¿A qué conclusiones generales puede Ud. arribar en este experimento ?

¿Qué diferencia observó entre los resultados de los monosacáridos y los disacáridos ?
 63

INFORME DE LA PRÁCTICA

REACCIONES COLOREADAS DE MONO Y

DISACÁRIDOS

EQUIPO #_____________DÍA_______________HORA_____________.

INTEGRANTES:
1.- _____________________________________________________________________
2.- _____________________________________________________________________
3.- _____________________________________________________________________
4.- _____________________________________________________________________
5.- _____________________________________________________________________

1.- Escriba en el siguiente cuadro las especificidades de cada una de las reacciones que se
le mencionan:

Reacción Especificidad
Molisch
Sellivanoff
Bial
Benedict
Barfoed

2.- De acuerdo con los resultados obtenidos en la práctica. ¿Qué puede Ud. afirmar en
relación con las características estructurales de?:

Sustancia Características estructurales

Glucosa
Fructosa
Galactosa
Ribosa
Arabinosa
Sacarosa
Maltosa
Lactosa
Almidón
Albúmina de huevo
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 65

PRÁCTICA # 6
EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LÍPIDOS
INTRODUCCIÓN

Los lípidos constituyen un importante y variado grupo de compuestos químicos. Debido

precisamente a su gran variabilidad estructural resulta imposible establecer un concepto quí-
mico de estas sustancias y por ello se precisa definirlas operacionalmente, así se entiende por
lípido a todo material biológico que sea extraíble por medio de la utilización de solventes no
polares

Sin embargo, para su clasificación sí resulta útil la agrupación de estos compuestos de acuer-
do con sus características estructurales, y de esa forma los mismos se clasifican en:

1.- Ácidos Grasos.

2.- Grasas neutras.
3.- Ceras.
4.- Fosfátidos de glicerina.
5.- Esfingolípidos.
6.- Lípidos isoprenoides.

Igual que diversa resulta la estructura de los lípidos, consecuentemente sus funciones bioló-
gicas también serán muy variadas, de ahí que a pesar de poder generalizar señalando que las
principales funciones que cumplen estos compuestos en el organismo son las de: servir como
combustible biológico, constituir la principal reserva de energía del organismo, ser compo-
nentes estructurales importantes de la célula y el organismo y poseer muchos de ellos activi-
dad biológica propia; deba señalarse que cada grupo clasificatorio además cumple con fun-
ciones específicas.

Consecuentemente con su definición, la obtención de los lípidos tendrá que realizarse utili-
zando como fuente algún tejido vivo y como material de extracción a alguno de los solventes
no polares u orgánicos. A pesar de que en general todos los lípidos son solubles en estos tipos
de solventes resulta que, de acuerdo con las características estructurales que presentan, serán
más o menos solubles en los diferentes tipos de solventes orgánicos: así el cloroformo será
un buen diluente para casi todos ellos, en tanto que el etanol y la acetona serán más específi-
cos. La acetona resulta un buen disolvente de los esteroides, en tanto que el etanol lo será
para los ácidos grasos de cadena corta. De esta manera utilizando diferentes combinaciones
de solventes no sólo se logra la extracción de los lípidos a partir de la materia orgánica, sino
que también se podrán diseñar métodos que permitan la obtención selectiva de algunos de
ellos.

En la presente práctica utilizaremos la propiedad de solubilidad para aislar a partir del cere-
bro de conejo los lípidos presentes utilizando el equipo de Soxhlet
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Como se aprecia en el esquema del equipo de Soxhlet: el cloroformo se ubica en el matraz, el

cual a su vez está inmerso en una manta de calefacción eléctrica regulada a una temperatura
de 65°C para lograr la ebullición del solvente. Los vapores del solvente ascienden por la
rama lateral del equipo y alcanzan el condensador, refrigerado por agua corriente, y luego de
volver al estado líquido cae en el vaso central del equipo. En este vaso central se encuentra el
dedal de extracción de Soxhlet que contiene al tejido objeto de estudio. El solvente se va
acumulando y elevando su nivel hasta alcanzar la parte superior del sifón, que se muestra en
la parte derecha de la figura, y entonces se vacía en el matraz. Con esto se logra un circuito
cerrado de circulación del solvente que permite que en múltiples ocasiones éste se ponga en
contacto con el material biológico y así vaya extrayendo sus lípidos constituyentes.
Insertar Soxhlet.

El tejido nervioso tiene un alto contenido lipídico y por

lo tanto constituye una fuente ideal de este material.
Aprovechando esta característica se procederá a extraer
Flujo del refrigerante los lípidos presentes en el encéfalo utilizando al cloro-
Flujo del solvente gaseoso formo como solvente. Con este procedimiento se logra-
Flujo del solvente líquido
rá disolver a la mayor parte de los lípidos existentes que
serán colectados en el matraz del equipo y luego por
evaporación del solvente se obtendrán los mismos.

En la presente práctica además de realizar algunos expe-

rimentos de carácter general, emplearemos este extracto
para la identificación de las propiedades físico químicas
de los lípidos obtenidos a partir del tejido nervioso.

PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LOS LÍPIDOS:

La primera y tal vez más importante propiedad físico-química de los lípido es su solubilidad.
Esta propiedad ha sido utilizada incluso para la propia definición de estos compuestos; sin
embargo a pesar de ser cierto que la mayoría de los lípidos son solubles en solventes apolares,
también es cierto que su solubilidad no es igual para todos ellos. Por ejemplo, existen lípidos
con cierto grado de polaridad y otros que son totalmente apolares; por consiguiente unos
serán más solubles que otros ante determinado solvente orgánico. Es el caso de algunas
lecitinas que incluso precipitan en presencia de la acetona fría y el de los ácidos grasos al ser
puestos en presencia del etanol.

SOLUBILIDAD DE LOS ÁCIDOS GRASOS EN ETANOL

El etanol es un solvente que no es totalmente apolar y algo similar ocurre con los ácidos
grasos que poseen en su estructura un grupo carboxilo polar y una cadena lateral
hidrocarbonada de longitud variable. De acuerdo con la longitud de esta cadena lateral y de
la presencia o no de dobles enlaces en la misma variará la solubilidad de los lípidos en el
etanol.
En sentido general se puede afirmar que mientras más corta sea la cadena lateral de los
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ácidos grasos más solubles serán en el etanol y que a igual número de átomos de carbono la
mayor solubilidad en este alcohol se verá en aquellos ácidos grasos que posean mayor núme-
ro de dobles enlaces. Esta propiedad la podremos demostrar en la presente práctica.

EMULSIFICACIÓN Y DETERGENCIA.

Como es de esperar resulta imposible mantener unido un sistema disperso integrado por una
mezcla de agua y grasa. Estos sistemas dispersos son coloides llamados emulsiones y quedan
constituidos por el agua que representa a la fase dispersante y la grasa que se comporta como
la fase dispersa fragmentándose en partículas denominadas micelas. Las dos fases se logran
mantener unidas sólo si se continúa la agitación, pues tan pronto como regresan al reposo de
inmediato se separan.

En los seres vivos que son organismo absolutamente dependientes del agua se necesita con-
servar estables a estas emulsiones para lograr tanto el transporte como el metabolismo de las
grasas. Esto se consigue a través de un mecanismo llamado la detergencia.

La detergencia es el mecanismo a través del cual la adición de una sustancia llamada deter-
gente garantiza la estabilidad de una emulsión.

En la figura que se muestra a continuación se aprecia que al agitar el agua y la grasa se logra
la obtención de una emulsión; pero cuando se permite el reposo del sistema ambas fases se
separan en un proceso denominado coalescencia; sin embargo al adicionar un detergente la
emulsión se estabiliza al impedir que las micelas coalezcan.
Insertar Emulsión

Los detergentes logran realizar esta actividad gracias a su estructura química. Independiente-
mente de su naturaleza química, todo detergente tendrá una parte apolar y otra polar ionizable,
de manera que son sustancias anfipáticas con afinidad tanto por el agua como por las sustan-
cias apolares.

En la siguiente figura se muestra una de las sales biliares, la del ácido glicocólico, y en ella
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se aprecia que el anillo del esterano resulta apolar en tanto que el residuo de glicina es alta-
mente polar e incluso iónico. Las sales biliares son los principales detergentes biológicos
Insertar Sal biliar

Como resultado de su carácter

anfipático las moléculas de deter-
gente mantendrán su parte apolar
incorporada en el interior de la
micela mientras que su porción po-
lar quedará en la superficie de la
misma y en íntimo contacto con el
agua por lo que constituirá un me-
dio de unión entre la grasa y el agua; además si dos micelas de estas se aproximaran la
igualdad de las cargas que mantienen en su superficie haría que ambas se repelieran y así se
logra evitar la coalescencia y por consiguiente estabilizar la emulsión.

En la siguiente figura se aprecia la interacción entre cuatro micelas que se han formado con
el glicocolato de sodio. Se puede distinguir en el interior de cada una de estas micelas la
presencia de los anillos de esterano mientras que la porción polar ha quedado en el exterior y
por lo tanto le confiere una carga negativa a toda esta superficie de la partícula. Debe señalar-
se que esta figura es sólo una representación esquemática del proceso y que el número de
moléculas de sales biliares que se mantienen unidas a cada micela es muy superior al que se
ha representado en la figura y por consiguiente la carga negativa externa es de magnitud
suficiente como para neutralizar la tendencia natural que tiene la grasa de volver a unirse.
Insertar y editar Miscela

REACCIONES DE HALOGENACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS: