Biología General

PRIMER CUATRIMESTRE 2019

Teoría Microscopía - UNIDAD I

Microscopía
Una vista al mundo oculto

La biología es un área muy rica visualmente. Sin embargo muchas de las estructuras y eventos biológicos
más interesantes son más pequeños de lo que el ojo humano puede ver sin ayuda. Hay una inmensa
cantidad de células, microorganismos, y eventos fisiológicos que ocurren a una escala muchísimo menor a
la que podemos observar a ojo desnudo, pero que influyen notablemente en la vida del hombre y su
entorno y, por tanto, requieren ser estudiadas con detalle. La capacidad del ojo humano es muy limitada a
la hora de discriminar imágenes muy pequeñas. El ojo humano tiene una resolución de cerca de 200 µm
(0,2mm). El poder de resolución es una medida de la capacidad para distinguir un objeto de otro, es la
distancia mínima que debe haber entre un objeto y otro para que sean percibidos como objetos separados.
Esto quiere decir que si hay dos líneas separadas por 0,2mm, nosotros lo veríamos como una sola línea. La
mayoría de las células miden mucho menos de 10 µm, esto es, menos de 10 veces el poder de resolución
del ojo humano.

Para la observación de pequeñas estructuras, como células individuales o, con más razón, las estructuras
que las componen, que se encuentran por debajo de la capacidad de visión del ojo humano, debemos
utilizar instrumentos que suministren una mejor resolución. Para ello recurrimos básicamente a dos
instrumentos, el microscopio y la lupa. Con el avance de las técnicas de microscopía el hombre ha sido
capaz de estudiar organismos y estructuras a simple vista invisibles y, con ello, ha conseguido progresos
fundamentales en el campo de la biología, por ejemplo en causas y diagnóstico de enfermedades. La
mayor parte del conocimiento actual acerca de la estructura celular se obtuvo con la ayuda de la
microscopía.

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Un poco de historia
La necesidad de amplificar imágenes se remonta a los griegos y romanos, quienes emplearon esferas de
vidrio llenas de agua, las que solo eran útiles para observar heridas y tejidos. A finales del siglo XVI
Leonardo da Vinci ya insistía en las ventajas de emplear lentes en el estudio de los objetos pequeños.
Durante este tiempo, se destaca el estudio de insectos minúsculos, tanto que en el libro Magia naturalis de
Juan Bautista de la Porta se describen los principios y usos de aquellas.

El microscopio como tal, fue inventado por Zacharias Janssen en 1590. La primera ocasión que se empleó la
palabra microscopio en una publicación científica fue hecha en 1625 por Federico Cesi y Francesco Stelluti
en una publicación de la Accademia dei Lincei, la más antigua de las sociedades científicas de Europa, en un
trabajo titulado Apiarium, en el cual reportaban observaciones microscópicas de una abeja. Otra
publicación de gran importancia fue Micrographia, de Robert ​Hooke​, quien presenta ahí sus observaciones
del corcho hechas en 1663 y establece el nombre de célula.. Pero su trabajo solo muestra con gran detalle
objetos que es posible observar a simple vista.

“celditas” de corcho.

La primera publicación verdaderamente crucial en que se reporta el empleo del microscopio fue una
investigación de la circulación de los glóbulos rojos (o eritrocitos, las células que transportan el oxígeno de

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la sangre y que están contenidas en esta) en las orejas del conejo. Este trabajo fue realizado por Macello
Malpighi en 1665. Fue el primero en estudiar tejidos vivos al microscopio.

A finales del siglo XVII Anton van Leeuwenhoek, tallando lentes, pudo apreciar el mundo que por su
tamaño tan pequeño no era posible ver a simple vista: el mundo microscópico. El secreto de Leeuwenhoek
para alcanzar esos aumentos fue que él mismo tallaba sus lentes, secreto que conservó celosamente y que
demoró el empleo del microscopio compuesto hasta el siglo XIX. Aunque el microscopio de Leeuwenhouk
es simple, logra aumentos de hasta 480 veces el tamaño de los objetos usando una sola lente, como las
lupas, a pesar de su poca complejidad.

Como lo describió Paul de Kruif en su libro Los cazadores de microbios, Leeuwenhoek fue el primer cazador
de microbios y un verdadero microscopista. Fue conserje de la casa consultorial de su pueblo natal,
comerciante de telas y el primero en asomarse a un mundo nuevo poblado de seres diferentes. La falta de
preparación académica de Leeuwenhoek fue un factor importante en los trabajos que realizó, pues su
supuesta ignorancia lo aislaba de la charlatanería de su tiempo, en el que las enfermedades se atribuían a
los malos espíritus.

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Por desgracia, Leeuwenhoek no compartió sus técnicas de pulido de lentes, y no fue sino hasta finales del
siglo XIX cuando los microscopios se perfeccionaron lo suficiente. Con el microscopio óptico, que utiliza
como la luz visible como fuente de luz, la capacidad de aumento había llegado a su límite. Para observar
objetos más pequeños que los que puede iluminar la luz visible es necesario un tipo de “luz” de menor
longitud de onda que pueda iluminar objetos aún más pequeños y llegar a los detectores adecuados.

No fue sino a partir de 1930 que se emplearon electrones como “luz” para iluminar objetos, por lo que el
concepto de microscopio se aplicó a otros instrumentos que no ocupan la luz visible como fuente de
iluminación y que utilizan detectores especiales para observar.

El ​microscopio electrónico de transmisión (T.E.M.) ​fue el primer tipo de microscopio electrónico

desarrollado, utiliza un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo aumentos
de 100.000 X. Fue desarrollada por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en 1931. Con el microscopio
electrónico se pudo cumplir el viejo anhelo de observar imágenes con un mayor aumento y una mejor
resolución; por ello, significó una segunda revolución en la ciencia pues, como ya se mencionó, no solo era
posible observar ahora organismos vivos sino también sus organelas, y determinar la forma e incluso las
partes de un virus, lo que era imposible con el microscopio óptico. Posteriormente, en 1942 se desarrolla el
microscopio electrónico de barrido (SEM)

Lupa estereoscópica

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Partes de la lupa
a) PARTE MECÁNICA: constituida por una platina de gran densidad, horadada para colocar en ella una placa
de contraste. Igualmente está provista de dos pinzas de sujeción.

Columna o vástago: perpendicular a la platina, sobre el cual irá alojado el bloque de la parte óptica de la
lupa, con el tornillo de sujeción.

Tornillo de aumento: tornillo que desplaza en cremallera, para enfocar los objetos.

b) PARTE ÓPTICA:

Oculares: situados en la parte superior, aumentan la imagen producida por los objetivos.

Objetivos: en el extremo inferior, situados sobre el objeto a estudiar, producen un aumento de la imagen.

Imagen en la lupa: ​La visión es por reflexión, permitiendo una imagen real y aumentada. La sensación de
relieve o estereoscópica se consigue con imágenes distintas en cada ocular, presentando para ello la lupa
dos sistemas ópticos distintos. Cada ojo recibe una imagen por separado, captada por cada sistema óptico
correspondiente del aparato, y con la convergencia necesaria para producir una visión correcta.

El aumento que proporciona la lupa es mucho menor que el proporcionado por el microscopio, pero el
campo visual de trabajo es mucho mayor.

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Uso de la lupa estereoscópica

No es necesario, aunque se puede, preparar la muestra en portaobjetos.

Puede verse “in toto”, entera, poniendo simplemente el ejemplar sobre el plato de la lupa. O sobre placa
de Petri, vidrio de reloj, etc.
Se procede a regular la luz incidente, y luego se busca el enfoque ajustando macro y micrométrico. Permite
ver varios planos de profundidad a la vez.

Microscopio óptico
Partes del microscopio
a) Parte mecánica​: soporte de la parte óptica.

El pie o base del microscopio. Pesado, conteniendo el aparato de iluminación.

El brazo, permite tomar el microscopio.

La platina, donde se apoya la preparación, puede ser cuadrada, redonda, inclinada u horizontal. Se
encuentra horadada en el centro. Posee conjuntamente un carro móvil que mueve la platina. Va provista
de pinzas.

El tubo hueco contiene los oculares y los objetivos, estos últimos enroscados en el revólver.

El macrométrico y el micrométrico, tornillos que permiten el enfoque moviendo el tubo o la platina,

ascendiendo y descendiendo.

B).- ​Parte óptica​: incluye las lentes y el aparato de iluminación.

El ocular o lente aplicada al ojo, aumenta la imagen producida por el objetivo. El microscopio puede ser
monocular o binocular. Tienen aumento de 10x, 15x, 20x, intercambiables.

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Los objetivos van enroscados en el revólver. Aumentos de 4x, 10x, 40x, y 100x (este último, se usa con
aceite de inmersión). Los colores indican el aumento de cada objetivo.

El condensador es un sistema de lentes debajo de la platina. Con movimiento por medio de la cremallera,
concentra los rayos luminosos que llegan desde el aparato de iluminación. Para regular la intensidad
luminosa, debajo del condensador existe un diafragma tipo iris que se abre o cierra gradualmente.

El aparato de iluminación consiste en lámparas de iluminación de alto voltaje.

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La ​imagen en el microscopio​ compuesto es una imagen ampliada, virtual e invertida. El objetivo actúa
como una cámara fotográfica, produciendo dicha imagen, mientras el ocular actúa como una lupa
aumentando la imagen observado por el objetivo. La imagen obtenida es combinación de las provocadas
por el objetivo y el ocular.

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Parámetros ópticos de un microscopio

a) Aumento:
El microscopio compuesto aumenta en dos etapas y puesto que una sola lente no es suficiente se deben
colocar varias lentes una detrás de la otra, potenciando de esta manera el poder de aumento. El primer
juego de lentes, cercano al objeto en estudio, se denomina objetivo y el segundo juego, cercano al ojo del
observador se denomina ocular. Cada sistema de lentes es capaz de producir una imagen aumentada cuyo
valor se enuncia con la letra x, así que 10x significa que la imagen está aumentada 10 veces.
Para conocer en el microscopio compuesto el aumento definitivo de una imagen se aplica la siguiente
fórmula:
AUMENTO TOTAL: Aumento del objetivo x Aumento del ocular
Con el microscopio compuesto clásico es posible alcanzar un aumento máximo de 1000x

b) Poder de resolución:
Es la capacidad que tiene un sistema óptico de aislar dos puntos que se encuentran muy próximos entre sí,
de manera que se puedan ver individualizados uno del otro. La riqueza de detalles que puede ser
observada al microscopio depende de la habilidad de éste para hacer que los puntos del objeto que están
muy cercanos aparezcan en la imagen como puntos separados. Mientras más corta sea la distancia entre
esos puntos del objeto, más finos serán los detalles. La distancia entre esos dos puntos se conoce como
Límite de Resolución, el cual es también referido como el Poder de Resolución y puede ser utilizada como
un indicador del rendimiento del microscopio. Esto se puede comparar vagamente con algunos aspectos
de la informática, el tamaño del pixel por ejemplo; mientras más pequeño sea el tamaño, mayor será la
cantidad de detalles de la imagen digital.. El poder de resolución es inversamente proporcional a la
longitud de onda de la luz incidente, esto es, mayor, cuanto menor es la longitud de onda de la luz con la
que se observa. Para aumentar aún más la resolución, otra posibilidad es colocar algún líquido entre la
lámina cubreobjeto y el objetivo. Se ha obtenido buenos resultados con ciertos aceites (aceite de cedro,
aceites sintéticos) cuyo índice de refracción es igual al del vidrio cubreobjeto, eliminando toda reflexión de
los rayos luminosos.

c) Número de campo.
Se denomina campo del microscopio al círculo visible que se observa en el ocular. También podemos
definirlo como la porción del plano visible observado a través de las lentes. Si el aumento es mayor, el

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campo disminuye, lo cual quiere decir que el campo es inversamente proporcional al aumento del
microscopio. El número de campo es el diámetro de la imagen, en mm.

d) Profundidad de foco
La profundidad de foco de un microscopio óptico es el rango de posición del plano de la imagen en la que
la imagen puede ser vista sin que parezca fuera de foco para un objeto o espécimen que no se mueven o
cambian de ubicación durante la visualización. Esto significa que la profundidad de foco es la claridad con

que aparece el espécimen.

e) Contraste.
Diferencia de absorción entre el objeto y el medio. Puede aumentarse con las tinciones.

Tipos de microscopio
Microscopio óptico
El microscopio óptico tiene un límite resolución de cerca de 200 nm (0.2 µm). Así, superan al ojo en
aproximadamente 500 veces. Es teóricamente imposible construir un microscopio óptico que supere dicho
valor. ​Este límite se debe a la longitud de onda de la luz visible​, que va desde 0.4 µm para la luz violeta,
hasta 0.7 µm para la luz roja. Con el microscopio óptico podemos distinguir las estructuras más grandes
dentro de las células eucarióticas, y también células procarióticas individuales. Las células observadas bajo
el microscopio óptico pueden estar vivas o fijadas y teñidas.

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Microscopio electrónico de transmisión

Con el microscopio electrónico de trasmisión, el poder de resolución es cerca de 1000 veces mayor que el
del microscopio óptico. Esto se logra utilizando ​fuentes de “iluminación” de una longitud de onda mucho
más corta que la luz visible, consistente en haces de electrones​. El microscopio electrónico de transmisión
(MET) tiene un límite de resolución de cerca de 0,1nm. Un MET mira a réplicas de células muertas, después
de haber sido fijadas y teñidas con iones de metales pesados. Los electrones son dispersados cuando
pasan a través de una fina sección del espécimen, y luego detectados y proyectados hacia una imagen
sobre una pantalla fluorescente.

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Microscopio electrónico de barrido

El microscopio electrónico de barrido (MEB) tiene un límite de 2nm. Al igual que el MET, el MEB permite
mirar a células muertas, después de haber sido fijadas y teñidas con iones de metales pesados. Con esta
técnica los electrones son reflectados sobre la superficie del espécimen y no de un corte del mismo. ​La
MEB suministra representaciones tridimensionales vívidas de las células y estructuras celulares​, lo que lo
convierte en una herramienta muy útil y compensa su resolución limitada. Tiene una profundidad de
campo mayor que el MET.

Microscopio de fluorescencia

La principal diferencia del Microscopio de Fluorescencia es que permite irradiar la muestra con la luz de
excitación y separar la luz fluorescente emitida, que es mucho más débil, de la luz de excitación. Así, ​sólo la
luz emitida por el espécimen es detectada por el detector ​(usualmente una cámara digital). Como
resultado, las partes fluorescentes de la muestra brillan contra un fondo oscuro con suficiente contraste
como para permitir la detección.

Se utiliza para detectar la localización de moléculas específicas dentro de la célula.

Bibliografía:
Arraiza, N., Viguria, P. N., & Ainciburu, A. (s.f.). Manual de microscopía. Auxilab S.L.

Curtis, H., & Sue Barnes, N. (1993). Biología. Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana S.A.

López, M. M. (junio de 2010). FUNDAMENTOS EN LA PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO. Tapachula, Chiapas, México.

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Murcia, J. Á. (2012). La historia del microscopio. La ciencia y el hombre. REVISTA DE DIVULGACIÓN

CIENTÍFICA Y TECNOLÓGICA DE LA UNIVERSIDAD VERACRUZANA.

Solomon, E. P., Martin, L. R., Solomon, D. W. E. P., Berg, L. R., & Martin, D. W. (2001). Biología.
McGraw-Hill Interamericana.

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