PRÁCTICA # 2

VERSIÓN: 1
FECHA: FEBRERO 2018
MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ELABORADO POR: EILEEN
CH. SANZ MORALES

PRÁCTICA 2: MÉTODOS DE SIEMBRA DE MICROORGANISMOS EN EL

LABORATORIO.

OBJETIVOS

 Sembrar microorganismos en diversos medios de cultivo empleando técnicas

microbiológicas estándar.
INTRODUCCIÓN
La técnica más usada en el laboratorio de Microbiología es probablemente la transferencia
de microorganismos de un ambiente a otro con el propósito de cultivarlos.
Para determinar las características de una bacteria es preciso obtenerla en cultivo puro.
Existen varios métodos para aislar las bacterias en cultivo puro; se entiende por cultivo puro
a una población de células, las cuales proceden todas de una sola célula madre.
Se denomina siembra a la inoculación de microorganismos presentes en una muestra en
un medio de cultivo, las siembras se realizan por medio del uso de un asa bacteriológica o
una pipeta, la transferencia de un cultivo a otro se denomina subcultivo o repique.
Para aislar o purificar una especie microbiana a partir de una muestra formada por muchos
tipos de microorganismos, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que
se multiplican no cambian de localización, tras muchos ciclos reproductivos, cada
microorganismo individual genera por multiplicación una colonia macroscópica compuesta
por decenas de millones de células iguales a la original. Si esta colonia individual se siembra
a su vez en un medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo de microorganismo.
Existen diferentes tipos de siembra, dependiendo del microorganismo y el tipo de medio de
cultivo que se quiere inocular.
TÉCNICAS DE SIEMBRA EN CAJAS PETRI.
Siembra en cajas de Petri por la Técnica de agotamiento, aislamiento o de estría
cruzada.
Es un buen método para el aislamiento de colonias (obtención de colonias aisladas);
mediante esta técnica se busca obtener colonias separadas a partir de un inóculo.
Procedimiento:
1.- Se toma la caja de Petri en la palma de la mano y ligeramente inclinada; con la mano
contraria, se manipula el asa de argolla previamente esterilizada por flameado directo a la
llama y con ella se recoge el material de cultivo, para colocarlo en un área periférica de la
caja haciendo movimientos circulares para homogeneizar el inóculo.
2.- El asa debe ser nuevamente flameada y enfriada en un lateral del agar (procurando no
dañarlo); a continuación, se realiza una estría partiendo de la primera y arrastrando los
microorganismos presentes en ella hacia el extremo contrario de la superficie del agar. Se
debe procurar que, en cada sección de la caja, las estrías queden trazadas con mayor
separación.
3.- Repita el paso 2, por tres veces (algunos autores reportan solo dos), recordando flamear
y enfriar el asa cada vez que culmine una estría y solo tocar con el asa la estría
inmediatamente anterior, con el objetivo de ir reduciendo la carga microbiana arrastrada por
la argolla. Finalmente se esteriliza el asa antes de descartarla (Figura 1).

Figura 1: Pasos para la siembra de bacterias por la técnica de agotamiento (y otros microorganismos
emulsionables como las levaduras) (Fuente: Rojas, A.).

Siembra en cajas de Petri por la Técnica de siembra en cuadrantes.

La técnica se basa en diluir el inóculo a medida que se realizan estrías en la superficie del
agar.
Procedimiento:
1.- La caja se divide en cuatro cuadrantes (imaginariamente o con un marcador vidriográfico
por la base de la caja);
2.- Se procede a esterilizar el asa en el mechero,
3.- Se toma el inóculo y se inicia el rayado de la superficie del agar, en cuatro cuadrantes
consecutivos (sin esterilizar el asa posteriormente o tomar nuevamente inóculo).
4.- Las cajas así sembradas, se incuban a la temperatura adecuada de acuerdo a la
bacteria.
Con esta técnica de siembra, se espera que al menos en el cuarto cuadrante (última estría
realizada), se encuentren colonias de la bacteria aisladas (Figura 2).

Figura 2. Técnica de siembra en cuadrantes, donde se observan las cuatro estrías realizadas una a
continuación de la otra y sin cargar el asa nuevamente (Fuente: Rojas, A.).

Siembras en cajas de Petri por la Técnica de punción.

Es un método de siembra utilizado para observar el crecimiento de hongos y así más
adelante establecer su morfología; así como, para la transferencia o subcultivo de cepas
previamente almacenadas y /o conservadas.
Procedimiento:
Consiste en tomar parte de micelio con un asa micológica (o asa recta), y por una punción
suave en el centro de la caja inocular el microorganismo a estudiar. Dependiendo del
objetivo, pueden hacerse múltiples picaduras en el agar (varios puntos de siembra) (Figura
3)

Figura 3. Procedimiento para la realización de una siembra por la técnica de punción, utilizando asa micológica
y sobre la superficie de un agar en caja Petri (Fuente: Rojas, A.). (Fuente: Rojas, A.).
TÉCNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS EN TUBOS.
La siembra de medios en tubos requiere mayor cuidado, puesto que un solo organismo
contaminante del aire puede superar en crecimiento al microorganismo de interés, por lo
tanto, se deben tener las siguientes precauciones:
- Mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va a transferir, de modo que los
microorganismos del aire caigan en las paredes externas del tubo y no en la boca de este.
- Los tapones se deben mantener en la mano contraría a aquella que contiene el tubo,
sosteniéndolos entre el dedo meñique, el anular y el dedo del corazón. Nunca deben
colocarse sobre la mesa de trabajo o algún otro lugar.
- Flamear la boca del tubo antes de cerrarlo después de la siembra o inoculación.
- Esterilizar el asa adecuadamente (toda la porción que entra en contacto con el medio de
cultivo). - Sumergir el asa en el medio de cultivo, sin tocar las paredes del tubo.
- Enfriar el asa en una parte del medio, sin deteriorar el mismo.
- Después de realizar la siembra, esterilizar el asa y flamear nuevamente la boca del tubo.
- Siembre trabaje con material abierto, en cámara de flujo laminar o en su defecto con
mecheros Bunsen.
- En las siembras por picadura y mixtas, evite romper el medio de cultivo, así como, utilice
asas totalmente rectas. Siembra en tubos por estría simple. Se realiza en un tubo con medio
sólido inclinado (en bisel o pico de flauta), y deslizando el asa sobre la superficie expuesta
del agar de manera que se marquen surcos o estrías (Figura 4A).
Siembra mixta en tubos. Se realiza sobre medios inclinados o en bisel, haciendo una
picadura hasta el fondo del tubo con asa recta y luego haciendo una siembra en estría
sobre la superficie expuesta del agar, deslizando el asa por la superficie en bisel marcando
las estrías; de tal manera que, con el asa cargada se realizan los dos tipos de siembra y sin
retirarla del tubo (Figura 4B).
Siembra en tubos por picadura (punción). Se designa con este nombre a la siembra que
se realiza con asa recta en tubos con medios sólidos y semisólidos generalmente sin
inclinar. Se realiza introduciendo el asa cargada con el microorganismo al medio de cultivo
por el centro de la superficie y llegando con el extremo del asa al fondo del tubo (Figura 4C
y 4D).
Siembra en tubo en medio líquido. Para transferir material a partir de un medio líquido o
sólido a otro líquido, puede usarse el asa bacteriológica (redonda). Se inocula el
microorganismo en el medio líquido haciéndola rotar del mango (Figura 4E).
Figura 4. Técnicas de siembras aplicadas a medios de cultivo contenidos en tubos, donde: (A) Siembra por
estría simple, (B) siembra mixta (picadura y estría), (C y D) siembra por picadura en agar inclinado y recto y, (E)
siembra con asa bacteriológica en medio líquido (Fuente: Rojas, A.)

ACTIVIDAD PRÁCTICA
Materiales por Subgrupo de laboratorio:
Asa micológica recta y redonda
Cajas de Petri con agar nutritivo, preparados en la práctica anterior
Cajas de Petri con agar PDA, preparados en la práctica anterior
Escobillones estériles o Aplicadores con algodón
Mechero, gradilla
Tubo de TSI inclinado, preparados en la práctica anterior
Tubo Agar nutritivo, preparados en la práctica anterior
Tubo Caldo Nutritivo, preparados en la práctica anterior.
Paños absorbentes, vinipel, alcohol 70%.
Cepas:
Cultivo Puro de E. coli en agar nutritivo
Cultivo puro de S. aureus en agar nutritivo
Cultivo puro de Salmonella en agar nutritivo
Cultivo puro de Bacillus sp en agar nutritivo
Cultivo puro de Penicillum sp. en PDA
Cultivo puro de S. cerevisiae en PDA.
Cultivo puro de Rhodotorula en PDA.
Cultivo puro de Alternaria sp en PDA.
Cultivo puro de Aspergillus en PDA.
Cultivo puro de Mucor sp en PDA.
Cultivo puro de Fusarium en PDA.

PROCEDIMIENTO
1.- SIEMBRA EN CAJA DE PETRI
A.- Siembra por agotamiento o estría:
Tome el inóculo bacteriano con el asa redonda y colóquela cerca de la periferia de caja de
Petri estéril que tiene medio de cultivo agar nutritivo, con el asa estéril, trace estrías hasta
la mitad o tercera parte de la caja, esterilice el asa, enfiela en el borde de la caja y gire la
caja para continuar con la estriación.
Esterilice nuevamente el asa, deje enfriar y gire la caja, realice estrías perpendiculares a
las hechas anteriormente, levante el asa y realice las estrías en forma de zigzag en el centro
de la caja.
Al terminar el anterior procedimiento esterilice el asa e incube la caja de Petri a 37°C por
24-48h.
B.- Siembra por sedimentación:
Abra la caja de Petri que contiene el medio de cultivo agar nutritivo en el sitio asignado,
expóngala al ambiente por cerca de 20minutos, tape la caja y márquela adecuadamente
indicando el lugar del muestro, la fecha y el subgrupo de trabajo, luego lleve a incubación
a 37°C por 24-48h.
C.- Siembra de Hongos por Punción:
Esterilice el asa micológica (asa recta), abra la caja de Petri que contiene el cultivo del
hongo ( Penicillum sp, u otro hongo disponible) y tome una pequeña porción de la muestra
raspando la superficie de la caja, luego cerca al mechero abra la caja de Petri que contiene
el medio de cultivo estéril PDA y realice punciones en los cuatro extremos de la caja sobre
los puntos previamente marcados, lleve a incubación a 28°C por 7 días.
2.- SIEMBRA EN TUBO
A.- Siembra en medio líquido:
Esterilice el asa redonda, destape el tubo estéril con el medio cultivo caldo nutritivo tomando
la tapa con el dedo meñique, nunca la coloque sobre la superficie de trabajo.
Enfríe el asa en el fondo del tubo, tape el tubo.
Tome la muestra de bacterias con asa redonda e introdúcela dentro del medio de cultivo
líquido y agítela, también se pueden sembrar las muestras liquidas con pipeta como en el
estudio de aguas, dejando caer la muestra de la pipeta lentamente por las paredes del tubo,
lleve a incubación a 37°C por 24-48h.

Figura 5. Siembra en medio líquido. Fuente: https://goo.gl/RiS33m

B.- Siembra en medio sólido:
Esterilice el asa recta, destape el tubo estéril con el medio de cultivo agar nutritivo tomando
la tapa con el meñique, nunca la coloque sobre la superficie de trabajo.
Enfríe el asa en el fondo del tubo y tápelo, tome la muestra con asa recta e introdúzcala
dentro del medio de cultivo sólido sin tocar el fondo del tubo. Retire el asa por el mismo
agujero que se originó tras la punción, flamee y cierre el tubo y lleve a incubación a 37°C
por 24-48h.
C.- Siembra mixta en medio de cultivo en pico de flauta:
Esterilice el asa, enfríe y tome un inoculo, abra el tubo de ensayo cerca al mechero, pique
el medio de cultivo inclinado (TSI) con el asa hasta el fondo y saque el asa hasta la
superficie de pico de flauta y sobre esta realice estrías. Lleve a incubación a 37°C por 24-
48h.

Figura 7. Siembra en medio semisólido. https://goo.gl/RiS33m

Recomendaciones
En cualquier siembra que usted realice debe marcar previamente las cajas Petri o los tubos
de manera clara, completa, legible, con la identificación respectiva y la fecha
Recuerde que las cajas Petri se incuban invertidas; si el inóculo no se ha adsorbido, espere
10 minutos, si este tiempo no es suficiente incube las cajas con la tapa hacia arriba por 30
minutos antes de invertirlas. Lo anterior, tiene como objetivo impedir que el agua de
condensación que pueda formarse en la tapa de la caja caiga sobre el medio dispersando
el crecimiento bacteriano y evitando la formación clara de las colonias.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
 Aquiahuatl, M.; Volke, T.; Prado, L.; Shirai, K.; Ramírez, F.; Salazar, M. 2012.
Manual de Prácticas de Laboratorio Microbiología General. Universidad Autónoma
Metropolitana. Unidad Iztapalapa. México.
 Benitez, N. 2002. Manual de Laboratorio de Microbiología. Universidad del Valle.
 Martinko, J.; Madigan, M.; Dunlap, P.; Clark, D. 2009. Brock, Biología de los
microorganismos. 12ª edición. Editorial Pearson.
 Rojas-Triviño, A. 2008. Identificación de estrategias de manejo de la Antracnosis
(Glomerella cingulata (Stonem.) Spauld & Schrenk., del guanábano (Annona
muricata L.). Tesis de Maestría, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Departamento
de Fitotecnia, Maestría en Fitopatología, Universidad de Caldas. Manizales. 177 p