Universidad de Carabobo

Facultad de Ciencias de la Salud

Escuela de Ciencias Biomédicas y Tecnológicas
Departamento de Ciencias Morfológicas y Forenses
Asignatura: Morfología Microscópica

Prof. Mayra Jiménez

 Unidad I. Introducción al estudio de la
Histología y Morfología Celular

Objetivo General: Especificar las herramientas que utiliza la histología

para el estudio ultraestructural de tejidos y de la célula como unidad
morfológica y funcional del organismo
Contenido: • Histología. Concepto y aplicaciones Científicas y clínicas.
• Tecnica Histológica. Etapas en la preparación de tejidos para su estudio al
microscopio óptico y electrónico.
• Histoquímica y Citoquímica
• Microscopía. Tipos de Microscopios y aplicación. Microscopio óptico:
partes y funcionamiento. Microscopio electrónico: de transmisión y de
barrido.
 ¿Qué es la Histología?
Etimológicamente: histo= tejido logos: estudio
⌂ Es la rama de la biología encargada del análisis
microscópico de la anatomía celular y tisular de los tejidos
biológicos.
⌂ Marcello Malpighi es reconocido como el fundador de la
Histología
⌂ Las primeras investigaciones histológicas se hicieron en el
siglo XVII gracias a la invención del microscopio óptico por
Antonio Van Leeuwenhoek
 ¿Qué es la Anatomía?
⌂ Es el estudio de la forma y la estructura de los organismos
vivos organizados
⌂ Anatomía Macroscópica: estudio de las estructuras
observables a simple vista
⌂ Anatomía Microscópica: es aquella que requiere de
auxiliares ópticos
¿Qué es la Citología? o biología celular es una disciplina
académica que se encarga del estudio de las células en
cuanto a lo que respecta a las propiedades, estructura,
funciones, organelos que contienen, su interacción con el
ambiente y su ciclo vital.
Célula: Unidad morfológica y funcional de todo ser vivo.
Es el elemento de menor tamaño que puede considerarse
vivo. Ejm:
Tejido: agrupación de células con la misma función
Órgano: unidad funcional mayor compuesto por distintos
tipos de tejido
Sistema de Órganos: conjunto de órganos con funciones
relacionadas
La Histología representa un nexo de unión entre la
bioquímica, la fisiología, la anatomía, la genética, la clínica
y la patología.
Obtención de la muestra de material humano: El material
humano puede provenir de tres fuentes: Las necropsias, las
biopsias y las piezas operadas.
De estas, sólo la primera puede darnos material normal; las
dos últimas proporcionan tejidos patológicos.

-Necropsias: son las piezas que se obtienen

de un cadáver. Para histología normal es
necesario que se trate de un cadáver fresco
y que no haya sido atacado por ninguna
lesión, por lo menos el órgano que se
quiere estudiar.
Biopsias: son trozos de tejido que se obtienen
de un sujeto con vida con el objeto de
estudiarlos al microscopio y efectuar un
diagnóstico histopatológico.

Piezas operadas: los tejidos que han sido extraídos de

las intervenciones quirúrgicas, generalmente tumores
u órganos inflamados, también pueden darnos material
de investigación.
Fundamentos Generales de la Preparación
Histológica de los tejidos
1.- Obtención de la muestra: mediante
extirpación de pequeños fragmentos de
tejido (humano o animal)
2.- Fijación: Su propósito es mantener
la morfología del tejido lo más parecida
posible a lo que ésta tenía antes de hacer
la extracción. (formaldehído al 37%)
Métodos: Químico → inmersión
Físico: congelación
La formalina no preserva todos los
componentes de la célula y los tejidos
Fundamentos Generales de la Preparación
Histológica de los tejidos
3.- Deshidratación: proceso por el cual se
elimina completamente el agua de la
muestra para que se pueda embeber
adecuadamente el tejido en aquellos
medios de inclusión que no sean
hidrosolubles. (Alcohol etilíco en
concentraciones crecientes)
4.- Aclaramiento: proceso por el cual se
consigue la sustitución del agente
deshidratante por una sustancia miscible
con el medio de inclusión. (Xilol)
5.- Infiltración (Impregnación) Proceso
que tiene por objeto “rellenar o infiltrar”
completamente la muestra histológica con
el medio que se va a usar para la
imbibición del tejido. (Baños sucesivos de
parafina fundida)
Fundamentos Generales de la Preparación
Histológica de los tejidos
6.- Encastramiento del tejido y
confección de los bloques: consiste en la
obtención de un bloque sólido de tejido
más medio de inclusión, mediante el
enfriamiento lento a 10-15ºC: El bloque
sólido se llama TACO
7.- Orientación de la pieza: para realizar
el corte del tejido se monta el taco en el
microtomo (aparato equipado con una hoja
de acero) y se obtienen cortes sumamente
delgados cuyo grosor para microscopía
óptica varía entre 5 – 10 micrómetros
1milímetro = 1000 micrómetros
 Fundamentos Generales de la Preparación
Histológica de los tejidos

8.- Montaje: los cortes se colocan sobre láminas

portaobjetos cubiertos previamente con capa de albúmina o
gelatina
9.- Aclaramiento: Extracción de la parafina con xilol
10.- Rehidratación: desplazar el xilol por agua. Alcohol
con agua en concentraciones decrecientes
11.- Tinción o Coloración: con colorantes histológicos en
su mayoría en solución acuosa
Fundamentos Generales de la Preparación Histológica de los tejidos

Reducción de la pieza Fijación de la muestra Introducción en cassette

de deshidratación

Deshidratación en Penetración de la parafina Barras de Leuckart

alcoholes sucesivos 56-58ºC
Fundamentos Generales de la Preparación Histológica de los tejidos

Fractura del taco para

cortar
Corte en microtomo

Bateria de coloración
H&E
Correlación Clínica: Biopsias por congelación
• Evaluar de inmediato el tejido obtenido
durante el acto quirúrgico y el diagnóstico
instantáneo determina el paso siguiente en
la cirugía
• Para identificar hallazgos intraoperatorios inesperados
• Para saber si se ha extirpado toda la masa patológica y si el borde
de la resección quirúrgica está libre de tejido enfermo
• Se congelan fragmentos de tejido usando anhídrido carbónico
comprimido o un líquido frío (isopentano) a una temp de -50ºC
• Corte del tejido congelado en un criostato (cámara refrigerada que
contiene un microtomo)
• Montaje del corte en un portaobjetos
• Tinción del corte: HE, azul de metileno y PAS
• El proceso puede tardar 10 minutos y el resultado se comunica al
cirujano inmediatamente
 Histoquímica y Citoquímica
Se ocupan de investigar la actividad química que tiene lugar en las células
y los tejidos. Se fundamentan en:
• La unión específica de un colorante
• El uso de anticuerpos marcados con un colorante fluorescente
• La actividad enzimática inherente de un elemento
constitutivo de las células

Composición química de las muestras histológicas

• La composición química de un tejido listo para una coloración de rutina
es difrente de la del tejido vivo
• Los componentes que perduran son moléculas grandes que no se
disuelven con facilidad con el fijador. Entre ellas: nucleoproteínas,
proteínas intracelulares del citoesqueleto, proteínas extracelulares,
complejos de fosfolípidos y proteínas (o carbohidratos) en las membranas.
 Composición química de las muestras histológicas
• Muchos componentes de los tejidos desaparecen durante la preparación
de los cortes teñidos con H-E
• Los solventes disuelven los lípidos neutros
• Las macromoléculas durante la fijación de rutina son:
-Glucógeno, Proteoglucanos y glucosaminoglucanos

• Los componentes solubles, los iones y las moléculas

pequeñas también desaparecen durante la preparación
de las muestras incluídas en parafina: glucosa, sodio,
cloro y susstancias similares

• Estos iones y pequeñas moléculas solubles no constituyen elementos

morfogénicos hísticos sino que participan en los procesos de síntesis o en
las reacciones celulares.
Coloraciones Utilizadas en Microscopía Óptica
Fundamento: Radica en la propiedad que
tienen todos los tejidos para incorporar y
fijar de modo variable diversas sustancias
Coloreadas. Según su afinidad tisular:
• Colorantes Básicos: poseen una carga global
positiva (catiónicos), reaccionan con los componentes aniónicos de las
células. Ej. Hematoxilina
• Colorantes Ácidos: poseen una carga global negativa (aniónicos),
reaccionan con los componentes catiónicos de las células. Ej. Eosina
• Colorantes neutros: su carga global es neutra. Propiedad de colorear
junta o separadamente diversas estructuras. Ej. Giemsa
• Colorantes metacromáticos: colorantes básicos. Producen tonos de
color totalmente distintos al que se espera por el colorante empleado
• Colorantes Indiferentes: no poseen carácter ácido, básico o salino
definido. Colorean mediante impregnación.
 Coloraciones Utilizadas en Microscopía Óptica
Hematoxilina-Eosina (HE): utiliza dos tipos de
colorantes. La hematoxilina que es un colorante básico,
colorea los componentes ácidos de la célula (núcleo) de
color morado; y la eosina que es un colorante ácido se
une a estructuras básicas de la célula (citoplasma)
otorgándole una tonalidad rosada

Impregnación con sales

Tinción Azul de Toluidina de plata
Tinción de Giemsa Colorante metacromático Coloración indiferente
Colorante neutro
Coloraciones Utilizadas en Microscopía Óptica
• Coloración con PAS (ácido periódico-Shiff): se usa
para determinar la presencia de macromoléculas ricas
en glúcidos como glucógeno, glucoproteínas y
glucosaminoglucanos. Se observa color fucsia al microscopio óptico.

• Coloración con Azán: (tricrómica): se obtiene tres colores

diferentes: Azul oscuro en los núcleos de la célula; rojo en el
músculo, queratina y citoplasma celular, y azul claro en el
mucinógeno y colágeno, o sea en el tejido conjuntivo

• Coloración con metales: actúan impregnando a ciertos

componentes celulares. Se usan para demostrar aparato
de golgi, y las neurofibrillas.
Coloraciones Utilizadas en Microscopía Óptica
• Coloración con hematoxilina férrica: útil para estudiar detalles
celulares finos. Ej. Las fibras elásticas y las mitocondrias
presentes en el citoplasma de ciertas células

• Tricrómico de Cajal y Gallego: implica

el uso de tres colorantes. Para demostración
diferencial y selectiva de las fibras colágenas y del músculo.

• La orceína y la fucsina resorcina: son colorantes para fibras

elásticas. Se observan entre bordeau y castaño oscuro.

• Carmín de Best: para tinción nuclear y detección de

glucógeno
Elementos celulares que presentan basofilia, es decir
afinidad por los colorantes ácidos y se ven de color
morado al microscopio óptico
- Heterocromatina y nucléolos del núcleo
- Algunos componentes citoplasmáticos
- Material extracelular

Elementos celulares que presentan acidofilia, es decir

afinidad por los colorantes básicos y se ven de color
rosado al microscopio óptico
-La mayoría de los filamentos citoplasmáticos
-La mayoría de los componentes membranosos
intracelulares
-La mayoría de las fibras extracelulares
 RESUMEN
- Que es la Histología. Que es la Anatomía: Anatomía Macroscópica y
Anatomía Microscópica. Que es la Citología. Célula, Tejido, Órgano, Sistema.
Obtención de la muestra de material humano: necropsia, biopsia, piezas
operadas.
-Preparación Histológica de los tejidos: Obtención de la muestra, fijación,
deshidratación, aclaramiento, impregnación, confección de bloques, Cortes,
Montaje, aclaramiento, rehidratación, coloración.
-Biopsias por congelación
-Fundamentos de la Histoquímica y Citoquímica
-Composición química de las muestras histológicas
-Coloraciones Utilizadas en Microscopía Óptica: colorantes básicos, ácidos,
neutros, metacromáticos e indiferentes.
- Coloración hematoxilina-eosina, Giemsa, azul te toluidina, sales de plata,
PAS, Azan, hematoxilina férrica, cajal gallego, orceína, fucsina resorcina…
Sustancias que presentan basofilia, es decir afinidad por los colorantes ácidos
y se ven de color morado al microscopio óptico
Sustancias que presentan acidofilia, es decir afinidad por los colorantes
básicos y se ven de color rosado al microscopio óptico
 MICROSCOPÍA
“El conocimiento detallado moderno de la arquitectura celular se basa
sobre varios tipos de observación por diferentes tipos de microscopios”
¿Qué es un Microscopio?
• Es un Instrumento que aumenta el tamaño de una imagen y
permite ver mayores detalles.
• EL Microscopio más sencillo: lupa, lentes de corrección

Campo claro Transmisión

M. Óptico
Campo oscuro M. Electrónico (MET)
compuesto Contraste de fase Barrido (MEB)
Fluorescencia
Luz U.V.
 La Luz como onda
En una onda electromagnética, por ejemplo, el campo
eléctrico cambia en intensidad de manera cíclica así:

• Cada ciclo de la onda se repite en intervalos separados por

una longitud de onda
• La frecuencia mide el número de estos ciclos que ocurren
cada segundo.
• En la luz, la longitud de onda determina el color de la luz (por
ejemplo la longitud de onda correspondiente al color verde es de
550 nanómetros)

EL ESPECTRO ÓPTICO
La luz blanca está compuesta de ondas de diversas frecuencias.
Cuando un rayo de luz blanca pasa por un prisma se separa en sus
componentes de acuerdo a la longitud de onda así:
d= 0.61λ/An
 MICROSCOPÍA
PODER DE RESOLUCIÓN
AUMENTO
Es la capacidad de producir
imágenes separadas de objetos que
Es la relación entre el
están muy cerca uno de otro.
tamaño de la imagen y el del
Numéricamente equivale a d o
objeto en medidas lineales
distancia mínima entre dos objetos
El Aumento de un distinguibles.
microscopio es:
Ojo humano: d= 0.2 mm
Am= Alente objetivo x ALente ocular
Depende de:
Ej: Ocular: 10X •Apertura numérica (An) del
Objetivo: 40X sistema óptico (objetivo y
condensador)
¿Cuanto es el aumento del
microscopio? •Longitud de onda de la luz
incidente (λ)
 Microscopio óptico de Campo Claro
Usa Luz Visible. D = 0.2 um.(micrométro)
La luz atraviesa el objeto examinado y el
objetivo capta la luz directa proveniente
de la fuente luminosa
Utilidad: Académico, Diagnóstico clínico
(Lab. Bioanálisis, Patológico), Investigación.
Componentes Principales:
- Fuente Luminosa
- Lente Condensadora: para enfocar el haz de luz a la altura de la
muestra
- Platina: sobre la que se coloca la muestra.
- Lente Objetivo: para recoger la luz que ha atravesado la muestra
- Lente ocular: a través de la cual se puede examinar directamente la
imagen formada por la lente objetivo
 MICROSCOPÍA
PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO

Mecánicas

•Cabezal
•Brazo
•Revolver
•Platina
•Carro Ópticas

•Tornillos •Lámpara
macrométrico y
micrométrico •Condensador
/Diafragma
•Base
•Objetivos
•Oculares
 Examen de un Preparado Histológico con el
Microscopio Óptico
- Los órganos son tridimensionales, mientras que
los cortes histológicos tienen sólo dos dimensiones
-Al examinar un corte hay que
reconstruir mentalmente la organización
de la estructura y sus partes constitutivas
- Los artefactos son elementos que
representan un error en el proceso
de preparación (partículas de polvo,
fragmentos de vidrio, agregados
de colorante, filamentos de gasa etc.)
 OTROS SISTEMAS ÓPTICOS
• Microscopio de Contraste de Fase: Aprovecha las
pequeñas diferencias en el índice de refracción que hay
en diferentes partes de una muestra de células o tejidos.
- Las partes oscuras corresponden a las regiones
densas y las partes claras corresponde a las regiones
menos densas
Utilidad: permite observar las células
en acción y estudiar los movimientos
implicados en procesos como la mitosis
o la migración celular. Estudiar cortes
semifinos no teñidos
 Microscopio de Campo Oscuro
-La lente objetivo no capta la luz directa proveniente de la
fuente luminosa
-El principio se consigue con un condensador específico
que permite transmitir la luz de forma circular, dejando el
centro oscuro.
- Con esto se logra que el fondo de la muestra aparezca
negro y los especimenes brillantes.
-Utilidad: En la práctica clínica para
la detección de cristales en la orina
y la identificación de espiroquetas
 Microscopio de Fluorescencia
-Aprovecha la capacidad de algunas moléculas de fluorescer
bajo la luz UV
-Utilidad: Detección de moléculas con autofluorescencia
como la vitamina A y algunos neurotransmisores
(fluorescencia natural)
- En técnicas de inmunocitoquímica (fluorescencia
secundaria),
- En la investigación del trayecto de fibras nerviosas
 Microscopio de Luz ultravioleta (UV)
-Utiliza lentes de cuarzo con una fuente de luz ultravioleta.
- La imagen depende de la absorción de la luz UV por las
moléculas de la muestra.
-La muestra no puede inspeccionarse directamente a través
del ocular porque la luz UV no es visible y lesiona el ojo.

Utilidad: Detectar ácidos nucleicos, en

especial las purinas y pirimidinas. Detectar
proteínas que tienen ciertos aminoácidos
en la práctica clínica para evaluar el grado
de ploidia en cortes de tumores
 MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
Representa un gran adelanto respecto a la
microscopía óptica ya que:
• La longitud de onda del haz de electrones es
2000 veces menor que la del haz de luz, por lo
que aumenta la resolución por un factor de 10³
• Los electrones no pueden atravesar el vidrio,
por lo que deben remplazarse por bobinas o
lentes electromagnéticas
Existen dos tipos: MET y el MEB
 Microscopio Electrónico de Transmisión

-Utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz

-La fuente es un filamento de tungsteno
calentado que emite electrones
-El haz de electrones atraviesa una
serie de lentes electromagnéticas que cumplen
la misma función que las lentes cristal de un
microscopio óptico
-La imagen final se observa en una pantalla
fosforescente
 Microscopio electrónico de barrido

- El haz de electrones no atraviesa la muestra sino que explora

(barre) su superficie.
- Forma una imagen de tipo tridimensional en un tubo de rayos
catódicos de alta resolución.
 RESUMEN
-Qué es un microscopio.
-Microscopio compuesto: campo claro, campo oscuro, contraste
de fase, fluorescencia, ultravioleta.
-Longitud de onda, frecuencia, espectro óptico
-Aumento de un microscopio, poder de resolución
-Microscopio óptico de campo claro: utilidad, componentes
principales, partes mecánicas y partes ópticas
-Examen de un preparado histológico en un microscopio óptico
-Microscopio de contrates de fase: fundamento, utilidad
-Microscopio de campo oscuro: fundamento, utilidad
-Microscopio de fluorescencia: fundamento, utilidad
-Microscopio de luz ultravioleta: fundamento, utilidad
-Microscopio Electrónico: de transmisión y de barrido