Establecimiento y multiplicación in vitro de mora de castilla

(Rubus glaucus 
     
meristemáticos
Stablishment and in vitro multiplication of thornless blackberry (Rubus glaucus
Benth.) by shoot apical meristems

Alina Katil Sigarroa-Rieche†, y Claudia Lucía García-Delgado*

Facultad de Ciencias Agrarias y del Ambiente, Universidad Francisco de Paula Santander, Cúcuta, Norte de Santander, Colombia.
*Autor para correspondencia: clgardel23@gmail.com; †asigarroa@ufps.edu.co

Rec.: 10.05.11 Acept.: 23.12.11

Resumen
 

 de micropropagación de plantas de mora (Rubus glaucus) de la variedad sin espi-
nas, a partir de ápices meristemáticos. En la fase de establecimiento se evaluó un protocolo de desin-
 


 


   !"

+ hipoclorito 3% con dos tiempos de exposición diferentes: T1 por 5 min y T2#
$&

   '
/ /  

 

6 
 89#9"$</

desarrolladas se efectuó la multiplicación en los medios de cultivo M1, M3 y M4. Ambos tratamientos
de desinfección resultaron efectivos alcanzando 100% de desinfección de los explantes con cada uno de
$=/ /   
  
 -
'

 > 


?B$D!
M1 y 66.6% para M2. El análisis de varianza (Anova) y la 
H
I
  

9# 

  
'
>

 J 
  
7.5 brotes/plántula y una altura promedio de 1.95 cm.
Palabras clave: Cultivo de meristemas, cultivo in vitro, micropropagación, mora sin espinas, Rubus
glaucus.

Abstract
O    
I   propagation in a thornless variety of blackberry (Rubus glaucus)
from shoot apical meristems. In the establishment phase, we evaluated a disinfection protocol: soapy
solution (commercial detergent and water) for 5 minutes + 70% alcohol for 2 minutes + 3% hypochlo-
rite with two different exposure times: T1 for 5 minutes and T2 for 10 minutes. When the microcuttings
were disinfected, the meristematic shoots were removed and established in vitro in a completely ran-
dom design to evaluate two cultivation mediums: M1 and M2. From the seedlings developed, the mul-
tiplication was performed, which tested three cultivation mediums: M1, M3 and M4. Both disinfection
treatments were effective achieving 100% disinfection of explants in each of them. Meristematic shoot


X
  

I
'

after six weeks of cultivation with rates of germination of 83.4% for M1 and 66.6% for M2. The analysis

Z<[\]<^

X_`Z=&^>X 

the M1 medium favored better growth and development of the explant to obtain a multiplication coef-
J 
$


#$j $
Key words: In vitro cultivation, meristems, micropropagation, Rubus glaucus, thornless blackberry.

347
ACTA AGRONÓMICA. 60 (4) 2011, p 347-354

Introducción <
‚
 < Zƒ9<‚<^>
efectuó un reconocimiento y se analizaron las
= ZRubus glaucus Benth.) es
zonas productoras de mora del municipio de
uno de los frutales más conocidos y cultivados
= >[

$|


|I6
-
de las plantas madre se seleccionaron culti-
cultores y constituye una de las principales
J
9
 

fuentes de ingresos, generación de empleo
San Bernardo de Balsa a 1.850 m.s.n.m. El
rural, oferta de alimento e insumo para la
material vegetal fue recolectado en las pri-
agroindustria (Barrero, 2009). Debido a su
meras horas del día (06:00 a.m.) a partir de

>   ""   I 
plantas con crecimiento activo, desarrollo
área cultivada aumente en 10,000 ha nuevas
vigoroso y sin signos de enfermedad visible.
con una producción de 104,265 t de fruta
Una vez recolectado se envolvió en papel
cosechada (Tafur et ál., 2006). A pesar de
   
   
 
 
I

>
 =
cultivo presenta grandes limitaciones como la
de Biotecnología Vegetal de la Universidad

 J > 
-
Francisco de Paula Santander, municipio de
troducción de nuevas variedades y problemas
=…>[

$
J
 
 

propagación asexual por acodos y estacas, lo Fase de establecimiento
I 

-
medades (Avilán et ál., 1989; Angulo, 2003, Del material seleccionado en campo se extra-
~>"j^$=  
 
     #   
> 

de la mora sin espinas es cada vez mayor 
'>I




debido a la alta capacidad de producción de solución de 150 mg/lt de ácido ascórbico (antio-
fruta, relacionada con un mayor número de '
^$
/> 
 
ramas productoras y un macollamiento entre de desinfección con dos tiempos de exposición
15% y 20% superior a la mora tradicional con Z|#^$ƒ
 


espinas (Bernal y Díaz, 2006). tiempos de exposición a cada desinfectante, se
En Colombia se ha incrementado el uso  

 

de la micropropagación de meristemos en  
        

 
  
     una solución de 150 mg/lt de ácido ascórbico
$   > /   para su conservación, mientras se procedía a
 
 
 €J  la extracción y siembra de los ápices meris-
libres de patógenos, garantiza alta calidad, / $  = ' 
   /  
mayor uniformidad y semillas limpias (Ma- realizó con la ayuda de un estereoscopio y la
rulanda et ál.>"^$= incubación se hizo a 20 °C ± 2 °C y un fotope-
investigaciones con plantas propagadas por riodo de 16 h luz/8 oscuridad.
acodo tradicional y por micropropagación,
Cuadro 1. Tratamientos de desinfección evaluados.

 I
- Componente T1 T2
das in vitro por este último sistema producen (min) (min)
/6>  


5 5
y homogeneidad (Barrero, 2009). (detergente comercial + agua)
Alcohol al 70% 2 2


Hipoclorito de sodio 3% 5 10

     
   
castilla (Rubus glaucus) variedad sin espinas,
mediante el cultivo de ápices meristemáticos. =  
     
evaluados (Cuadro 2) se hizo de acuerdo con
Materiales y métodos los resultados previos obtenidos por Ballesta
(2008). En el experimento se emplearon 30
Obtención del material vegetal ápices meristemáticos (unidad experimental)
Para la recolección del material vegetal, con por tratamiento, con tres repeticiones cada
la colaboración de la Unidad Municipal de 


6I$


348
 ESTABLECIMIENTO Y MULTIPLICACIÓN IN VITRO DE MORA DE CASTILLA (RUBUS GLAUCUS BENTH.)
VARIEDAD SIN ESPINAS, MEDIANTE ÁPICES MERISTEMÁTICOS

fase de seis semanas de duración, se midieron Cuadro 3. Medios de cultivo evaluados en la fase multiplicación

Z ^>
H- de microestacas de mora variedad sin espinas.


 
>


 
 Componente Medio Medio Medio
(mg/lt) M1 M3 M4

 
 


$
Sales MS 100% 100% 100%
Myo-inositol 100 100 100
Cuadro 2. Medios de cultivo evaluados en la fase
Tiamina 1 1 1
establecimiento de ápices meristemáticos de
=Š €
 50 50 50
mora sin espinas.
Sacarosa 30000 30000 30000
Componente Medio Medio
Phytagel 3000 3000 3000
(mg/lt) M1 M2
6 BAP 1 1.5 1.5
Sales MS 100% 100% AG3 0.5 — —
Myo-inositol 100 100 AIA — 0.75 —
Tiamina 1 1 AIB — — 0.75
pH 6 6 6
=Š €
 50 50
Fuente: <[Š<Z"j^Ž
Sacarosa 30000 30000 Marulanda et ál. (2000), y Erig et ál. (2002).
Agar 6000 6000
6 BAP 1 1 Resultados y discusión
AG3 0.5 —
Fase de establecimiento
AIA — 0.5
pH 6 6
= 
/ /  
explantes primarios permitió el estableci-

   
  > 

Fase de multiplicación
ambos tratamientos se logró un 100% de
En esta fase se utilizaron plántulas desarro- desinfección, pues no se manifestó contami-
lladas en el medio de cultivo M1 de la fase nación endógena en ninguno de los explantes.
 
  I 

 
 En las condiciones de este mismo labo-
conformación general adecuada con promedio ratorio, Ballesta (2008) utilizando el mismo
de altura de 1.2 cm, desarrollo foliar abun- protocolo de desinfección, pero tomando como
dante y buen alargamiento de entrenudos; explantes microestacas de 7 mm, observó
por el contrario, las plántulas en el medio M2 niveles de contaminación endógena hasta del
presentaban una altura < 0.6 cm y escaso !$  = 
  I   
desarrollo foliar. El proceso de multiplicación ápices meristemáticos como explantes permi-

 

 te reducir la contaminación endógena hasta

   J

 
 - un nivel mínimo, sin necesidad de emplear
tacas con una yema axilar y longitud entre protocolos más agresivos para la desinfección
0.3 y 0.5 cm. del material vegetal.
En esta fase se evaluaron la longitud El efecto de los medios de cultivo sobre
Z ^ J 
  
Z
H- el desarrollo de los explantes durante la fase
/
J
Œ
H'
 de establecimiento se observa en el Cuadro
establecidos) en tres medios de cultivo adap- 4. Se encontraron diferencias (P < 0.05) en
  [Š<   Z"j^Ž 

H

Marulanda et ál. (2000), y Erig et ál. (2002) cultivo, observándose un mayor crecimiento
(Cuadro 3). y desarrollo de ápices meristemáticos en el
Durante cuatro semanas se evaluó la 9#>I 
-
formación de callo de los explantes en cada ción de plántulas antes del inicio de la fase
uno de los medios de cultivo y los resultados 9  
Z_#^$96ˆZ"‰^
obtenidos se analizaron siguiendo el modelo 


I
 
inferencial, completamente al azar, utili- de mora de castilla (R. glaucus) la utiliza-
zando el programa Statgraphics Centurion ción de AG3
 
]Z"j^
/
 cuando se aplicó en combinación con BAP,
comparación de medias mediante la prueba 


 

de F (P < 0.05).

349
ACTA AGRONÓMICA. 60 (4) 2011, p 347-354

Cuadro 4.   


H
 
/ 
/ 

>
$
Medios de cultivo Crecimiento promedio Fenolización Porcentaje de
Longitud (cm) Hojas (no.) (+) (-) prendimiento (%)
M1 1.21 a* 5.58 a 16.6% 83.4% 83.4
(6BAP 1 mg/lt; AG3 0.5 mg/lt)

M2 0.57 b 2.45 b 6.6% 93.4% 66.6

(6BAP 1 mg/lt; AIA 0.5 mg/lt)
’… 


 

J H
_Z…“$^$

a b
Foto 1. Plántulas de mora sin espinas de seis semanas de crecimiento. (a) Plántula desarrollada en M1. (b) Plántula desarrollada
en M2.

y propágulos para la multiplicación masiva.  / 

  I  /  
  
Marulanda et ál. (2000) emplearon un medio (AIA) para el crecimiento de las plántulas.
de cultivo con BAP (1 mg/lt) y AG3 (1mg/lt) = 
 
‰~<…Z#Œ^ 


para el establecimiento in vitro de plantas de concentración no tóxica de AG3 (0.5 mg/lt)
R. glaucus, y obtuvieron explantes con buen permitió obtener plántulas de mayor altura
desarrollo y un promedio de tres brotes en  
Z_"^$
cada uno, los cuales fueron transferidos con El fenómeno de fenolización se presentó
'  
$ - 

 
-
>
/>I- dios de cultivo (Cuadro 4). Esto se explica
dores de crecimiento así como su combinación tanto por el uso de agentes antioxidantes (áci-
en un medio de cultivo, son necesarios para la   =Š €
^


obtención de plántulas viables en la iniciación y medio de cultivo, como por la ubicación del
de un proceso de micropropagación. '
>I/ / 
En ambos medios de cultivo se presentó está protegido por los primordios foliares y
desarrollo de los ápices meristemáticos por la no es expuesto directamente al agente desin-

 I

‰~<…>
 fectante, adicionalmente el procedimiento de
I
 
 >
> extracción no implica la realización intensa
mayor elongación en el medio M1 se manifestó  I 
 
 -
por la presencia de AG3. Fisiológicamente las 
 $<Z"j^6I
giberelinas inciden en el alargamiento celular, los procesos de oxidación son causados prin-
principalmente de entrenudos e incrementan cipalmente por el efecto abrasivo del agente
la producción de auxinas endógenas, según desinfectante aplicado durante la asepsia del
Torres et ál. (1996) su concentración óptima '
> I
se halla en el rango 0.1 – 1 ppm. Debido a composición del medio de cultivo, resaltando
I  
R. glaucus ocurre prin- como principales sustancias antioxidantes el
cipalmente en los entrenudos, el AG3 mostró /   =Š €
$

350
 ESTABLECIMIENTO Y MULTIPLICACIÓN IN VITRO DE MORA DE CASTILLA (RUBUS GLAUCUS BENTH.)
VARIEDAD SIN ESPINAS, MEDIANTE ÁPICES MERISTEMÁTICOS

Primera semana, 0.25 cm Segunda semana, 0.5 cm

Tercera semana, 0.8 cm Cuarta semana, 0.95 cm

Quinta semana, 1.15 cm Sexta semana, 1.2 cm

Foto 2. Evolución del crecimiento del ápice meristemático en medio de cultivo M1, el más adecuado para
la fase establecimiento de plántulas de mora sin espinas.

351
ACTA AGRONÓMICA. 60 (4) 2011, p 347-354

Fase de multiplicación 5.87 cm en medio de cultivo con 2 mg/lt de

& 
  
> BA y 0.5 mg/lt de GA3, pero con menor nú-
las plántulas generadas en el medio M1 al- mero de brotes.
canzaron mayores longitudes y número de Con los medios de cultivo M3 y M4 no se
I9B9DZ…“$#^Z|- encontraron resultados satisfactorios como
^$=
9# 
 
 J 
-
se debieron a la combinación hormonal 6BAP cación y de longitud de las plántulas, bási-
+ AG3, en contraste con los medios M3 y M4, camente por las combinaciones hormonales
I/‰~<…> 



 I

  '
$   et ál. (2002) al
AIA del grupo de las auxinas para el M3, y evaluar 6BAP y AIB en la multiplicación in
ácido indolbutírico (AIB) para el M4. Villa vitro de frambuesa (R. idaeus^
I
et ál. (2005) al evaluar el efecto de 6BAP en en medios de cultivo con niveles crecientes
diferentes concentraciones sobre la multipli- de BAP y concentraciones variables de AIB,
cación in vitro de Mora (Rubus sp.) hallaron se presenta reducción en el promedio de lon-
el mayor número de brotes (3.99) en un medio >6
I
de cultivo con 1 mg/lt de BAP y concluyeron <~ ' 

 I

>
I  

-  
J 

-
ponsable de la elongación de los tallos. Por ción y crecimiento en forma de roseta de las
[Š<Z"j^ /
>  € I


en estudios de micropropagación de mora sin estudio se evidenció en los medios de cultivo
espinas, encontraron una altura máxima de M3 y M4 (Foto 3).

Cuadro 5. Efecto de los medios de cultivo en fase multiplicación de microestacas de mora sin espinas,
 
$
Medios de Crecimiento promedio  
cultivo longitud multiplicación
(cm) (no. de brotes)
M1 1.95 a* 7.5
(6BAP 1 mg/lt; AG3 0.5 mg/lt)

M3 0.78 b 1.1
(6BAP 1.5 mg/lt; AIA 0.75 mg/lt)

M4 0.83 b 1.1
(6BAP 1.5 mg/lt; AIB 0.75 mg/lt)
’… 


 

J H
_Z…“$^$

Foto 3. Crecimiento de R. glaucus sin espinas en los medios evaluados. &I 8  

9#>9B
y M4, respectivamente.

352
 ESTABLECIMIENTO Y MULTIPLICACIÓN IN VITRO DE MORA DE CASTILLA (RUBUS GLAUCUS BENTH.)
VARIEDAD SIN ESPINAS, MEDIANTE ÁPICES MERISTEMÁTICOS

En fase de multiplicación la formación t Para un proceso de micropropagación de

de callos se presentó en todos los medios R. glaucus sin espinas, la combinación
de cultivo, pero con diferentes intensidades. 
 I

Œ
 -
En los medios M3 y M4 la mayoría de las  
  
J 

plántulas desarrollaron callos (81% y 84%,  
 
 I

Œ
respectivamente); no obstante, en M1 fue auxina.
 
 

  t = €    
Z#!^>  I 

 I  promisoria para la obtención de plántulas
combinación hormonal en el M1 es la más 

>

 
adecuada. Marulanda et ál.Z"^- micropropagación.
ron con dos medios de cultivo compuestos:
1.5 mg./lt BA + 1.5 mg/lt AG3, y 2 mg/ Referencias
lt BA + 2 mg/lt AG3 


I
Azofeifa, Á. 2009. Problemas de oxidación y oscure-


 I

~<
cimiento de explantes cultivados In vitro. Agron.



J  - Mesoam. 20(1):153 - 175.
ción de callos. Este fenómeno no es deseable ~> =$ "j$ |  
>  
 
en un proceso de micropropagación masiva producción de material limpio de mora con alto
 I 
     
  valor agregado. Corporación Colombiana de In-

 
Z…et ál., 1998). vestigación Agropecuaria (Corpoica). Regional 1.
=  
 
 
 I  Cundinamarca. p. 5.
posible disminuir la concentración de BA al Ballesta, M. 2008. Establecimiento y multiplicación
menos a 1 mg/lt para reducir la formación in vitro de mora de castilla (Rubus glaucus) en el
 >



 J 
 =  ~
€ ]   ƒ
-
de multiplicación y aceptable longitud en versidad Francisco de Paula Santander. Tesis de
las plántulas. grado. Universidad Francisco de Paula Santander.
Cúcuta, Norte de Santander. 75 p.
Bernal, J. y Díaz, C. 2006. Materiales locales y me-
Conclusiones />
t  /  /   
  I por los agricultores y cultivares, disponibles para
resulta eficaz como explante primario su evaluación en Colombia. Corporación Colom-


 
< Z| ^Š=
para iniciar un proceso de micropropaga-
Selva. Bol. Div. no. 7. p. 10 - 13.



$ 
 > <Ž ˆ> <$Ž  = > ”$ ""$ ‰Š
-
división permiten un rápido crecimiento, nopurina e ácido indolbutírico na multiplicação
siempre y cuando se encuentren en el in vitro da amoreira preta (Rubus idaeus=$^ $
medio de cultivo apropiado; además, fa- Tupy. Ciência Rural 32(5):765 - 770.
cilita la obtención de plántulas libres de 9
> 9$Ž |
> 9$Ž  ]
 $ "$
contaminantes endógenos para la fase de Establecimiento y multiplicación in vitro de plan-
multiplicación. tas seleccionadas de Rubus glaucus Benth. para
t = 
 
 
  
 
 el departamento de Risaralda (Colombia). Actual.
(agua + detergente comercial), cinco mi- Biol. 22(73):121 - 129.
nutos; alcohol al 70% durante dos minu- 96>$ˆ>$"‰$ 
tos e hipoclorito de sodio al 3% (cinco o   
>=Š €
/   

cultivo in vitro de mora de Castilla (Rubus glaucus
diez minutos) permite un 100% de des-
Benth.). Tesis de grado. Universidad Nacional
infección de los ápices meristemáticos. Agraria, Managua, Nicaragua. 27 p.
t Para las fases establecimiento y multi- [Š<> –$  > —$ "j$ 9 -
  
>  pagation of thornless trailing blackberry (Rubus
M1 (6 benzilaminopurina 6BAP 1 mg/lt sp.) by axillary bud explants. Aust. J. Crop Sci.
/  <”3$Œ^>I 3(4):191 - 194.
permite aumentar progresivamente la …> –$Ž <> —$Ž ” > ˆ$Ž –
> $Ž 
longitud, el desarrollo foliar y el número \
$> …$ #jj?$ … 
   
-
de brotes. tica de plantas por biotecnología. Santa Clara,

353
ACTA AGRONÓMICA. 60 (4) 2011, p 347-354

Cuba. Instituto de biotecnología de las plantas. Torres, A. C.; Teixeira, A.; y Campos, M. 1996. Medio
p. 105 - 116. de cultivo. Centro Brasileiro Argentino de Biotec-
 |

$"j$]
]$…
 nología. Brasilia. 21 p.
Technologies, Inc. Warrenton, U.S.A. ]>_$Ž”><$Ž>=.Ž…I>9$"$
Tafur, R.; Toro, J.; Perfetti, J.; Ruiz, D.; y Morales, J. Multiplicação In vitro da amoreira-preta ‘Ebano’
2006. Plan Frutícola Nacional (PFN). Ministerio de em diferentes concentrações de meio MS e BAP.
Agricultura y Desarrollo Rural, Fondo Nacional de Ciência e Agrotecnologia 29(3):582 - 589.
Fomento Hortofrutícola, Asohofrucol, SAG. 43 p.

354