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Aporte nutricional de las macromoléculas
Jose Luis Camargo ∙ Sebastián Martínez
Abstract
Milk is one of the most important and
basic foods that makes up our diet, due to the
high proportion between its calorie contents
and the vitamins and nutrients that are found
in it. One of the most important
characteristics of milk is the abundance of
casein, a high biological value protein
(meaning it has essential amino acids in a
proportion similar to that needed by the body)
which makes up to 82% of total protein in this
food, and is made of up to 200 amino acids.
This paper reviews one of the
methods of extraction used to isolate casein
from milk, consisting in adding an acid, like
acetic acid, until reaching a specific ph at
which casein has a neutral charge (isoelectric
point), making it easier for it to precipitate
because of the increase in its particles size;
this procedure was followed by a Biuret assay
to determine the concentration of casein in
Palabras clave
Punto isoeléctrico ∙ pH ∙ proteína∙
Electroforesis SDS-page ∙ centrifugación.
Resumen
La leche es una de las comidas más
importantes que hacen parte de nuestra dieta,
debido a la alta cantidad de vitaminas y
nutrientes que provee respecto a su contenido
calórico (Fernández & Martínez, 2015). Una
de las características que más resaltan de la
different solutions, and by an electrophoresis
SDS-page to identify the types of protein
obtained in different parts of the procedure.
This paper also reviews the
spectrophotometric method utilized to
calculate the isoelectric point of casein, by
adding a solution with the protein of study to
a series of pH known solutions.
The purpose of this experiment, is to
understand the principles and functioning of
electrophoresis SDS-page, and to quantify
the amount of casein found in a sample of
milk, using spectrophotometry as the main
method.
It’s hoped that this experiment and its
results can inform any interested person
about the basics of spectrophotometry and
electrophoresis SDS-page, the principal
characteristics of proteins found in cow milk,
and the amount of casein found in it.
leche es su alto contenido de caseína, la cual
es una proteína de alto valor biológico,
significando que provee al organismo de
aminoácidos esenciales en proporciones
similares a las requeridas por el cuerpo
("Protein and aminoacid requirements in
human nutrition", 2007), al estar compuesta
por más de 200 aminoacidos y corresponder
a cerca del 82% de la proteína total de la leche
(Zimmermann & Ruiz, 2017).
2
Este informe repasa uno de los
métodos utilizados para extraer la caseína de
la leche, mediante la adición de un ácido,
como lo es el ácido acético hasta alcanzar un
pH especifico (pH=4.6), en el cual la caseína
posee carga neutra (punto isoeléctrico)
haciendo más fácil su precipitación debido al
aumento en el tamaño de las partículas; este
procedimiento fue seguido por un ensayo de
Biuret y una electroforesis SDS-page,
mediante las cuales se determinó la
concentración de caseína en diferentes
soluciones problema y se estableció los tipos
de proteína presentes en las muestras en
diferentes partes del procedimiento; de igual
manera, este informe hace un recuento del
método electroforético utilizado para
determinar el punto isoeléctrico de una
proteína, mediante la medición de la
absorbancia a varias muestras, cada una de
las cuales está compuesta por una solución de
la proteína y una solución de pH conocido.
El Objetivo principal de este
experimento es entender los principios y el
funcionamiento de las técnicas utilizadas,
como lo es la electroforesis SDS-page y el
método de Biuret, al igual que otros métodos
experimentales secundarios útiles a la hora de
extraer y/o cuantificar una o más proteínas,
como lo es la espectrofotometría.
Se espera que este experimento y sus
resultados puedan informar a cualquier
persona interesada sobre los esquemas
básicos de la espectrofotometría, la
electroforesis SDS-page, el método de
cuantificación proteica de Biuret y de las
características principales de las proteínas
halladas en la leche, al igual que de la
composición de la caseína.
Introducción
La leche es considerada un alimento
de alto valor biológico, debido a la amplia
variedad de nutrientes como las proteínas, los
lípidos, glicídios, minerales y vitaminas que
posee.
La leche de vaca contiene
aproximadamente un 3,5% de proteína, que
tiene como función natural, proporcionar a
los mamíferos, aminoácidos esenciales
necesarios para el desarrollo; además, poseen
propiedades de fundamental importancia en
las características de muchos productos
lácteos, pues determinan el rendimiento en la
fabricación de quesos y otros productos,
además de sus beneficios nutricionales y
propiedades estructurales y físico-químicas
únicas (Ye, 2011).
Las proteínas, entre los componentes
de la leche, son las de mayor valor para la
industrialización, debido a su amplio uso en
industrias de diferentes campos. La eficiencia
con que se puede obtener la proteína, depente
de gran manera de su fuente de orginen y de
la materia prima utilizada (parámetros de
sanidad del rebaño, como: conteo de células
somáticas e higiene, y recuento bacteriano
total).
Los tratamientos a altas temperaturas
a los que se somete la leche de manera
industrial son posibles debido a la alta
estabilidad térmica de algunas de sus
proteínas, como lo es la caseína, (Fox &
Mcsweeney, 1998). Sin embargo, la
hidrólisis enzimática de la k-caseína debido a
ciertas condiciones de pH está entre los
principales factores que afectan la estabilidad
coloidal de las micelas de caseína (O'Connell,
2006).
3
Las proteínas lácteas representan la
base estructural de los productos lácteos
como el queso y el yogur, que en gran medida
deben sus atributos estructurales y
sensoriales a la formación de redes de
proteínas por calor, pH, modificación
enzimática o una combinación de éstas
(Farrell, 1999)
Las proteínas de la leche son
vehículos naturales, que suministran
micronutrientes esenciales (calcio y fósforo)
y aminoácidos, como componentes del
sistema inmune (inmunoglobulinas y
lactoferrina) para el recién nacido (LIVNEY,
2010); estas proteínas se distribuyen siendo
el 80% de caseína y el 20% de proteínas del
suero (porcentaje que puede variar en función
de la raza de los animales, de la ración
suministrada y del país de origen) Las
principales proteínas de la leche se
encuentran detalladas en la Tabla 1
Tabla 1. Principales proteínas presentes en la leche
(LIVNEY,2010)
Las proteínas presentes en el suero,
son un grupo de proteínas que permanecen
solubles después de la precipitación de la
caseína a pH 4,6 y temperatura de 20 ° C al
tener un fuerte carácter hidrofilico
(FARRELL JR, 2006). La mayoría de estas
proteínas son globulares de cadenas
peptídicas densamente dobladas
(PHADUNGATH, 2005). Los dos
componentes principales de las proteínas del
suero son α-lactalbúmina y β-lactoglobulina.
Una vez aislada la proteína de interés,
es posible realizar diferentes pruebas con el
fin de determinar la composición de la
muestra; una de las técnicas más usadas a
nivel de laboratorio es la electroforesis SDS-
page, la cual se ayuda a identificar la
composición proteica de una muestra
mediante el peso molecular (relación
masa/carga) de las diferentes proteínas y no
de acuerdo a su forma, como la electroforesis
en condiciones nativas, debido a que para este
método se utilizan condiciones reductoras,
las cuales desnaturalizan las proteínas
presentes en la muestra. (Cooper, 1984)
Métodos y materiales
Metodología
Aislamiento de la caseína
Calentar en un beaker 100 mL de agua
destilada a 38°C. Una vez alcanzada esta
temperatura, añadir 50 mL de leche deslactosada
y mezclar bien con agitación magnética. Agregar
ácido acético 1N gota a gota hasta que se
presencie un precipitado (hasta que se corte la
leche).
Precipitar, centrifugar y guardar el
sobrenadante para utilizar como solución A.
Lavar el precipitado con 20 mL de etanol,
centrifugar de nuevo y guardar el sobrenadante
como solución B. pesar un beaker vacío, luego
añadir el precipitado y pesar de nuevo. Lavar el
precipitado con 10 mL de éter etílico, centrifugar
4

y recoger el precipitado (desechar el Cuantificación de proteínas de la leche

sobrenadante).
Preparar las siguientes reacciones en
Preparación de la solución de caseína 10 tubos de ensayo:

Colocar aproximadamente 250 mg de

Albumi

Extract
na (ml)

Biuret
Leche

o (ml)
Agua
Tubo
caseína en un beaker de 50 mL. Agregar 20

(ml)

(ml)

(ml)
mL de agua destilada y 5 mL de NaOH 1N
(agitar hasta lograr la disolución completa de
la caseína). B 1,8 - - - 1,2
1 1,6 0,2 - - 1,2
Una vez disuelta la caseína, se vierta 2 1,4 0,4 - - 1,2
a un matraz aforado de 50 mL, se añaden 5 3 1,2 0,6 - - 1,2
4 1,0 0,8 - - 1,2
mL de ácido acético 1N y se completa a
5 0,8 1,0 - - 1,2
volumen con agua destilada hasta el aforo (la
Leche 1,6 - 0,01 - 1,2
solución debe ser clara y limpia). Sln A - - - 1,8 1,2
Sln B - - - 1,8 1,2
Determinación del punto isoeléctrico de la Sln C - - - 1,8 1,2
caseína
Sln D - - - 1,8 1,2
Colocar en 10 beakers limpios y secos los
siguientes volúmenes de reactivos: Agitar suavemente y esperar 15 min a
que se desarrolle el color en la oscuridad.
Acetat Ácido pH Medir la absorbancia a 595 nm.
Ácido
o acétic resultante
Tub acétic
sódico o aproximad Materiales y equipos
o o 0,1N
0,1N 0,01N o
(ml)
(ml) (ml)
Micropipetas, centrifuga, tubos
1 0,5 9,5 - 3,2
falcón, beakers (25, 50 y 250 ml), matraz
2 1,0 9,0 - 3,6
aforado de 50 ml, tubos de ensayo, probeta
3 1,5 8,5 - 3,8
4 2,0 8,0 - 4,0
de 10 ml, pipeta graduada (1,5 y 10 ml),
5 3,0 7,0 - 4,2 embudo de vidrio, termómetro,
6 4,0 6,0 - 4,5 espectrofotómetro, potenciómetro, cámara
7 6,0 4,0 - 4,7 de electroforesis, fuente de poder.
8 8,0 2,0 - 5,1
9 6,0 - 4,0 5,5 Reactivos
10 8,0 - 2,0 6,1
Solución buffer pH 4.0 y 7.0, leche
Medir los pH de las sustancias; luego, deslactosada, reactivo de Bradford, patrón
añadir 1mL de la solución de caseína a cada albumina de huevo, acetato sódico 0.1N,
vaso (el resto de la solución de caseína se ácido acético 1N, ácido acético 0.1N,
guarda como solución C). Esperar 3 minutos hidróxido de sodio 1N, éter etílico, etanol
y luego medir la absorbancia de cada muestra 70%.
a 640 nm.
5

Resultados [albúmina]
Absorbancia
mg/ml
Para la primera parte experimental, Muestra 1 0,00222 0,091
se realizó la precipitación de la caseína, para Muestra 2 0,00444 0,139
la cual fue necesario añadir 3 mL de ácido Muestra 3 0,00667 0,185
acético a los 150 mL de solución. Luego de Muestra 4 0,00889 0,202
separar el precipitado y someterlo a un Muestra 5 0,01111 0,619
secado de 24 horas, el peso neto de caseína Tabla 3. Absorbancias de las muestras
obtenido fue de 21.2978 g.
Una vez calculadas las
La concentración de albúmina en las concentraciones, se procedió a realizar la
soluciones se encontró multiplicando los curva de calibración, con el fin de determinar
mililitros utilizados de muestra patrón por la la concentración de caseína en las muestras
densidad de la muestra, y luego dividiendo el trabajadas (en equivalentes de albumina)
resultado dentro de los ml totales en cada mediante la interpolación de datos (Grafica
tubo de ensayo. Dando como resultado la 1).
Tabla 2

Para las muestras se realizo el

siguiente calculo, utilizando como ejemplo
los datos de la muestra 1.

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑎𝑙𝑏𝑢𝑚𝑖𝑛𝑎 = 𝑚𝐿 𝑎𝑙𝑏𝑢𝑚𝑖𝑛𝑎 ∗ 𝑑𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑎𝑙𝑏𝑢𝑚𝑖𝑛𝑎

𝑚𝑔
𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑎𝑙𝑏𝑢𝑚𝑖𝑛𝑎 = 0,2 𝑚𝑙 ∗ 0,02 = 0,004𝑚𝑔
𝑚𝑙
𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑎𝑙𝑏𝑢𝑚𝑖𝑛𝑎
[𝐴𝑙𝑏𝑢𝑚𝑖𝑛𝑎] =
𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
Grafica 1. Curva de calibración de la caseina no lineal
0,004 𝑚𝑔
[𝐴𝑙𝑏𝑢𝑚𝑖𝑛𝑎] = = 0,002 𝑚𝑔/𝑚𝑙
(1,6 + 0,2) 𝑚𝑙 Ya que uno de los valores de
absorbancia registrada presenta una variación
B 1 2 3 4 5 tan grande respecto a las demás muestras, se
agua 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 decidió eliminar dicho valor con el fin de
albumina 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 generar resultados más exactos a la hora de
peso interpolar las concentraciones de las muestras
0 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02
albumina problema (Grafica 2).
[albumina] 0 0.0022 0.0044 0.0067 0.0089 0.011
Tabla 2. Concentracion de Albumina

A continuación, se muestran los

resultados obtenidos de las absorbancias
medidas para las muestras patrón, junto a la
concentración de Albúmina encontrada para
cada una de estas (Tabla 3).
6

utilizados para determinar la concentración

de caseína, son la media entre ambas medidas
de cada muestra.

Para la determinación del punto

isoeléctrico de la caseína, se midió el valor de
pH de 10 soluciones con un potenciómetro;
luego, después de añadir 1 ml de la solución
de caseína a cada uno de los beakers, se
procedió a medir la absorbancia. Los valores
de pH de las soluciones iniciales y las
Grafica 2. Curva de calibración de la caseina absorbancias medidas para dichas soluciones
junto a la solución de caseína se muestran a
Tras analizar la curva de calibración continuación (Tabla 5).
(Grafica 2), se calculó la ecuación de la recta
(1) y el coeficiente de extinción molar de la
pH ABS
albúmina; el cual corresponde al valor de la
pendiente de la recta. 17.055 (𝑀−1 𝑐𝑚−1 ). 3.45 0.15
3.66 0.1
𝑦 = 17.055𝑥 + 0.0595 (1) 3.84 0.235
3.96 0.27
𝑚 = 17.055 (𝑀−1 𝑐𝑚−1 ) 4.23 0.267
4.54 0.28
A partir de la ecuación de la recta (1), 4.67 0.174
se procedió a calcular la concentración de
5.11 0.128
caseína en las muestras problema. Esto se
hizo mediante el despeje de la ecuación (1), 5.3 0.118
cuyo resultado se muestra a continuación: 5.71 0.132
Tabla 5. Absorbancias de acuerdo al pH
𝑦 − 0,0595
𝑋= (2) Al graficar las absorbancias obtenidas
17,055
respecto a los pH, se obtuvo la siguiente
Los valores obtenidos de X hacen grafica (Grafica 3).
referencia a las concentraciones halladas para
las muestras trabajadas; dichos resultados se
ilustran a continuación (Tabla 4).

Abs ABS prom [caseína]

A 0.142 0.233 0.1875 0.007505
B 0.066 0.072 0.069 0.000557
C 0.459 0.471 0.465 0.023776
Leche 0.420 0.366 0.393 0.019554
Tabla 4. Concentracion de caseína
Grafica 3. Determinacion PI por medio de la absorbancia
La medición de las absorbancias se y pH
realizó por duplicado, por lo cual los valores
7

Del mismo modo, es posible calcular

la transmitancia de cada muestra y expresarla
en función del pH. A continuación, se
muestra la manera en que se realizó los
cálculos, los resultados finales (Tabla 6), y la
representación gráfica de ellos (Grafica 4).

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 = − log(𝑇𝑟𝑎𝑛𝑠𝑚𝑖𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎)
10−𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 = 𝑇𝑟𝑎𝑛𝑠𝑚𝑖𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎
Obteniendo la siguiente tabla (Tabla 6)

pH Transmitancia
3,45 0,7079
3,66 0,7943
3,84 0,5821
3,96 0,5370 Grafica 5. Electroforesis SDS-PAGE muestras A, B y C
4,23 0,5408
4,54 0,5248 Para los cuales se realizó la caracterizacion
4,67 0,6699 de cada muestra de acuerdo al siguiente
5,11 0,7447 marcador de gel (Grafica 6)
5,3 0,7621
5,71 0,7379
Tabla 6. Transmitancia de acuerdo al pH

Transmitancia vs pH
0,9
0,8
0,7
Transmitancia

0,6
0,5
0,4 4,54

0,3
0,2
0,1
0
0 1 2 3 4 5 6
pH

Grafica 4. Determinacion PI por medio de la transmitancia

y pH

Para el análisis electroforético Grafica 6. Marcador de kDa Tris-Glycine 15%

realizado para las muestras A, B y C se
obtuvieron los siguientes resultados (Grafica Obteniendo aproximadamente los
5). siguientes pesos moleculares (Graficas 7,8 y
9).
8
Grafica 7. Bandas muestra A
Grafica 8. Banda muestra B
Grafica 9. Bandas muestra C
Análisis de resultados
Al analizar la tabla 4, la cual muestra
la concentración de caseína encontrada para
cada muestra trabajada (solución A, B, C y
solución con leche), es posible observar que
el valor máximo de absorbancia obtenido
corresponde a la solución C, seguida por la
solución con leche, la solución A y la
solución B respectivamente.
Abs ABS prom [caseína]
A 0.142 0.233 0.1875 0.007505
B 0.066 0.072 0.069 0.000557
C 0.459 0.471 0.465 0.023776
Leche 0.420 0.366 0.393 0.019554
Tabla 4. Concentracion de caseína
Con el fin de facilitar el análisis de las
concentraciones obtenidas, a continuación, se
muestra la composición de cada una de las
muestras tomadas (Tabla 7)
solucion Descripcion
alicuota tomada de la primera centrifugacion
A despues de precipitar la caseina. Su compoiscion
constata mayoritariamente de suero.
Alicuota tomada de la segunda centrigufacion, es
B decir despues de haber añadido el etanol al
precipitado.
Restante de la solucion de caseina (C= 250
C
mg/50ml).
con leche Solucion de agua y leche.
Tabla 7. Composicion de las muestras
Es fácil deducir el por qué las
muestras B y A poseen las menores
concentraciones entre el grupo de muestras,
ya a que estas están compuestas por etanol y
suero (en su mayor parte) respectivamente,
con algunas partículas de caseína que pueden
haber sido separadas del precipitado, gracias
a movimientos ejercidos sobre el tubo falcón.
Es por esto, que no se esperaba que estas
9

soluciones presentaran concentraciones altas aproximada de caseína en la solución,

respecto a las demás. La solución A presentó teniendo en cuenta la siguiente
una mayor concentración, ya que pudo haber información:
quedado alguna cantidad de caseína
suspendida en el suero. a. Volumen de leche agregada:
0.01mL
De igual manera, las soluciones C y con b. Densidad normal de la leche:
leche (solución a la cual se referirá como 1.028 a 1.033 g/mL (SENA,
solución D de ahora en adelante) presentaron 1987) (se usará una densidad
una mayor concentración, debido a que en promedio: 1.03 g/mL)
ningún momento se separó la caseína de c. Volumen total contenido en el
ellas, estando compuestas por la solución de tubo de ensayo antes de medir
caseína preparada y leche respectivamente. A la absorbancia: 2.81 mL
continuación, se presentan una serie de d. El contendió proteico de la
cálculos efectuados con el fin de verificar por leche; el cual pertenece
qué la solución C presento mayor aproximadamente al 3% de su
concentración que la solución D. peso (Agudelo, 2005).

- Solución C: 1.03 𝑔 1000 𝑚𝑔

0.01𝑚𝐿 × = 10.3 𝑚𝑔 (𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛)
𝑚𝐿 1𝑔

Teniendo en cuenta los siguientes 10.3 𝑚𝑔 × 0.03 = 0.309 𝑚𝑔 (𝑐𝑎𝑠𝑒𝑖𝑛𝑎)

datos:
0.309 𝑚𝑔
= 0.11 𝑚𝑔/𝑚𝐿
2.81 𝑚𝐿
a. Cantidad de caseína utilizada
para preparar la solución de Siendo así, es posible concluir que los
caseína: 250.9 mg datos obtenidos son correctos, y que la
b. Volumen total de la solución de solución C posee una concentración mayor a
caseína: 50mL la solución D, debido a que la solución de
c. Volumen total contenido en el caseína (muestra C) contenía una mayor
tubo de ensayo antes de medir la proporción solución/caseína que la leche
absorbancia: 3mL analizada; sin embargo, se especula que la
absorbancia de la muestra C tuvo algún tipo
Es posible determinar la de interferencia, o error, ya que esta debería
concentración aproximada de la ser mayor.
solución C de la siguiente manera:
Al analizar la gráfica 3, obtenida de
250.9 𝑚𝑔
= 5.018 𝑚𝑔/𝑚𝐿 ([𝑐𝑎𝑠𝑒𝑖𝑛𝑎]𝑖 ) los resultados de absorbancia y pH de las
50 𝑚𝐿
soluciones realizadas, es posible determinar
5.018 𝑚𝑔 el punto isoeléctrico experimental de la
= 1.67 𝑚𝑔/𝑚𝐿
3 𝑚𝐿 caseína, al determinar el valor de pH
correspondiente al punto más alto (en el eje
- Solución D: y) de la gráfica; el cual, en este caso
corresponde a un pH de 4.54.
Al igual que para la solución C, es
posible determinar la concentración
10

Transmitancia vs pH
0,9
0,8
0,7

Transmitancia
0,6
0,5
0,4 4,54

0,3
0,2
0,1
0
0 1 2 3 4 5 6
pH

Grafica 3. Determinacion PI por medio de la absorbancia

y pH Grafica 4. Determinacion PI por medio de la transmitancia
y pH

Teniendo en cuenta que el punto Después de analizar la gráfica 3, y el

isoeléctrico teórico de la caseína corresponde
a un pH de 4.6 (FARRELL JR, 2006), se
puede concluir que el punto isoeléctrico
experimental (pH=4.54) presenta un grado de
error del 1.30%, lo cual puede deberse a la
adición de un exceso de ácido a la leche,
generando una carga positiva en algunas de
las moléculas; esto se puede ver reflejado en
un aumento en la absorbancia de la muestra
A, debido a partículas de caseína que
pudieron quedar en suspensión.
Al analizar la gráfica 4, la cual
representa los niveles de transmitancia
respecto al pH, se encontró justo lo que se
esperaba teóricamente, al obtener una gráfica
idéntica a la obtenida para el análisis de
absorbancia en función del pH pero invertida;
es decir, que para este caso, el punto
isoeléctrico de la caseína, corresponde al
punto más bajo en el eje Y, el cual, para este
caso es de un pH de 4.54. Esta relación
“estructural” entre ambas gráficas, se debe a
que, al graficar la absorbancia vs pH de la
solución, se está mostrando la cantidad de luz
absorbida por la muestra, mientras que al
graficar la transmitancia vs pH se está
mostrando la porción de luz que atravesó la
solución por completo; por lo cual, la muestra
que haya presentado un mayor valor de
absorbancia, será la que presente un menor
índice de transmitancia.
procedimiento realizado para la precipitación
de la caseína, se llegó a la conclusión de que,
en el punto isoeléctrico, la caseína poseé su
nivel mínimo de solubilidad debido a la
reducción de interacciones moleculares con
otras moléculas, ya que se encuentra con
carga neutra (se protonan los fosfatos); de
igual manera, en este punto, las moléculas
tienden a formar coágulos, debido a la
atracción entre sí, aumentando así el índice de
hidrofobicidad; esto debido a que
conformación de las moléculas expone
considerablemente los residuos hidrofóbicos,
lo que resulta en una fuerte asociación entre
las caseínas y las hacen insolubles en agua
(Fox & Mcsweeney, 2003)
Al realizar el análisis de la
electroforesis se logró confirmar algunos de
los datos hallados anteriormente en cuanto a
la concetracion de caseína en las muestras A
y B.
11
Grafica 7. Muestra A Grafica 8. muestra B
En estas bandas se evidencia
(Graficas 7 y 8) una baja concentración
proteica (representado por bandas
horizontales bastante claras). En la Grafica 7
y 8 la presencia de S1- caseína, S2- caseína,
y β-caseína fue determinada mediante la
comparación de pesos moleculares respecto a
la tabla 1.
Tabla 1. Principales proteínas presentes en la leche
(LIVNEY,2010)
Realizando dichas comparaciones se
verifico que los pesos moleculares obtenidos
por el análisis del gel, concuerdan con los
valores teóricos de peso molecular en kDa.
Según los resultados obtenidos, se puede
deducir que el tiempo de corrida utilizado es
óptimo, ya que se permitió el correcto
distanciamiento de las muestras en el gel, sin
generar un disperzamiento y ensanchamiento
de la muestra, lo cual dificulta su análisis.
(Schägger, 1987)
Por último, al realizar el análisis de la
muestra C, se encontró la presencia de los 4
tipos de caseínas: S1- S2-  - -caseína,
representando alrededor del 38%, 10%, 35% y el
15%, respectivamente las cuales presentan pesos
moleculares de 22.1-23.7, 25.2-25.4, 23.9-24.1, y
19 KDa respectivamente.
Grafica 9. Bandas muestra C
Además, en la banda de la muestra se
evidencia una marca aproximadamente entre
65 y 75 kDa, la cual se infiere, mediante los
valores presentados en la tabla 1 que
corresponde a albúmina de suero bovino
(BSA). Esta última marca de la albúmina es
mucho más clara comparada a las marcas de
las caseínas, debido a que, en la leche el 20 %
de las proteínas de la leche provienen del
suero y la caseína el 80% de las proteínas de la
leche (según Fox & Mcsweeney. 2003) la caseina
consiste en cuatro proteínas principales: S1- S2-
- -caseina, representando alrededor del 38%,
10%, 35% y el 15%, respectivamente, que se
componen de 199, 207, 209 y 169 residuos de
aminoácidos, con pesos moleculares de 23, 25, 24
y 19kDa respectivamente. Estos resultados
12
comprueban que el análisis realizado
previamente es correcto, al respaldar los
resultados deducidos sobre las concentraciones
calculadas para cada muestra utilizando la curva
de calibración realizada.
Conclusiones
- Los valores de concentración
obtenidos para las muestras
trabajadas concuerda con las
estimaciones teóricas, cálculos
realizados, y el análisis
electroforético, siendo la solución C
la solución con más concentración,
seguida por las soluciones D, A, y B;
sin embargo, se cree que se generó un
error al medir la absorbancia de la
muestra C, ya que la concentración
calculada para esta muestra es mucho
mayor a la concentración de la
muestra D, por lo cual la diferencia
entre sus absorbancias, y por ende de
sus concentraciones halladas
mediante la curva de calibración,
debería ser mayor.
- El punto isoeléctrico calculado
mediante la gráfica de absorbancia a
640 nm vs pH de las soluciones tuvo
un error del 1.30% el cual se debe
posiblemente a un pequeño exceso de
ácido añadido a la leche, el cual pudo
generar la protonacion del grupo
amino, generando una carga neta
positiva en la molécula, lo que resultó
en el aumento de interacciones
intermoleculares con otras partículas
. Opinion in Colloid & Interface Science, v. 11, p.
- El exceso de ácido que generó el error
del cálculo del punto isoeléctrico,
pudo también ser el causante de que
la solución A presentase una mayor
concentración de caseína que la
solución B, debido a la generación de
carga neta positiva de algunas de las
moléculas de caseína.
- La concentración hallada para la
solución de caseína preparada es de
5.018 mg/ ml, calculada al tomar la
cantidad de caseina agregada (250.9
mg) y dividirla en el volumen total de
la solución preparada (50 mL);
- Los resultados de la electroforesis
fueron obtenidos de manera exitosa,
presentando bandas bien marcadas y
sin presentar un gran índice de
ensanchamiento; por lo cual puede
deducirse que el tiempo de corrido
utilizado y el voltaje aplicado fue
ideal para la correcta caracterización
de las muestras; cuyos pesos
moleculares concordaron con
aquellos hallados en la literatura.
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