Prueba de Torch y Detección de anticuerpos IgG para

Escherichia coli de las cepas K88 y K99 a través del

ensayo ELISA indirecto
1
Asignatura de Inmunología, Carrera de Ingeniería en Biotecnología, Departamento de Ciencias de la
Vida y la Agricultura, Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE, Sangolquí, Ecuador

Fecha de entrega: 19/01/2018

RESUMEN
El perfil de Torch para la detección de múltiples infecciones virales por Toxoplasma gondii (TOXO),
Cytomegalovirus (CMV), Rubéola (RB), Virus de Herpes Simple (HSV-1 y HSV-2), es un método rápido
simple ampliamente distribuido en los laboratorios. La presente práctica que evaluó el suero de tres
individuos distintos, donde en el primer análisis se obtuvieron 3 pruebas inválidas y ningún suero mostró
evidencia de infección por alguno de los virus contemplados en el perfil Torch, mientras en el segundo
análisis con dos sueros, el suero de muestra clínica de toxoplasma fue positivo para toxiplasma con
presencia de IgG.

Escherichia coli, es una enterobacteria tipo bacilo gramnegativo que frecuenta en afecciones en el tracto
intestinal de vertebrados de sangre caliente. En la presente práctica se realizó la detección de anticuerpos
IgG para Escherichia coli de las cepas K88 y K99 a través del ensayo ELISA indirecto, donde se observó
que las absorbancias obtenidas tenían una relación directamente proporcional a la concentración del
antígeno y se encontró un cutoff de 0.15.

Palabras claves: perfil Torch, inmunoensayo, ELISA indirecto, suero, IgG, E. coli.

INTRODUCCIÓN
Escherichia coli (E. coli) es una bacteria de tipo gramnegativo, termosensible que frecuenta en infecciones
en el intestino distal de los organismos de sangre caliente, a pesar de que en su mayoría las cepas de E. coli
son inocuas algunas pueden llegar a provocar fuertes infecciones alimentarias (OMS, 2017). Las cepas de
Escherichia coli enterotoxigénicas (ECET) son de interés debido a que causan diversas enfermedades como
diarrea neonatal en cerdos, donde la patogénesis se encuentra relacionada estrechamente con las fimbrias
del patógeno. Se conoce que las ECET en porcinos expresan fimbrias de tipo K88 (F4), K99 (F5), F41,
987p (F6) y F18 (Zamora, Reinhardt, Polette, & Macías, 1999). La importancia de estas adhesinas
fimbriales radica en su capacidad para dirigirse hacia receptores específicos en el epitelio intestinal
permitiendo la colonización de la bacteria y así secretar las toxinas que influyen sobre los síntomas
ocasionados en el hospedero (Francis, 2002).

Los anticuerpos Policlonales son una mezcla compleja de varios anticuerpos, estos son producidos por
diversos clones de Linfocitos B a través de la inmunización de organismo. Se realizan con frecuencia en
modelos animales de conejos y tienen la capacidad de reconocer y unirse a diversos epítopos de un mismo
antígeno, permitiendo la formación de cedazos con los antígenos (Cheriyedath, 2016).
La técnica ELISA es una técnica de inmuno ensayo basada en la especificidad de la reacción antígeno con
el respectivo anticuerpo, que a través del uso de anticuerpos conjugados que se colorean frente a la presencia
de sustratos, esta técnica es ampliamente utilizado en laboratorios de calidad para la detección de sustancias
como alérgenos alimentarios. Para estos fines puede emplean tanto anticicuerpos monoclonales o
policlonales (Bioser, 2015).

El monitoreo médico de enfermedades constituye un método de prevención contra eventos potencialmente

dañinos, especialmente durante el embarazo y en la actualidad existen numerosos procedimientos con este
fin, para realizar la supervisión constante para el bebé y la madre. El jefe de área en los Laboratorio de
Análisis Clínicos Florida Satélite, comenta que uno de los exámenes más confiables para supervisar la
gestación es el perfil de TORCH, el cual indica la presencia de toxoplasma, rubéola, citomegalovirus y
herpes, es decir, grupo de enfermedades que inciden directamente en el desarrollo fetal. En la actualidad se
disponen de dos tipos de TORCH, uno que nos permite saber si alguno de estos problemas se sufrió con
anterioridad (localiza anticuerpos ‘de memoria’ o IgG), y otro que revela la existencia de una infección
reciente o en curso (rastrea anticuerpos activos, llamados IgM) (Mejía, 2016).

El objetivo de la presente práctica fue realizar el diagnostico de Torch y determinar la presencia de

anticuerpos IgG contra E. coli empleando la técnica de ELISA indirecto.

P ROTOCOLO

1. Extracción de sangre
1. Lavarse las manos y desinfectarse con alcohol al 70°.
2. El paciente debe estar sentado y con su brazo descubierto.
3. Colocar el torniquete en la parte superior del brazo, de 10 a 15 cm por encima del lugar de
punción.
4. Desinfectar la zona en forma circular empleando una torunda humedecida con alcohol al 70°.
5. Una vez seco el área, puncionar la vena seleccionada con un Vacutainer y colocar un tubo tapa
roja. Las venas más adecuadas para venopunción son fácilmente palpables, flexibles.
6. Aflojar el torniquete.
7. Retirar el tubo una vez que se haya llenado con la sangre.
8. Extraer el Vacutainer de la zona de punción cuidadosamente, mientras se coloca una torunda
de algodón humedecida con alcohol sobre el sitio de la punción.
9. Con mucho cuidado, cubrir la aguja con la tapa protectora y descartar el Vacutainer en el
depósito correspondiente.

2. Prueba de Torch
1. Centrifugar la muestra de sangre a 4000 rpm por 15 minutos.
2. Recolectar el suero en un tubo Eppendorf de 1.5 mL.
3. Las muestras clínicas a emplear, deben mantenerse en refrigeración a 4°C, el día del empleo
deben descongelarse a temperatura ambiente
4. Emplear dos kits comerciales:
  TORCH 5 in 1 One-Step Kit Serum/Plasma Test marca QikTech para la detección de
TOXO (Toxoplasma gondii), CMV (Cytomegalovirus), RUB (rubéola), HSV1 y HSV2
(virus del herpes simple 1 y 2)
 Kit OneSite Rapid Test Toxo IgG/IgM-Casete marca CTK Biotech para la detección de
TOXO.
5. Con la ayuda de una micropipeta colocar 45 μL de suero de la muestra los pocillos de cada kit.
6. Luego de 30 s, añadir una gota (~ 45 μL) de Torch Buffer en los pocillos del kit para la prueba
de TORCH y del mismo modo colocar una gota del diluyente para la prueba TOXO IgG/IgM.
Mantener los pocillos húmedos con los diluyentes de los kits respectivos.
7. La prueba se lee a los 10 min.
Modificado de: (CTK Biotech, 2006)
3. Preparación del antígeno con E. coli K88 y K99
1. En tubos de ensayo con 5 mL de caldo triptosa inocular muestras de E. coli K88 y E. coli K99.
2. Incubar los tubos de ensayo a 37°C y agitación durante 24 horas.
3. Centrifugar los tubos de ensayo a 4000 rpm por 30 min.
4. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet con 10 mL de PbS 1X.
5. Centrifugar los tubos de ensayo a 4000 rpm por 30 min.
6. Descartar el sobrenadante y nuevamente resuspender el pellet con 10 mL de PbS 1X.
7. Centrifugar los tubos de ensayo a 4000 rpm por 30 min.
8. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet con 2 mL de PbS 1X.
9. La última resuspención bacteriana se inactiva por choque térmico a 65°C por 30 min e
inmediatamente se la coloca a 0°C por 15 min.
10. Diluir la mezcla en buffer carbonato-bicarbonato a pH 9.6 en diferentes concentraciones: 1/50,
1/100 y 1/200 para emplear en las placas de ELISA.
Fuente: Laboratorios de Biotecnología
4. Obtención de los anticuerpos policlonales
1. Incubar muestras individuales de E. coli K88 y E. coli K99 en caldo triptosa durante 24 horas
a 37°C.
2. Cuatro horas después de la incubación existen 1x10 8 UFC/mL de bacterias. Se inactivan las
muestras por choque térmico a 65°C por 30 min e inmediatamente se las coloca a 0°C por 15
min.
3. Mezclar 1 mL de la solución bacteriana con 1 mL de la solución adyuvante de Freund.
4. Realizar cinco inmunizaciones, una cada semana, a conejos raza Nueva Zelanda de un mes de
edad. La primera inmunización emplear la solución bacteriana con solución adyuvante de
Freund completo, las posteriores inmunizaciones van a contener la solución bacteriana con
adyuvante de Freund incompleto.
5. Las inyecciones se realizan por vía subcutánea en el lado dorsal del pescuezo inyectando en
zonas distintas a manera de cuadrado, la última inyección debe realizarse en el centro de la
zona dorsal.
6. Extraer la sangre total del conejo por punción cardiaca.
7. Precipitar la sangre con sulfato de amonio pH 7.8.
8. Purificar las inmunoglobulinas en columnas de 1 mL de afinidad HiTrap G Protein.
Fuente: Laboratorios de Biotecnología

5. ELISA
1. Emplear placas de ELISA de 96 pocillos, se trabajan con las tres primeras columnas y las filas
de la A hasta la H.
 2. Sensibilización de la placa: Colocar 200 μL por pocillo de la solución antigénica (bacteria,
PbS y solución carbonato-bicarbonato) a concentración 1/50 en la columna 1, la solución de
concentración 1/100 colocar en la columna 2 y la solución a concentración 1/200 colocar en
la columna 3. Todas las soluciones de proteínas antigénicas se colocan en los pocillos de la
fila A hasta la F durante toda la noche a 4°C.
3. Lavar tres veces la placa con solución PbS 1X – Tween 20%.
4. Bloqueo de la placa: Añadir 200 μL de solución de bloqueo (solución 5% de leche de soya
descremada grado reactivo con PbS 1X). Sellar e incubar la placa a 37°C por 20 min.
5. Lavar tres veces la placa con solución PbS 1X – Tween 20%.
6. Colocar 100 μL de la solución de suero anti-K88 en las filas A y B, colocar 100 μL de suero
anti-K99 en las filas C y D, colocar 100 μL de suero de conejo no inmunizado. Sellar e incubar
la placa a 37°C por 20 min.
7. Lavar tres veces la placa con solución PbS 1X – Tween 20%.
8. Colocar 100 μL de la solución comercial 1/50000 de anticuerpo anti-conejo conjugado con
enzima fosfatasa alcalina. Sellar e incubar la placa a 37°C por 20 min.
9. Lavar tres veces la placa con solución PbS 1X – Tween 20%.
10. Colocar 100 μL de solución sustrato pH 9.8 compuesta por PNPP (para-nitrofenil fosfato) y
buffer sustrato. Mantener cubierta la solución durante su manipulación.
11. Cubrir la placa con papel toalla, mantenerla en incubación a temperatura ambiente durante 20
min. Pasado el tiempo se realiza la medición a 405 nm.
12. La medición se realizó 6 horas después a 405 nm en el equipo Multiskan GO marca Thermo
Scientific empleando el programa Skanit Software 4.1.
13. Se emplean controles tras cada paso del proceso:
 Control 1 (celda H1): Solución Carbonato-Bicarbonato + solución bloqueo + suero
con anticuerpos policlonales anti-K99 + conjugado anti-conejo-fosfatasa alcalina +
PNPP.
 Control 2 (celda G1): solución bloqueo + suero con anticuerpos policlonales anti-K88
+ conjugado anti-conejo-fosfatasa alcalina + PNPP.
 Control 3 (celda H2): suero con anticuerpos policlonales anti-K88 + conjugado anti-
conejo-fosfatasa alcalina + PNPP.
 Control 4 (celda H3): conjugado anti-conejo-fosfatasa alcalina + PNPP.
 Control 5 (celda G2): PNPP.
Fuente: (Torres, 2016)
6. Cálculos de las soluciones empleadas
 Composición de la solución de lavado: PbS +Tween 20%

PbS-Buffer fosfato salino 1X para 1L

 27g de cloruro de sodio

 0.2 g de cloruro de potasio
 1.15g de Na2HPO4
 Tween 20%
o 20mL de Tween aforado a 100mL con agua destilada

 Cálculos para las soluciones de carbonato, bicarbonato pH 9.6

Carbonato 0,05 M:
 𝑀∗𝑉 = 𝑛

𝑚𝑜𝑙
0,05 ∗ 0,1𝐿 = 5 × 10−3 𝑚𝑜𝑙
𝐿
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑒𝑛 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠
𝑛=
𝑃𝑀
𝑔
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑒𝑛 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 = 𝑛 ∗ 𝑃𝑀 = 5 × 10−3 𝑚𝑜𝑙 ∗ 60
𝑚𝑜𝑙

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑒𝑛 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 = 0,3g

Bicarbonato 0,05 M:

𝑀∗𝑉 = 𝑛

𝑚𝑜𝑙
0,05 ∗ 0,1𝐿 = 5 × 10−3 𝑚𝑜𝑙
𝐿
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑒𝑛 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠
𝑛=
𝑃𝑀
𝑔
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑒𝑛 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 = 𝑛 ∗ 𝑃𝑀 = 5 × 10−3 𝑚𝑜𝑙 ∗ 61
𝑚𝑜𝑙

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑒𝑛 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 = 0,305𝑔

 Cálculos para el buffer sustrato (fotosensible)

𝑀𝑔𝐶𝑙2 − 6𝐻2 𝑂 0,5 𝑚𝑀 = 5 × 10−4 𝑀:

𝑀∗𝑉 = 𝑛

5 × 10−4 𝑚𝑜𝑙⁄𝐿 ∗ 0,1𝐿 = 5 × 10−5 𝑚𝑜𝑙

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑒𝑛 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠
𝑛=
𝑃𝑀
𝑔
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑒𝑛 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 = 𝑛 ∗ 𝑃𝑀 = 5 × 10−5 𝑚𝑜𝑙 ∗ 203,3
𝑚𝑜𝑙

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑒𝑛 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 = 0,0101𝑔

Dietanolamina (𝐶4 𝐻11 𝑁𝑂2 ) 1M:

𝑀∗𝑉 = 𝑛
 1 𝑚𝑜𝑙⁄𝐿 ∗ 0,1𝐿 = 0,1𝑚𝑜𝑙

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑒𝑛 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠
𝑛=
𝑃𝑀
𝑔
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑒𝑛 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 = 𝑛 ∗ 𝑃𝑀 = 0,1 𝑚𝑜𝑙 ∗ 105,14
𝑚𝑜𝑙

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑒𝑛 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 = 10,514𝑔

RESULTADOS REPRESENTATIVOS

Prueba de Torch

a) b) c)

Figura 1. Prueba de Torch para la detección en suero de Toxoplasma gondii, Citomegalovirus, virus Rubéola,
virus del Herpes simple 1 y 2.
a) Suero de muestras clínicas de un paciente con varicela: la placa exhibe franjas rojas levemente
evidenciables en la zona de control (C) de Citomegalovirus, virus Rubéola, virus del Herpes simple 1 y
a. 2. No se observa franja roja en el control de Toxoplasma gondii. La zona de prueba (T) no exhibe franja
roja para ningún tipo de virus (Prueba inválida para Toxoplasma gondii y negativa para Citomegalovirus,
virus Rubéola, virus del Herpes simple 1 y 2.
b) Suero de muestras clínicas de un paciente con toxoplasma: la placa exhibe franjas rojas levemente
evidenciables en la zona de control (C) de virus del Herpes simple 1 y 2. No se observa franja roja en el
control de Toxoplasma gondii, Citomegalovirus, virus Rubéola. La zona de prueba (T) no exhibe franja
roja para ningún tipo de virus (Prueba inválida para Toxoplasma gondii, Citomegalovirus y virus Rubéola,
y negativa para virus del Herpes simple 1 y 2.
c) Suero de un alumno aparentemente sano: la placa exhibe franjas rojas evidenciables en la zona de control
(C) de Toxoplasma gondii, Citomegalovirus, virus del Herpes simple 1 y 2. No se observa franja roja en
el control de virus Rubéola. La zona de prueba (T) no exhibe franja roja para ningún tipo de virus (Prueba
inválida para Rubéola y negativa para Toxoplasma gondii, Citomegalovirus y virus del Herpes simple 1
y 2.

a) b)

Figura 2. Prueba de Torch exclusiva para detección de Toxoplasma gondii y presencia de IgG e IgM.
a) Suero de un alumno aparentemente sano: la placa exhibe una franja roja evidenciable en la zona de control
(C) de Toxoplasma gondii. No se observa franja roja para la detección de IgG e IgM (Negativo para
Inmunoensayo ELISA indirecto

Tabla 1. Resultados de la lectura del ELISA a 405 nm tras 6 horas desde la finalización del laboratorio para la
detección de anticuerpos IgG contra E. coli. Las celdas entre A4:H12 corresponden a los pocillos que se encontraban
vacíos (azul). Las celdas entre A1:B3 corresponden a los pocillos de prueba con cepa K88 como antígeno + IgG anti
K88 + anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina + PNPP (rojo). Las celdas entre C1:D3 corresponden a los pocillos
de prueba con cepa K99 como antígeno + IgG anti K99 + anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina + PNPP (verde).
Las celdas entre E1:F3 corresponden a los pocillos de control negativo donde se encontraban antígenos + IgG de
conejos no inmunizados + anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina + PNPP (negro). Las celdas entre G1:H2
corresponden a los pocillos de control de soluciones (mostaza), G1 contenía el control 2, G2 control 5, H1 control 1,
H2 control 3 (Véase composición de controles en metodología). La celda H3 corresponde al pocillo de control positivo
de la sustancia donde se encontraban anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina + PNPP (gris). Las concentraciones
de antígenos utilizadas correspondieron a las diluciones del antígeno respectivo en 1/50 (columna 1), 1/100 (columna
2), 1/200 (columna 3). La concentración de sueros respectivos fue de 1/50 en todas las pruebas.

Abs 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0,121 0,090 0,086 0,058 0,057 0,057 0,056 0,056 0,054 0,059 0,060 0,064
B 0,124 0,107 0,085 0,057 0,060 0,055 0,058 0,068 0,057 0,058 0,061 0,059
C 0,132 0,101 0,088 0,057 0,059 0,058 0,057 0,058 0,055 0,057 0,055 0,071
D 0,142 0,099 0,083 0,059 0,056 0,083 0,058 0,055 0,054 0,056 0,067 0,062
E 0,081 0,071 0,078 0,061 0,053 0,057 0,059 0,059 0,059 0,056 0,059 0,061
F 0,082 0,081 0,095 0,064 0,057 0,059 0,057 0,052 0,052 0,057 0,057 0,059
G 0,071 0,043 0,053 0,059 0,057 0,058 0,056 0,056 0,056 0,052 0,060 0,060
H 0,092 0,070 3,966 0,059 0,061 0,060 0,057 0,055 0,055 0,060 0,065 0,075
 Figura 3. Gráfica de las mediciones de absorbancia para los controles positivos y negativos. Las dos rectas
cuyas absorbancias medidas a 405 nm son menos corresponden a los controles negativos 1 y 2, donde se
esperaba que no se formen significativamente complejos entre anticuerpo primario y secundario, sin embargo,
se observa un valor de absorbancia de la recta del control negativo 2, la cual supera a las absorbancias de los
controles positivos con disoluciones de antígeno de 1/200. Al observar las rectas correspondientes a los
controles positivos se observa que las absorbancias son inversamente proporcionales al grado de dilución del
antígeno. En una dilución de 1/50 las absorbancias para K99 son las mayores, seguidas de las absorbancias
de para K88, mientras que para la dilución de 1/100 se observaron mayores absorbancias para ambos
antígenos K88 y K99.

Interacción de las absorbancias de los micropocillos respecto a las 3 pruebas realizadas para el test de Elisa de
IgG para H. pylori a 450nm.
 Validación del ensayo ELISA indirecto

Para que el ensayo sea válido, el valor promedio de los controles positivos (𝑀𝐶𝑃) debe ser mayor
𝑀𝐶𝑃
o igual a 2,4 veces al valor promedio de los controles negativos (𝑀𝐶𝑁). Es decir: ≥ 2,4
𝑀𝐶𝑁
(Instituto de Inmunología Clínica , 2017).

∑ 𝐶𝑃 1.258
𝑀𝐶𝑃 = = = 0.105
12 12
∑ 𝐶𝑁 0.488
𝑀𝐶𝑁 = = = 0.081
6 6
𝑀𝐶𝑃 0.105
= = 1.29
𝑀𝐶𝑁 0.081

1.29 ≤ 2.4 ∴ El ensayo ELISA indirecto no es válido

Cálculo del punto de corte o Cutoff

Cutoff = 1,9 x MCN.

Cutoff = 1,9 x 0.081 = 0.1539

DISCUSIÓN

PRUEBA DE TORCH

La prueba de TORCH es una prueba para detección de anticuerpos producidos por infecciones de
toxoplasmosis (TOXO), rubeola (RUB), citomegalovirus (CMV) y herpes (HSV1 Y HSV2). Esta prueba
se orienta a identificar IgG (anticuerpos de una infección pasada) o IgM (anticuerpos de una infección
reciente) (Deska, Pagana, & Noel , 2017).

En la práctica tres sueros fueron empleados para la realizar la prueba de Torch, dos de los sueros prevenían
de muestras clínicas, uno era de un paciente con varicela y el otro de un paciente con toxoplasmosis, el
tercer suero fue de uno de los estudiantes. En la Figura 1a se observa que la prueba del paciente con varicela
tiene reacción negativa a la presencia de anticuerpos IgG o IgY contra citomegalovirus, rubeola y herpes
simple 1 y 2 pues únicamente se visualiza una franja en la zona de control, respecto a la prueba para
toxoplasmosis no es posible la diferenciación de franja ni en la zona de control ni en la zona de la prueba.
Según lo que establece la guía de QikTech, (2016) cuando la banda coloreada no aparece en le región “C”
de control la prueba es inválida, una de las razones puede ser la adicción de la muestra en el compartimento
equivocado o el deterioro de la prueba. Los kits usados en la práctica tenían varios meses en
almacenamiento lo que posiblemente causó la falta de franja en la prueba. Para este paciente en específio
la prueba necesariamente resultaba negativa pues la detección de anticuepos para varicela no está
contemplada, en contraste a este resultado debe ser la prueba para el suero de un paciente con toxoplasmosis
(Fig. 1b) en este caso hay una reactividad negativa para CMV, HSV1 y HSV2, mientras que las pruebas
para TOXO y RUB también resultaron inválidas por ausencia de banda en la región de control.

La Figura 1c muestra la prueba para el suero de un estudiante en todos los carriles se observan franjas
rosadas en la región de control lo que representa un resultado negativo a la presencia de IgG o IgM para los
cinco tipos de patógenos, en el caso de la prueba para rubeola la franja es tenue pero está presente.

La principal aplicación de esta prueba está orientada al diagnóstico de infecciones en mujeres embarazadas
(Sachdeva & Dutta, 2016), esta prueba permite diferenciar entre infecciones agudas, congénitas e intraparto
causadas por tales patógenos, pues los altos niveles de IgM son indicadores de una posible infección
intrauterina (Daniels, 2010).

Las pruebas exclusivas de Torch para la detección de Toxoplasma gondii también se analizaron para dos
de los tres sueros probados anteriormente. En la Figura 2a, muestra proveniente del estudiante, se observa
la presencia de una sola banda en la región de control “C” del mismo modo que la prueba de Torch la
presencia de una sola banda en esta región implica que la prueba es negativa a la presencia de T. gondii
(CTK Biotech, 2006). Por tanto con ambas pruebas es confirmatorio que el estudiante nunca antes había
estado expuesto a este parásito. En la Figura 2b, muestra clínica de un paciente con toxoplasmosis, se
observan dos franjas, una en la región C y otra en la región G, es decir que el suero de este paciente contiene
IgG contra T. gondii, siendo el mismo suero que se empleó en la prueba de Torch y que para esta última no
hubo confirmación de anticuerpos por obtenerse una prueba inválida, para la completa confirmación de
sugiere la repetición del test con el kit Toxo IgG/IgM.

Cuando para etas pruebas exclusivas de TOXO los resultados nos dan una mejor identificación del tipo de
enfermedad que tuvo o tiene el paciente, para este caso particular se obtuvo IgG positivo e IgM negativo lo
cual está asociado a una infección pasada (Phadkelabs, 2017) e implica que los anticuerpos reconocidos
son anticuerpos memoria, cualidad característica de los IgG.

Como lo menciona Abbas, Litchman, & Pillai, (2015) las inmunoglobulinas G son las de mayor tiempo de
vida medio, ~ 23 días, mientras que las IgM, ~ 5 días, persisten en el organismo durante las primeras etapas
de la infección.

La toxoplasmosis es una zoonosis mundial causada por T. gondii, esta infección parasitaria afecta a gran
cantidad de mamíferos y específicamente en humanos, reside y afecta al sistema retículoendotelial (Giraldo,
2008; Ecobedo, Carbonell, Nuñez, & Ginorio, 2006). La detección de infecciones, asociadas a este parásito
y los virus analizados en la prueba de Torch, permite el diagnóstico temprano para la presencia de estos
mejora los tratamientos d control y seguimiento del paciente contaminado y es principalmente importante
en mujeres embarazadas pues acarrea muchas consecuencias graves para el recién nacido cusandole
defectos congénitos o malformaciones, inclusive pueden provocar el aborto del feto (principal defecto causa
por T. gondii) (Turgeon, 2014).
ENSAYO ELISA INDIRECTO

La técnica ELISA es una técnica de inmuno ensayo basada en la especificidad de la reacción antígeno-
anticuerpo, que a través del uso de anticuerpos conjugados con enzimas en presencia de los sustratos para
dichas moléculas provocan reacciones de coloración que pueden ser analizadas por espectrofotometría y es
utilizado para la cuantificación de antígenos o anticuerpos, así como en detección de sustancias como
alérgenos alimentarios (Bioser, 2015; Abbas, Litchman, & Pillai, 2015).

En la práctica se llevó acabo un ensayo de ELISA indirecto que emplea una muestra de antígeno, cuero de
prueba que contiene los anticuerpos contra estos antígenos y los anticuerpos conjugados con una enzima
(Tortora, Funke, & Case, 2007). Escherichia coli es una bacteria de tipo gramnegativo, termosensible que
frecuenta en infecciones en el intestino distal de los organismos de sangre caliente pudiendo provocar
fuertes infecciones alimentarias (OMS, 2017).

Los anticuerpos policlonales son anticuerpos extraídos de una mezcla de inmunoglobulinas con diferentes
especificidades provenientes de distintos clones de células plasmáticas, dichos anticuerpos van a reconocer
distintos epítopos de un mismo antígeno. El conejo es el animal más empleado para la obtención de
anticuerpos policlonales (Lacave & Caballero, 2012).

En la práctica se emplearon como antígenos muestras de E. coli de las cepas K88 y K99 previamente
inactivadas y sensibilizadas, las soluciones de antígenos se colocaron a diferentes concentraciones (1/50,
1/100 y 1/200), como anticuerpos primarios se emplearon anticuerpos policlonales de conejos que eran
específicos para estas cepas bacterianas y como anticuerpos secundarios se emplearon anticuerpos
comerciales anti-conejo conjugados con fosfatasa alcalina que en presencia de PNPP (p-notrofenil fosfato)
se produce la reacción colorimétrica que es leida a 405 nm.

Los resultados de las absorbancias se observan en la Tabla 1, en esta se puede verificar que mientras mayor
es la dilución del antígeno menor es la absorbancia media (se observa de las columnas 1 a la 3), lo que
muestra un resultado positivo para la formación del complejo. En las filas E y F de la Tabla 1 que son los
controles negativos para los anticuerpos prueba, se puede observar que las absorbancias disminuyen
respecto a las absorbancias de las fila A:D lo cual es correcto, para estas filas de control se emplearon sueros
de conejos que no tenían exposición a E. coli y por tanto no existen anticuerpos que reconozcan los
antígenos esto a su vez impide la unión del anticuerpo secundario y por tanto la reacción colorimétrica no
puede alcanzar altos rangos de absorbancia. Del mismo modo ocurre con los controles empleados en las
filas G y H que en carencia de uno de los reactivos no puede mostrar una absorbancia adecuada.

En la Figura 3 se puede observar los valores de absorbancia resultantes por cada disolución de antígenos,
se visualiza una disminución de las absorbancias para todas las muestras que emplearon sueros con
anticuerpos policlonales específicos, mientras que en los controles negativos siendo que estos no poseen el
anticuerpo adecuado para permitir la conformación del complejo se pueden lograr mayores absorbancias,
esto se visualiza principalmente en la columna de la concentración antigénica 1/200. Esto último puede
representar un problema para la determinación del punto de corte durante la valización del ELISA, con los
resultados de la práctica se calculó un Cutoff o punto de corte igual a 0.1539 que al comparar con los
promedios de los controles positivos tienen un valor menor, este resultado implica que los sueros positivos
realmente no están reconociendo el antígeno o que no son muy específicos para este (Cardona , Lora, &
Gomez, 2005). Para que un ensayo sea considerado como válido, la razón de los promedios de los controles
positivos y los negativos debe ser mayor aun valor de 2.4 (Instituto de Inmunología Clínica , 2017), en este
ensayo no se logró superar dicho valor por tanto no se puede afirmar que exista validez en la prueba ELISA.

Los factores que pueden favorecer los errores durante un ELISA pueden producirse por contaminación
microbiana, almacenamiento e incubación a temperaturas y tiempos subóptimos, uso de microplacas no
estériles, errores en la dispensación de los reactivos, etc. (De Lejarazu, Ortega, & Eiros, 2014). En este caso
se podrían considerar al uso de placas no estériles y tiempos de incubación subóptimos como los posibles
causantes de una prueba no valida, este ensayo está estandarizado por parte de los investigadores de los
laboratorios de biotecnología de la universidad y el procedimiento requiere al menos una hora de incubación
por cada etapa en la preparación, adicionalmente el uso de placas no estériles da paso a errores en las
lecturas del espectrofotómetro que como se observa en las diferentes celdas sin muestras puede provocar
lecturas superiores a las observadas en los pocillos con reacción (Tabla 1).

CONCLUSIONES
 Las pruebas de Torch nos permiten identificar la presencia de toxoplasmosis, rubeola,
citomegalovirus y herpes en muestras de suero sanquíneas. Ninguna de las tres muestras tuvo
resultado positivo para los antígenos de estos patógenos, en algunos kits las pruebas resultaron
inválidas pues la franja de control no fue visible. Los kits de TOXO IgG/IgM detectaron IgG
positivas para el patógeno en uno de los sueros.
 La prueba de ELISA puede emplearse para la identificación y cuantificación de antígenos o
anticuerpos, el ensayo de ELISA indirecto permitió probar sueros de conejos inmunizados con E.
coli K88 Y K99 mas la validez de la prueba no pudo ser confirmada aunque las absorbancias
mostraran resultados positivos de formación del complejo a medida que disminuían las
concentraciones de la solución antigpenica.

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