MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA

Microscopía de fluorescencia: Descubierto en 1908 por Köhler y Siedentopf, y se basa en que una
sustancia natural en las células o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un
haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbida como rayas luminosos.

Siendo escasas las moléculas autofluorecentes, su aplicación más difundida es para revelar una
fluorescencia agregada, como en la detección de antígenos o anticuerpos. También se puede
inyectar moléculas fluorescentes específicas en un animal o directamente en células y usarlas
como marcadores.

Fluorocromos: Pueden usarse directamente, aprovechando la propiedad de unirse a determinadas

moléculas u orgánulos. Pero lo más habitual es que estos colorantes se empleen conjugados a
otras moléculas, como anticuerpos, que son capaces de unirse de modo específico a estructuras
concretas de la célula. Algunos colorantes denominados fluorocromos tienen la propiedad de ser
excitados (pasar a un nivel superior de energía) cuando absorben luz ultravioleta (luz de longitud
de onda corta).

Problema: La utilización de fluorocromos pierde grandes intensidades de luz empleadas, entonces

no pueden observadas durante largos periodos de tiempo debido a la desaparición de la
fluorescencia.

Fluorescencia: A medida que las moléculas excitadas regresan a su estado normal liberan el exceso
de energía en forma de luz visible de mayor longitud de onda que la radiación excitante. Los
objetos fluorescentes aparecen brillantemente iluminados contra un fondo oscuro, según el color
del colorante usado.

Epifluorescencia: Hoy día se utiliza mucho un microscopio de fluorescencia en el cual la luz es

emitida desde arriba del preparado. Por lo tanto, el objetivo del microscopio actúa como lente
iluminadora y de imagen.

CONSTITUCION FUNDAMENTAL:

Fuente luminosa (lámpara de mercurio o halógena): Debe emitir la mayor cantidad de luz
ultravioleta en el límite del espectro visible, que atraviesan el material de la preparación de la
misma forma en que lo hace un microscopio óptico común

Objetivos: Suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiación ultra-violeta.

Filtros: Retienen la radiación ultra-violeta, peligrosa para el ojo humano, dejando pasar solamente
la radiación visible, que no es peligrosa. Existen un gran número de juegos de filtros de excitación
y de emisión para los diferentes fluorocromos:

*El de excitación: Ubicada entre la fuente de luz y el preparado. Permite el paso de ondas de luz
con longitud que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado exclusivamente
por la luz azul y produzca emisión de luz fluorescente.
*El de barrera: Ubicada antes del ocular para prevenir daños retinianos que podrían ser causados
por rayos ultravioleta que escapan el espejo dicrómico. Corta completamente la luz de excitación
no deseada, es decir selecciona la longitud de onda de emisión del fluorocromo.

*Espejo Dicroico: Permite la separación de la luz de excitación y la fluorescencia.

Posicionado en 45° respecto al eje óptico, la longitud de onda más corta es reflejada y la longitud
de onda más larga lo atraviesa.

FUENTE: http://morfoudec.blogspot.com/2008/07/microscopa-de-fluorescencia.html

COMPARACION CON MICROSCOPIO CONVENCIONAL

Este microscopio es similar al microscopio convencional, a excepción de que la luz incidente que
procede de una potente fuente atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de onda capaz
de excitar al fluorocromo.

Otra diferencia radica en que la luz de iluminación (excitación) no está involucrada en la formación
de la imagen. En este sentido la microscopía de fluorescencia difiere de la microscopía normal en
la cual la imagen es formada por la luz de iluminación.

FUNDAMENTO FISICO

La luz de una fuente de longitud de onda múltiple se mueve a través de un filtro excitador que solo
permite que pase la radiación excitada de la longitud de onda deseada. Esta radiación es reflejada
por el filtro dicromático y enfocada por la lente del objetivo sobre la muestra, las moléculas
fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda
específica y mayor. Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a través del filtro
dicromático y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia
de la radiación de excitación. Ejemplo:

1. Primer filtro de excitación: selecciona la luz de la longitud de onda incidente. En el esquema está
seleccionando luz de longitud de onda entre 450 y 490 nm (azul)

2. Espejo dicroico: Refleja la luz de ciertas longitudes de onda y de dejar pasar otras. En este caso
refleja luz de longitud de onda menos de 510 nm (por ello refleja la luz incidente azul) y deja pasar
la luz de longitud de onda superior a 510 nm, dejando pasar la luz verde emitida por el
fluorocromo .
3. Segundo filtro de barrera: Es el filtro que selecciona la luz de longitud de onda fluorescente. En
este caso deja pasar la luz de longitud de onda 520 a 560 nm.

Entre otros aspectos o fundamentos, importantes a considerar tenemos:

*El largo de onda de la fluorescencia (emisión) es generalmente más largo que el largo de onda de
la luz excitadora

*Mientras más larga sea la longitud de onda, más baja es la energía de la luz. Por lo tanto la
energía de la fluorescencia es mas baja que la luz absorbida.

*La intensidad de la fluorescencia es generalmente mucho más baja que la de la luz de excitación

*La fluorescencia se desvanece.

*Cada substancia posee un espectro de fluorescencia característico.

FUENTE: http://morfoudec.blogspot.com/2008/07/microscopa-de-fluorescencia.html

APLICACIONES

1. Auto fluorescencia: Detecta la fluorescencia emitida por moléculas de la muestra misma.

2. Fluorescencia inducida: Partes específicas de la muestra pueden ser observadas selectivamente,

mediante métodos de tinción. Ej: substancias específicas como organelos celulares, proteínas,
anticuerpos, DNA, RNA, etc.

3. Sobre objetos bastante más pequeños que la limitación del poder de resolución, siempre que su
emisión de luz sea lo suficientemente intensa. Ej: molécula de DNA, un virus.
 MICROSCOPÍA EN CONTRASTE DE FASE
Se usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las células
sin colorear. Es ideal para especimenes delgados, o células aisladas. El microscopio de fase ilumina
el espécimen con un cono hueco de luz, como en el microscopio en campo oscuro. Sin embargo en
el microscopio de fase el cono de luz es más estrecho y entra en el campo de visión del objetivo,
que contiene un dispositivo en forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un
cambio de fase de un cuarto de la longitud de onda. Este tipo de iluminación provoca variaciones
minúsculas en el índice de refracción de un espécimen transparente, haciéndolo visible. Este tipo
de microscopio es muy útil a la hora de examinar tejidos vivos, por lo que se utiliza con frecuencia
en biología y medicina

¿Qué es el microscopio de contraste de fase?

Para poder observar una célula o tejido al microscopio de campo claro convencional hay que fijarla
y hacerle una tinción, lo que implica, la muerte de la célula en cuestión. Esto siempre ha sido una
preocupación para los expertos en el campo del estudio celular, debido que al pasar por todos
estos procesos, algunas estructuras pueden dañarse o cambiar su forma. Para esto se utiliza el
microscopio de contraste de fase (entre otros métodos más modernos), que permite realizar
exámenes inmediatos y observar células vivas.

La microscopía de contraste de fase, fue desarrollada fundamentalmente por Zernike en 1932. Se

basa fundamentalmente en el retraso que se produce en las ondas de luz al atravesar objetos de
distintos índices de refracción, aprovechando y amplificando dichos retrasos.

El microscopio de contraste de fase permite observar células sin colorear y resulta especialmente
útil para células vivas.

Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una
célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice
de refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de
ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de
una serie de anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera
de fase inicial del haz de luz y produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la
imagen corresponden a las porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen
corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar
células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.

Constitución del microscopio de contraste de fase

Fundamentalmente el microscopio de contraste de fase es un microscopio óptico de campo claro

con algunas modificaciones, como objetivos y condensadores especiales.

El condensador presenta un disco que proyecta un haz de luz con forma anular, y en la lente de
salida de los objetivos, se agregan unos “anillos de fase”, que son discos transparentes con un
diseño en relieve, cabe destacar que existen dos tipos diferentes de anillos de fase, denominados
positivo y negativo, los cuales tienen distintos efectos sobre la luz y por lo tanto, las imágenes se
ven diferentes en cada uno, esto se explicará más adelante.
 FUENTE: http://morfoudec.blogspot.com/2008/07/microscopa-de-contraste-de-fase.html

En la figura superior se muestra la ubicación del anillo de fase y el condensador anular en el

microscopio. Además en la de la derecha, se muestra un corte de un objetivo, mostrando el disco
de fase. Hay que considerar además que cada una de estas parte no es única, sino que existen
varios juegos de condensadores y de objetivos, dependiendo de la ocasión y el zoom que se
necesite.

Fundamentos físicos:

Como ya mencioné, este microscopio se basa en que la luz, al atravesar objetos con distintos
índices de refracción, experimente retrasos (o desfases), sin embargo, estos no son tan notorios
como para poder observarlos, el microscopio de contraste de fase, mediante las dos adaptaciones
que aparecen arriba, acentúa dichos retrasos, haciendo que zonas con distintos índices de
refracción se traduzcan en una variación de contraste lo cual puede ser observado.

FUENTE: http://morfoudec.blogspot.com/2008/07/microscopa-de-contraste-de-fase.html
La manera de funcionar es la siguiente: Por medio del condensador, se logran separar los rayos
luminosos que no son difractados por el objeto de los que no lo hacen, al pasar por la muestra, los
rayos que atraviesan objetos más densos, experimentan un retraso de un cuarto de lambda, y al
pasar por el anillo de fase estos rayos, debido a la forma del anillo de fase, estas ondas se retrasan
un cuarto de lambda más, en cambio, las que no se han retrasado, pasan por una parte más
delgada del anillo de fase y no se siguen retrasando. Entonces estos desfases de las ondas
luminosas se perciben como diferencias en el contraste, en distintos tonos de gris. Además el
anillo de fase disminuye la intensidad de la luz.

Aplicaciones

El microscopio de contraste de fase, debido a sus propiedades, se utiliza para exámenes

inmediatos (o invivo), este tipo de microscopio ha desplazado en uso al de campo claro.

Cabe destacar como desventaja, el que los objetos se vean delimitados por un halo o aura brillante
alrededor en el caso del contraste de fase positivo, o por una sombra en el caso del contraste
negativo, defecto producido por la manera de que se producen las imagenes.

BLIOGRAFIA

--. (--). Tecnología Médica. --, de Colegio Tecnológico de Chile Sitio web:
http://morfoudec.blogspot.com/2008/07/microscopa-de-contraste-de-
fase.html
Tecnología médica. (---). Microscopia de fluorescencia. ---, de -- Sitio web:
http://morfoudec.blogspot.com/2008/07/microscopa-de-fluorescencia.html
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTIN
FACULTAD DE INGENIERIA DE PROCESOS
ESCUELA PROFECIONAL DE INGENIERIA QUIMICA

TEMAS:
MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
MICROSCOPÍA EN CONTRASTE DE FASE

DOCENTE
ING. MARCIA JUANA QUEQUESANA BEDREGAL
ALUMNOS
 FERIA QUINTANA RAFAEL
 CAIRA INCAHUANACO DAVID
 MARQUEZ RODRIGUEZ SAMANTHA
 QUISPE ORTIZ JHON
 HUILLCA PALOMINO MICHAEL
 LUIS ANGEL ANCO ALVIZ
AREQUIPA - 2019