UNIVERSIDAD CATOLICA SANTA MARIA

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL

CURSO: MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

PRACTICA N° 5

DETERMINACION DE LA CURVA DE CRECIMIENTO, EFECTO DE

FACTORES EXTERNOS

​OBJETIVOS
1. Que el estudiante conozca las fases de una curva de crecimiento
2. Que se observe la velocidad de crecimiento
3. Que el alumno aprenda a calcular parámetros cinéticos (/*, td) característicos de las
especies bacterianas.

Introducción
El crecimiento se da como Crecimiento individual donde se da el incremento en el tamaño y
peso de cada microorganismo y Crecimiento poblacional incremento en el número de células.
Por la división celular.
Se considera la Tasa de Crecimiento como el cambio del número de células o masa por unidad
de tiempo.
Las fases de crecimiento de una población bacteriana pueden determinarse midiendo la turbidez
del cultivo. Aunque dicha turbidez no es una medida directa del número de células, su
incremento es una indicación del crecimiento bacteriano.

Para estas determinaciones se utiliza un espectrofotómetro, en el cual la luz pasa a través del
cultivo bacteriano hasta alcanzar una célula fotoeléctrica conectada a un galvanómetro. A
medida que la concentración celular aumenta, el cultivo se hace más turbio, y se reduce la
cantidad de luz transmitida que alcanza la célula fotoeléctrica, como consecuencia de la
difracción de la luz por parte de las células.
Existen factores que influyen en el crecimiento como factores externos ambientales como T°,
P°, H​2​O, pH, O​2​, CO​2​, factores nutricionales como N y C y Factores internos como la capacidad
metabólica.

CICLO DEL CRECIMIENTO POBLACIONAL:

El ciclo de crecimiento poblacional de bacterias se puede dividir en varias fases por lo que varía
la curva de crecimiento. Dichas fases son:
● Fase de retardo o de Retraso (fase “lag”)​: Es el período de tiempo durante el cual el
inóculo se adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha sembrado. Es un
período de ajuste metabólico. Puede ser breve o largo. Su duración depende de varios
factores: tamaño del inóculo; estado metabólico previo del inóculo, etc.
El valor del tiempo de generación (g) depende de: composición del medio, temperatura, pH,
osmolaridad, etc.
Varía el desarrollo dependiendo de las características de la bacteria si ésta es vieja o es un
cultivo nuevo.
Es una fase de preparación y de adaptación al medio, su duración depende del medio de cultivo
y el estado fisiológico de las células vivas.

● Fase de crecimiento exponencial (= fase logarítmica​): Esta fase se debe a que cada
célula entra en la fase exponencial con desfase respecto de sus compañeras. Ello
 demuestra que las células del inóculo no están todas en las mismas condiciones
fisiológicas.
Durante la fase logarítmica se da un crecimiento balanceado no restringido durante unas pocas
generaciones. Cada célula se divide para formar dos células, cada una de ellas forma
otras dos células y así sucesivamente. La mayoría de estos organismos unicelulares
crece exponencialmente. La velocidad de crecimiento exponencial varía mucho de un
organismo a otro, unas bacterias crecen muy rápidamente y otras muy lentamente. Las
condiciones ambientales afectan a la velocidad de crecimiento exponencial, tales como
la temperatura, la composición del medio de cultivo, etc.

● Fase estacionaria​: Previa una fase de aceleración negativa, de crecimiento

desequilibrado, esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de crecimiento se
hace nulo (m = 0), pero aún existe crecimiento. Lo que ocurre es que el crecimiento
bruto se equilibra con las muertes celulares. Hay limitación de nutrientes especiales y
se acumulan sustancias de desecho.
En  ella  no  se  incrementa  el  número  de  bacterias  (ni  la  masa  u  otros  parámetros  del 
cultivo).  Las  células  en  fase  estacionaria  desarrollan  un  metabolismo  diferente 
al  de  la  fase  de  exponencial  y  durante  ella  se  produce  una  acumulación  y 
liberación  de  metabolitos  secundarios  que  pueden  tener  importancia en el curso 
de las infecciones o intoxicaciones producidas por bacterias. 
El crecimiento se detiene, los nutrientes indispensables se detienen 
 

● Fase de muerte exponencial: Se da muerte y lisis masiva, exponencial, del cultivo. Se

debe al agotamiento de reservas de energía.

El cambio de luz se registra en el espectrofotómetro como porcentaje de transmisión (cantidad

de luz transmitida) y absorbancia o densidad óptica (D.O.), valor derivado del porcentaje de
transmisión, correspondiente al log del cociente entre la intensidad de luz incidente sobre la
suspensión (Io) y la de la luz transmitida por la suspensión (I). A = log Io/I. Cuando se inocula
una pequeña población bacteriana en un medio de cultivo líquido adecuado, generalmente el
crecimiento no comienza inmediatamente, sino que hay un período de latencia. Una vez que
empieza el crecimiento, se observa un incremento exponencial en la densidad celular, que
corresponde a la fase exponencial de crecimiento.

Esta fase es la más significativa en el ciclo de crecimiento de los microorganismos y se

caracteriza porque los parámetros cinéticos del crecimiento (μ, q) se mantienen constantes. A
medida que el crecimiento avanza, la concentración de los nutrientes esenciales disminuye, y se
acumulan los productos finales del metabolismo, hasta que el crecimiento llega a detenerse, de
modo que el cultivo entra en fase estacionaria. Después las células lentamente se mueren,
lisándose en algunos casos, en una última fase de muerte celular.
Uno de los más básicos modelos matemáticos en biología es la ecuación de crecimiento
exponencial para microorganismos. Esta ecuación puede ser usada para calcular la cantidad de
microorganismos o biomasa (X) después de una cierta cantidad de tiempo. La biomasa puede
ser la masa física de los microorganismos, la concentración de las células u otro tipo de
medición que ayude a especificar cuántos microorganismos hay presentes (como densidad
óptica, OD). En la presente práctica nos centraremos en la cantidad de microorganismo. En la
ecuación del modelo de crecimiento exponencial, no se considera una limitación o inhibición
por sustrato.

● X​t​ es la concentración de biomasa al punto de tiempo t [g L​-1​]

● X​t0​ es la concentración de biomasa a tiempo inicial [g L​-1​]
● µmax es la tasa máxima de crecimiento específico [h​-1​]
● t es el tiempo [h]
● t​0​ es el tiempo en que el experimento inicia. Normalmente es cero [h]

Esta ecuación será importante luego, para poder obtener el tiempo de duplicación:

MATERIALES
● Microorganismo utilizado: ​Escherichia coli, y Levaduras
● Medio de cultivo: Caldo Nutritivo
● Asas
● Escala de McFarland
● Tubos
● Frascos
● Ependorf
● Espectofotómetro.

METODOLOGIA

PROCEDIMIENTO:
● 1ºDIA ​.- Preparación del preinóculo: se siembra un tubo con 10 ml de medio líquido
caldo nutritivo con ​E.coli​ y Levaduras, y se cultiva a 37ºC
 ● 2º DIA.​- A partir de este cultivo reciente, se siembra con pipeta estéril un volumen
determinado en un matraz con 500 ml de Caldo Nutritivo, y se mide la D.O. en el
espectrofotómetro. Esta medida corresponde al tiempo 0.
Situar el matraz en un agitador orbital a 37ºC y 180 r.p.m. La D.O. debe medirse cada hora y por
12 horas, teniendo cuidado de agitar el matraz antes de tomar la muestra para realizar las
medidas.

MEDIDA DEL CRECIMIENTO EN ESPECTROFOTÓMETRO

1. Encender el aparato manteniéndolo 5 minutos de precalentamiento antes de realizar la
lectura.
2. Fijar la λ=600 nm, para absorbancia.
3. Fijar el 0 del aparato con el botón A hasta que la aguja mida 0% transmitancia.
4. Colocar el control correspondiente
5. Para medir las muestras, tomar 1 ml de cultivo bien homogenizado en un tubo y situarlo
en el lugar de las muestras y anotar la absorbancia (D.O.).

RESULTADOS
Crear una tabla donde se muestren los 12 valores de tiempo con sus correspondientes
mediciones de D.O. y el valor de µmax para cada uno de ellos.
Realizar la gráfica de tiempo (t) y D.O. y tiempo (t) y Ln (D.O.)

CUESTIONARIO
1. Resumir que ocurre en cada una de las fases.
2. Importancia de la determinación de la cinética de crecimiento.
3. Indique que factores internos influyen en el crecimiento microbiano.
4. Indique que factores externos influyen en el crecimiento microbiano
5. Realiza una búsqueda bibliográfica para determinar cuáles son los valores por
heurísticas de µmax para bacterias, hongos y levaduras.
6. Con los datos obtenidos experimentalmente (11 mediciones) hallar el valor práctico de
µmax. Recuerda que para determinarlo, se deberá reemplazar los valores de D.O.
obtenidos en cada lectura en la ecuación inicial y hallar el promedio del mismo.
7. Con el valor obtenido en el punto anterior, determinar el T​D​.