INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Laboratorio de Bioquímica General
Manrique Abad Zuri, Cuellar Aguilar Emanuelle.
4QV2 Sección 2 Fecha de entrega 05/05/19

Aislamiento de ADN plasmídico

INTRODUCCIÓN ● Aislar DNA plasmídico
Los plásmidos son moléculas Bacteriano, comprobando dicho
pequeñas de ADN circular muy aislamiento mediante
comunes en bacterias que se replican electroforesis en gel de agarosa.
de modo autónomo e independiente del
cromosoma de la célula. Constituyen RESULTADOS
una herramienta fundamental en
Biologiá Molecular e Ingenieria ́
Genética ya que se pueden usar como
“vectores” para introducir en ellos
cualquier fragmento de ADN de interés
y de esta forma amplificarlo (es lo que
se llama “clonar” un fragmento de
DNA). La obtención de grandes
cantidades de ADN puro de estos
“vectores” es fundamental en
aplicaciones posteriores. En esta
práctica se realizará el aislamiento y
purificación de un ADN plasmid ́ ico
mediante la utilización de un “kit” de
uso rutinario en laboratorios de
Biologia ́ Molecular. Posteriormente se
visualizará mediante electroforesis en
gel de agarosa.
DISCUSIÓN
Electroforesis de ácidos nucleicos
en gel de agarosa El problema principal que hay que
Mediante la utilización de este método resolver es la separación del DNA
de extracción y purificación se obtendrá plasmídico y DNA cromosómico. En
ADN plasmid ́ ico. Mediante la este ensayo se optó por el método de
visualización en el gel de agarosa se “lisis alcalina”, por su simplicidad, bajo
podrá comprobar la cantidad de costo y reproducibilidad. Este método
plásmido obtenido en relación al patrón explota las diferencias en las
que se utilice en la electroforesis. propiedades de desnaturalización y
OBJETIVOS renaturalización entre el DNA
p lasmídico (pequeños círculos de DNA
cerrados covalentemente) y el DNA
cromosómico (fragmentado).
La alcalinización con NaOH en
presencia de un detergente
fuertemente aniónico (SDS), provoca la
lisis celular, la desnaturalización del
DNA cromosómico y de las proteínas, y
la liberación de los plásmidos. Los
plásmidos se ven menos afectados por
su pequeño tamaño y estructura
superenrollada. La neutralización del
medio en presencia de una
concentración alta de sal (acetato
potásico), provoca la precipitación de
las proteínas (por el tratamiento con el
detergente y la insolubilidad de la sal
potásica del dodecil sulfato) y la del
DNA cromosómico (por reasociaciones
aleatorias intracatenarias). Los
agregados insolubles de proteínas y
DNA cromosómico se separan por
centrifugación del DNA plasmídico que
queda en el sobrenadante y conserva
mayoritariamente su estructura nativa.
Posteriormente, para obtener el DNA
plasmídico en el sobrenadante, se
utilizó Isopropanol (alcohol con baja
constante dieléctrica), cuyo efecto al
adicionarlo propicia la precipitación del
DNA plasmídico, bajando la constante
dieléctrica, neutralizando las cargas
que poseen los ácidos nucleicos y de
esta manera provocando que ya no
sea soluble en agua; pero también
puede provocar que se cambie la
estructura del ácido nucleico al
disminuir o neutralizar a los grupos
fosfatos y así causando la agregación
del DNA. Este paso es esencial para
obtener el plásmido, pues al eliminar el
sobrenadante se pueden eliminar
algunas impurezas, pero para asegurar
la purificación del plásmido se agrega
posteriormente etanol, pero al 70%.
Esto es para que el plásmido
permanezca precipitado, mientras que
los demás contaminantes se disuelvan
en el agua y separarlos de la mezcla,
para finalmente, con el plásmido en
forma de “pellet”, resuspenderlo en
agua y tenerlo listo para usos
posteriores, como el ensayo de
restricción.
CONCLUSIONES
Las enzimas de restricción resultan
útiles para romper plásmidos en sitios
específicos.
La correcta purificación del plásmido
resulta imprescindible para así evitar
contaminaciones significativas de DNA
genómico. El plásmido debe
predominar en su forma abierta para
realizar el corte ya que así es más
accesible el sitio a seccionar para la
enzima.
BIBLIOGRAFÍA
Sambrook J, Russell DW (2001)
“Molecular Cloning: A Laboratory
Manual”, 3a ed. Cold Spring Harbor
Laboratory Press.
Birren B, Ed (1999) Genome Analysis.
A Laboratory Manual Series, 4
Volúmenes. Cold Spring Harbor
Laboratory Press.
Davis LG, Dibner MK, Battey JF (1986)
Basic Methods in Molecular Biology.
Elsevier.