Libro - Microbiologia General - RESUMEN 2019

Universidad Nacional Daniel Alcides Carrión Cátedra: Microbiología General
Mg. Blgo. Julio IBÁÑEZ OJEDA 1 E-mail: jibanezo@undac.edu.pe

NORMAS DE SEGURIDAD EN LABORATORIO

MICROBIOLOGIA GENERAL
El trabajo en el laboratorio requiere la observación de una serie de normas de seguridad que eviten posibles accidentes
debido a desconocimiento de lo que se está haciendo o a una posible negligencia de los alumnos que estén en un
momento dado, trabajando en el laboratorio.
NORMAS PERSONALES
1. Cada grupo de prácticas se responsabilizará de su zona de trabajo y de su material.
2. Es conveniente la utilización de mandil blanco o chaqueta blanca, ya que evita que posibles proyecciones de
sustancias químicas lleguen a la piel. por supuesto además, evitarás posibles deterioros en tus prendas de
vestir.
3. Si tienes el pelo largo, es conveniente que lo lleves recogido.
4. En el laboratorio está terminantemente prohibido fumar, tomar bebidas y comidas.
NORMAS DE UTILIZACIÓN DE PRODUCTOS QUIMICOS

1. Antes de utilizar un compuesto, asegurarse bien de que es el que se necesita, ver el rótulo.
2. Como regla general, no coger ningún producto químico. El docente te lo proporcionará.
3. No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados sin consultar con el
profesor.
4. Es muy importante que cuando los productos químicos de desecho se viertan en la bandeja de desagüe,
aunque estén debidamente neutralizados, debe dejarse que circule por la misma, abundante agua.
5. No tocar con las manos y menos con la boca, los productos químicos.
6. No pipetear con la boca. utilizar la bombilla manual o una jeringuilla.
7. Los ácidos requieren un cuidado especial. cuando queramos diluirlos, nunca echaremos agua sobre ellos;
siempre al contrario, es decir, ácido sobre agua.
8. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc) no deben estar cerca de fuentes de calor. Si hay que
calentar tubos con estos productos, se hará al baño maría, nunca directamente a la llama.
9. Si se vierte sobre ti cualquier ácido o producto corrosivo, lávate inmediatamente con mucha agua y avisa al
profesor.
10. Al preparar cualquier disolución se colocará en un frasco limpio y rotulado convenientemente.
NORMAS DE UTILIZACION DE VIDRIO

1. Cuidado con los bordes y puntas cortantes de los tubos u objetos de vidrio.
2. El vidrio caliente no se diferencia a simple vista del vidrio frío. Para evitar quemaduras, dejarlo enfriar antes de
tocarlo.
3. Las manos deberán ser protegidos con guantes o trapos cuando se introduzca un tapón en un tubo de vidrio.
4. Si tienes que calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo, observa cuidadosamente estas dos
normas:
 Ten sumo cuidado que la boca del tubo de ensayo no apunte a ningún compañero.
 Puede hervir el líquido y salir disparado, por lo que podrías ocasionar un accidente.
NORMAS DE UTILIZACIÓN DE BALANZA

1. Cuando se determinan masas de productos químicos con balanza, se colocará papel de filtro sobre los platos
de la misma y si es necesario porque el producto a pesar fuera corrosivo, se utilizará un vidrio de reloj.
2. Se debe evitar cualquier perturbación que conduzca a un error, como vibraciones debidas a golpes, aparatos en
funcionamiento, soplar sobre los platos de la balanza, etc.
CONTENIDO
ITEMS Pág.
 Contra carátula……………………..…………………………………………………………………………………...…. 02
 Normas de Seguridad en Laboratorio Microbiología de Alimentos.................................................................... 03
 Contenido........................................................................................................................................................... 04
 Práctica No. 01: El Microscopio, partes y funcionamiento……………….............................................................. 05
 Práctica No. 02: Coloraciones o Tinciones: Simple, doble y neutra…………………………………………………. 11
 Práctica No. 03: Coloraciones o Tinciones de Gram y Ácido Resistente.............................................................. 15
 Práctica No. 04: Agrupaciones Bacterianas en Cocos, Bacilos y/o Espirilos........................................................ 21
 Práctica No. 05: Coloración de Bacterias Esporuladas......................................................................................... 24
 Práctica No. 06: Coloración de cápsula bacteriana.............................................................................................. 27
 Práctica No. 07: Reconocimiento del Rhizobium sp............................................................................................. 30
 Práctica No. 08: Microorganismos de aire por exposición en placa...................................................................... 34
 Práctica No. 09: Coliformes en Aguas de uso industrial o doméstico................................................................... 37
 Practica No. 10: Microorganismos mesofilos aerobios viables en alimentos…………………….………………… 41
 Practica No. 11: Bacterias lácticas en alimentos……………………………………………………………………… 44
 Práctica No. 12: Levadura: Sacharomyces cerevisiae en alimentos.................................................................... 47
 Bibliografía............................................................................................................................................................ 60

EL MICROSCOPIO: PARTES Y FUNCIONAMIENTO

PRÁCTICA No. 01
I. INTRODUCCIÓN
OBJETIVO
El objetivo que persigue la práctica siguiente es:
- Conocer, a través de la observación y manipulación, las funciones que presentan los diversos sistemas
(componentes), que integran el microscopio óptico haciendo uso de uno de éstos instrumentos presentes en
el laboratorio.
- Diferenciar algunos instrumentos ópticos como microscopios compuestos, lupas y estereomicroscopios
presentes en el laboratorio de Industrias Alimentarias.
- Reconocer y familiarizar al alumno con el manejo de la lupa estereoscópica y microscopios ópticos presentes
en el laboratorio de Industrias Alimentarias, haciendo uso de una muestra de papel.
II. MATERIALES y METODOS

A) MATERIALES
- Microscopio Compuesto - Lámina portaobjeto
- Agua destilada - Lámina cubreobjeto
- Xilol - Pinzas
- Vaso de precipitación - Goteros
- Tela suave - Alcohol 96º.
- Aceite de inmersión
B) PROCEDIMIENTO
Técnica:
a. Colocar el microscopio, sobre la mesa de trabajo, transportándolo cuidadosamente teniendo en cuanta las
indicaciones que se dan para estos casos.
b. Identificar y ubicar los sistemas de soporte, aumento, ajuste y de iluminación del microscopio óptico
compuesto de acuerdo a la descripción que le da su manual y con el microscopio que Ud. lo tiene sobre la
mesa. revisar todas y cada una de las partes del microscopio, consultando la figura adjunta.
c. Observe que tanto en la parte superior como en la parte inferior del microscopio están colocados las piezas
ópticas (lentes y espejos), de tal manera que esta disposición asegura la observación de las imágenes de
los objetos.
d. Localice el sistema de iluminación situado por debajo de la platina y verifique su posición tanto del
condensador como del diafragma y del espejo. Establezca sus características y diferencias.
e. Localice los objetivos y verifique sus características y establezca las diferencias que hay entre los objetivos
a seco y objetivos a inmersión. Verifique el poder de resolución con cada uno de los objetivos, utilizando la
lámina con un preparado a seco, determine su distancia focal, distancia frontal, el poder de resolución de los
objetivos y que tipo de imagen se forma en ellos.
El preparado a seco se debe hacer con una muestra de papel periódico, para ello haga un recorte de la letra
"e" mas pequeña que encuentre. Con las pinzas coloque sobre la lámina portaobjeto, agregue una gota de
agua y cúbralo con la lámina cubreobjeto.
Accionando los tornillos del carro o charriot localice la letra "e" y observe en posición con respecto a la
misma letra vista fuera del microscopio. Nota alguna diferencia ?.
Ahora mueva el carro de tal manera que el preparado se deslice de derecha a izquierda. En qué dirección ve
Ud. moverse la imagen a través del ocular ?.
f. Observar el ocular y establezca sus características.

g. Observe y localice cada una de las partes del sistema de ajuste, soporte y establezca su posición,
características y utilización de cada uno de ellos.
h. En cuanto al sistema de iluminación:
 Verificar que los lentes y el espejo estén completamente limpios y que el diafragma del condensador este
abierto. Utilizar el espejo cóncavo y orientarlo a la fuente de iluminación.
 Colocar el objetivo de 10X en su posición normal, subir el condensador a tope si se necesita mayor
cantidad de luz o bajarlo si se necesita menor luz.
 Observar a través del ocular y luego coger con los dos dedos el espejo sin que tope con la superficie de
éste, y de inmediato se procede a maniobrar de tal manera que le permita captar la mayor cantidad de
luz y obtenga un campo nítido. La iluminación se consigue utilizando fuentes luminosas adecuadas ya
sea natural o artificial.
f. En cuanto al enfoque se debe proceder de la siguiente manera:
 Coloque la lámina portaobjeto en la platina, sujetando con las pinzas.
 Haga coincidir la muestra examen con la abertura de la platina y el frontal de objetivo.
 Coloque su vista sobre el ocular y desplace el tornillo macrométrico hasta que aparezca la magen.
 Con el tornillo micrométrico realice movimiento finos hasta que vea con nitidez la imagen.
Recuerde que los objetivos a seco tienen una distancia libre de trabajo ya determinada. Algunos
microscopios poseen topes al desplazarse para el enfoque, pero otros no y pueden deteriorarse y romper el
portaobjeto, destruyendo la muestra e inclusive el objetivo.
g. Coloque todas las partes del microscopio según lo indicado la guía.
III. CUESTIONARIO
1. ¿Qué diferencias funcionales existen entre los microscopios ópticos, electrónicos y lupas?
2. ¿Por que los objetivos dan una imagen real e invertida en los microscopios ópticos?
3. ¿Cuál es la diferencia entre el ocular y el objetivo de un microscopio?
4. Menciona 5 tipos de microscopios ópticos y sus fundamentos.
5. ¿Qué tipo de imagen producen las lupas estereoscópicas?
6. ¿Cuál es el limite de resolución (LR) de un microscopio, si se sabe que tiene una apertura numérica total
es de 1,4 y cuya  = 400 nm.?. Nota = 1 m equivale a 1000 nm. Rpta = 174 nm.
7. ¿Cuál será el aumento total de una levadura vista al microscopio óptico con un objetivo de 90X y un
ocular de 15X?. Rpta = 1350 aumentos.
8. Determine Ud. el poder de resolución (PR) de un microscopio sabiendo que la AN del condensador es de
0,9 y del objetivo de inmersión es de 1,25; con una  = 550 nm (0,55 m). Rpta = 0,255 m.
9. Si se sabe que una bacteria tiene un diámetro de 0,23 m. Diga Ud. si sería posible observarlo a una  =
550 nm. con un microscopio óptico cuya AN del condensador y objetivo son de 0,85 y 0,65
respectivamente. ¿Por qué?. Rpta = No es posible por que el PR es 0,47 m. Mientras que el de la
bacteria apenas es de 0,23 m.
10. Determine Ud. la AN del condensador sabiendo que el índice de refracción del medio es de 0,95 y el
ángulo de apertura es de 45º. Rpta = 0,67.

COLORACIONES O TINCIONES: SIMPLE, DOBLE Y NEUTRA

PRÁCTICA No. 02
I. INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
Al finalizar la practica, el alumno estará en la capacidad de:
- Realizar, a través de un frotis, tinciones bacterianas de tipo simple, doble y neutra a partir de muestras
biológicas, y su posterior observación al microscopio óptico.
- Observar la morfología bacteriana y diferenciar los distintos tipos de agrupaciones microbiológicas que
existen en la muestra tomada.
- Practicar un adecuado enfoque de la muestra a través del microscopio óptico, haciendo uso de los
diferentes objetivos óticos incluyéndose los de menor, mediano y gran aumento, asi como eld e inmersión.
I. MATERIALES y METODOS
1. COLORACIÓN SIMPLE
A) MATERIALES
- Muestra: Mucosa labial - Colorantes ácidos: Eosina, fucsina ácida o safranina. O
- Alcohol 96° - Colorantes básicos: hematoxilina, azul de metileno,
- Agua destilada violeta de genciana o fucsina básica.
- Lamina porta y cubreobjeto. - Algodón.
- Goteros y frasco lavador - Agua destilada
- Microscopio compuesto. - Cubeta de tinción.
B) PROCEDIMIENTO
Debe seguirse los pasos siguientes:
Técnica:
a. Obtener la muestra a través de un raspado de mucosa labial; luego, por extensión o frotis colocar la
lámina portaobjeto.
b. Seguidamente, debe hacerse la fijación la cual puede ser con alcohol, calor moderado del mechero,
secar al medio ambiente u otros fijadores.
c. Colorear de 1 a 5 minutos (con colorante ácido o básico).
d. Lavar con agua destilada a chorro lento.
e. Secar al medio ambiente o calor moderado.
f. Observar, empleando objetivos de mayor aumento y luego con el de inmersión.
2. COLORACIÓN DOBLE
A) MATERIALES
- Mucosa labial - Agua destilada
- Alcohol 96° - Lamina portaobjeto y cubreobjeto
- Colorantes acedos: Eosina. - Algodón
- Colorantes básicos: hemateina. - Xilol
- Goteros - Microscopio compuesto.
- Cubeta de tinción.
B) PROCEDIMIENTO
Técnica:
a. Obtener la muestra a través de un raspado de mucosa labial; luego, por extensión o frotis colocar la
lámina portaobjeto.
b. Seguidamente, debe hacerse la fijación la cual puede ser con alcohol, calor moderado del mechero,
c. Colorear de 3 a 5 minutos con el colorante hemateina
d. Colocar el preparado en agua destilada por un tiempo de 1 a 2 minutos
e. Agregar luego el colorante eosina en un tiempo de 5 a 10 minutos
f. Lavar con agua destilada a chorro lento.
g. Secar al medio ambiente o calor moderado.
h. Observar, empleando objetivos de mayor aumento y luego con el de inmersión.
3. COLORACIÓN NEUTRA
A) MATERIALES
- Sangre humana
- Alcohol 96º, mechero de alcohol
- Colorante: Wright, Leishman o May-Grunwald
- Agua destilada
- Lamina portaobjeto y cubreobjeto
- Algodón, gradillas, lanceta hémolet
- Microscopio compuesto
B) PROCEDIMIENTO
Técnica:
a. Obtener una gota de sangre a través de una punción en el dedo índice con una lanceta hemolet.
b. Luego, por extensión o frotis colocar el la lámina portaobjeto.
c. Seguidamente, debe hacerse la fijación la cual puede ser con alcohol, calor moderado del mechero,
d. Colorear con cualquiera de los tres colorantes antes mencionados, agregar aproximadamente el doble
de agua destilada al doble de la cantidad de colorante.
e. Dejar en reposo de 3 a 5 minutos.
f. Lavar con agua destilada a chorro lento.
g. Secar al medio ambiente o calor moderado.
h. Observar, empleando objetivos de mayor aumento y luego con el de inmersión.
II. CUESTIONARIO
1. ¿Qué tipos de morfología y agrupación aparecen en los frotis de los cultivos?
2. ¿Qué fin tiene la fijación de muestras al realizar un frotis bacteriano?
3. Señale las ventajas y desventajas de la tinción simple respecto del examen en fresco.
4. ¿Por qué en una tinción neutra el colorante tiñe a toda la estructura celular sin diferenciar?
5. ¿Que estructuras celulares son teñidos por colorantes ácido y básico?. Menciónelos.
6. ¿Qué diferencias existe entre un preparado en fresco y en seco?
7. ¿Qué diferencias existe entre una tinción doble y una neutra?.

COLORACIONES TINCIONES DE GRAM Y ACIDO RESISTENTE

PRÁCTICA No. 03
I. INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
- Realizar, siguiendo los protocolos respectivos, tinciones microbiológicas especiales de Gram y Ziehl-Neelsen, a
partir de muestras biológicas fijadas.
- Reconocer, a través del microscopio óptico, los microorganismos presentes en las muestras biológicas, teniendo
en cuenta sus características de color en las tinciones de Gram y Ziehl Neelsen, asi como sus diferencias
estructurales en estas tinciones.

1. TINCION DE GRAM
A) MATERIALES
- Sarro dentario, esputo o pus. - Alcohol acetona
- Frascos de vidrio - Agua destilada
- Asa de Koll - Colorante básico: Violeta de Genciana o Azul de
- Mechero Metileno
- Xilol - Colorante de contraste: Fucsina básica o Safranina
- Lamina portaobjeto y cubreobjeto - Gradillas de madera o Cubeta de tinción.
- Lugol - Microscopio compuesto.
B) PROCEDIMIENTO
Debe seguirse los pasos siguientes:
a. Recolectar la muestra examen (sarro dentario, pus o esputo) en un frasco de vidrio o petri previamente
esterilizado.
b. Con la asa koll esterilizada al calor, tomar una pequeña porción de la sustancia examen y realizar una
extensión o frotis en una lámina portaobjeto.
c. Seguidamente, debe fijarse la muestra al calor moderado.
d. Agregar el colorante básico elegido (violeta de genciana o azul de metileno) hasta cubrir el preparado y
dejarlo en reposo por espacio de 1 a 2 minutos.
e. Eliminar el exceso de colorante, sin lavar la lámina.
f. Agregar lugol hasta cubrir el preparado y dejarlo en reposo por espacio de 1 a 2 minutos.
g. Decolorar con alcohol-acetona (80 alcohol + 20 acetona), hasta que el preparado este incoloro.
h. Lavar el preparado en agua destilada
i. Añadir el colorante de contraste elegido (fucsina básica o safranina) y dejarlo en reposo por espacio de
1 a 2 minutos.
j. Lavar el preparado en agua destilada.
k. Secar el preparado al medio ambiente o al calor moderado.
l. Observar al microscopio con objetivo de inmersión e identificar los diferentes tipos de bacterias
(Streptococcos, Diplococcos, Bacillos, etc.). Aquellos teñidos de color violeta o azul son los Gram
positivos; mientras que, los de color rosado son los Gram negativos.
NOTA: La acción del lugol en esta coloración es conseguir una mayor fijación del violeta de genciana o
azul de metileno por parte de los gérmenes Gram positivos por unión del colorante con el yodo del lugol.

2. COLORACIÓN DE BACTERIAS ACIDO-RESISTENTES

Tinción de Ziehl– Neelsen (Método Caliente)
A) MATERIALES
- Esputo (de tuberculoso) o - Fucsina fenicada de Ziehl Neelsen,
secreción esmegmática. carbofucsina, fucsina básica o fucsina-
- Frascos de vidrio fenol
- Asa de Koll - Azul de metileno de Loefler
- Xilol - Agua destilada
- Algodón - Alcohol-ácido (ácido clorhídrico al 3%)
- Palitos mordadientes - Gradillas de madera o Cubeta de tinción.
- Mechero - Microscopio compuesto
- Mascarilla - Lamina portaobjeto y cubreobjeto.
B) PROCEDIMIENTO
Técnica
a. Hacer una extensión de raspado de secreción esmegmática (Mycobacterium smegmatis), esputo
(Mycobacterium tuberculosis o Mycobacterium phlaey ) o raspado epitelial (M. leprae), en una
lámina portaobjeto. Se recomienda tener sumo cuidado el uso de las dos últimas muestras, por
ser microorganismos altamente infectocontagiosos.
b. Fijar al calor del mechero.
c. Colocar la fucsina fenicada de Ziehl Neelsen.
d. Luego, se le hace flamear al calor con un hisopo de algodón impregnado de alcohol durante 5
minutos, sin que hierva el colorante, botar y lavar con agua destilada.
e. Decolorar con alcohol-ácido clorhídrico al 3%.
f. Agregar azul de metileno de Loefler y dejar en reposo por 1 a 2 minutos.
g. Lavar, secar y observar al microscopio con objetivo de inmersión e identificar los bacilos de color
rojo (Mycobacterium sp.) y el fondo de color azul.
Resultados:
Se observan los bacilos de Mycobacterium tuberculosis a manera de bastones delgados y se
agrupan próximos uno de otros desde 1 a más células. De coloración rojos, lo que contrasta con el
medio y otras bacterias que es azul o violeta (Ver cuadro adjunto para la lectura de resultados)
Cuadro: Método de los Centros para el Control de Enfermedades y la

OMS, en Smithwick, R. W. Laboratory Manual for Acid-fast
Microscopy. 2ª. Ed. Atlanta. Secretaría de Salud y Servicios de los
EUA. Centros para el Control de Enfermedades. 1976.
No. DE BACILOS ÁCIDO-
RESISTENTES (BAC) INFORME O BIEN
OBSERVADOS
0 Negativo en BAC -
1 – 2/300 campos Número observado ±
1 – 9/100 campos Número/100 campos 1+
1 – 9/10 campos Número/10 campos 2+
1 – 9/campo Número/campo 3+
9/campo 9/campo 4+
III. CUESTIONARIO
1. ¿Qué bacterias, de las que se han teñido, son Gram+ y Gram-? Fundamente y dé cinco ejemplos de cada uno.
2. ¿Existe alguna relación entre el tipo de morfología y la tinción de Gram? . Fundamente.
3. ¿Qué diferencias estructurales hay entre bacterias Gram+ y Gram-?. Fundamente.
4. ¿Por qué es necesario que la muestra no hierva durante la tinción con carbofucsina?
5. Otras bacterias que posean en su pared celular estructuras que proporcionen alta hidrofobicidad ¿serían
resistentes a la decoloración por ácidos y alcoholes en la tinción de Ziehl-Neelsen?.
6. En la tinción Gram ¿Qué función cumple el lugol?
7. Determine Ud. el principio por el cual los colorantes se adhieren a una muestra determinada.
8. ¿Por qué en la tinción Gram, las bacterias Gram+ se observan de color azul y las Gram- de color rojo. Asi
mismo, en las tinción de Ziiehl-Neelsen, ¿porque los microorganismos ácido-resistentes se tiñen de color rojo?.
9. ¿Cómo se caracterizan las lesiones por la lepra?

AGRUPACIONES BACTERIANAS: COCOS, BACILOS Y/O ESPIRILOS

PRÁCTICA No. 04
I. INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
 Reconocer, a través del microscopio óptico, las agrupaciones que presentan las bacterias, como: estafilococos,
estreptococos, diplococo , tetragenas o tetracocos, sarcinas, bacilos , estreptobacilos y/o espirilos, fijados con
una tinción simple.
 Diferenciar, a través del microscopio óptico, las agrupaciones que presentan las bacterias, como: estafilococos
(Staphylococcus sp.), estreptococos (Streptococcus sp.), diplococo (Streptococcus sp.), tetragenas o tetracocos
(Pediococcus sp.), sarcinas (Sarcina sp.), bacilos (Lactobacillus sp.) y/o espirilos (Vibrio sp.), fijados con una
tinción simple.

A) MATERIALES
- Muestra: Leche contaminada, raspado dérmico - Lamina portaobjeto y cubreobjeto
y/o sarro dentario. - Colorante: Azul de metileno al 10%
- Frascos de vidrio - Agua destilada
- Asa de Koll - Nitrato de plata amoniacal.
- Mechero de bunsen o de alcohol - colorantes Tinta Negra Parker 51 y
- Mascarillas Tinta China Pelikan R.
- Alcohol etílico 95º - Ácido tánico fenolado
- Formol al 10%. - Gelatina al 5%
- Nitrato de Plata al 1% y 2%. - Solución de hidroquinina al 3%.
- Solución de Tiosulfato de Sodio al 5% - Solución de goma de mascar.
- Xilol. - Foco de luz eléctrica
- Solución de Krajian - Lugol
- Revelador de Krajian - Cristal de violeta fenolada,
- Safranina - Microscopio óptico.
- Cubeta de tinción.
B) PROCEDIMIENTO
Tinción para Cocos y Bacilos
Técnica
a. Hacer una extensión de la muestras de leche contaminada, raspado dérmico o sarro dentario.
b. Fijar al calor del mechero.
c. Colorear con el colorante azul de metileno a 10% durante 5 minutos
d. Lavar con agua destilada
e. Secar al medio ambiente o mechero de alcohol.
f. Observar al microscopio con objetivo de mayor aumento e inmersión y determinar cada uno de los
microorganismos presentes según la practica.
g. Dibujar y comparar.
Resultados
Morfológicamente tanto los cocos como los bacilos se pueden diferenciar muy nítidamente a inmersión de
color azul.
III. CUESTIONARIO
1. Entre los géneros Streptococcus sp., Staphylococcus sp., Lactobacillus sp. y Diplococcus sp. ¿Cuál de ellos
presenta mayor tamaño?.
2. Que diferencia existe entre: colonia, célula, población y comunidad bacteriana?
3. Usando la tinción simple, ¿existe alguna diferencia cualitativa y cuantitativas entre los microorganismos
reconocidos? ¿por qué?.
4. Para la determinación de Lactobacillus sp, ¿por qué, se recomienda la leche como muestra?. Qué otra
muestra podría usarse?.
5. ¿Qué especies de diplococos, estreptococos, espiroquetas, sarcinas y tetracocos conoce?. Cite al menos
cinco especies de cada una.
6. ¿Que especies de Streptococcus sp y Lactobacillus sp. están asociados a la fermentación láctea?.
Menciónelas.
7. ¿Qué diplobacilos, estreptobacilos conoce?. Mencione tres ejemplos de cada uno.
8. ¿Qué enfermedades transmitidos por espiroquetas son recurrentes en el Perú?.

COLORACIÓN DE BACTERIAS ESPORULADAS

PRÁCTICA No. 05
I. INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
Al finalizar la practica, el alumno estarán en la capacidad de:
- Reconocer, morfológicamente, los géneros Clostridium sp. y Bacillus sp. a partir de muestras biológicas, a través
de tinciones especiales de esporas, con ayuda de un microscopio óptico y objetivo a inmersión.
- Establecer diferencias y tipos de endosporas, a través del microscopio óptico, en algunos géneros Clostridium o
Bacillus, usando algunas de las tinciones especiales mencionadas.

A) MATERIALES
- Muestra: Sangre periférica, conservas - Franela
o alimentos sospechosos. - Laminas portaobjeto y cubreobjeto
- Frascos de vidrio - Colorante: Verde de Malaquita al 5% y safranina
- Asa de Koll (colorante de contraste), Nigrosina y/o Fucsina fenicada
- Mechero bunse o de alcohol de Ziehl Neelsen.
- Xilol - Agua destilada
- Algodón - Microscopio óptico
- Mascarilla - Pinzas de madera
- Bombilla propipeta universal - Microscopio óptico y aceite de inmersión.
- Tubos de ensayo - Alcohol etílico 96º
- Gradillas de madera - Estufa o secador.
- Cubeta de tinción
B) PROCEDIMIENTO
1. Método de Bartholomew-Mittwer
Técnica:
a. Con ayuda de la asa koll, hacer una extensión o frotis de la muestras a trabajar sobre la lámina
portaobjeto.
b. Fijar al calor del mechero de bunsen pasando rápidamente tres veces por la llama, o secar al medio
ambiente.
c. Colorear con verde de malaquita al 5% y calentar hasta el desprendimiento de vapores por tres o cuatro
veces durante 5 minutos
d. Lavar suavemente con agua destilada
e. Colorear con safranina durante 1 minuto
f. Lavar con agua destilada y secar al medio ambiente o mechero
g. Observar y examinar la muestra con objetivo de inmersión.
Resultados
En muestras positivas, las bacterias aparecen de color verde y el cuerpo bacteriano de color rojo.
2. Método de Dorner
Técnica:
a. En un tubo de ensayo colocar una cantidad de cultivo usando agua destilada, emulsionar añadiéndose un
volumen igual de colorante Fucsina fenicada de Ziehl Neelsen.
b. Calentar suavemente el tubo o dejar en baño maría de 5 a 10 minutos a 40ºC.

c. Colocar una gota de este preparado sobre el portaobjetos y añadirse una gota igual de nigrosina hervida y
recientemente filtrada.
d. Extender suavemente la mezcla y dejar secar, bajo calor suave de la llama.
e. Examinar bajo el microscopio de inmersión
Resultados
Las esporas aparecen coloreadas de rojo, el cuerpo bacteriano se ve transparente bajo un fondo gris.
III. CUESTIONARIO
1. ¿Qué son las estructuras teñidas con verde malaquita que aparecen en el medio circundante?
2. ¿Todas las endosporas aparecen igual en las bacterias de la misma especie? ¿A qué se debe esta diferencia?
3. ¿Qué función cumple las endosporas en una bacteria?
4. ¿Cuáles son las formas de orígenes de las endosporas?
5. ¿Qué características estructurales condicionan la esporulación a una bacteria?
6. ¿En qué alimentos es frecuente la presencia de Cl. botulinum?.

COLORACIÓN DE LA CÁPSULA BACTERIANA

PRÁCTICA No. 06
I. INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
Al finalizar la practica, el alumno estarán en la capacidad de:
- Ejecutar, algunas de las tinciones especiales para cápsula: método de Maneval, Hiss, Anthony-Welch, Nigrosina,
Tinta China Pelikan R o Wright, siguiendo los protocolos establecidos, para luego observarlos al microscopio
óptico a inmersión.
- Reconocer, a través del microscopio óptico la estructura capsular (glicocalix) presente en el genero Klebsiella
obtenido a partir de muestras biológicas.

A) MATERIALES
- Muestra: Heces o esputo, sangre periférica, - Colorante: Verde de Malaquita al 5% y safranina
conservas o alimentos sospechosos. (colorante de contraste), cristal violeta al 1%, Maneval
- Frascos de vidrio B, fucsina básica al 0,15%, azul de metileno de
- Asa de Koll Loeffler o safranina, Wright o tinta china pelikan R.
- Mechero - Solución buffer de Sörensen
- Mascarilla - Solución de sulfato de cobre
- Laminas portaobjeto y cubreobjeto - Solución de rojo de Congo
- Cubeta de tinción - Microscopio óptico.
- Agua destilada
B) PROCEDIMIENTO
1. Método de Hiss
Técnica:
a. Realizar una extensión suave de la muestra utilizando suero fisiológico
b. Fijar al calor suave o al aire
c. Colorear con gotas abundantes de fucsina básica al 0,15% o cristal violeta al 0,1%.
d. Pasar y calentar en la llama hasta el desprendimiento de vapores por tres o cuatro veces.
e. Lavar la lámina con una solución de sulfato de cobre al 20% dejándolo actuar mas de 30 segundos.
f. Secar con papel de filtro o al ambiente.
g. Observar al microscopio óptico con objetivo de inmersión.
Resultado
La cápsula se observa de color azul-pálido y el cuerpo bacteriano de color granate.
2. Método de Nigrosina o Tinción Negativa

Técnica:
a. Mezclar una gota de suspensión del germen capsulado en una gota de Nigrosina al 10% sobre una
lámina portaobjeto durante 1 minuto.
b. Hacer una extensión empleando otra lámina.
c. Sacar y fijar al calor de una llama de mechero.
d. Contra colorear con azul de metileno de Loeffler o safranina.
e. Lavar con agua destilada.
f. Sacar al calor de una llama de mechero.
g. Observar al microscopio óptico con objetivo de inmersión.

Resultado
La cápsula aparece transparente bajo un fondo negro y el cuerpo bacteriano aparece de color azul o rojizo.
III. CUESTIONARIO
1. ¿Qué bacterias son formadoras de cápsula? Mencione al menos 5 especies.
2. ¿Por qué la presencia de cápsula en una bacteria aumenta su virulencia?
3. ¿Cómo se origina la síntesis de la cápsula bacteriana?
4. Los micoplasmas (PPLO) son formadoras de cápsula?. Si es así que tipo de polímeros forma?
5. En el método de Método de Anthony-Welch ¿Qué función cumple el sulfato de cobre?
6. ¿qué asociación tienen las lectinas con las cápsulas bacterianas?.
7. Dentro de la propiedad de adherencia que tiene las bacterias capsuladas, indique Ud. algunos efectos
benéficos que aquellas pueden brindar a los organismos superiores. Fundamente.

RECONOCIMIENTO DE Rhizobium sp.

PRÁCTICA NO. 07

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