GUÍA RÁPIDA DE KIT DE ADN DE TEJIDOS

EXTRACCIÓN DE ADN Y PURIFICACIÓN DEL TEJIDO

Este método es adecuado para el aislamiento de ADN de hasta 30 mg de tejido. Los

rendimientos varían dependiendo de la fuente. El protocolo se puede ampliar para acomodar
muestras de tejido más grandes, pero el TL Buffer adicional y BL Buffer deberán comprarse
por separado.

1. Pique hasta 30 mg de tejido y transfiéralo en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml

2. Añadir 200 μL de tampón TL.
Nota: Para acelerar la lisis, corte el tejido en trozos pequeños. Para muestras de más
de 30 mg, simplemente aumente el volumen de TL Buffer utilizado; para una muestra
de 40-60 mg usar 400 μL TL Buffer.
3. Añadir 25 μL de solución de proteasa OB. Vortex para mezclar bien.
4. Incubar a 55 ° C en un baño de agua con agitación.
Nota: Si no está disponible un baño de agua con agitación, agite la muestra cada 20-
30 minutos. El tiempo de lisis depende de la cantidad y el tipo de tejido utilizado. El
tiempo promedio suele ser inferior a 3 horas. La lisis puede proceder de la noche a la
mañana.

Opcional: Ciertos tejidos, como el tejido hepático, tienen niveles altos de ARN que se
purificarán conjuntamente con el ADN utilizando este kit. Si bien no interferirá con la PCR,
el ARN puede eliminarse en este punto.

1. Agregue 4 μL de ARNasa A (100 mg / ml) por 30 mg de tejido.

2. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 2 minutos.
3. Continúe con el paso 5 a continuación.

5. Centrifugar a la velocidad máxima (≥10,000 x g) durante 5 minutos

6. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga estéril de 1.5 ml. No molestar
ni transferir ninguno de los pellets insolubles.
7. Añadir 220 μl de tampón BL. Ajuste el volumen de BL Buffer en función de la
cantidad de material de partida. Vortex para mezclar bien.

Ejemplo:
Si usó 400 μL de TL Buffer, a continuación, agregue 420 μL de BL Buffer y 420 μL de
etanol al 100%.
Nota: Se puede formar un precipitado tenue al agregar BL Buffer. Esto no interfiere con la
recuperación del ADN.

8. Incubar a 70 ° C durante 10 minutos.

9. Añadir 220 μl de etanol al 100%. Ajuste el volumen de etanol requerido en función
de la cantidad de material de partida. Vortex para mezclar bien.
10. Inserte una mini columna de ADN HiBind® en un tubo de recolección de 2 ml.
 11. Transfiera toda la muestra del Paso 9 a la columna Mini DNA de HiBind®,
incluidos los precipitados que puedan haberse formado
12. Centrifugar a la velocidad máxima durante 1 minuto. Deseche el filtrado y reutilice
el tubo de recogida.
13. Añadir 500 μL de tampón HBC diluido con 100% de isopropanol
14. Centrifugar a velocidad máxima durante 30 segundos. Deseche el filtrado y el tubo
de recogida.
15. Inserte la mini columna de ADN HiBind® en un nuevo tubo de recolección de 2 ml.
16. Añadir 700 μL de tampón de lavado de ADN.
Nota: El tampón de lavado de ADN debe diluirse con etanol al 100% antes de su uso.
Centrifugar a velocidad máxima durante 30 segundos. Deseche el filtrado y reutilice
el tubo de recogida.
17. Repita los pasos 16 para un segundo paso de lavado con tampón de lavado de ADN.
18. Centrifugar la mini columna vacía de ADN de HiBind® a la velocidad máxima
durante 2 minutos para secar la columna
Nota: Este paso es crítico para la eliminación de trazas de etanol que pueden interferir
con aplicaciones posteriores
19. Transfiera la mini columna de ADN HiBind® a un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml
sin nucleasas
20. Añadir 100-200 μl de tampón de elución calentado a 70 ° C. Dejar reposar a
temperatura ambiente durante 2 minutos. Centrifugar a la velocidad máxima durante
1 minuto.
21. Repita los pasos 20 para un segundo paso de elución
22. Almacenar ADN eluido a -20 ° C.

EXTRACCIÓN DE ADN Y PURIFICACIÓN DE CÉLULAS CULTIVADAS

1. Prepare la suspensión celular utilizando uno de los siguientes métodos:

A) Las muestras de células congeladas deben descongelarse antes de comenzar este

protocolo. Pellet las células por centrifugación. Lavar las células con PBS frío (4°C).
Resuspender las células en 200 μL de PBS. Continúe con el paso 2.

B) Para células cultivadas en suspensión, pellet 5 x 106 girando a 1.200 x g en un tubo

de centrífuga. Aspire y deseche el sobrenadante, y lave las células una vez con PBS
frío (4°C). Resuspender las células en 200 μL de PBS. Continúe con el paso 2.

C) Para las células cultivadas en una monocapa, coseche la célula usando un tratamiento
con tripsina o raspando con un policía de goma. Lavar las células dos veces con PBS
frío (4°C). Resuspender las células en 200 μL de PBS. Continuar con el paso 2

2. Añadir 25 μL de solución de proteasa OB. Vortex para mezclar bien.

Opcional:
Las células cultivadas tienen altos niveles de ARN que se purificarán conjuntamente con el
ADN utilizando este kit. Si bien no interferirá con la PCR, el ARN puede eliminarse en este
punto.

1. Agregue 4 μL de ARNasa A (100 mg / ml) por 30 mg de tejido.

2. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 2 minutos.
3. Continúe con el paso 3 a continuación.

3. Continúe con el paso 7 del protocolo de EXTRACCIÓN DE ADN Y PURIFICACIÓN

DEL TEJIDO