Figura 5 La represión transcripcional no causa la contracción nucleolar y la carga de

condensación.

(A) La pérdida de Rrn3 es insuficiente para causar la contracción del núcleo. Las células WT Y
rrn3-1 de fase logarítmica que portaban YCS4-Myc9 marcadas cromosómicamente en YPD se
cambiaron de 23 a 38ºC y se incubaron durante 3 h. Se muestran imágenes fusionadas de tinción
nuclear (blanco brillante) y nucleolar (gris claro).

(B) La pérdida de Rrn3 es insuficiente para causar la carga de condensina en la matriz de ADNr.
Las muestras en (A) se examinaron para determinar la asociación con Ycs4-Myc9 con el
promotor del ADNr 35S y CUP1 por ChIP con el anticuerpo Myc (9E10). –Ab, no se utilizó
anticuerpo como control negativo.

(C) La pérdida de Pol I es insuficiente para causar la contracción del núcleo. Las células WT de
fase logarítmica temprana (RPA190), rpa190-1 y rpa190-3 en YPD se cambiaron de 23 a 371C y
se incubaron durante 3 h. Se muestra la tinción fusionada de Nop1 y DAPI.

(D) La pérdida de Pol I es insuficiente para causar la desacetilación de H4. Las muestras en (C)
se examinaron para determinar el nivel de acetilación de H4 en el promotor del ADNr 35S y las
regiones de transcripción 25S por ChIP con el anticuerpo anti-hipercetona H4 anti-
hiperacetilado. Se usó CAb, pre-suero de conejo como control negativo.

Figura 6 El tratamiento con rapamicina en ausencia de condensina causa el fenotipo de nucleolo

fragmentado como resultado de la formación de ERC. (A) El tratamiento con rapamicina del
mutante de condensina causa un fenotipo de nucleolo fragmentado. Las células WT y ycs4-2 de
fase logarítmica iniciales en YPD se cambiaron de 23 a 371C durante 2 h, seguido de incubación
con rapamicina 200 nM (þ Rap) o un portador de fármacos (Rap) durante 0, 1, 3 y 6 h. La
estructura nuclear se visualizó por IF con un anticuerpo Nop1 (blanco brillante). Se muestran
imágenes fusionadas de células representativas con tinción DAPI (gris claro). Una versión en
color de esta figura está disponible en The EMBO Journal Online. (B) Cuantificación de resultados
de (A). N ¼ 100. (C) top1Dtop2-4 células muestran fenotipo de nucleolo fragmentado similar y
distribución de ADNr en todo el núcleo. Las células top1Dtop2-4 cultivadas a 231C se analizaron
para determinar las estructuras nucleolar y rDNA por IF y FISH, respectivamente. Se muestran
imágenes fusionadas con tinción DAPI. Una versión en color de esta figura está disponible en
The EMBO Journal Online. (D) El tratamiento con rapamicina en ausencia de condensina hace
que el ADNr se distribuya por todo el núcleo. Las células ycs4-2 de la fase logarítmica temprana
en YPD se cambiaron de 23 a 371C durante 2 h, seguido de incubación con rapamicina 200 nM
(þ Rap) o portador de fármaco (Rap) durante 6 h. La estructura del ADNr se visualizó mediante
FISH con una sonda de ADNr 25S (blanco brillante). Se muestran imágenes fusionadas con
tinción DAPI. La punta de flecha apunta a una célula que contiene un ADNr distribuido en todo
el núcleo. Una versión en color de esta figura está disponible en The EMBO Journal Online. (E)
La pérdida de condensina provoca la acumulación de círculos de ADNr extracromosómicos (ERC).
Las células WT y ycs4-2 (y-4) de fase logarítmica iniciales en YPD se cambiaron de 23 a 371C
durante 0 y 6 h. El ADN total se aisló, se separó mediante electroforesis en gel de ADN de agarosa
y se analizó mediante transferencia de Southern con una sonda de ADNr 25S marcada con 32P.
Las células top1Dtop2-4 cultivadas a 37ºC durante 2 h se utilizaron como control. ADNr gen,
ADNr genómico.
Figura 7 La condensación mantiene la estabilidad del ADNr durante la represión transcripcional.
(A) Las mutaciones rpa190-1 / 3 causan un fenotipo de nucleolo fragmentado. Las primeras
células logarítmicas WT y rpa190-1 / 3 se cambiaron de 23 a 371C en YPD para diferentes
momentos. Se muestran imágenes fusionadas del nucleolo con el núcleo a las 5 h. Las imágenes
de otros puntos de tiempo y una versión en color de esta figura están disponibles en The EMBO
Journal Online. (B) Las mutaciones de rpa190-1 / 3 causan la acumulación de células con rDNA
distribuido en todo el núcleo. Las células rpa190-1 / 3 se incubaron a 371C durante 5 hy luego
se analizaron para determinar las estructuras nucleolar y rDNA por IF y FISH, respectivamente.
Se muestran imágenes típicas de células que contienen nucleolo fragmentado o altos niveles de
ERC. Una versión en color de esta figura está disponible en The EMBO Journal Online. (C) El
tratamiento con rapamicina suprime la formación de ERC en los mutantes Pol I. Las células WT
y rpa190-1 / 3 de fase logarítmica iniciales se cambiaron de 23 a 371C durante 2,5 h para
inactivar Pol I, seguido de incubación con o sin rapamicina durante diferentes momentos. El
ADNr fue analizado por FISH. El panel superior muestra la estrategia experimental. Las células
en caja se agrandaron para una mejor visualización. Las imágenes de otros puntos de tiempo y
una versión en color de esta figura están disponibles en The EMBO Journal Online. (D)
Condensina es necesaria para la supresión de la formación de ERC en Pol I mutante en presencia
de rapamicina. El mutante único (rpa190-1 YCS4) y el mutante doble (rpa190-1 ycs4-2) se
cambiaron de 23 a 371C durante 2,5 h para inactivar Pol I y condensina, seguido de incubación
con o sin rapamicina durante 3 h. Se muestran imágenes fusionadas del nucleolo con el núcleo.
Una versión en color de esta figura está disponible en The EMBO Journal Online.

TRADUCCION DEL DOCUMENTO

La contracción nuclear y la carga de condensina en el rDNA son independientes de la

transcripción del Rdna

En general, se anticipa que los dominios cromosómicos reprimidos transcripcionalmente tienen

una estructura de cromatina más compacta. Por lo tanto, la carga de condensina y la
condensación del ADN mediada por condensina durante la inanición pueden ser simplemente
un efecto indirecto de la represión transcripcional de ADNr. Para probar esta idea, utilizamos la
mutación rrn3-1 / syc1-8 para reprimir la transcripción de ADNr. Rrn3 es un factor de
transcripción crucial para Pol I, que se requiere para la síntesis de ARNr 35S y el crecimiento
celular (Cadwell et al, 1997). Después de una incubación prolongada a la temperatura restrictiva
(38ºC), sin embargo, el nucleolo permanece en la forma de media luna grande (Figura 5A). Bajo
tal condición, la condensina se carga en el rDNA solo en presencia pero no en ausencia de
rapamicina (Figura 5B). Esencialmente, se obtuvieron los mismos resultados con los mutantes
rpa190-1 y rpa190-3. Rpa190 es la subunidad más grande de Pol I. La incubación de estas células
mutantes a la temperatura restrictiva inhibe el crecimiento celular y la síntesis de ARNr 35S
(Wittenkind et al, 1989). Sin embargo, no induce la contracción nucleolar (Figura 5C). Además,
la acetilación de la histona H4 no se ve afectada (Figura 5D).

En conjunto, estos resultados muestran que la represión de la transcripción de ADNr per se es

insuficiente para causar la desacetilación de histonas, la carga de condensina o la condensación
de ADNr. Por lo tanto, la desacetilación de histonas y la carga de condensina parecen funcionar
independientemente de la transcripción de ADNr. La rapamicina también inhibe la transcripción
de los genes RP (Powers y Walter, 1999), pero causa la disociación de la condensina de estos loci
genómicos (Figura 2D). Por lo tanto, la asociación de condensina tampoco está relacionada con
la transcripción de genes dependientes de Pol II.

La condensina es necesaria para mantener la integridad del nucleolo y el ADNr cuando la

transcripción del ADNr es inhibida por la rapamicina.

Hemos notado que el tratamiento prolongado con rapamicina (>3 h) del mutante ycs4-2 a la
temperatura restrictiva conduce a muchas células con un nucleolo fragmentado (Figura 6A y B
y Figura Suplementaria 5A). Este fenotipo se ha mostrado anteriormente como resultado de la
acumulación de ERC (Sinclair y Guarente, 1997). El mutante top1Dtop2-4 también contiene ERC
elevados (Kim y Wang, 1989). Encontramos que las células top1Dtop2-4 tienen el mismo
fenotipo nucleolar fragmentado (Figura 6C), lo que sugiere que el fenotipo nucleolar
fragmentado es una característica común para las ERC. Debido a que las ERC son
extracromosómicas, planteamos la hipótesis de que las células con un alto contenido de ERC
mostrarían un ADNr distribuido en todo el núcleo. De hecho, la tinción con FISH indica que el
rDNA se dispersa por todo el núcleo en las células top1Dtop2-4 (Figura 6C). De manera similar,
el rDNA se distribuye por todo el núcleo en un mismo porcentaje de células ycs4-2 que con el
nucleolo fragmentado (Figura 6D). Estos resultados muestran que la tinción con FISH del ADNr
es un buen método para detectar células con un alto contenido de ERC.

Para confirmar que los mutantes de condensina tratados con rapamicina acumulan ERC,
aislamos el ADN total de las células WT y ycs4-2 cultivadas en diferentes condiciones y
realizamos un análisis de transferencia Southern con una sonda de ADNr 25S marcada con 32P.
Como se esperaba, las células WT y ycs4-2 contienen poco o ningún ERC (Figura 6E). El
tratamiento con rapamicina causa un aumento significativo de ERC en ycs4-2 pero no en la cepa
WT. Se utilizaron células top1Dtop2-4 como control positivo.

Hemos encontrado que la rapamicina aún inhibe significativamente la transcripción de ADNr en

mutantes de condensina (datos no mostrados), lo que sugiere que la condensina se puede usar
para proteger la integridad del ADNr cuando la transcripción de ADNr se reprime por inanición.

Las células con un alto contenido de ERC no muestran una morfología uniforme.

planteamos la hipótesis de que el tratamiento con rapamicina estabilizaría el rDNA en un

mutante Pol I si la carga de condensina es realmente importante como se sugiere en los
experimentos anteriores. Para probar esto, primero inactivamos rpa190-1 y rpa190-3 a 371C
durante 2,5 h para inhibir la transcripción dependiente de Pol I. En este punto, aún no han
aparecido ERC significativos (Figura 6A complementaria). Luego utilizamos rapamicina para
inducir la carga de condensina. Encontramos que el tratamiento con rapamicina no solo causa
la condensación del ADNr, sino que también suprime de manera eficiente la formación de ERC
(Figura 7C y Figura 6C y D). Para confirmar que el efecto protector de la rapamicina se debe a la
condensina, generamos un doble mutante rpa190-1 ycs4-2 y repetimos el experimento. En las
células rpa190-1 ycs4-2, la rapamicina no puede suprimir la formación de ERC (Figura 7D y Figura
Suplementaria 6F), lo que confirma que se requiere condensina para prevenir la formación de
ERC.

Discusiones
El tamaño del ADN nuclear aumenta ligeramente durante la inanición de nutrientes o el
tratamiento con rapamicina, lo que posiblemente refleja una menor ocupación de
condensina fuera de la matriz de ADNr. Por tanto la condensación del ADNr parece
mantener la estabilidad del ADNr cuando la transcripción del ADNr se reprime durante
la inanición, donde la fosforilación desempeña un papel importante en la regulación de la
condensina.
La modificación postraduccional de la condensina desempeña un papel importante en la
regulación global de la condensina durante la mitosis. En este estudio, se mostró que la
desacetilación de la histona H4 por Rpd3 es necesaria y suficiente para controlar la carga
de condensina en el ADNr durante la inanición, lo que sugiere que las modificaciones de
las histonas tienen un papel en dirigir condensinas a un dominio cromosómico específico.
Los resultados obtenidos muestran que la represión transcripcional de ADNr en ausencia
de condensina conduce a la inestabilidad del ADNr y la acumulación de ERC y que la
rapamicina no puede suprimir la formación de ERC, por tanto se confirma que se requiere
condensina para prevenir la formación de ERC.

Conclusion
Se examinó como el enriquecimiento de condesina previene la inestabilidad del ADNr
durante una falta de nutrientes y además se determinó las efectividad que tiene frente a
la rapamicina para la formación del círculo de ADNr extracromosómico (ERC)