2014lare0017 DGuerin PDF

 voisp

THESE
Présentée pour l’obtention du titre de Docteur de l’université de la Réunion
Spécialité : BIOCHIM IE

Etude des modifications structurales et fonctionnelles de l’albumine
dans le diabète de type 2 : identification de biomarqueurs de
glycoxydation et de facteurs de risque de complications vasculaires

Par
Alexis Guerin‐Dubourg

Soutenue publiquement le mercredi 03 décembre 2014
Amphithéâtre Charpak, Saint Denis de La Réunion

Pr. P. GILLERY Professeur et Praticien Hospitalier, CHU Reims Rapporteur
Pr. D. GRUSON Professeur, Clinique Universitaire St Luc, Bruxelles Rapporteur
Dr. O. M EILHAC Directeur de Recherches INSERM , Uté de La Réunion Examinateur
Dr. M COURNOT Docteur et Praticien Hospitalier, CH G.M artin, St Paul Examinateur
Pr E. BOURDON Professeur, Université de la Réunion Directeur
DrHDR P. RONDEAU Ingénieur d’Etudes, Université de la Réunion Co ‐Directeur

2
L’ensemble des t ravaux de cet t e t hèse de sciences ont ét é réalisés au sein du laborat oire
GEICO‐UFR Sant é‐Universit é de La Réunion et du laborat oire de Biochimie du CHU La
Réunion ‐Hôpit al Félix Guyon.

Je t iens à remercier premièrement t ous ceux qui m’ont sout enu dans ce projet avant même
la créat ion sinon aux premières heures du CHU et de l’UFR‐Sant é Universit é de La Réunion:

 Professeur Pascale GUIRAUD (Doyen de l’UFR Sant é) : merci pour t on sout ien amical,
t a confiance t oujours affirmée à mon égard et pour m’avoir permis de m’épanouir dans
mes act ivit és de recherche et d’enseignement à l’UFR Sant é ces 4 dernières années.

 M . David GRUSON (Direct eur général du CHU) et M . Lionel CALENGE (Direct eur
Général Adjoint du CHU) merci pour vot re confiance, vot re disponibilit é et pour m’avoir
sout enu dans la réalisat ion de cet t e projet .

 Professeur Christ ian LEFEBVRE D’HELLENCOURT (Direct eur du GEICO) : merci de
m’avoir accueilli dès mon st age de mast er 2 dans t on laborat oire, pour t es conseils avert is
et pour t es encouragement s à poursuivre ces t ravaux dans le cadre d’un doct orat .

 Dr Xavier DEBUSSCHE (Président de la DRCI) : t u m’as accompagné dès mon arrivée
au CHR, t u m’as t oujours encouragé à aller de l’avant et à me projet er bien au ‐delà de mes
propres ambit ions. M erci pour t on sout ien, t on amit ié, t es conseils et pour m’avoir
présent é bon nombre des act eurs de la recherche à La Réunion.

 M . Christ ian M ERIAU (Direct eur du CYROI) : pour t on accueil t oujours chaleureux au
CYROI, merci d’avoir syst émat iquement défendu mes différent s projet s.

 Dr M aya CESARI (Direct eur scient ifique – CYROI), pour m’avoir accompagné dans ma
recherche init iale d’un st age de M 2 sur l’île de La Réunion, pour m’avoir mis en relat ion
avec le duo Emmanuel Bourdon ‐ Philippe Rondeau. M erci pour t a bienveillance.

 Dr Frank TALLET (Chef du Pôle Plat eau Technique – Chef de service de Biochimie –
CHU La Réunion) pour m’avoir accueilli les bras ouvert s dans t on laborat oire, pour m’avoir
permis d’effect uer ces t ravaux de recherche dans des condit ions opt imales. M erci Frank
pour t es encouragement s, t on amit ié et t ous t es conseils prodigués durant nos années de
t ravail en commun. Je t acherai d’en faire bon usage.

C’est grâce à vot re engagement à t ous que ce projet a pu se concrét iser. Sans vous La
Réunion ne disposerait pas aujourd’hui d’out ils performant s d’encadrement pédagogique en
sciences de la sant é, en biochimie et en recherche clinique.
3
Je remercie t out part iculièrement les act eurs principaux de cet t e t hèse qui m’ont
accompagné durant ces 4 années de t ravail :

A M onsieur Emmanuel BOURDON , Professeur Universit aire, Responsable pédagogique et
Direct eur de Thèse : pour m’avoir accompagné avec bienveillance et pat ience t out au long
de ces années. Pour avoir su me sout enir et encourager quand il le fallait . Je t e remercie,
ainsi que l’ensemble du groupe GEICO, de m’avoir donné l’envie et le goût de poursuivre
dans la recherche et de finaliser ce t ravail de t hèse.

A M onsieur Philippe RONDEAU , Ingénieur d’Et udes, HDR et Co ‐Direct eur de Thèse : rien de
ces t ravaux n’aurait pu êt re possible sans t a cont ribut ion. Je t e remercie pour t on
encadrement et t on expert ise t echnique si précise. Vous formez avec Emmanuel un duo
remarquable de complément arit é et vous m’avez fait découvrir une vision conviviale et
humaine de la recherche. M erci aussi d’avoir su ent recouper ces t ravaux par des pauses
gast ronomiques fromagères savoyardes, que je qualifierai de « t art iflesques », dont t oi seul
a le secret .

A M onsieur Olivier M EILHAC, Direct eur de Recherche : t on ent housiasme et t on énergie
désormais légendaires sont pour moi une source d’inspirat ion formidable. M erci pour t on
sout ien amical, t on accueil dans la fut ure équipe DETROI et pour t es encouragement s.
J’espère sincèrement que l’avenir nous donnera l’opport unit é de t ravailler sur des projet s
communs.

A Jennifer BARAKA‐VIDOT, pour nos échanges scient ifiques, professionnels et amicaux
durant ces 4 années qui auront cont ribués à nos t ravaux respect ifs. Je t e souhait e un bel
avenir dans la recherche scient ifique.

A Aurélie CATAN et Cynt hia PLANESSE pour vot re part icipat ion act ive à ces t ravaux et pour
vos sourires qui m’ont t oujours accueillis.
4
Je remercie également M lle CURDY, M essieurs ROBERT et M AILLOT, t echniciens de
laborat oire, qui m’ont aidé à recueillir les prélèvement s nécessaires à cet t e ét ude.

M erci aussi à M onsieur Adrian FIANU (Biost at ist icien : CIC – CHU La Réunion) pour le t emps
précieux que t u as su m’accorder dans l’expression mét hodologique et st at ist ique de mes
idées. Bon courage à t oi pour la fin de t on projet de t hèse.

A t ous les membres du GEICO qui devient aujourd’hui une des premières unit és INSERM de
La Réunion : merci aux enseignant s chercheurs, doct orant s et t echniciens de recherche
pour vot re accueil et vot re convivialit é, ce fut t oujours un t rès grand plaisir de quit t er mon
laborat oire de biologie médicale pour venir me rafraîchir les idées dans vot re laborat oire de
recherche.

A mes grand ‐mères,

A mes parent s,

A mes amis,
5
6

A Emeline, ma moit ié

A Barnabé, Sacha et Clément ine nos enfant s chéris

Ce sont vos sourires qui me donnent la force d’avancer….
7
8
ABREVIATIONS
ADA American Diabet es Associat ion
ADP Adenosine diphosphat e
AGEs Advanced Glycat ion End Product s
AGJ Anomalie de glycémie à jeun
AOM I Art ériopat hie oblit érant e des membres inférieurs
AOPPs Produit s d’oxydat ion prot éiques avancés
APP Amyloid prot ein precursor
AVC Accident Vasculaire Cérébral
bFGF Basic Fibroblast Grow t h Fact or
CM L Carboxy M et hyl Lysine
CRP Prot éine C‐réact ive
CV Cardiovasculaire
DAG Diacylglycérol
DDI D‐Dimères
DN‐RAGE Dominant Negat ive RAGE
eNOS Endot helial nit ric oxyde synt hase
esRAGE Endogenous secret ory RAGE
FID Fédérat ion Int ernat ionale du Diabèt e
FR Fact eurs de risque
GA Glycat ed Albumin
GPxs Glut at hion peroxydases
HAS Haut e Aut orit é de Sant é
HbA1c Hémoglobine glyquée
HDL High densit y lipoprot ein
HGPO hyperglycémie provoquée par voie orale
HM GB1 High mobilit y group box‐1
HPLC High Perfromance Liquip Chromat ography
HTA Hypert ension Art érielle
ICAM ‐1 Int racellular adhesion molecule‐1
IDL Int ermediat e‐densit y lipoprot ein
IG Int olérance au glucose
IL‐1β int erleukine 1β
IL‐6 Int erleukine 6
IM Infarct us du M yocarde
IM A Ischemia M odified Albumin
IM T Epaisseur Int ima ‐M edia (int ima ‐media t hickness)
InVS Inst it ut de Veille Sanit aire
IPS Indice de pression syst olique
IRS Insulin Responsiv Element
9
LDL Low densit y lipoprot ein
Lp ‐PLA2 Lipoprot ein associat ed Phospholipase A2
M APK M it ogen ‐Act ivat ed Prot ein Kinase
M CP‐1 M onocyt e chemot act ic‐prot ein ‐1
M CV M aladie cardiovasculaire
mDia ‐1 M ammalian diaphanous1
M GO M ét hylglyoxal
NADH Nicot inamide Adénine Dinucléot ide
NADPH Nicot inamide Adénine Dinucléot ide Phosphat e
NF‐kB Necrosis Fact or kappa B
NO M onoxyde d'azot e
OM S Organisat ion mondiale de la Sant é
PAF Plat elet act ivat ing fact or
PAI‐1 Inhibit eur de l'act ivat eur du plasminogène
PAS Pression art érielle syst olique
PGI2 Prost acycline
PI3K Phosphoinosit ol 3 kinase
PKC Prot éines kinases C
RAGE Recept or for advanced glycat ion end ‐product s
RBP4 Rét inol ‐binding prot ein ‐4
RE Rét iculum endoplasmique
ROS React iv Oxygen Species
SAA Serum Amyloïde A
SCA Syndrome coronarien aigu
SOD Superoxide dismut ase
sRAGE RAGE solubles
TGF‐ Tumor Grow t h Fact or )
TLR Toll like recept or
TNF‐ Tumor Necrosis Fact or ‐α
t PA Act ivat eur du plasminogène t issulaire
TT/ TH Rapport t our de t aille/ t our de hanches
VCAM ‐1 Vascular Cell Adhesion M olecule‐1
VEGF Vascular endot helial grow t h fact or
VLDL very low ‐densit y lipoprot ein
WHO World Healt h Organizat ion
10
TABLEAUX
Tableau 1 ERM IES données générales d’inclusion (moyenne + / ‐ écart ‐t ype)
Tableau 2 Données biologiques (moyenne +/ ‐ écart ‐t ype) présent ées par sous‐
groupes d’at t eint es vasculaires relevées à l’inclusion d’ERM IES (absence
d’at t eint e vasculaire vs. Complicat ion vasculaire comparaison). Les
variables sont comparées selon le t est t de St udent (en gras, p < 0,2).

Tableau 3 Coefficient s de corrélat ion de Spearman ent re biomarqueurs de glycat ion
(HbA1c, fruct osamines, GA), d’oxydat ion (IM A) et de glycoxydat ion
(AGEs). (* p <0,001)
11
FIGURES
Figure n°1 Prévalence du diabèt e de t ype 2. Données 2013 mondiales et répart it ion
par cont inent
Figure n°2 M ort alit é liée au diabèt e chez les individus de moins de 60 ans
Figure n°3 M écanismes int racellulaires de l’insulinorésist ance
Figure n°4 St ruct ure de la paroi vasculaire et place de l’endot hélium vasculaire
Figure n°5 Coupe schémat ique d’une art ère saine et d’une art ère art érioscléreuse :
place de l’endot hélium vasculaire
Figure n°6 Dysfonct ion endot héliale et complicat ions cardiovasculaires du diabèt e :
at hérosclérose, néphropat hie et rét inopat hie
Figure n°7 Coupure Homolyt ique d’une molécule et product ion d’espèces radicalaires
Figure n° 8 représent at ion schémat ique des mécanismes de product ion de ROS au
cours du diabèt e
Figure n° 9 Principaux sit es de l’albumine impliqués dans son act ivit é ant ioxydant e
Figure n°10 M écanismes physiologiques de générat ion de ROS et principales défenses
ant ioxydant es
Figure n°11 Format ion des produit s d’Amadori et réarrangement oxydat ifs en produit s
avancés de glycat ion – Phénomène de glycoxydat ion
Figure n°12 Différent es formes d’AGEs rencont rés au cours du diabèt e
Figure n°13 St ruct ure t ridimensionnelle de l’albumine : représent at ion des sit es de
liaison spécifique de Sudlow (t ype 1 et t ype 2) et des principaux sit es de
glycat ion (lysines)
12
Figure n°14 Produit s avancés de Glycat ion – Sources et implicat ions
physiopat hologiques
96
Figure n°15 Récept eurs RAGE – Principales Isoformes
Figure n°16 Effet s cellulaires de l’act ivat ion du RAGE – Transduct ion du Signal
Figure n°17 Valeurs comparat ives de concent rat ions plasmat iques de biomarqueurs
(moyenne +/ ‐ écart ‐t ype) ent re les groupes sans complicat ion vasculaire
vs. avec complicat ion vasculaire
Figure n°18 Dist ribut ion des valeurs d’IM A (DO) et d’IM A/ Albumine ent re les groupes
sans complicat ion vasculaire et avec complicat ion vasculaire relevée à
l’inclusion d’ERM IES. Représent at ion en box‐plot (valeur minimale, 25
ème
percent ile, valeur médiane, 75 percent ile et valeur maximale)

ème
Figure n°19 Courbes ROC (Receiver Operat ing Charact erist ic) des paramèt res
biologiques IM A et de l’HbA1c rapport ées à l’ident ificat ion des at t eint es
vasculaires relevées à l’inclusion d’ERM IES. Données comparées d’aire
sous la courbe
Figure n°20 Dist ribut ion des valeurs d’AGE et de GA ent re les groupes sans
complicat ion vasculaire et avec complicat ion vasculaire relevée à
l’inclusion d’ERM IES. Représent at ion en box‐plot (valeur minimale, 25
ème
percent ile, valeur médiane, 75 percent ile et valeur maximale)

ème
13
14
SOMMAIRE
ABREVIATIONS............................................................................................................................ 9
TABLEAUX................................................................................................................................. 11
FIGURES.................................................................................................................................... 12
SOM M AIRE............................................................................................................................... 15
INTRODUCTION ........................................................................................................................ 18
PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE....................................................................................................... 21
1. LE DIABETE DE TYPE 2...................................................................................................... 23
1.1. Définit ion ................................................................................................................... 23
1.2. Epidémiologie ............................................................................................................ 23
1.2.1. Epidémiologie mondiale..................................................................................... 23
1.2.2. Epidémiologie en France .................................................................................... 26
1.3. Diagnost ic et suivi...................................................................................................... 27
1.3.1. La glycémie ......................................................................................................... 27
1.3.2. L’hémoglobine glyquée (HbA1c) ........................................................................ 28
1.4. Et iologie et immunopat hologie du diabèt e de t ype 2 .............................................. 28
1.4.1. Les fact eurs génét iques...................................................................................... 29
1.4.2. Les fact eurs environnement aux......................................................................... 29
1.4.3. Immunologie ...................................................................................................... 30
1.5. Complicat ions chroniques du diabèt e...................................................................... 34
1.5.1. Complicat ions microangiopat hiques.................................................................. 35
1.5.2. Complicat ions macroangiopat hiques................................................................. 36
2. COM PLICATIONS CARDIOVASCULAIRES DU DIABETE DE TYPE2 ...................................... 37
2.1. Les complicat ions cardiovasculaires du diabèt e ....................................................... 37
2.1.1. Cardiopat hie ischémique ................................................................................... 37
2.1.2. Art érit e des membres inférieurs........................................................................ 39
2.1.3. At hérosclérose carot idienne .............................................................................. 39
2.2. Complicat ions vasculaires et fonct ion endot héliale ................................................. 40
2.2.1. L’endot hélium vasculaire : rôle physiologique .................................................. 40
15
2.2.2. Dysfonct ion endot héliale et pat hologies vasculaires ........................................ 43
3. Evaluat ion du risque cardiovasculaire et pat hologie diabét ique : fact eurs de risque..... 46
3.1. Fact eurs de risques cardiovasculaires convent ionnels............................................. 46
3.1.1. Les dyslipidémies................................................................................................ 46
3.1.2. L’hypert ension art érielle .................................................................................... 47
3.1.3. L’âge et le sexe ................................................................................................... 48
3.1.4. Le t abagisme ...................................................................................................... 48
3.1.5. Le surpoids et l’élévat ion du rat io t our de t aille/ t our de hanches.................... 48
3.2. Evaluat ion du risque vasculaire................................................................................. 49
3.2.1. Le score de Framingham .................................................................................... 49
3.2.2. Risque cardiovasculaire et diabèt e de t ype 2 .................................................... 49
3.3. Améliorer le dépist age du risque cardiovasculaire................................................... 51
4. DIABETE, STRESS OXYDANT ET HYPERGLYCEM IE CHRONIQUE........................................ 53
4.1 Hyperglycémie chronique et st ress oxydant .............................................................. 53
4.1.1. Définit ions des radicaux libres. .......................................................................... 53
4.1.2. Diabèt e de t ype 2 et hyperproduct ion de radicaux libres ................................. 54
4.1.3. Les défenses ant ioxydant es. .............................................................................. 57
4.1.4. Conséquences de l’hyperproduct ion d’espèces réact ives de l’oxygène. .......... 62
4.2. Hyperglycémie chronique et AGEs (advanced glycat ion end ‐product s)................... 65
4.2.1. Format ion des AGEs : phénomène de Glycoxydat ion........................................ 65
4.2.2. Effet s des AGEs sur la mat rice ext racellulaire, les prot éines circulant es et
cellulaires...................................................................................................................... 68
4.2.3. Les Récept eurs aux AGEs. .................................................................................. 72
OBJECTIF DU TRAVAIL .............................................................................................................. 78
PARTIE EXPERIM ENTALE .......................................................................................................... 81
1. ETUDES DES M ODIFICATIONS STRUCTURALES ET FONCTIONNELLES DE L’ALBUM INE AU
COURS DU DIABETE DE TYPE 2 ............................................................................................. 83
1.1. Int roduct ion ........................................................................................................... 83
1.2. Résult at s.................................................................................................................... 85
1.3. Discussion ............................................................................................................. 107
1.4. Conclusion ............................................................................................................ 109
16
2. EFFETS CELLULAIRES DE L’ALBUM INE M ODIFIEE AU COURS DU DIABETE.................... 111
2.1. Int roduct ion............................................................................................................. 111
2.2. Résult at s.................................................................................................................. 112
2.3. Discussion ................................................................................................................ 127
2.4. Conclusion ............................................................................................................... 128
3. ETUDE PILOTE D’ASSOCIATION DES FORM ES M ODIFIEES DE L’ALBUM INE (AGES, GA ET
IM A) AUX ATTEINTES VASCULAIRES DES PATIENTS DIABETIQUES : ERM IES‐ALBOX......... 131
3.1. Et at act uel des connaissances................................................................................. 131
3.1.1. Les complicat ions vasculaires du diabèt e de t ype 2 ........................................ 131
3.1.2. Prévent ion des complicat ions vasculaires du diabèt e ..................................... 131
3.1.3. Glycat ion des prot éines et st ress oxydat if dans le diabèt e ............................. 132
3.2. Object ifs de la recherche ........................................................................................ 133
3.3. Aspect s M ét hodologiques....................................................................................... 134
3.3.1. Schéma de la recherche ................................................................................... 134
3.3.2. Crit ères d ‘éligibilit é......................................................................................... 135
3.3.3. Crit ères d’évaluat ions..................................................................................... 136
3.3.4. M ét hodes analyt iques.................................................................................... 137
3.3.5. Analyse st at ist ique des données.................................................................... 139
3.4. Résult at s.................................................................................................................. 141
3.4.1 Descript ion générale de la populat ion observée .............................................. 141
3.4.2 Corrélat ions des marqueurs biochimiques ....................................................... 144
3.4.3 IM A et at t eint es vasculaires.............................................................................. 145
3.4.4 GA, AGEs et at t eint es vasculaires ..................................................................... 147
3.5. Discussion, conclusions et perspect ives.................................................................. 148
CONCLUSION .......................................................................................................................... 153
BIBLIOGRAPHIE....................................................................................................................... 157
17
INTRODUCTION
Le diabèt e de t ype 2 est considéré aujourd’hui comme le mal du siècle. Cet t e maladie
mét abolique chronique, liée aux changement s de mode de vie et d’habit udes aliment aires
de ces 30 dernières années, voit en effet son incidence croît re de manière exponent ielle et
t ouche désormais plus de 350 millions de personnes à t ravers le monde.

La mort alit é du diabèt e de t ype 2 est principalement due aux complicat ions vasculaires de
cet t e pat hologie amenant , à t erme, à des événement s cardiovasculaires graves t els
l’infarct us du myocarde (IM ) ou encore des accident s vasculaires cérébraux (AVC). Le risque
1
d’événement cardiovasculaire est mult iplié par 3 chez les pat ient s souffrant du diabèt e .
L’hyperglycémie chronique rencont rée au cours du diabèt e est donc considérée aujourd’hui
comme un fact eur de risque cardiovasculaire.

Des effort s import ant s doivent t oujours êt re fournis en t erme de dépist age et de prévent ion
du diabèt e de t ype 2 à t ravers le monde pour enrayer la progression de cet t e pandémie. Il en
est de même pour le dépist age, la prévent ion et la prise en charge des at t eint es vasculaires
liées au diabèt e. En effet le t rait ement de l’hyperglycémie reconnue comme fact eur de
risques cardiovasculaires ainsi que celui de l’hypert ension art érielle, des dyslipidémies ou
encore de l’obésit é, fact eurs de risque couramment ut ilisés et associés au syndrome
mét abolique des diabét iques de t ype 2, permet t ent de ret arder l’apparit ion des
complicat ions cardiovasculaires et de limit er la mort alit é liée au diabèt e.

Cependant de t rop nombreux pat ient s souffrent et meurent encore des complicat ions
vasculaires du diabèt e par défaut de prise en charge puisqu’ils n’ont pas ét é ident ifiés, sinon
t rop t ardivement , comme à haut risque cardiovasculaire au moyen des biomarqueurs
convent ionnels. Ceci amène à penser que les fact eurs de risque cardiovasculaires
act uellement ident ifiés sont insuffisant s et que les mécanismes physiopat hologiques
amenant aux at t eint es vasculaires du diabèt e ne sont pas encore t ot alement élucidés.

De nombreux t ravaux rest ent donc à ent reprendre pour mieux comprendre l’ensemble des
mécanismes physiopat hologiques qui cont ribuent à l’augment at ion des at t eint es vasculaires
18
au cours du diabèt e. Le décrypt age précis de ces mécanismes physiopat hologiques nous
permet t raient ainsi d’ident ifier de nouveaux biomarqueurs suscept ibles de dépist er
précocement les pat ient s à haut risque vasculaire et pourraient const it uer des cibles
pharmacologiques innovant es dans la prise en charge des complicat ions vasculaires du
diabèt e.

Parmi les hypot hèses couramment évoquées, le laborat oire GEICO s’est plus
part iculièrement int éressé aux mécanismes combinés de l’hyperglycémie et du st ress
oxydant rencont rés au cours du diabèt e. Ces deux phénomènes conjugués, regroupés sous
le nom de glycoxydat ion, const it ueraient en effet un mécanisme physiopat hologique cent ral
du diabèt e et de ses complicat ions vasculaires.

Un des axes import ant de recherche au laborat oire GEICO consist e en l’ét ude de l’effet de la
glycoxydat ion sur la prot éine circulant e la plus abondant e du plasma, à savoir l’albumine.
C’est aut our de cet axe que l’ensemble des t ravaux de ce mémoire s’est art iculé. Nous avons
ici t ravaillé dans un premier t emps sur l’ident ificat ion des modificat ions des propriét és
st ruct urales et fonct ionnelles de l’albumine au cours du diabèt e. Dans un deuxième t emps
nous avons cherché à ident ifier si ces modificat ions glycoxydat ives de l’albumine avaient
des conséquences physiopat hologiques pouvant êt re reliées aux complicat ions
cardiovasculaires rencont rées dans le diabèt e de t ype 2.
19
20
PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE
21
22
1. Le diabète de type 2
1.1. Définition

Le diabèt e est défini comme une affect ion mét abolique, caract érisée par une hyperglycémie
(t aux de sucre dans le sang t rop élevé) liée à une déficience, soit de la sécrét ion, soit de
l’act ion de l’insuline, ou des deux. L’insuline est une hormone produit e par le pancréas,
indispensable à la pénét rat ion du glucose sanguin dans les cellules. Lorsqu’elle fait défaut , le
t aux de sucre augment e dans le sang, or l’organisme est t rès sensible à ces variat ions : la
chronicit é de l’hyperglycémie est responsable de complicat ions à long t erme t ouchant de
2
nombreux organes not amment les yeux, les reins, les nerfs, le cœur et les vaisseaux .

La grande majorit é des cas de diabèt e se répart issent en deux cat égories : le diabèt e de t ype
1 et le diabèt e de t ype 2. Les aut res cas de diabèt e sont le diabèt e gest at ionnel défini
comme une int olérance au glucose début ant e ou découvert e la première fois pendant la
3
grossesse ou d’aut res t ypes plus spécifiques car liés à : des défaut s génét iques des cellules ß
du pancréas, des défaut s génét iques de l’act ion de l’insuline, des maladies du pancréas
exocrine, des endocrinopat hies, secondaire à la prise de médicament s ou de subst ances
chimiques, secondaire à une infect ion, des formes non communes de diabèt es immuns ou
2
des diabèt es associés à des syndromes génét iques .

Le diabèt e de t ype 2 est caract érisé par une résist ance à l’insuline et une carence relat ive de
la sécrét ion d’insuline. Son apparit ion est lent e : il peut évoluer avec un degré
d’hyperglycémie suffisant pour engendrer des at t eint es organiques et fonct ionnelles dans de
nombreux t issus mais sans sympt ôme clinique et donc sans diagnost ic pendant plusieurs
années. Cet t e forme de diabèt e s’ét ablie le plus souvent chez des personnes adult es et t rès
4
majorit airement en surpoids .
1.2. Epidémiologie
1.2.1. Epidémiologie mondiale
23
Selon la Fédérat ion Int ernat ionale du Diabèt e (FID), l’épidémie mondiale du diabèt e a
explosé pour t oucher en 2013, 382 millions de personnes, soit 8,3 % de la populat ion adult e.
Si cet t e t endance se poursuit , 550 millions de personnes environ, soit un adult e sur 10,
seront at t eint es de diabèt e d'ici 2030, ce qui représent e près de 10 millions de nouveaux cas
par an. Not ons de plus que la proport ion de personnes at t eint es du diabèt e mais non
5
diagnost iquées est est imé à près de 46% soit environ 175 millions .

En Europe Occident ale, on compt e aujourd’hui 33 millions de diabét iques, avec une
prévision de 50 millions en 2030.

Figure n°1 : Prévalence du diabèt e de t ype 2. Données 2013 mondiales et répart it ion par
cont inent .
5

Environ 80 % des diabét iques vivent dans des pays à faible et moyen revenus et la
prévalence est supérieure dans les zones urbaines par rapport aux zones rurales, avec une
at t eint e plus grande des groupes sociaux défavorisés. Les principaux élément s responsables
de l’augment at ion du diabèt e sont les changement s de st yle de vie et le vieillissement des
24
populat ions. En 2011, la t ranche d'âge la plus t ouchée par le diabèt e, est représent ée par les
5
40‐59 ans qui t ot alisent 179 millions de personnes .

Le diabèt e de t ype 2 est un problème de sant é mondial. La mort alit é liée au diabèt e est t rès
fort e et peut représent er selon les cont inent s de 28% à 76% des causes de décès chez les
individus de moins de 60 ans. Sa prévalence est fort ement associée à l’et hnie mais son
développement accéléré s'est effect ué, dans la plupart des pays, en parallèle avec les
changement s cult urels et sociaux rapides (l'urbanisat ion croissant e, les changement s
aliment aires, la réduct ion de l'act ivit é physique) et avec le vieillissement démographique.

La mort alit é des diabét iques est principalement due aux complicat ions vasculaires
rencont rées dans le diabèt e de t ype 2 qui associent la microangiopat hie diabét ique
(rét inopat hie, néphropat hie et pied diabét ique) et la macroangiopat hie diabét ique
(at hérosclérose, syndromes coronariens, accident s vasculaires cérébraux (AVC),…). En effet ,
le risque d’at t eint e vasculaire est fort ement augment é et les complicat ions cardiovasculaires
associées (AVC, infarct us du myocarde (IM )) sont responsables de 80% des décès des
personnes diabét iques.

Figure n°2 : M ort alit é liée au diabèt e chez les individus de moins de 60 ans
5
25
La prévent ion du diabèt e de t ype 2 et de ses complicat ions repose donc essent iellement sur
des modificat ions du st yle de vie, une modificat ion de l’aliment at ion et une incit at ion à la
prat ique sport ive.
1.2.2. Epidémiologie en France

L’Inst it ut de Veille Sanit aire (InVS) rapport e, d’après l’analyse du régime général de
l’assurance maladie, une prévalence du diabèt e t rait é pharmacologiquement en France de
4,4 % de la populat ion, soit 2,9 millions de personnes en 2009. Cet t e prévalence augment e
de manière cont inue et cela devrait se poursuivre avec le vieillissement de la populat ion,
l’augment at ion de l’espérance de vie des diabét iques et l’augment at ion de la prévalence de
4
l’obésit é .
Il ressort de l’enquêt e épidémiologique descript ive ENTRED 2007 (Echant illon nat ional
t émoin représent at if des personnes diabét iques), que la grande majorit é des personnes (92
%) ont un diabèt e de t ype 2. La populat ion diabét ique est âgée : la moyenne d’âge est de 65
ans et un quart a 75 ans ou plus, et souvent peu aisée financièrement . Sur l’ensemble de
l’échant illon représent at if, 77% des personnes diabét iques sont nées en France, 12% dans
6
un pays du M aghreb et 11% dans d’aut res pays .

Les zones les plus t ouchées sont les DOM ‐TOM (7,4% de diabét iques en M art inique; 8,1% en
7
Guadeloupe; 8,8% à La Réunion ; 7,3% en Guyane), ainsi que le nord et le nord ‐est de la
mét ropole (Nord ‐Pas‐de‐Calais 5,4%; Picardie 5,3%; Champagne‐Ardenne 5,0%; Alsace
6,8
5,0%) .

L’augment at ion de l’espérance de vie part icipe également à l’augment at ion de la prévalence
du diabèt e. En effet , il exist e une disparit é import ant e selon les âges : 0,4% pour les 0‐44
ans, 5,8% pour les 45 ‐64 ans, 13,3% pour les 65‐74 ans et 13,4% pour les 75 ans et plus.
Ainsi, la prévent ion, le dépist age et la prise en charge des pat ient s diabét iques, ainsi que la
prévent ion et le t rait ement des complicat ions du diabèt e sont des enjeux majeurs de sant é
publique, t ant sur le plan mondial, qu’européen ou français.
26
1.3. Diagnostic et suivi
1.3.1. La glycémie

Le diagnost ic du diabèt e repose sur la mesure de la glycémie (t aux de sucre dans le sang),
pour cela t rois mét hodes sont possibles et , en l’absence d’hyperglycémie sans équivoque,
chacune doit êt re confirmée un aut re jour par la répét it ion d’une de ces t rois mét hodes. Le
9 10
pat ient sera considéré comme diabét ique dans les sit uat ions suivant es , :

‐ Glycémie à jeun (absence d’apport calorique depuis au moins 8 heures)
supérieure ou égale à 126 mg/ dl ou 7mmol/ l
‐ Glycémie à un moment quelconque de la journée en présence des signes
cliniques d’hyperglycémie (polyurie, polydipsie, pert e de poids inexpliquée
souvent associée à une polyphagie) supérieure ou égale à 200 mg/ dl ou
11,1 mmol/ l
ème
‐ Glycémie à la 2 heure d’une HGPO (hyperglycémie provoquée par voie
orale selon les recommandat ions de l’OM S en ut ilisant une charge orale
en glucose anhydre égale à 75g dissout dans de l’eau) supérieure ou égale
à 200 mg/ dl ou 11,1 mmol/ l

Les valeurs normales de glycémies sont inférieures à 100 mg/ dl à jeun et inférieures à 140
mg/ dl à la deuxième heure d’une HPGO. Aussi exist e‐t ‐il un groupe int ermédiaire de sujet s
dont les niveaux de glucose sanguin, bien que ne répondant pas aux crit ères diagnost iques
du diabèt e, sont néanmoins t rop élevés pour êt re considérés comme normaux :
‐ Si la glycémie à jeun est comprise ent re 100 et 125 mg/ dl (ou ent re 5,6 et
6,9 mmol/ l) on parlera d’anomalie de la glycémie à jeun (AGJ).
‐ Si à la 2ème heure d’une HGPO la glycémie est comprise ent re 140 et 199
mg/ dl (ou ent re 7,8 et 11,1 mmol/ l) on parlera d’int olérance au glucose
(IG).

L’IG et l’AGJ ne sont pas des ent it és cliniques en elles‐mêmes mais des fact eurs de risque
10,9
d’un fut ur diabèt e ou de maladies cardiovasculaires .
27
1.3.2. L’hémoglobine glyquée (HbA1c)

Le dosage de l’hémoglobine glyquée permet d’obt enir une est imat ion de la glycémie
moyenne au cours des deux à t rois derniers mois de suivi d’un pat ient . Sa valeur est
généralement exprimée en pourcent age et permet la surveillance de l’équilibre glycémique
11
des pat ient s diabét iques . Il s’agit principalement d’un élément de suivi de l ‘équilibre
glycémique, mais un niveau supérieur ou égal à 6,5% d’HbA1c, dét erminé par HPLC
(chromat ographie en phase liquide à haut e performance), à deux reprises, a récemment ét é

10
int égré aux crit ères diagnost iques du diabèt e par l’ADA (American Diabet es Associat ion) .

L’hémoglobine glyquée est issue de la glycat ion de l’hémoglobine sanguine au cours
d’épisodes d’hyperglycémie prolongée. La glycat ion est une réact ion non enzymat ique au
cours de laquelle le glucose se lie aux prot éines de manière irréversible. Le degré de
glycat ion des prot éines dépend de l’exposit ion au glucose et donc du niveau
d’hyperglycémie associé à la durée d’exposit ion des prot éines au glucose. Le dosage de
l’HbA1c est le reflet de l’équilibre glycémique sur une période de 4 à 8 semaines. Une
12,11
corrélat ion a ét é ét ablie ent re le t aux moyen de glycémie et le pourcent age d’HbA1c .

Un bon cont rôle de la glycémie est représent é par une valeur d’HbA1c peu élevée, et celle‐ci
est at t endue dans la prévent ion de l’apparit ion des complicat ions microvasculaires et
macrovasculaires du diabèt e. Une augment at ion relat ive de 30% des complicat ions
13
microvasculaires du diabèt e a ét é observée pour chaque pourcent d’élévat ion de l’HbA1c .
Cet t e mesure, marqueur rét rospect if de la glycémie moyenne des deux derniers mois
permet d’évaluer l’efficacit é des t rait ement s pour ainsi les réadapt er en fonct ions des
11
object ifs t hérapeut iques fixés . Une HbA1c supérieure à 7,5% const it ue également un
fact eur de risque de complicat ion cardiovasculaire.
1.4. Etiologie et immunopathologie du diabète de type 2

Le développement d'un diabèt e de t ype 2 est associé à de fort es prédisposit ions génét iques
combiné à des fact eurs environnement aux favorisant s.
28
1.4.1. Les facteurs génétiques

La part du dét erminisme génét ique dans le diabèt e de t ype 2 est t rès import ant e puisque
l’on est ime que le risque de développer la maladie est de 30% avec un parent at t eint de
diabèt e de t ype 2 et de 70% si les deux parent s le sont . Le t aux de concordance ent re
jumeaux monozygot es est de près de 90%.
Cependant , au regard de l’import ant e prévalence du diabèt e de t ype 2 dans la populat ion
générale, il est probable que les gènes de suscept ibilit é soient t rès nombreux, t rès répandus
et de faible pénét rance, ce qui les rend difficile à ident ifier. Ainsi de nombreux gènes ont ét é
analysés not amment ceux impliqués dans la régulat ion de la sécrét ion de l’insuline ou de son

4,14
act ion mais les variat ions int erindividuelles et int er ‐et hniques limit ent les conclusions .
1.4.2. Les facteurs environnementaux

Le fact eur le plus puissant prédisposant au diabèt e de t ype 2 est l’obésit é, part iculièrement
à répart it ion abdominale, puisque 80% des personnes at t eint es de ce t ype de diabèt e
présent ent un excès pondéral. L’obésit é est capable d’induire ou d’aggraver une
insulinorésist ance, imposant au pancréas une hypersécrét ion permanent e d’insuline. Pour la
majorit é des personnes obèses le pancréas sera capable de s’adapt er et de maint enir une
glycémie dans les valeurs normales mais pour un t iers d’ent re eux les capacit és de
4
compensat ion s’épuiseront et ils développeront un diabèt e de t ype 2 .

La sédent arit é, de plus en plus présent e dans nos sociét és indust rialisées, est également
mise en cause dans l’apparit ion de la maladie, puisque l’act ivit é physique améliore la
sensibilit é des t issus à l’insuline et donc présent e un effet prot ect eur.
Enfin la qualit é de la composit ion du régime aliment aire, not amment la présence d’un index
glycémique élevé : aliment at ion riche en acides gras et pauvre en fibres double le risque de
diabèt e.
29
1.4.3. Immunologie

Le diabèt e de t ype 2 est le résult at de deux composant es physiopat hologiques : des
anomalies de la sensibilit é à l’insuline et des anomalies de sa sécrét ion. L’inflammat ion est
fort ement mise en cause dans la pat hogénie du diabèt e 2. Une augment at ion du nombre de
prot éines de la phase inflammat oire aigue (prot éine C‐réact ive (CRP)), d’acide sialique, de
cyt okines et de chimiokines est ret rouvée dans le plasma des pat ient s at t eint s de diabèt e de
t ype 2. Des niveaux élevés d’int erleukine 1β (IL‐1β), d’int erleukine 6 (IL‐6) et de CRP sont
15
également prédict ifs d’un diabèt e de t ype 2 .

1.4.3.1. M écanismes de l’insulinorésist ance

L’insulinorésist ance est définie comme une diminut ion de l’act ion de l’insuline au niveau des
t issus cibles : les muscles, le foie et le t issu adipeux, se t raduisant par des défaut s de
capt at ion du glucose au sein de ces t issus et un moindre frein de la product ion de glucose
4
par le foie en réponse à l’insuline . L’insulinorésist ance est liée à des mécanismes complexes
mêlant réact ion inflammat oire, accumulat ion d’acides gras, st ress oxydant et dysfonct ion
mit ochondriale (figure n°3).

Longt emps vu comme un t issu inert e, on sait désormais que le t issu adipeux part icipe à la
pat hogénèse du diabèt e. Les adipocyt es ont une capacit é à produire des adipokines
(hormones et cyt okines) qui régulent l’ut ilisat ion et le st ockage des nut riment s dans les
aut res t issus. L’augment at ion de la masse adipeuse au cours de l’obésit é s’accompagne
d’une libérat ion accrue de résist ine, de RBP4 (rét inol ‐binding prot ein ‐4) et de TNF‐ (Tumor
16
Necrosis Fact or ‐) responsables d’une moindre sensibilit é des t issus à l’insuline . D’aut res
adipokines t elles que la lept ine et l’adiponect ine sont considérées comme « ant i ‐
diabét ogènes » car elles diminuent la synt hèse de t riglycérides, st imulent l’oxydat ion du
16
glucose et des lipides et favorisent l’act ion de l’insuline au niveau du muscle et du foie .
L’obésit é s’accompagnerait d’un défaut d’adiponect ine et d’une résist ance à la lept ine et
16
aurait par conséquence un effet diabét ogène .

L’hypoxie et la mort de cellules adipocyt aires observées au cours de l’obésit é cont ribuent au
30
recrut ement d’un grand nombre de macrophages au sein du t issu adipeux. Ces macrophages
act ivés part icipent également à la libérat ion de nombreuses subst ances pro ‐inflammat oires
(TNF‐, IL‐6…) ent rainant l’induct ion et la maint enance d’un ét at inflammat oire associé à
15
l’obésit é .

Au cours de l’obésit é la sat urat ion des possibilit és de st ockage des lipides au niveau des
adipocyt es ent raine une redist ribut ion anormale de ces lipides responsable d’une
lipot oxicit é.

Dans les hépat ocyt es, les défaut s d’oxydat ion des acides gras ent rainent une surcharge
mét abolique par accumulat ion d’espèces lipidiques cyt osoliques t elles que le diacylglycérol
(DAG), les céramides et les t riglycérides. Ce phénomène peut êt re at t ribué à l’augment at ion
de malonyl ‐coA, induit e par le glucose, qui sert à la fois d’int ermédiaire précurseur de novo
pour la lipogenèse et qui bloque l’enzyme clé de l’ent rée des acides gras, l’acyl ‐coA, dans la
mit ochondrie et donc leur oxydat ion. L’augment at ion d’insuline inhibe l’expression
d’enzymes ‐oxydat ives et ce rôle est maint enu au cours du développement de
16
l’insulinorésist ance, alors que son act ion de suppression de la néoglucogenèse diminue .

L’excès d’apport aliment aire, au niveau hépat ique comme au niveau du t issu adipeux, est
également associé à un st ress du rét iculum endoplasmique (RE). Ce st ress du RE et
l’accumulat ion des produit s dérivés des lipides act ivent des prot éines de t ype
sérine/ t hréonine kinases : les prot éines kinases C (PKC), qui agissent sur les récept eurs à
l’insuline ou sur leurs subst rat s IRS1 et IRS2 (Insulin Responsive Element ), ent ravant le signal
14,15
de l’insuline .

Dans les cellules du muscle st rié squelet t ique, on observe également une accumulat ion
cyt oplasmique de dérivés lipidiques (DAG, céramides) mais l’insulinorésist ance au niveau
musculaire est principalement liée à des dysfonct ions mit ochondriales. Dans ce modèle, la ‐
oxydat ion a bien lieu mais n’ét ant pas associée à une augment at ion du cycle de l’acide
t ricarboxylique et de l’act ivit é de la chaine de t ransport des élect rons, elle pourrait conduire
à un mét abolisme incomplet des acides gras dans cet t e voie et une augment at ion de dérivés
t els que l’aryl ‐carnit ine et d’espèces réact ives de l’oxygène au sein de la mit ochondrie. Ces
31
st ress sont suscept ibles d’act iver des prot éines kinases qui ent ravent la t ranslocat ion du
14,16
t ransport eur de glucose GLUT4 et donc la pénét rat ion du glucose au sein des t issus .

La liaison de l’insuline à son récept eur ent raine la phosphorylat ion de résidus t yrosine des
subst rat s IRS permet t ant l’act ivat ion de la PI3K (phosphoinosit ol 3 kinase), puis la
t ranslocat ion du t ransport eur de glucose GLUT4 dans le muscle et le t issu adipeux, la
synt hèse de glycogène au niveau musculaire et hépat ique, et l’inhibit ion de la
17
néoglucogenèse hépat ique et de la lipolyse dans le t issu adipeux .

L’obésit é et l’aliment at ion riche en graisse ent rainent donc l’apparit ion de différent s st ress
mét aboliques. Des st imuli ext racellulaires représent és par les cyt okines comme l’IL‐1 et le
TNF‐, par les acides gras libres et par les produit s t erminaux de la glycat ion (AGEs), formés
suit e à l’hyperglycémie, qui se lient respect ivement à leurs récept eurs cellulaires spécifiques
: IL‐1R, TNFR, t oll like recept or (TLR) et le récept eur RAGE (recept or for advanced glycat ion
end ‐product s). Des st ress int racellulaires induit s par la surcharge mét abolique que sont
l’accumulat ion de lipides (céramides), l’augment at ion de la product ion d’espèces oxygéno ‐
réact ives, du st ress du rét iculum endoplasmique et l’act ivat ion des PKC. Ces différent s
st imuli about issent à l’act ivat ion des voies du IKKb (IkB kinase b)‐NF‐B au niveau des
15,18
hépat ocyt es, des adipocyt es et des macrophages qui leur sont associés .

La voie du NF‐κB est act ivée dans de nombreux t issus au cours du diabèt e de t ype 2 et de
l’obésit é et a un rôle cent ral dans la promot ion de l’inflammat ion t issulaire. L’obésit é induit
ainsi l’expression de gènes cible du fact eur de t ranscript ion NF‐κB comme les gènes des
15
cyt okines pro ‐inflammat oires dans le foie et les t issus adipeux . Ces cyt okines, incluant le
TNF‐, l’IL‐ 6 et l’IL‐1 peuvent ent rainer une insulinorésist ance dans les t issus dans lesquels
elles sont produit es et peuvent êt re t ransport ées dans la circulat ion sanguine pour affect er
des t issus à dist ance : parois des vaisseaux sanguins, muscle, cœur, reins, et leucocyt es
circulant s. La voie du JNK act ive des fact eurs de t ranscript ion dont le rôle n’est pas
15
complèt ement ét abli au cours de l’insulinorésist ance . Les cyt okines produit es par la voie
du NF‐kB, not amment IL‐1 et TNF‐ ont elles‐mêmes la capacit é d’act iver la voie du NF‐kB.
32

Figure n°3 : M écanismes int racellulaires de l’insulinorésist ance

Ces processus une fois act ivés peuvent donc êt re aut o ‐ent ret enus par un feed ‐back posit if,
15
et perpét uer l’ét at inflammat oire .

1.4.3.2. M écanismes du déficit insulinosécrét oire

Le diabèt e de t ype 2 s’accompagne d’un défaut quant it at if et qualit at if de la sécrét ion
d’insuline évoluant vers une réduct ion progressive de cet t e sécrét ion sous‐t endue par des
4
phénomènes d’apopt ose des cellules  du pancréas . Plusieurs mécanismes ont ét é évoqués
pour expliquer la disparit ion progressive de ces cellules. Les niveaux élevés de cyt okines et
de chimiokines ret rouvés au niveau des îlot s des diabét iques de t ype 2 placent à nouveau
l’inflammat ion au cœur des processus pat hogéniques.

L’exposit ion chronique des îlot s pancréat iques à de fort e quant it é de nut riment s
(hyperglycémie et excès d’acides gras libres) induit des dysfonct ions des cellules  et about it
à leur mort cellulaire, définissant le concept de « glucolipot oxicit é ». L’hyperglycémie
ent raine une apopt ose des cellules  par l’induct ion de l’expression du récept eur pro ‐
apopt ot ique FAS à la surface de ces cellules et cet t e expression est ensuit e posit ivement
régulée par la product ion d’IL‐1 par les cellules  sous l’influence du glucose. Les acides
33
gras, surt out en présence de glucose, sont également responsables d’une augment at ion de
la product ion d’IL‐1. L’induct ion init iale d’IL‐1 peut ensuit e êt re amplifiée par un cycle
d’aut o ‐inflammat ion, les cellules  exprimant fort ement son récept eur l’IL‐1R1 (IL‐1 recept or
t ype 1) alors que son récept eur ant agonist e IL‐1RA est diminué dans les îlot s des pat ient s
at t eint s de diabèt e de t ype 2. La voie du NF‐κB est également act ivée dans les cellules  des
îlot s par l’int ermédiaire de l’act ion du glucose et de l’ IL‐1 et son inhibit ion semble prot éger
15
ces cellules des effet s néfast es liés à la glucot oxicit é .

L’hyperglycémie est responsable d’une plus fort e sollicit at ion de la fonct ion sécrét rice des
cellules . La demande accrue d’insuline ent raine une surcharge de t ravail au niveau du
rét iculum endoplasmique (RE), conduisant à un st ress du RE pouvant conduire à la mort des
16
cellules par aut ophagie.

L’hyperglycémie ent raine également une augment at ion de la product ion d’espèces
oxygénoréact ives, or les cellules  sont t rès pauvres en enzymes ant ioxydant es et donc t rès
15
suscept ibles au st ress oxydat if ent raînant à t erme une mort cellulaire par apopt ose.

Enfin l’hypersécrét ion d’insuline est accompagnée par une libérat ion accrue d’amyline
suscept ible de former des fibres amyloïdes qui s’accumulent à la surface des cellules ,
about issant à leur dysfonct ion et leur apopt ose. Elles induisent la sécrét ion d’IL‐1  par les
macrophages et peuvent ainsi cont ribuer elles aussi à l’inflammat ion des îlot s et à la
15
dest ruct ion progressive des cellules  du pancréas .
1.5. Complications chroniques du diabète

Les complicat ions à long t erme du diabèt e sont classiquement divisées en deux cat égories :
‐ les complicat ions microangiopat hiques : neuropat hie, néphropat hie et
rét inopat hie dont le fact eur de risque majeur est l’hyperglycémie
chronique
‐ les complicat ions macroangiopat hiques : maladies cardiovasculaires dont

les fact eurs de risque sont l’hyperglycémie, l’insulinorésist ance, des
34
carences en insuline, une dyslipidémie, l’hypert ension, l’hyperlipidémie et
19
l’inflammat ion .
1.5.1. Complications microangiopathiques

1.5.1.1. Rét inopat hie
La rét inopat hie est une complicat ion fréquent e qui t ouche plus de 50% des diabét iques
après 15 ans d’évolut ion du diabèt e. Fort ement liée à l’hyperglycémie et la durée du
diabèt e, elle se t raduit par diverses lésions observables lors d’un examen du fond d’œil :
micro ‐anévrismes rét iniens, hémorragies rét iniennes punct iformes, exsudat s et oedèmes
19
rét iniens, et oœdème maculaire. Elle est responsable, à t erme, de cécit é .

1.5.1.2. Néphropat hie
La néphropat hie t ouche préférent iellement les diabét iques de t ype 1 : 50% des malades en
sont at t eint s. Ses principaux fact eurs d’apparit ion et de progression sont le mauvais
équilibre glycémique et l’hypert ension. La néphropat hie diabét ique évolue en plusieurs
ét apes et début e par une prot éinurie discrèt e, couramment appelée micro ‐albuminurie, qui
t raduit des défaut s anat omiques et biochimiques au niveau des glomérules rénaux. Elle
évolue associée à une hypert ension en un syndrome œdémat eux suscept ible d’évoluer vers
une insuffisance rénale. Le pat ient est alors macroalbuminurique et les glomérules rénaux
diminuent en nombre et en capacit é fonct ionnelle. La néphropat hie diabét ique évolue à
19
t erme vers une insuffisance rénale chronique sévère .

1.5.1.3. Neuropat hie
La neuropat hie est la complicat ion la plus fréquent e et la plus précoce du diabèt e sucré. Il
s’agit d’une démyélisat ion segment aire des axones associée à des dépôt s lipidiques sur les
cellules de Schw ann ent ourant les axones. Sa manifest at ion la plus commune est la
polynévrit e : at t eint e bilat érale et symét rique au départ dist ale puis qui remont e
progressivement au niveau proximal des membres, t ouchant quasi exclusivement les
membres inférieurs. Elle début e par des parest hésies et des dysest hésies qui évoluent par
une sympt omat ologie douloureuse not amment la nuit et qui cèdent en général au cours de
l’exercice physique. On observe fréquemment une disparit ion des réflexes ost éo ‐t endineux,
35
une alt érat ion des sensibilit és profondes et superficielles, les t roubles mot eurs ét ant
except ionnels. La polynévrit e diabét ique peut êt re compliquée par des t roubles t rophiques,
not amment le mal perforant plant aire. Il s’agit d’une ulcérat ion cut anée au niveau des
point s de pression du pied, en général non douloureuse du fait de la neuropat hie. La
présence d’une infect ion à ce niveau est suscept ible de la faire évoluer en lésions
dest ruct ives art iculaires et osseuses s’accompagnant d’une déformat ion du pied. La
neuropat hie peut également se manifest er par des at t eint es végét at ives : vasomot rices,
génit o ‐urinaires et digest ives. Sa prévent ion passe essent iellement par le maint ien d’un bon
19
équilibre glycémique .
1.5.2. Complications macroangiopathiques

Elles t ouchent t out es les art ères de l’organisme mais se manifest ent principalement au
niveau des art ères coronaires et cérébrales, et des membres inférieurs. Les principaux
fact eurs de risque associés sont l’âge, le sexe, l’obésit é, le t abagisme, l’hyperglycémie,
l’hypert ension art érielle, la dyslipidémie (augment at ion des t riglycérides, diminut ion du HDL
cholest érol et présence de pet it s LDL denses t rès at hérogènes) ou encore un syndrome
inflammat oire sous‐jacent .

Les lésions sont dist ales, souvent calcifiées et les dépôt s lipidiques au niveau des art ères
sont accompagnés de dépôt s glycoprot éiques. Elles peuvent conduire à une insuffisance
coronaire suscept ible d’ent rainer un infarct us du myocarde, à une at t eint e des t roncs
art ériels supra‐aort iques responsables d’accident s vasculaires cérébraux, et à une
art ériopat hie pouvant conduire à des nécroses dist ales à l’origine d’amput at ions le plus
19
souvent des membres inférieurs .

36
2. COMPLICATIONS CARDIOVASCULAIRES DU DIABETE DE
TYPE2

(at hérosclérose, syndromes coronariens, AVC,…).

En effet , le risque d’at t eint e vasculaire est t rès fort ement augment é au cours du diabèt e. Et
les complicat ions cardiovasculaires associées (AVC, IM ) sont responsables de 80% des décès
5
des personnes diabét iques .
2.1. Les complications cardiovasculaires du diabète

Les conséquences les plus import ant es du diabèt e se sit uent au niveau macrovasculaire, et
en part iculier au niveau coronarien, dont l’at t eint e condit ionne le pronost ic vit al des
pat ient s. Chez les pat ient s diabét iques la principale cause de mort alit é est en effet
6,20
cardiovasculaire (60% de décès) . En prat ique, le diabèt e mult iplie par t rois à cinq le risque
d’infarct us du myocarde. En 2006 en France, 12 639 personnes diabét iques ont ét é
6
hospit alisées pour un infarct us du myocarde et 9 % en sont décédées .

Les at t eint es macrovasculaires t ouchent les carot ides, l’aort e, les art ères des membres
inférieurs, et surt out les coronaires.
2.1.1. Cardiopathie ischémique

La cardiopat hie ischémique est la première cause de mort alit é au niveau mondial : sur 50
21
millions de décès, ceux par ischémie myocardique représent ent 6,3 millions .
Dans l’ét ude ENTRED 2001, 17 % des pat ient s diabét iques déclaraient avoir eu une
complicat ion ischémique cardiaque (angor, IDM , ou revascularisat ion coronaire), et 20% des
médecins déclaraient une complicat ion macrovasculaire chez leurs pat ient s (angor, IM ,
37
22
revascularisat ion coronaire ou AVC) .
L’ét ude Framingham a mont ré que les hommes diabét iques ont 2 fois plus de pat hologies
23
cardiaques et les femmes diabét iques 3 à 5 fois plus que les non diabét iques . Cert aines
ét udes t endent également à mont rer que le t aux d’évènement s cardiaques chez le
diabét ique est aussi élevé que chez le pat ient non diabét ique en ayant déjà eu un
24
événement cardiovasculaire .

Plusieurs phénomènes peuvent expliquer l’augment at ion du risque d’infarct us chez les
sujet s diabét iques et le fait que le pronost ic soit plus péjorat if :
‐ l’ét at d’hypercoagulabilit é associé au diabèt e,
‐ une at hérosclérose souvent plus diffuse que chez un pat ient non diabét ique,
‐ une alt érat ion de la st ruct ure des vaisseaux, ce qui rend la revascularisat ion plus
difficile
‐ un dysfonct ionnement mét abolique empêchant les mécanismes compensat oires

25
d’êt re efficaces .

L’at t eint e cardiaque chez le diabét ique peut se manifest er de différent es manières :
ischémie myocardique silencieuse, angor ou infarct us. L’act ion prévent ive repose sur un
t rait ement médicament eux int ensif, permet t ant une réduct ion du risque d’évènement :
‐ par un cont rôle glycémique (par exemple l’ét ude UKPDS a mont ré que la
diminut ion de 1% du t aux d’hémoglobine glyquée s’accompagnait d’une baisse de

26
14% du risque d’IDM ) ,
‐ par un cont rôle de l’hypert ension art érielle (cet t e même ét ude UKPDS a
démont ré une baisse de 15% de la mort alit é liée au diabèt e pour t out e
27
diminut ion de la pression art érielle syst olique (PAS) de 10 mm Hg)
‐ par une mait rise des dyslipidémies (dans l’ét ude CARDS, les pat ient s diabét iques
sous 10 mg d’at orvast at ine, hypolipémiant inhibit eur de l’HM G CoA‐reduct ase,
ont une diminut ion de 37% des évènement s cardiovasculaires et de 27% de la
28
mort alit é) .

Par ailleurs, l’indicat ion d’une revascularisat ion peut êt re ret enue, soit par angioplast ie avec
évent uelle pose de st ent , soit par pont age aort o ‐coronarien. La meilleure st rat égie de
38
revascularisat ion rest e encore débat t ue et est discut ée au cas par cas.
2.1.2. Artérite des membres inférieurs

L’at t eint e des art ères périphériques des membres inférieurs (AOM I : art ériopat hie
oblit érant e des membres inférieurs) a une incidence de 0,12% dans la populat ion générale
et environ 3 fois plus élevée chez les diabét iques (soit 0,4%). C’est un fact eur prédict if
29
indépendant de mort alit é et d’at t eint e des art ères cérébrales et coronariennes .

L’art érit e se manifest e cliniquement par une claudicat ion int ermit t ent e. Chez les pat ient s
asympt omat iques, elle se dépist e par la mesure de l’indice de pression syst olique (IPS). L’IPS
se mesure en faisant le rapport ent re la pression art érielle de la cheville et du bras. En cas
d’art ériopat hie, l’IPS est inférieur à 0,9. Une fois ident ifiée, la prise en charge des pat ient s
repose sur un t rait ement médicament eux int ensif avec une correct ion des fact eurs de
30
risque :
‐ un arrêt définit if du t abagisme,
‐ une st at ine,
‐ un inhibit eur de l’enzyme de conversion,
‐ un t rait ement inhibit eur de l’agrégat ion plaquet t aire (qui réduit le risque
d’évènement cardiovasculaire sévère),
‐ un ß‐bloquant en cas de cardiopat hie.

Un programme de réhabilit at ion à l’exercice est de plus fort ement recommandé.
En cas de claudicat ion int erférant gravement sur le st yle de vie, ou d’ischémie met t ant en
jeu le pronost ic du membre inférieur, une revascularisat ion par angioplast ie et +/ ‐ st ent ing,
ou pont age vasculaire est alors nécessaire, afin d’évit er le t rait ement radical qu’est
l’amput at ion.
2.1.3. Athérosclérose carotidienne

Sa principale complicat ion est l’AVC. L’AVC est la deuxième cause de mort alit é à t ravers le
monde chez les personnes de plus de 60 ans (5,5 millions en 2002). En France, 150 000
39
personnes sont vict imes d’AVC chaque année (dont 28 000 de moins de 60 ans), ce qui en
31
fait la première cause de morbidit é et la t roisième cause de mort alit é . Il exist e différent
t ypes d’AVC : l’accident ischémique t ransit oire, ischémique const it ué, l’hémorragie int ra
parenchymat euse, l’hémorragie méningée. L’AVC ischémique est la conséquence de
l’at hérosclérose carot idienne. Celle‐ci rest e longt emps asympt omat ique.
Le premier signe d’at hérosclérose est une augment at ion de l’épaisseur int ima‐média (IM T).
Chez le diabét ique, l’IM T est plus import ant e que chez le non diabét ique, indépendamment
32
de t ous les aut res fact eurs de risque . Elle est d’aut ant plus élevée que le diabèt e est mal
33
cont rôlé (HbA1c élevée) et dure depuis longt emps . La résist ance à l’insuline chez ces
34
pat ient s est un fact eur de risque de développer une at hérosclérose carot idienne . Vient
ensuit e la format ion de plaques at héroscléreuses, pouvant provoquer des st énoses et se
compliquer en accident vasculaire.

Les lésions endot héliales des macros vaisseaux chez le diabét ique sont la conséquence des
at t eint es dues:
‐ aux aut res fact eurs de risque cardiovasculaire: hypert ension art érielle,
dyslipidémie, t abagisme, hypercoagulabilit é, act ivat ion plaquet t aire,
‐ à des phénomènes propres au diabèt e : désulfat isat ion des glycosaminoglycanes
de la mat rice vasculaire, act ivat ion du syst ème rénine‐angiot ensine‐aldost érone,
st ress oxydat if, inflammat ion de l’endot hélium, secondaire à la glycémie élevée, à
l’insuline et ses précurseurs, ainsi qu’aux produit s liés à la glycat ion et à leurs
35
récept eurs .
2.2. Complications vasculaires et fonction endothéliale
2.2.1. L’endothélium vasculaire : rôle physiologique
L'endot hélium vasculaire const it ue une couche de cellules t apissant l'int érieur des vaisseaux
sanguins. Il joue un rôle cent ral dans le maint ien de l’homéost asie vasculaire de par sa
36
posit ion à l’int erface des élément s circulant s et du muscle lisse vasculaire (figure n°4) .
40
Figure n°4 : st ruct ure de la paroi vasculaire et place de l’endot hélium vasculaire
36

L’endot hélium est premièrement le régulat eur du t onus vasculaire grâce à sa capacit é à
libérer des subst ances vasoact ives, not amment le monoxyde d'azot e (NO) et la prost acycline
(propriét és vasodilat at rices) ainsi que l'endot héline et la t hromboxane A2 (propriét és
37
vasoconst rict ives) . En ce qui concerne le NO il est libéré en réponse aux forces de
cisaillement de l'endot hélium. Par ailleurs le NO at t énue la réponse cont ract ile à différent s
vasopresseurs comme la noradrénaline, l'angiot ensine II et l'endot héline. Ces agonist es
act ivent en effet des récept eurs endot héliaux et , par ce biais, st imulent la product ion de NO.
En cas d'anomalie de la fonct ion endot héliale, la libérat ion de NO est diminuée, avec pour
résult at une mont ée t ensionnelle plus import ant e pendant la syst ole et un effet
vasoconst rict eur accru de la noradrénaline, de l'angiot ensine II et de l'endot héline. Quant à
l'endot héline, elle est libérée par les cellules endot héliales soumises à un cisaillement ou
st imulées par exemple par la t hrombine, l'angiot ensine II et les lipoprot éines à basse densit é

38
(LDL) oxydées .
Le syst ème nerveux aut onome régule également le t onus vasculaire par le biais de
l’endot hélium. En effet , l'acét ylcholine provoque une vasorelaxat ion en libérant du NO de
l'endot hélium. Cet t e subst ance induit par cont re une vasoconst rict ion lorsqu'elle agit
direct ement sur la musculat ure des vaisseaux sanguins. Ainsi, en cas de dysfonct ion
41
endot héliale, l'effet vasodilat at eur de l'acét ylcholine est diminué, voire aboli ou remplacé
par un effet vasoconst rict eur.
L'endot hélium, en raison de sa localisat ion à l'int erface ent re le sang et les const it uant s de la
paroi vasculaire, est impliqué également de manière t rès import ant e dans les processus
d'hémost ase, ceci en libérant des fact eurs à act ion ant icoagulant e aussi bien que des
fact eurs à act ion procoagulant e. Dans les condit ions normales la couche endot héliale
assume une fonct ion ant icoagulant e prédominant e, mais en cas d'at t eint e de l'endot hélium,
la cont ribut ion des fact eurs menant à la t hrombose prend le dessus.
37
La cellule endot héliale int ervient dans les phénomènes de régulat ion de l'hémost ase .
38
L'act ion ant icoagulant e de l'endot hélium comport e :
1) la libérat ion de l'act ivat eur du plasminogène t issulaire (t PA) qui conduit à la
format ion de plasmine act ivée et , en conséquence, à une dégradat ion de la fibrine
2) la libérat ion de NO et de prost acycline (PGI2) qui diminuent l'agrégabilit é
plaquet t aire
3) la présence à la surface cellulaire d'une prot éine (t hrombomoduline) capable de lier
la t hrombine, ent raînant ainsi une act ivat ion de la prot éine C et , par ce mécanisme,
une inact ivat ion des fact eurs V et VIII act ivés
4) la présence à la surface endot héliale d'ect onucléot idases capables de dégrader l'ADP
libéré lors de l'agrégat ion plaquet t aire et , par ce biais, de limit er le processus
d'agrégat ion induit par l'ADP.
38
Quant à la fonct ion procoagulant e de l'endot hélium, elle met en jeu :
1) la libérat ion du fact eur t issulaire qui act ive la voie ext rinsèque de la coagulat ion
2) la libérat ion de t hromboxane A2 et du «plat elet act ivat ing fact or» (PAF) qui
augment ent l'agrégabilit é plaquet t aire
3) la libérat ion de l'inhibit eur de l'act ivat eur du plasminogène (PAI‐1)
4) la libérat ion du fact eur de von Willebrand qui facilit e l'adhésion des plaquet t es au
t issu lésé et , t out en t ransport ant le fact eur VIII, ralent it sa dégradat ion.
42
L’endot hélium joue également un rôle essent iel dans la régulat ion du passage des
37
monocyt es sanguins dans la paroi vasculaire . Ces monocyt es jouent , ent re aut re, un rôle
import ant dans la pat hogenèse de l'at hérosclérose. Ils sont at t irés dans l'int ima par les LDL
oxydées et le «monocyt e chemot act ic‐prot ein ‐1» (M CP‐1), un fact eur dont la libérat ion à
part ir de l'endot hélium est augment ée par l'endot héline et diminuée par le NO. Le
monocyt e une fois localisé dans l'int ima devient un macrophage qui possède beaucoup de
récept eurs capables de fixer les LDL oxydées, ce qui l'amène à capt er une grande quant it é de
ces lipoprot éines et à devenir une cellule spumeuse. Le passage des monocyt es est facilit é
par les molécules d'adhésion présent es à la surface des cellules endot héliales. Leur
38
expression est accrue par l'endot héline, et diminuée au cont raire par le NO .
2.2.2. Dysfonction endothéliale et pathologies vasculaires

La caract érist ique principale de la dysfonct ion endot héliale est une réduct ion de la
biodisponibilit é en NO associée à la pert e de ses propriét és ant iat hérogènes et
39
ant it hrombot iques .
C’est pourquoi la dysfonct ion endot héliale est impliquée de façon précoce dans la
physiopat hologie de l’at hérosclérose (figure n°5) prédict eur de la mort alit é et morbidit é
40
cardiovasculaire .
43

Figure n°5 : Coupe schémat ique d’une art ère saine et d’une art ère art érioscléreuse : place de
l’endot hélium vasculaire
41

Bien que la pat hophysiologie de la dysfonct ion endot héliale soit complexe et implique de
mult iples mécanismes, la diminut ion de la biodisponibilit é du NO pourrait avoir quat re
origines :
 l’augment at ion de la capt ure ou de la dégradat ion du NO par les radicaux libres;
 la réduct ion de l’expression et / ou de l’act ivit é de la eNOS ;
 le « découplage » de la eNOS (en l’absence du subst rat l ‐arginine ou du cofact eur
42
BH4) ;
 l’alt érat ion de la t ransmission des événement s signalét iques init iés par le NO .
42

Ét ant donné le rôle majeur de la dysfonct ion endot héliale dans la maladie cardiovasculaire,
on comprend pourquoi elle est rapidement apparue comme une cible prévent ive et
t hérapeut ique priorit aire.
La présence de dysfonct ion endot héliale, définie comme une diminut ion de la réponse
vasodilat at rice à l'acét ylcholine, a ét é démont rée dans différent s t errit oires vasculaires, que
ce soit chez des malades connus pour êt re coronariens ou des malades présent ant un
fact eur de risque cardiovasculaire (hypert ension, hypercholest érolémie, diabèt e,
44
39
t abagisme) . Les ét udes ont mont ré qu'il est possible d'améliorer la fonct ion endot héliale
grâce au t rait ement ant ihypert enseur, aux hypolipémiant s et aux hypoglycémiant s.
Il est dès lors t ent ant de spéculer que la mise en évidence d'une dysfonct ion endot héliale
chez un malade donné indique l'exist ence d'un processus at hérosclérot ique sous‐jacent ,
associé à un risque anormalement élevé de présent er une complicat ion cardiovasculaire à
43
moyen ou long t ermes (figure n°6) .
Figure n°6 : dysfonct ion endot héliale et complicat ions cardiovasculaires du diabèt e :

at hérosclérose, néphropat hie et rét inopat hie
43
45
3. Evaluation du risque cardiovasculaire et pathologie diabétique :
facteurs de risque
3.1. Facteurs de risques cardiovasculaires conventionnels

En dehors de la not ion de diabèt e, plusieurs sit uat ions physiopat hologiques sont
convent ionnellement considérées comme ét ant à risque de développer une pat hologie
cardiovasculaire. Ces fact eurs de risque de maladie cardiovasculaire (M CV) peuvent êt re
9
répart is, selon les classificat ions, en modifiables ou non modifiables :
 Les fact eurs de risque non modifiables de M CV sont l’âge et le sexe.

 Les fact eurs de risque modifiables, qui font l’objet d’une prise en charge
t hérapeut ique, sont :
‐ Les dyslipidémies (hyper LDLémie et hypo HDLémie principalement )

‐ L’hypert ension art érielle
‐ Le t abagisme
‐ Le surpoids lié direct ement à la not ion de sédent arit é

3.1.1. Les dyslipidémies

Plusieurs anomalies lipidiques sont à l’origine d’un risque accru d’at hérosclérose.

3.1.1.1. L’hyper LDLémie
De nombreuses ét udes mont rent qu’un t aux élevé de LDL est associé à une augment at ion
9
des pat hologies cardiaques ou cardiovasculaires et de la mort alit é . Selon la Haut e Aut orit é
de Sant é (HAS), chez un pat ient sans fact eur de risque, le bilan sera considéré comme
normal si le LDL cholest érol est < 1,60 g/ l (4,1 mmol/ l).
Chez les pat ient s ayant une hyperLDLémie, un t rait ement reposant init ialement sur les
règles hygiéno ‐diét ét iques sera inst auré durant 3 mois, suivi évent uellement d’un
t rait ement médicament eux hypolipémiant .

46
3.1.1.2. L’hypo HDLémie
Elle est définie par un HDL‐cholest érol < 0,40 g/ l (1 mmol/ l), est souvent associée à une
hypert riglycéridémie, une obésit é, ou un diabèt e de t ype 2, et peut s’inscrire dans un
t ableau de syndrome mét abolique. Le t rait ement repose essent iellement sur la correct ion
des fact eurs de risque associés, except é en prévent ion secondaire, où la prescript ion d’un
fibrat e peut êt re just ifiée en cas d’échec diét ét ique (si hypert riglycéridémie avec LDL‐
cholest érol< 1,0 g/ l et HDL‐cholest érol < 0,40 g/ l). L’hypo HDLémie est un fact eur de risque
d’évènement cardio ‐vasculaire à part ent ière. A l’inverse, un HDL élevé (>0,60 g/ l ; soit
44
1,5mmol/ l) est un fact eur cardio ‐prot ect eur .

3.1.1.3. L’hypert riglycéridémie
Elle est définie par un t aux de t riglycérides >1,5 g/ l (1,7mmol/ l) et s’inscrit aussi souvent
dans le cadre d’un syndrome mét abolique.1En cas d’hypert riglycéridémie <4g/ l (4,6mmol/ l),
la prise en charge est avant t out diét ét ique associant une réduct ion pondérale avec
réduct ion des glucides simples, une act ivit é physique, et une réduct ion de la consommat ion
d’alcool.

3.1.1.4. L’apolipoprot éine A1 et l’apolipoprot éine B
L’apoA1 est le principal composant possédant une act ivit é ant i ‐at hérogène biologiquement
act ive de l'HDL cholest érol. L’apoB est un t ransport eur de part icules VLDL (very low ‐densit y
lipoprot ein), IDL (int ermediat e‐densit y lipoprot ein) et LDL, t out es pot ent iellement
at hérogènes. Un rapport apoB / apoA1 élevé est associé à un plus grand nombre d’IDM ,
45
comme l’a mont ré l’ét ude INTERHEART . Une mét a analyse mont re que ce rapport apoB /
apoA1 est un meilleur indicat eur d’at hérosclérose que le cholest érol LDL ou le rapport
46
cholest érol t ot al/ HDL .
3.1.2. L’hypertension artérielle

Chez le diabét ique, l’hypert ension art érielle (HTA) représent e un fact eur aggravant de la
néphropat hie, de la rét inopat hie, et de la cardiopat hie diabét ique.
47
L’object if t ensionnel chez le pat ient diabét ique est donc plus st rict : PA < 130/ 80 mm Hg.
47
L’ét ude UKPDS a mont ré qu’un cont rôle t ensionnel plus import ant (object if TA<150/ 85
mmHg, avec un t rait ement par capt opril ou at enolol) vs un object if t ensionnel moins st rict
(TA <180/ 105 mm Hg) chez le diabét ique permet d’en diminuer les complicat ions : réduct ion
de 32% de la mort alit é liée au diabèt e, diminut ion de 44% du nombre d’AVC et enfin
réduct ion de 37% des complicat ions microvasculaires (rénales ou opht almologiques).
Cependant , ce cont rôle doit êt re poursuivi de façon durable afin que les bénéfices puissent
êt re maint enus sur le long t erme.
3.1.3. L’âge et le sexe

La prévalence des maladies cardiovasculaires augment e avec l’âge. Un âge supérieur ou égal
à 45 ans pour l’homme et 55 ans pour la femme est considéré comme un fact eur de risque.
Chez les pat ient s diabét iques, par cont re, le risque relat if de mort par maladie coronarienne
48
est significat ivement plus élevé chez la femme que chez l’homme .
3.1.4. Le tabagisme

La fumée de t abac est à la fois un fact eur prot hrombot ique et at hérogène. C’est un fact eur
de risque d’IDM , de mort subit e, d’anévrysme aort ique, et d’at t eint e vasculaire
périphérique. Cependant , l’arrêt du t abac, même après 65 ans, ent raine une réduct ion de la
49
mort alit é et de la morbidit é cardiovasculaire rapide .
3.1.5. Le surpoids et l’élévation du ratio tour de taille/ tour de hanches

L’ét ude INTERHEART a mont ré que l’IM C n’ét ait pas un bon marqueur de risque. En
revanche, dans cet t e ét ude le rapport t our de t aille/ t our de hanches (TT/ TH) ét ait un fact eur
fort ement associé au risque d’IDM . Le t our de t aille est lui fort ement corrélé au risque
d’IDM , alors que le t our de hanches y est inversement corrélé. Les normes de t our de t aille
sont 80 cm chez la femme, 94 cm chez l’homme. Les normes du rapport TT/ TH : 0,85
50
chez les femmes, 1 chez les hommes .
48
3.2. Evaluation du risque vasculaire
3.2.1. Le score de Framingham

Le score de Framingham permet d’est imer le risque à 10 ans de développer une pat hologie
coronarienne grave. Il a ét é élaboré grâce aux résult at s de l’ét ude Framingham. Le risque est

51
calculé en fonct ion de plusieurs données :
‐ Age
‐ Sexe
‐ Cholest érol t ot al
‐ HDL cholest érol
‐ Tabagisme
‐ Pression art érielle syst olique
‐ Présence ou non d’un diabèt e
‐ +/ ‐ Présence ou non d’une hypert rophie vent riculaire gauche

Il se déroule en 9 ét apes avec des scores différent s en fonct ion du sexe. De nombreux
logiciels permet t ent cependant de faire le calcul rapidement . En fonct ion du score, t rois
niveaux de risque sont définis :
‐ Faible : score < 10%
‐ Int ermédiaire : score ent re 10 et 20%
‐ Elevé : score 20%
Les sociét és savant es européennes et américaines ont fixé à 20% le seuil de risque

9,10,52
cardio ‐vasculaire global nécessit ant une int ervent ion t hérapeut ique .
3.2.2. Risque cardiovasculaire et diabète de type 2

La définit ion du risque vasculaire chez le pat ient diabét ique diffère quelque peu selon les
pays. Aux Et at s‐Unis, en 1998, Haffner et al. ont comparé l’incidence des IDM sur 7 ans chez
53
les diabét iques et les non diabét iques avec ou sans ant écédent d’infarct us . Le risque relat if
ent re le t aux d’IDM chez les non diabét iques en prévent ion secondaire et chez les
diabét iques en prévent ion primaire ét ait de 1,2 une fois ajust é aux fact eurs de risque
49
t radit ionnels, les classant donc en risque équivalent . De même, l’American Heart
Associat ion, ainsi que l’American Diabet es Associat ion (ADA) considèrent dans leurs
recommandat ions que le pat ient diabét ique doit êt re t rait é comme un sujet à risque
9,10
coronaire équivalent (ayant déjà eu un évènement cardiaque ischémique) .

En France, selon les recommandat ions HAS, un pat ient diabét ique est considéré comme à
haut risque cardio ‐vasculaire (ou risque cardio ‐vasculaire équivalent à une prévent ion
secondaire) s’il présent e :
‐ Soit une at t eint e rénale, qui est définie par la présence d’une albuminurie 300
mg/ 24h, ou bien par une diminut ion du début de filt rat ion glomérulaire (calcul
selon la formule de Cockcroft et Gault ) inférieur à 60 ml/ min.
‐ Soit un diabèt e évoluant depuis plus de 10 ans et au moins 2 fact eurs de risque
parmi lesquels :
‐ Des ant écédent s familiaux de maladie coronaire précoce (infarct us ou
er
mort subit e chez le père ou un parent du 1 degré de sexe masculin avant
er
55 ans, ou avant 65 ans chez la mère ou un parent du 1 degré de sexe
féminin), des ant écédent s familiaux d’AVC const it ués avant l’âge de 45
ans
‐ un t abagisme act if ou arrêt é depuis moins de 3 ans,
‐ une hypert ension art érielle,
‐ un HDL‐cholest érol <0,40 g/ l (soit 1 mmol/ l),
‐ une microalbuminurie (>30 mg/ 24 heures),
‐ un âge 50 ans pour un homme, ou 60 ans pour une femme.
‐ Soit , après calcul par des équat ions de risque, un risque >20% de faire un
événement coronarien dans les 10 ans.

En 2001, dans l’ét ude ENTRED, 29% des pat ient s diabét iques de t ype 2 avaient un risque
vasculaire élevé (selon les définit ions du risque vasculaire de l’HAS suscit ées). Ce
pourcent age ét ait probablement sous‐est imé du fait des fréquences insuffisant es des
dosages de microalbuminurie et de cholest érol. Seulement un quart (26%) des personnes à
haut risque at t eignaient en 2001 l’object if de LDL inférieur ou égal à 1 g/ l.
50
Bien que discut ées d’un pays à l’aut re, l’ensemble de ces données met en exergue la réalit é
d’un risque vasculaire t rès élevé chez les pat ient s diabét iques de t ype 2. Il est
communément admis que le risque cardiovasculaire est 5 fois supérieur chez les sujet s
diabét iques comparés à la populat ion non diabét ique. Les complicat ions cardiovasculaires
qui en résult ent (AVC, IM , AOM I, IRC) sont les principales causes de morbi ‐mort alit é des
pat ient s diabét ique const it uant aujourd’hui un réel problème de sant é publique au ‐delà du
dépist age et de la prévent ion du diabèt e de t ype 2.
3.3. Améliorer le dépistage du risque cardiovasculaire

Les fact eurs de risque (FR) cardiovasculaire (CV) classiques t els que la dyslipidémie,
l’hypert ension, le t abagisme et le diabèt e sucré ont ét é int égrés dans des modèles à
variables mult iples pour évaluer le risque de survenue d’un accident CV dans la populat ion
générale. Ce concept d’est imat ion globale du risque permet de prédire avec plus de
vraisemblance le risque CV, t out en jouant un rôle clé dans l’individualisat ion des mesures
52
t hérapeut iques .

Ainsi que l’a démont ré l’ét ude INTERHEART réalisée sur un collect if de plus de 30 000
part icipant s issus de 52 pays différent s, les FR t radit ionnels sont à même d’expliquer plus de

45
90% des infarct us du myocarde . Fondés sur ces FR classiques, les algorit hmes permet t ent
de st rat ifier les individus en t rois cat égories de risque, faible, int ermédiaire et élevé.
Cependant , il faut t out de même const at er que ces modèles ne sont pas parfait s. En effet ,
dans le cadre de l’ét ude prospect ive PROCAM (Prospect ive cardiovascular muenst er), un
t iers des vict imes d’infarct us du myocarde a ét é observé dans le groupe des sujet s qui
54
avaient ét é init ialement classifiés comme ét ant à risque int ermédiaire .

C’est pour cet t e raison qu’au cours de ces dernières années un grand nombre de paramèt res
biochimiques ont ét é évalués en t ant que fact eurs pot ent iels de risque CV avec pour object if

55
d’améliorer l’évaluat ion du risque vasculaire aux moyens de mét hodes non invasives .

51
Parmi les biomarqueurs biochimiques act uellement évalués on compt e :
‐ les marqueurs de l’inflammat ion (CRP Ult rasensible, Homocyst éine, Serum
Amyloïde A (SAA), Lp ‐PLA2 (Lipoprot ein associat ed Phospholipase A2),
cyt okines (Il ‐6, IL‐18) et fact eurs chimiot act iques (M CP‐1, ICAM ‐1, VCAM ‐1)
‐ les marqueurs lipoprot éiques aut res que les marqueurs convent ionnellement
ut ilisés (LDL‐Ox, Génot ypes d’ApoE, Lp(a), Small Dense LDL)
‐ les marqueurs de l’at hérot hrombose (fibrinogène, D‐Dimères (DDI), Act ivat eur
t issulaire du plasminogène (TPA),…)
‐ les marqueurs d’oxydat ion (homocyst éine, Lp ‐PLA2, AGEs, …)
‐ les marqueurs de la néphropat hie diabét ique (microalbuminurie, cyst at ine C)

Ces biomarqueurs sont représent at ifs de mécanismes physiopat hologiques impliqués
direct ement dans le processus de dysfonct ionnement endot hélial et d’at hérosclérose. Ils
pourraient const it uer des crit ères de jugement prédict ifs de l’apparit ion d’évènement s
cardiovasculaires en associat ion ou non aux fact eurs de risques convent ionnels. Dans cet
opt ique, des invest igat ions cliniques sont en cours.
52
4. DIABETE, STRESS OXYDANT ET HYPERGLYCEMIE CHRONIQUE

4.1 Hyperglycémie chronique et stress oxydant

Le st ress oxydat if correspond globalement à un déséquilibre ent re la product ion cellulaire de
radicaux libres, d’espèces réact ives de l’oxygène (ROS : React ive Oxygen Species) et les
56
défenses ant ioxydant es de l’organisme . La t oxicit é des radicaux libres varie en fonct ion de
l’int ensit é et de la durée de leur format ion.

La product ion modérée et t ransit oire de radicaux libres peut servir de mécanisme de
défense en permet t ant la dest ruct ion de cellules cancéreuses. Si la synt hèse d’espèces
radicalaires est récurrent e et chronique alors il y a un déséquilibre ent re product ion et
dét oxificat ion et st ress oxydat if. Dans le cas d’un st ress oxydant prolongé, la product ion
excessive d’espèces radicalaires peut engendrer indirect ement des mécanismes de mort
57
cellulaire programmée (apopt ose, aut ophagie) .
4.1.1. Définitions des radicaux libres.
Ce sont des espèces chimiques fort ement réact ives comport ant des élect rons non appariés
au niveau de leur couche ext erne. La présence d'un élect ron célibat aire confère à ces
molécules, la plupart du t emps, une grande inst abilit é. Elles ont la possibilit é de réagir avec
de nombreux composés dans des processus le plus souvent non spécifiques, et que leur
durée de vie en solut ion est t rès court e. La st abilit é de ces ent it és chimiques décroît lorsque
le nombre d'élect rons célibat aires augment e.

Les radicaux sont généralement obt enus par rupt ure de liaisons chimiques (figure n°7). Ét ant
−1
donné que les liaisons chimiques ont des énergies de l'ordre de cent aines de kJ.mol , les
condit ions mises en jeu pour donner des radicaux sont souvent drast iques : haut es
t empérat ures, radiat ions ionisant es, ult raviolet s. Ils résult ent de la coupure homolyt ique
58
d’une molécule .
53
• •
Figure n°7 : Coupure Homolyt ique d’une molécule et product ion d’espèces radicalaires
4.1.2. Diabète de type 2 et hyperproduction de radicaux libres

Au cours du diabèt e, et plus part iculièrement dans le t ype 2 lié à un syndrome mét abolique,
l’hyperglycémie est associée à un st ress oxydant lié à une hyperproduct ion de radicaux libres
et ROS.

59
Le st ress oxydant lié à l’hyperglycémie a plusieurs origines (figure n°8 et 10) :

 Le glucose sous sa forme ène‐diol en présence de mét aux de t ransit ions donne un
radical anionique ène‐diol. Le radical ène‐diol en réduisant l’oxygène moléculaire
•‐
libère des radicaux superoxydes (O2 ). De plus, il y a format ion concomit ant e d’un
dérivé carbonylé au cours de cet t e réact ion. L’anion superoxyde peut se dismut er en
peroxyde d’hydrogène qui en présence de mét aux de t ransit ions produit un radical
• 58
hydroxyle (HO ) t rès réact if .

 La glycat ion des prot éines est par elle‐même générat rice d’ROS (espèces réact ives de
l’oxygène). Tout es les ét apes de la glycat ion génèrent des ROS, aussi bien au st ade
des produit s init iaux que des produit s int ermédiaires et avancés, conduisant à la
format ion d’aldéhydes réact ifs comme le mét hylglyoxal (M GO). Les produit s
d’AM ADORI t elle que l’hémoglobine glyquée réagissent avec l’oxygène moléculaire
57
pour former de l’ion superoxyde ou du peroxyde d’hydrogène .

 Un déséquilibre de la chaine respirat oire mit ochondriale et de la NADPH oxydase
présent e dans les cellules musculaires et endot héliales génère des radicaux
superoxydes. Le gradient de prot on généré par la chaine respirat oire mit ochondriale
•‐
est à l’origine de la product ion de radicaux superoxydes (O2 ). Cet t e product ion de
54
radicaux superoxydes se sit ue au niveau de la NADH déshydrogénase du complexe I
et à l’int erface ent re l’ubiquinone et le complexe III.

 L’hyperglycémie prolongée induit la format ion de produit s t erminaux de glycat ion.
Les AGE st imulent les récept eurs membranaires RAGE sit ués à la surface des cellules
endot héliales et musculaires. L’int eract ion AGE‐RAGE st imule des voies de
signalisat ion comport ant les voies des M it ogen ‐Act ivat ed Prot eine Kinases (M APK) et
la voie du fact eur de t ranscript ion NFB (Necrosis Fact or kappa B) induisant la
product ion de radicaux libres via la st imulat ion de la NADPH oxydase.

 L’hyperglycémie induit l’augment at ion de la product ion de sorbit ol par la voie des
polyols. La product ion de sorbit ol a pour conséquence la baisse de NADPH
int racellulaire. En effet , le NADPH est nécessaire à l’act ivit é de l’aldose réduct ase
pour la synt hèse du sorbit ol. Le NADPH ét ant diminué, le glut at hion oxydé sera
réduit plus faiblement . De plus, le sorbit ol est oxydé en fruct ose avec réduct ion du
+
NAD+ en NADH,H . L’augment at ion de la concent rat ion en sorbit ol et fruct ose
conduit à un oedème osmot ique au niveau oculaire, ce qui explique que la voie des
60
polyols joue un rôle clé dans la cat aract e induit e par le diabèt e . La voie des polyols
ent raine la baisse du NADPH ce qui provoque une baisse d’act ivit é de la NO‐synt hase
qui synt hét ise le NO. Le radical superoxyde induit une baisse du NO en réagissant
avec celui ‐ci et en formant un anion peroxynit rit e t rès réact if. La baisse de
concent rat ion en NO pourrait êt re à l’origine de phénomènes d’hypert ension car le
NO est un puissant vasodilat at eur. La biodisponibilit é du NO est , de plus, diminuée
par t rois mécanismes :
- Diminut ion d’act ivit é de la NO‐synt hase, consécut ive à la chut e du rapport
+ +
NADPH,H / NADP .
- Réact ion du NO avec l’anion superoxyde conduisant à la format ion de
peroxynit rit e, oxydant puissant .
- Piégeage du NO par les AGE.
55
 L’hyperglycémie induit la synt hèse de diacylglycerol conduisant à l’act ivat ion de la
voie de la prot éine kinase C. La prot éine kinase C st imule la NADPH oxydase
61
provoquant la product ion d’espèces réact ives de l’oxygène .

Figure n° 8 : représent at ion schémat ique des mécanismes de product ion de ROS au cours
du diabèt e (AGEs: advanced glycat ion end product s; CAT: cat alase; GPX: glut at hione
peroxidase; HBP: hexosamine biosynt het ic pat hw ay; PKC: prot ein kinase C;
PP: polyol pat hw ay; ROS: react ive oxygen species; SOD: superoxide dismut ase)
59

56
4.1.3. Les défenses antioxydantes.

L’organisme possède un ensemble de défenses ant ioxydant es pour se prot éger des ROS
(figure n°10). L’organisme comport e deux t ypes de défenses ant ioxydant es. L’une d’origine
endogène formée d’enzymes et l’aut re d’origine exogène const it uée principalement de
vit amines et d’oligoélément s.

4.1.3.1. Les syst èmes de défenses enzymat iques.

‐Les superoxydes dismut ases (SOD).
Ces sont des mét alloprot éines. Elles sont en première ligne dans le syst ème de défense du
st ress oxydant . Elles assurent la dismut at ion de l’anion superoxyde en peroxyde
d’hydrogène et en oxygène. Il exist e t rois isoenzymes de la SOD: la Cu/ Zn ‐SOD1 présent e
dans le cyt osol, la M n ‐SOD2 mit ochondriale et la Cu/ Zn ‐SOD3. La SOD3 est sécrét ée par les
cellules musculaires lisses et représent e le syst ème de défense majeur dans la paroi des
art ères. L’expression de la SOD3 est augment ée par les fact eurs vasoact ifs comme
56
l’hist amine, l’endot héline 1 et l’angiot ensine 2, et diminuée par l’homocyst éine .

‐Les glut at hion peroxydases (GPxs).
Les GPxs sont des sélénoprot éines. Les GPxs réduisent les peroxydes lipidiques formés par
l’oxydat ion des acides gras polyinsat urés. Le t aux de GPxs est effondré en cas de déficit en
sélénium. A part ir d’un t aux élevé en sélénium la concent rat ion en GPxs at t eint un plat eau.
Le dosage des GPxs ne peut êt re ut ilisé comme marqueur d’une int oxicat ion au sélénium. La
synt hèse des GPxs ét ant rénale et hépat ique, l’insuffisance rénale et / ou hépat ique peuvent
56
faire varier leurs t aux .

‐Le syst ème t hiorédoxine.
La t hiorédoxine est l’ant ioxydant majeur qui maint ient les prot éines int racellulaires à l’ét at
réduit . La t hiorédoxine est régénérée par le NADPH sous l’act ion de la t hiorédoxine
réduct ase. La t hiorédoxine cont ient un groupement sélénocyst éine dans son sit e act if. De
plus, elle int ervient dans la dégradat ion des peroxydes lipidiques et du peroxyde
56
d’hydrogène. Elle permet la régénérat ion du radical ascorbyl en acide ascorbique .
57
‐La cat alase.
La cat alase est une enzyme héminique const it uée de quat re sous‐unit és cont enant chacune
2+
un groupement héminique Fe lié au sit e act if. Elle est localisée dans les peroxysomes et les
hémat ies. La réact ion que cat alyse cet t e enzyme consist e en une dismut at ion du peroxyde
60
d’hydrogène (H2O2) en oxygène et eau .
4.1.3.2. Les syst èmes de défenses non enzymat iques.

‐Le glut at hion
Le glut hat ion est formé par la condensat ion de t rois acides aminés (acide glut amique,
cyst éine et glycine). Il est la source majorit aire de résidus t hiols (‐SH) dans la cellule où il est
présent sous forme réduit e (GSH). En condit ion physiologique normale, sa forme oxydée
(GSSG) est présent e en t rès faible concent rat ion. Le rapport GSH/ GSSG est un excellent
marqueur de la peroxydat ion lipidique. Ce rapport t end à diminuer lors d’un exercice
56
physique int ense et au cours du vieillissement .

‐ L’albumine et les prot éines‐t hiols
Tout es les prot éines circulant es qui cont iennent des groupement s t hiols part icipent aux
62
défenses ant ioxydant es cont re les ROS .

Parmi ces prot éines, l’albumine t ient une place prépondérant e, cet t e prot éine est la plus
abondant e du plasma, elle const it ue le principal t ampon cont re les ROS circulant s. Cet t e
prot éine de 585 acides aminés est composée de 3 domaines homologues divisés en 9
boucles dont la st abilit é est assurée par 17 pont s disulfures, conférant à cet t e prot éine une
63
cert aine flexibilit é (figure n°9) .

L’albumine const it ue donc l’ant ioxydant prot éique majeur du plasma, compart iment
fort ement sollicit é par le st ress oxydat if et en cont act direct avec l’endot hélium vasculaire.
La plupart de ses propriét és ant ioxydant es sont at t ribuées à sa capacit é de fixat ion de
nombreux ligands de par l’adapt abilit é import ant e de sa st ruct ure. L’albumine est en effet
une prot éine de t ransport de nombreux mét abolit es, xénobiot iques, lipides ou encore de
58
mét aux divalent s. Dans ce cadre elle présent e un effet ant ioxydant indirect puisqu’elle limit e
64
l’effet de molécules prooxydant es par liaison à l’albumine.

Figure n° 9: Principaux sit es de l’albumine impliqués dans son act ivit é ant ioxydant e .
64

De plus son seul groupement t hiol libre au niveau du résidu Cys34 lui confère d’une par des
capacit és de fixat ion de ligands supplément aires et surt out la possibilit é de piéger des
65
radicaux libres. Chez un adult e normal, environ 70 à 80% du résidu Cys34 de l’albumine est
à l’ét at réduit (S‐H). Le rest e est sous la forme de pont s disulfures avec plusieurs composés
soufrés comme la cyst éine, l’homocyst éine et le glut at hion. Le groupement –SH de
l’albumine représent e un sit e de prot ect ion ant ioxydant puissant , cont re les ROS et d’aut res
espèces radicalaires.

‐La vit amine C (acide ascorbique).

L’homme ne peut synt hét iser la vit amine C et doit assurer un apport journalier d’environ
100 mg via une aliment at ion riche en fruit s. La vit amine C est un piégeur d’ROS comme le
59
radical hydroxyle ou l’anion superoxyde en agissant en synergie avec la vit amine E. En effet ,
elle inhibe la peroxydat ion lipidique en régénérant la vit amine E à part ir de la forme
66
radicalaire issue de sa réact ion avec des radicaux lipidiques .

‐La vit amine E.
Le t erme de vit amine E désigne un ensemble d’isomères qui comprend les t ocophérols et les
t ocot riénols. Les deux isomères ‐et ‐t ocophérol sont int éressant s d’un point de vue
biologique. Ayant un caract ère lipophile, ils s’insèrent aux seins des membranes
cyt oplasmiques riches en acides gras polyinsat urés. Ils réagissent avec les radicaux peroxyles

•
ROO pour former un radical t ocophéryle, et ainsi ils limit ent la propagat ion de la
peroxydat ion lipidique.

‐Les carot énoïdes.
Parmi plus de 600 carot énoïdes différent s, le ‐carot ène est le chef de file. On le ret rouve
dans l’abricot , le melon, la carot t e et les légumes vert s. L’effet bénéfique du ß‐carot ène
n’est présent qu’à dose physiologique ou aliment aire. A dose pharmacologique, le ß‐
carot ène est délét ère, surt out chez le fumeur car les ROS alt èrent le mét abolisme des
56
carot énoïdes et libèrent des mét abolit es pro ‐carcinogènes .

‐Le Coenzyme Q10 ou ubiquinone.
C’est un dérivé benzoquinolique à longue chaîne lat érale isoprénique. Sa chaine lat érale lui
confère un caract ère lipophile. Il joue un rôle essent iel dans la chaine mit ochondriale de
56
t ransport d’élect rons et il est un puissant inhibit eur de la peroxydat ion lipidique .

‐L’acide urique.
Il est présent sous la forme d’urat e à pH physiologique et c’est le produit t erminal majeur du
mét abolisme des purines. L’urat e est un puissant piégeur de ROS. Ces réact ions conduisent à
des espèces radicalaires qui seront réduit es, not amment par la vit amine C. L’allant oïne qui
est un produit de la réact ion ent re l’urat e et les ROS est présent à des t aux élevés lors d’un
56
st ress oxydant .

60
‐La bilirubine.
La bilirubine est un produit t erminal de la dégradat ion de l’hème par les cellules
rét iculoendot héliales. La bilirubine non soluble se lie à l’albumine dans un rapport
st œchiomét rique 1/ 1, ainsi sa liaison à l’albumine l’empêche de pénét rer dans les t issus
•
riches en lipides t els que le cerveau. La bilirubine piège les radicaux ROO et l’oxygène
56
singulet . Ainsi la bilirubine prot ège l’albumine des ROS .

‐Les polyphénols.
Ils sont nat urellement présent s dans l’aliment at ion. Ils sont présent s sous forme
d’ant hocyanine dans les fruit s rouges et le vin rouge. Ils sont sous forme de flavonoïdes dans
les agrumes et l’huile de lin, et enfin sous forme d’épicat échine dans le vin, le t hé, le
67
chocolat , les pommes, les oignons et les algues brunes . Ce sont d’excellent s piégeurs de
ROS et de t rès bons chélat eurs de mét aux de t ransit ion comme le cuivre et le fer.

‐Les oligoélément s :
 Le sélénium. Le sélénium est un cofact eur de la GPx, il est donc ant ioxydant de façon
indirect . On ret rouve le sélénium organique dans l’aliment at ion, sous forme d’un
acide aminé, la sélénocyst éine. Le sélénium organique est mieux absorbé, il subit une
mét abolisat ion hépat ique conduisant à des int ermédiaires nécessaires à la synt hèse
de la GPx.
 Le cuivre. A concent rat ion physiologique le cuivre est le cofact eur d’une SOD,
cependant , il peut jouer un rôle dans la product ion de ROS (réact ion de FENTON)
lorsque sa concent rat ion est élevée.
 Le zinc. Le zinc est un cofact eur essent iel de la SOD. Il prot ège les groupement s t hiols
des prot éines. Il peut inhiber les réact ions de format ion de ROS induit es par les
56
mét aux de t ransit ion comme le fer ou le cuivre .
61

Figure n° 10 : M écanismes physiologiques de générat ion de ROS et principales défenses
ant ioxydant es
56
4.1.4. Conséquences de l’hyperproduction d’espèces réactives de l’oxygène.

Les ROS réagissent avec leur environnement et le dégrade. Ils réagissent avec :

4.1.4.1. M odificat ions oxydat ives de l’ADN.
Par exemple, la guanine peut réagir avec un radical OH pour former la 8‐hydroxy‐2’ ‐
désoxyguanosine qui s’apparie avec une adénine au lieu d’une cyt osine. Ceci ent raine alors
des mut at ions au sein de l’ADN qui conduisent à l’alt érat ion du message génét ique et peut
68
déclencher un cancer et augment er le vieillissement . L’anion superoxyde provoque des
cassures au niveau de l’ADN, ceci induit le fonct ionnement des poly (ADP‐ribose)
polymérases qui sont des enzymes de réparat ion de l’ADN. L’excès d’ADP‐ribose formé par
cet t e hyperact ivit é enzymat ique vient se fixer sur la glycéraldéhyde‐3‐phosphat e
déshydrogénase et ainsi, l’inhibe. L’accumulat ion des mét abolit es de la glycolyse en amont
62
est responsable de l’act ivat ion de quat re voies mét aboliques (voie des polyols, voie des
68
hexosamines, voie de la PKC et la voie des AGE) .

4.1.4.2. M odificat ions oxydat ives des prot éines.
Les acides aminés les plus réact ifs aux ROS sont l’hist idine, la proline, le t rypt ophane, la
cyst éine et la t yrosine. L’at t aque de produit s radicalaires sur les prot éines ent raine
l’oxydat ion de cert ains résidus avec pour conséquences l’apparit ion de groupement s
carbonylés, des clivages de chaînes pept idiques et des pont s disulfures int ra et int er ‐chaînes.

L’albumine, prot éine circulant la plus abondant e, présent e une act ivit é ant ioxydant e t rès
import ant e puisqu’elle présent e de nombreux sit es lui permet t ant de piéger des radicaux
64
libres (figure n°9) . Cet t e propriét é vaut à l’albumine de subir d’import ant es modificat ions
oxydat ives puisqu’elle est la cible privilégiée des radicaux libres circulant s. Si les
modificat ions st ruct urales et fonct ionnelles de l’albumine au cours d’un st ress oxydat if
prolongé n’ont pas t out es fait l’objet d’une descript ion dét aillée, l’albumine modifiée par
l’ischémie encore appelée IM A (Ischemia M odified Albumin), premièrement décrit e lors
d’épisode ischémiques du t ype syndrome coronarien aigu (SCA) ou infarct us du myocarde
69
(IM ), est aujourd’hui communément reconnue comme un marqueur du st ress oxydant .

Cet t e forme d’albumine est caract érisée par une capacit é de liaison d’ions bivalent s
2+
diminués, plus part iculièrement le Co . L’IM A est donc mise en évidence dans le plasma par
mesure de la capacit é de liaison de Cobalt en excès rapport é à la concent rat ion plasmat ique
70
d’albumine. La concent rat ion d’IM A est inversement proport ionnelle à la concent rat ion de
Cobalt non lié à l’albumine et est le reflet de l’impact du st ress oxydant dans le
71
compart iment plasmat ique.

De nombreuses ét udes ont mis en évidences ces dernières années l’augment at ion de l’IM A
dans des pat hologies chroniques sujet t es à un fort st ress oxydant (diabèt e,
72,73,74,75
at hérosclérose) .

63
La plupart des dommages sont irréparables et peuvent ent raîner des modificat ions
fonct ionnelles import ant es comme par exemple la non reconnaissance d’un récept eur par
un ligand ou une pert e d’act ivit é enzymat ique. Cert aines prot éines oxydées sont peu
dégradées et forment des agrégat s dans les cellules et dans le compart iment
63,76
ext racellulaire .

Les prot éines modifiées par le st ress oxydant présent ent t rès cert ainement un rôle dans les
mécanismes physiopat hologiques impliqués dans des pat hologies chroniques comme le
diabèt e. Par exemple, les modificat ions oxydat ives de prot éines comme l’albumine, sont
elles‐mêmes source de radicaux libres et d’un st ress oxydant qui a pu êt re mis en évidence in

77
vit ro sur des monocyt es .

4.1.3.3. M odificat ions oxydat ives des lipides membranaires.

En phase d’init iat ion le radical hydroxyle peut arracher un hydrogène sur les carbones sit ués
ent re une double liaison. Le radical lipidique réagit avec l’oxygène et forme un radical
•
peroxyle (ROO ). Celui ‐ci est capable d’arracher un hydrogène à l’acide gras polyinsat uré
voisin et ainsi de propager la réact ion. Ceci induit une alt érat ion de la fluidit é membranaire
et conduit à la mort cellulaire. Les peroxydes formés sont neut ralisés par la glut at hion
peroxydase, ou, ils cont inuent de s’oxyder et de se fragment er en aldéhydes
(malondialdéhyde, 4‐hydroxynonénal) qui ont des act ivit és pro ‐at hérogènes et cancérigènes.

4.1.3.4. M odificat ions oxydat ives des lipoprot éines.

Les LDL oxydées sont capt ées par des récept eurs spécifiques sit ués sur les macrophages. Les
macrophages se t ransforment alors en cellules spumeuses qui ont un rôle dans les
premières ét apes de l’at hérosclérose. Les LDL oxydées sont immunogènes et les immuns
56
complexes formés act ivent la voie classique du complément .
64
4.2. Hyperglycémie chronique et AGEs (advanced glycation end-
products).

4.2.1. Formation des AGEs : phénomène de Glycoxydation
Le t erme de glycat ion non enzymat ique désigne les modificat ions t ardives induit es par la
fixat ion d’oses simples sur les groupement s aminés des prot éines. C’est une réact ion
générale, spont anée, irréversible et cumulat ive procédant en plusieurs ét apes. Une phase
précoce qui commence par la format ion d’une liaison aldimine (base de Schiff) capable de
subir un réarrangement moléculaire dit réarrangement d’Amadori. L’HbA1c et les

57
fruct osamines sont des exemples caract érist iques des produit s d’Amadori .

Les produit s d’Amadori ne const it uent pas un ét at définit if. Au cours d’une phase plus
t ardive, ils subissent des réact ions oxydat ives formant des int ermédiaires dicarbonylés
réact ifs (M GO ou le 3désoxyglucosone) et about issant à la format ion de st ruct ures plus
complexes appelées AGEs: on parle alors de glycoxydat ion, phénomène combinant les
57,78,79
mécanismes de glycat ion et d’oxydat ion des prot éines (figure n°11) .

Les AGEs int erviennent dans différent s phénomènes t els que l’inflammat ion, l’apopt ose
cellulaire, le remodelage t issulaire ou l’angiogénèse. La plupart des réact ions de glycat ion
s’accompagnent de réact ions d’oxydat ion qui sont à l’origine du t erme de glycoxydat ion. Les
différent es ét apes de la glycat ion sont générat rices de ROS. Les ROS induisent la format ion
d’aldéhydes réact ifs dont l’un des plus abondant est le M GO. Ces produit s int ermédiaires
réagissent avec les groupement s aminés libres des prot éines afin de former des AGEs.
65

Figure n°11 : Format ion des produit s d’Amadori et réarrangement oxydat ifs en produit s
avancés de glycat ion – Phénomène de glycoxydat ion .
57

Les voies de la glycat ion about issent à des composés communs avec ceux issus de la
80
peroxydat ion lipidique comme par exemple la carboxymet hyllysine .

Tous les AGEs n’ont pas encore ét é ident ifiés et les mécanismes sous‐jacent s à leur
format ion rest ent incomplèt ement élucidés. La CM L et la pent osidine ont ét é les plus
ét udiés car elles possèdent des propriét és ant igéniques, ainsi elles peuvent êt re localisées et
quant ifiées à l’aide de t echniques immunologiques. Les t aux sériques de CM L ont corrélés
avec le développement de lésions microvasculaires chez des pat ient s diabét iques de t ype
81
2 . Au cours de l’insuffisance rénale, on observe une import ant e accumulat ion de CM L dans
l’organisme, liée à un défaut d’éliminat ion du rein.

Les différent s AGEs aujourd’hui décrit s, ident ifiés à part ir de mécanismes de glycoxydat ion
d’albumine in vit ro , sont présent és dans la figure n°12 .

79
66

Figure n°12 : Différent es formes d’AGEs rencont rés au cours du diabèt e
79
67
4.2.2. Effets des AGEs sur la matrice extracellulaire, les protéines circulantes
et cellulaires.

4.2.2.1. AGEs et mat rice ext racellulaire

On observe dans les t issus une rét iculat ion des prot éines et la format ion d’agrégat s. Il exist e
plusieurs mécanismes à l’origine de ce phénomène. Le premier mécanisme est l’oxydat ion
de groupement sulfhydrile en pont s disulfures. Un deuxième mécanisme exist ant est la
format ion de liaisons covalent es ent re produit s avancés de glycat ion. Ces liaisons covalent es
ent re AGEs expliquent l’augment at ion des espaces int ermoléculaires du collagène
responsable d’hyperperméabilit é vasculaire et des défaut s de polymérisat ion de t ubuline
axonale. Une t roisième voie est la format ion de liaisons covalent es de prot éines
63
plasmat iques au niveau de groupement s réact ifs générés par la glycat ion . Des liaisons
croisées s’ét ablissent ent re AGEs, collagène, albumine et LDL (low densit y lipoprot ein) au
niveau des membranes basales, ceci implique le rôle des AGE dans la microangiopat hie et
82
dans la macroangiopat hie diabét ique . Les AGEs s’accumulent dans les t issus et not amment
78
sur les prot éines à longue durée de vie comme le collagène de t ype I .

Les AGEs peuvent se lier à la laminine, prot éine st ruct urale de la mat rice ext racellulaire, et
induire une diminut ion de la liaison d’aut res composant s majeurs et not amment les
prot éoglycannes. Ces derniers empêchent la fuit e prot éique au niveau de la membrane
83
basale glomérulaire en lui conférant une charge négat ive . Il exist e une corrélat ion ent re la
concent rat ion en AGEs et la sévérit é de la pat hologie rénale dans des modèles
expériment aux d’animaux. On t rouve une augment at ion en CM L (Carboxy M et hyl Lysine)
dans les prot éines solubles et insolubles du collagène chez les insuffisant s rénaux
diabét iques. La dénat urat ion du collagène par les AGEs et leur capacit é à ret enir les
prot éines plasmat iques est à l’origine de l’épaississement de la membrane basale du
glomérule. Les AGEs sont à l’origine de l’expansion mésangiale ce qui a pour conséquence
une baisse de la filt rat ion glomérulaire par compression des capillaires. Il a ét é démont ré
que les AGEs augment ent la libérat ion de TGF‐ (Tumor Grow t h Fact or ) qui st imule la
84
synt hèse de collagène et donc l’épaississement de la membrane basale .
68
4.2.2.2. AGEs et acides nucléiques

Les AGE sont suscept ibles de réagir avec les groupement s aminés des nucléot ides, et donc,
de conduire ainsi à des coupures de l’ADN. Les AGEs pourraient êt re impliqués dans les
embryopat hies diabét iques. Au niveau oculaire, la modificat ion du crist allin par les AGEs
explique en grande part ie l’opacificat ion progressive et l’apparit ion de cat aract e survenant
au cours du diabèt e. On ret rouve des concent rat ions élevées d’AGEs au niveau de l’humeur
61
vit rée du pat ient diabét ique, en rapport avec la rét inopat hie diabét ique . Les AGEs
pourraient cont ribuer à l’augment at ion de la perméabilit é vasculaire en alt érant l’adhérence
des cellules endot héliales et compromet t ant leur réplicat ion normale.

4.2.2.3. Effet s des AGEs sur les prot éines : cas part iculier de l’albumine

Il exist e aussi une glycat ion des prot éines circulant es. La format ion de l’hémoglobine
glyquée induit une augment at ion de sa viscosit é au sein des globules rouges.

La glycat ion prot éique peut ent rainer une alt érat ion d’act ivit és enzymat iques, liées à la
présence de résidus de lysine au voisinage du sit e act if ou à des modificat ions
conformat ionnelles.

L’albumine, principale prot éine circulant e, subit également d’import ant es modificat ions par
mécanismes glycoxydat ifs pour former des AGEs.

Nous nous sommes at t achés dans cet t e ét ude à décrire les effet s de la glycoxydat ion sur de
cet t e prot éine en ét udiant ses propriét és st ruct urales mais aussi fonct ionnelles : t ransport
de molécules endogènes et xénobiot iques, propriét é ant ioxydant es, maint ien de
85
l’homéost asie plasmat ique .
69

Figure n°13 : St ruct ure t ridimensionnelle de l’albumine : représent at ion des sit es de liaison
spécifique de Sudlow (t ype 1 et t ype 2) et des principaux sit es de glycat ion (lysines)
79

La format ion des AGEs sur des prot éines int racellulaires est possible au niveau des t issus non
insulino ‐dépendant s. L’hyperglycémie peut induire une augment at ion int racellulaire de
sucres comme le fruct ose, le glucose‐6‐phosphat e et les composés réact ifs dicarbonylés. Il se
forme alors des AGE à part ir des prot éines cyt osoliques et de ces sucres. La glycat ion du
bFGF (basic Fibroblast Grow t h Fact or) dans les cellules endot héliales affect e son act ivit é
86
mit ogénique .

Les LDL subissent aussi une glycat ion lors d’hyperglycémie prolongée. La glycat ion des LDL
est souvent accompagnée d’une oxydat ion. Cet t e oxydat ion cont ribue à l’accumulat ion de
LDL oxydées pro ‐at hérogènes dans le sang. Cet t e glycat ion empêche leur reconnaissance par
les récept eurs aux LDL et ainsi elle diminue leur clairance. De plus, la glycat ion des HDL a
70
pour conséquence la baisse de l’act ivit é de la paraoxonase. La paraoxonase prévient
l’oxydat ion des LDL et l’adhésion des monocyt es aux cellules endot héliales de l’aort e, ces
deux paramèt res sont des évènement s init iaux clés dans la format ion de la plaque
d’at hérome. De plus, la présence d’AGEs au niveau du collagène des parois art érielles
permet de piéger les LDL et / ou d’aut res prot éines plasmat iques favorisant ainsi la format ion
84
de la plaque d’at hérome . Au niveau endot hélial, les AGEs sont capables de piéger le
61
monoxyde d’azot e puissant vasodilat at eur .

Figure n°14 : Produit s avancés de Glycat ion – Sources et implicat ions physiopat hologiques
20
71
4.2.3. Les Récepteurs aux AGEs.

4.2.3.1 Les différent s récept eurs aux AGE.
Les AGEs ont la capacit é de se lier à différent es prot éines membranaires spécifiques : les
RAGE (recept or for advanced glycat ion end product s), les AGE récept eurs 1 (prot éine OST48
du complexe oligosaccharyl ‐t ransférase), les AGE récept eurs 2 (prot éine 80K‐H, subst rat
membranaire de prot éines kinases), les AGE récept eurs 3 (galect ine‐3) et les récept eurs
87,88
scavengers de classe A et B . Les récept eurs scavengers int ernalisent les AGE et peuvent
89
fixer les LDL glycoxydées .

4.2.3.2 Le Récept eur RAGE
Le RAGE est un récept eur mult i ‐ligands t ransmembranaire appart enant à la super famille des
immunoglobulines. Le RAGE est une prot éine de 45 kDa présent e à la surface de
nombreuses cellules comme les cellules endot héliales, les lymphocyt es, les monocyt es, les
68
polynucléaires et les neurones . Il est const it ué d’une région ext racellulaire comprenant un
domaine V variable et de deux domaines C et C’ const ant s, d’un seul domaine
81
t ransmembranaire et d’un domaine cyt oplasmique court (moins de 50 acides aminés) .

90,91,88
Il exist e plusieurs isoformes de RAGE (figure n°15) :

 Les RAGE membranaires peuvent êt re ent iers ou t ronqués. Les formes t ronquées ne
t ransmet t ent pas le signal. Les RAGE ent iers t ransmet t ent un signal pat hogène à la
cellule.
 Les RAGE solubles (sRAGE) sont présent s dans la circulat ion sanguine. Les sRAGE sont

82
le résult at d’un clivage des RAGE membranaires par des mét alloprot éinases . Les
RAGE solubles ont la propriét é de se lier aux AGE circulant s, et donc de limit er leurs
effet s pat hologiques. Les diabét iques de t ype 2 ont un t aux circulant de sRAGE
diminué par rapport à une personne non diabét ique.
 Les esRAGE (endogenous secret ory RAGE) sont le résult at d’un épissage alt ernat if de
la part ie C‐t erminale de RAGE. Les esRAGE ne possèdent pas de domaines
membranaires et cyt oplasmiques.
72
 Les DN‐RAGE (Dominant Negat ive RAGE) présent s au niveau de la membrane
plasmique. Cet t e forme de RAGE présent e une part ie ext racellulaire ident ique à celle
du RAGE mais est dépourvue de sit e d’act ion cyt oplasmique empêchant t out e
t ransduct ion du signal.

Figure n°15 : Récept eurs RAGE – Principales Isoformes

88

4.2.3.3. Les ligands de RAGE

Il exist e cinq familles de ligands aux RAGE :
 Les AGEs ou produit s t erminaux de glycat ion.

 La famille des S100/ calgranulines dont le polypept ide EN‐RAGE. Ce sont des
polypept ides capables de déclencher une réponse pro ‐inflammat oire et
92
prooxydant e .
73
 Les AOPPs (produit s d’oxydat ion prot éiques avancés). Ils sont le résult at de l’act ion
du st ress oxydant sur les prot éines. Par exemple, l’albumine glyquée int eragit avec le
RAGE et conduit à l’augment at ion de la product ion d’IL‐8 (int erleukine‐8) et de M CP‐
1 dans les cellules épit héliales rét iniennes pigment aires. En agissant en synergie avec
une cyt okine inflammat oire, le TNF‐, déclenche une voie de signalisat ion impliquant
Raf et les M AP Kinases. L’albumine glyquée st imule la synt hèse de la mat rice
ext racellulaire en act ivant la product ion de fact eurs de croissance comme le TGF‐1
par l’int ermédiaire de la voie de la PKC et des M APK de t ype ERK. Dans les cellules
musculaires lisses, elle induit l’augment at ion de la sécrét ion de NO via la NO
93
synt hase induct ible .
 Le pept ide ‐amyloïde. Il est le produit de clivage de la prot éine APP (amyloid prot ein

94
precursor). Il est impliqué dans la maladie d’Alzheimer .
 L’ HM GB1 (high mobilit y group box‐1) ou amphot érine. Elle est décrit e comme une
prot éine nucléaire de t ype non hist one. Elle favorise la croissance des neurit es au
cours du développement . En sit uat ion de st ress ou de st imulat ion, les cellules
libèrent cet t e prot éine. L’HM GB‐1 est capable de modifier les propriét és des cellules
qui expriment les RAGE t els que les cellules inflammat oires (lymphocyt es,
monocyt es, macrophages, cellules dendrit iques), les cardiomyocyt es en inhibant les
canaux pot assiques ainsi que les canaux calciques de t ype L, les neurones et les
cellules cancéreuses. L’inhibit ion de la signalisat ion induit e par l’int eract ion RAGE‐
amphot érine inhibe la croissance et la capacit é invasive des cellules t umorales
95
gliales .

4.2.3.4 Transduct ion du signal des AGE par les RAGE.

Les mécanismes de t ransduct ion du signal et d’act ivat ion du récept eur RAGE sont décrit s sur
96
la figure n°16 .

Les récept eurs des AGE sont dépourvus de domaine t yrosine kinase. Une homodimérisat ion
des RAGE est essent ielle à la t ransduct ion du signal. Les sRAGE peuvent inhiber
68,89
l’homodimérisat ion des RAGE et ainsi empêcher la t ransduct ion du signal . La fixat ion des
AGE sur le RAGE déclenche une signalisat ion ent raînant un st ress oxydant int racellulaire. Le
74
st ress oxydant est renforcé par l’act ivat ion de la NADPH oxydase. La NADPH oxydase
•‐
cat alyse la réduct ion de l’oxygène moléculaire en anion superoxyde (O2 ). De plus, cet t e
fixat ion induit l’expression des gènes impliqués dans la réponse inflammat oire ent rainant le
recrut ement des M AP Kinases, et l’act ivat ion du fact eur de t ranscript ion NFB. Le fact eur de
t ranscript ion NFB st imulé pénèt re dans le noyau et se lie à son élément de réponse sur le
68,89
promot eur des gènes cibles .

Figure n°16 : Effet s cellulaires de l’act ivat ion du RAGE – Transduct ion du Signal
96

Le domaine int ra‐cyt oplasmique du RAGE int eragit avec la prot éine mammalian diaphanous1
(mDia‐1) appart enant à la famille des formines. La prot éine mDia‐1 est essent ielle à la
96
t ransduct ion du signal about issant à la migrat ion cellulaire .
75
La st imulat ion des RAGE induit aussi une baisse d’act ivit é des glyoxalases 1. Les glyoxalases
sont des enzymes qui mét abolisent les composés pré‐AGE (M GO). Cet t e baisse d’act ivit é a
pour conséquence une amplificat ion de la format ion des AGE, des LDL oxydées et aut res
96
AOPPS .

Au niveau des reins, les RAGE sont fort ement exprimés à la surface des podocyt es. La
st imulat ion des RAGE sur les podocyt es conduit à leur apopt ose et à la libérat ion de fact eurs
inflammat oires comme NFB et M CP1. La st imulat ion des RAGE des podocyt es induit aussi
une surexpression du VEGF (vascular endot helial grow t h fact or). Ces fact eurs libérés vont
êt re en relat ion avec la sclérose du glomérule. Ceci a pour conséquence la pert e d’int égrit é
68,96
de la membrane basale et ainsi favorise l’albuminurie ret rouvées dans la néphropat hie
diabét ique.

Au niveau endot hélial, la fixat ion des AGE sur le RAGE ent raine l’act ivat ion de la product ion
de cyt okines t elles que l’IL1‐, l’IL‐6 ou le TNF‐ et de chimiokines t els que le M CP‐1. Ces
molécules induisent en ret our l’expression de molécules d’adhésion t elles que ICAM ‐1
(int racellular adhesion molecule‐1) et VCAM ‐1 (Vascular Cell Adhesion M olecule‐1)
impliquées dans le recrut ement des leucocyt es. Les cellules ainsi recrut ées libèrent des
cyt okines (S100/ calgranulines, M AC‐1 et HM GB‐1) ligands des RAGE. De plus, NFB induit
une augment at ion de l’expression des RAGE. La réponse inflammat oire est alors aut o
ent ret enue, elle devient chronique et prolongée cont ribuant à l’augment at ion du st ress
cellulaire et aux lésions cellulaires que l’on peut observer dans les complicat ions du diabèt e,
le vieillissement , les t umeurs et aut res maladies neurodégénérat ives. De plus, le fact eur
NFB induit un ét at pro ‐coagulant par l’augment at ion de la synt hèse du fact eur t issulaire FT
96
et de la t hrombomoduline .

76
A t ravers cet t e part ie bibliographique, nous avons pu mont rer qu’au cours du diabèt e de
t ype 2, l’hyperglycémie chronique associée à un syndrome mét abolique ét ait à l’origine d’un
st ress oxydat if import ant lié à une fort e product ion endogène de ROS. L’hyperglycémie
associée à ce st ress oxydat if est à l’origine de modificat ion post ‐t ranslat ionnelles
import ant es des prot éines circulant es par des mécanismes de glycat ion et d’oxydat ion
combinés regroupés sous le t erme de glycoxydat ion. Cet t e glycoxydat ion amène à la
format ion de pept ides et de prot éines modifiées appelés AGEs.

Les complicat ions cardiovasculaires du diabèt e sont liées à un phénomène de dysfonct ion
endot héliale. Ce dysfonct ionnement endot hélial init ial aux at t eint es vasculaires chroniques
du diabèt e est dû à des mécanismes physiopat hologiques mêlant à la fois réact ion
inflammat oire et st ress oxydat if. Ces at t eint es oxydat ives de l’endot hélium vasculaires sont
dues aux effet s direct s des ROS, des radicaux libres et aussi des AGEs circulant sur ces
cellules qui sont en cont act direct avec l’environnement plasmat ique. La capt ure du NO par
•–
l’O2 semble êt re l’événement majeur de la dysfonct ion endot héliale. L’act ivat ion combinée
par les AGEs du RAGE présent à la surface des cellules endot héliales induit des effet s pro ‐
oxydant s et pro ‐inflammat oires. Le st ress oxydant , la product ion associée de ROS et
d’AGE au cours du diabèt e de t ype 2 et l’act ivat ion du RAGE const it uent donc l’hypot hèse
physiopat hologique dominant e des complicat ions cardiovasculaires du diabèt e.

Dans la part ie expériment ale de ces t ravaux, nous avons donc cherché dans un premier
t emps à caract ériser et à quant ifier les modificat ions st ruct urales et fonct ionnelles des
prot éines au cours du diabèt e et plus part iculièrement celles de l’albumine, prot éine
circulant e la plus abondant e et aux propriét és ant ioxydant es majeures. Nous avons ensuit e
ét udié l’implicat ion pot ent ielle des formes modifiées d’albumine dans la physiopat hologie
des complicat ions vasculaires du diabèt e à t ravers une ét ude cellulaire in vit ro . Pour finir,
nous avons évalué l’int érêt pot ent iel de ces formes modifiées comme biomarqueurs de ces
complicat ions dans une ét ude clinique pilot e préambule à un projet de recherche clinique
prospect if de plus grande ampleur.

77
OBJECTIF DU TRAVAIL

Au cours de ces t ravaux, not re object if a ét é de caract ériser les modificat ions st ruct urales et
fonct ionnelles des prot éines, et plus part iculièrement l’albumine, au cours de la pat hologie
diabét ique. En effet , l’hyperglycémie chronique et le st ress oxydant , rencont rés au cours du
diabèt e de t ype 2, sont à l’origine de modificat ions glycoxydat ives des prot éines circulant es.
Si des modificat ions de l’albumine ont bien ét é caract érisées à part ir de modèles de
glycat ion in vit ro en présence de glucose ou de mét hylglyoxal (M GO), les modificat ions
st ruct urales et fonct ionnelles de l’albumine rencont rées in vivo ont nécessit é des ét udes
spécifiques, objet s de ce mémoire.

Le laborat oire GEICO a développé ces dernières années des compét ences propres en
mat ière d’ext ract ion et de purificat ion d’albumine à part ir de plasma humain. Nous nous
sommes donc appuyés sur cet t e expert ise pour ét udier de manière plus approfondie les
modificat ions st ruct urales et fonct ionnelles de l’albumine purifiée issue de plasmas de
pat ient s diabét iques de t ype 2 en comparaison avec différent es formes d’albumines,
commerciales ou purifiées, glyquées in vit ro . Ces t ravaux font l’objet de la première part ie
de l’ét ude expériment ale de ce rapport .

Dans un deuxième t emps, nous avons ét udié les effet s de l’albumine de pat ient s diabét iques
sur des modèles cellulaires de macrophages et d’adipocyt es. Ces cellules sont impliquées
dans les mécanismes physiopat hologiques du diabèt e et de ses complicat ions
cardiovasculaires. L’albumine, prot éine la plus abondant e du plasma joue un rôle essent iel
de t ampon du st ress oxydant en raison de ses propriét és ant ioxydant es. L’albumine est
profondément modifiée par l’hyperglycémie chronique et le st ress oxydant au cours de la
pat hologie diabét ique. Ces modificat ions peuvent amener l’albumine de pat ient diabét ique à
jouer un rôle de mémoire du st ress oxydant en ét ant elle‐même à l’origine de la product ion
de ROS et par là‐même jouer un rôle direct dans la physiopat hologie des complicat ions
vasculaires du diabèt e de t ype 2.
78
Pour finir, au t ravers d’une ét ude clinique pilot e descript ive ERM IES Alb ‐Ox, s’appuyant sur
les données d’inclusion du projet de recherche clinique régional d’éducat ion t hérapeut ique
ERM IES, nous avons évalué les niveaux de concent rat ion plasmat ique de plusieurs produit s
de glycat ion, de glycoxydat ion issus de l’albumine dans une populat ion de pat ient s
diabét iques de t ype 2 anciens fort ement déséquilibrés présent ant à l’inclusion des
t ypologies de complicat ions vasculaires hét érogènes. L’object if de ce projet pilot e est de
mont rer si des différences significat ives exist ent ent re les concent rat ions plasmat iques des
marqueurs de glycat ion et de glycoxydat ion à des niveaux différent s d’at t eint es vasculaires,
et ainsi dét erminer s’ils pourraient const it uer des biomarqueurs d’int érêt dans le suivi ou le
dépist age des complicat ions vasculaires du diabèt e.
79
80

PARTIE EXPERIMENTALE

81

82
1. ETUDES DES MODIFICATIONS STRUCTURALES ET
FONCTIONNELLES DE L’ALBUMINE AU COURS DU DIABETE DE
TYPE 2

1.1. Introduction

L’Albumine est la prot éine la plus abondant e du plasma ou du sérum humain. Cet t e
prot éine est en effet présent e à des concent rat ions plasmat iques allant de 30 à 50 G/ L. Elle
représent e à cet égard environ 60% des prot éines plasmat iques. La sérum ‐albumine
humaine (HSA) a un poids moléculaire de 66.7 kDa et est composée d’une chaîne
97
polypept idique de 585 acides aminés réarrangés par 17 pont s disulfure . La part ie N‐
t erminale de l’albumine ainsi que ses 59 lysines et 24 arginines sont aut ant de sit es de
glycat ion pot ent iels de cet t e prot éine puisqu’ils présent ent des résidus amines libres cibles
de la réact ion de M aillard. Il est à not er cependant que t ous ces résidus amines libres
79
présent s sur cet t e prot éine ne présent ent pas t ous la même capacit é à êt re glyqués .

L’albumine présent e 3 fonct ions principales. Premièrement ses propriét és physico ‐
chimiques et son import ant e concent rat ion plasmat iques permet t ent de maint enir la
pression osmot ique et le pH plasmat ique. L’albumine possède également 2 sit es de liaison
non spécifiques lui conférant une t rès import ant e capacit é de t ransport pour des subst ances
endogènes (hormones de bas poids moléculaire, acide gras) et de nombreux xénobiot iques
97,79
(médicament s, mét abolit es,…) . Cet t e propriét é influe sur les dét erminant s
pharmacocinét iques et plus part iculièrement le volume de dist ribut ion de nombreux
médicament s qui sont fort ement liés à l’albumine.

La t roisième propriét é de l’albumine, qui nous apparaît ici comme ét ant la plus import ant e,
64
est son rôle de prot ect ion cont re le st ress oxydant . En effet , l’albumine, comme de
nombreuses prot éines présent ant une fonct ion t hiol libre, a la capacit é de piéger et de
neut raliser les ROS. Ce t hiol libre est représent é par une cyst éine présent e en posit ion 34 de
la prot éine. L’albumine agit donc comme un t ampon cont re le st ress oxydant au niveau
83
plasmat ique et permet de limit er les réact ions en chaîne de product ion de ROS dans la
circulat ion sanguine.

Cet t e fonct ion ant ioxydant e de l’albumine est donc mise à rude épreuve au cours du
diabèt e, maladie chronique au cours de laquelle nous ret rouvons au niveau plasmat ique à la
fois une hyperglycémie chronique et un st ress oxydant profond marqué par une product ion
accrue de radicaux libres oxygénés. L’albumine au cours du diabèt e peut donc êt re sujet t e à
plusieurs modificat ions post ‐t raduct ionnelles liée d’une part à des mécanismes de glycat ion
sur ces résidus amines libres et d’aut re part à des mécanismes oxydat ifs.

Si des modificat ions st ruct urales et fonct ionnelles de l’albumine ont pu êt re mises en
évidence à part ir de sérum albumine humaine (SAH) au moyen de modèles de glycat ion in
vit ro comme une exposit ion prolongée à un excès de glucose ou à du mét hyglyoxal (M GO),
ces modèles rest ent aujourd’hui largement discut és puisque les ét at s hyperglycémiques
ut ilisés (glucose 100mM ) sont largement supérieurs à ceux ret rouvés au niveau
63
physiologique (5mM ) ou même au cour d’un diabèt e déséquilibré (25 mM ) . Egalement , les
phénomènes de glycat ion et de st ress oxydant rencont rés in vivo sont à priori largement
plus complexes et pourraient limit er sinon accent uer les phénomènes rencont rés in vivo .

Cet t e ét ude s’est donc port ée premièrement sur la caract érisat ion des modificat ions
st ruct urales et fonct ionnelles de l’albumine au cours de la pat hologie diabét ique. Nous
avons pour cela comparé les propriét és st ruct urales et fonct ionnelles d’albumines ext rait es
et purifiées de pat ient s diabét iques à celles ext rait es de pat ient s non diabét iques ainsi qu’à
de la sérum albumine humaine commerciale modifiées ou non par glycat ion in vit ro (glucose
ou M GO). Ces t ravaux ont fait l’objet de deux art icles publiés présent és ci ‐dessous en
98,99
résult at s .

84
1.2. Résultats

Article 1 : St ruct ural modificat ions of human albumin in Diabet es. Diabet es and M et abolism.
2011; 38 :171‐178. A. Guerin‐Dubourg, A. Catan, E. Bourdon ; P. Rondeau.
85

86
AVA ILA B LE ONLINE A T
WWW.SCIE NCE DIRE CT.COM
Diabetes & Metabolism 38 (2012) 171–178
Original article
Structural modifications of human albumin in diabetes

A. Guerin-Dubourg a,b , A. Catan a , E. Bourdon a , P. Rondeau a,∗
a Laboratoire de biochimie et génétique moléculaire (LBGM), groupe d’étude sur l’inflammation chronique et l’obésité (GEICO),
université de La Réunion, 15, avenue René-Cassin, BP 7151, 97715 Saint-Denis Messag cedex 09, Réunion
b Unité fonctionnelle de recherche biochimie, centre hospitalier Félix-Guyon, 97405 Saint-Denis, Réunion
Received 7 July 2011; accepted 9 November 2011
Abstract
Aim. – Albumin, a major protein in the blood circulation, can undergo increased glycation in diabetes. From recent studies, it has become evident
that glycation has important implications for albumin actions and impact on cell functioning. This study compares the structural and functional
properties of albumin glycated by glucose and methylglyoxal (MGO) with those of albumin purified from diabetic patients.
Methods. – Human serum albumin (HSA) was purified from diabetic patients and control subjects using affinity chromatography, and oxidation
parameters in various albumin preparations were determined. Tryptophan and 1-anilino-8-naphthalene sulphonic acid (ANSA) probe fluorescence,
redox state, antioxidant and copper-binding capacities of the different preparations of albumin were also determined and compared.
Results. – Occurrence of oxidative modifications was enhanced in albumin whether purified from diabetic patients, or glycated by glucose or
MGO, after determination of their fructosamine and free thiol and amino group contents, carbonyl content and antioxidant activities. Whereas more
quantitative changes in oxidative and structural parameters were observed in the glucose- and MGO-modified albumins, significant impairment of
albumin function (free-radical-scavenging and copper-binding capacities) were demonstrated in the HSA purified from diabetics. These findings
reveal different structural and functional features of diabetic HSA compared with in vitro models.
Conclusion. – This study provides new information supporting albumin as an important biomarker for monitoring diabetic pathophysiology. In
addition, it reconfirms the influence of experimental conditions in which advanced glycation end-products (AGEs) are generated in tests designed
to mimic the pathological conditions of diabetes.
© 2011 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.
Keywords: Albumin; AGEs; Oxidative stress; Diabetes
Résumé
Modifications structurales de l’albumine au cours du diabète.
But. – Le stress oxydant et les modifications oxydatives des protéines sont directement impliqués dans les complications du diabète. Un facteur
puissamment protecteur contre le stress oxydant, produit par notre organisme, n’est autre que l’albumine, protéine la plus abondante du plasma.
Mais, en particulier chez les diabétiques, la structure de l’albumine se trouve modifiée par des phénomènes de glycation qui confèrent à la protéine
des propriétés biologiques néfastes. Dans cette étude, nous avons cherché à comparer les modifications structurales et fonctionnelles de l’albumine
glyquée in vitro avec celles de l’albumine purifiée à partir de patients diabétiques.
Méthodes. – L’albumine humaine a été purifiée à partir de patients diabétiques ou de témoins en utilisant la chromatographie d’affinité. La
glycation in vitro d’albumine humaine a été effectuée par des incubations en présence de méthylglyoxal (MGO) ou de glucose. Les statuts
structuraux et fonctionnels (pouvoir antioxydant) des différentes préparations d’albumine ont été déterminés et comparés au moyen notamment de
mesures de propriétés électrophorétiques, de fluorescence, de capacités de liaison de métaux ou de neutralisation de radicaux libres.
Abbreviations: AAPH, 2,2′ azobis 2-amidinopropane; AGEs, Advanced glycation end-products; HRP, Horseradish peroxidase; HSA, Human serum albumin;
HSA-C, Commercial human serum albumin; HSA-ND, Human serum albumin from non-diabetic patients; HSA-D, Human serum albumin from diabetic patients;
mPAGE, Phenylboronate polyacrylamide electrophoresis; PBS, Phosphate-buffered saline; –SH, sulfhydryl group; SMBG, Self-monitoring of blood glucose;
TNBS, 2,4,6-trinitrobenzene sulphonic acid.
∗ Corresponding author.
E-mail address: rophil@univ-reunion.fr (P. Rondeau).
1262-3636/$ – see front matter © 2011 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.
doi:10.1016/j.diabet.2011.11.002
172 A. Guerin-Dubourg et al. / Diabetes & Metabolism 38 (2012) 171–178
Résultats. – Une augmentation importante et significative des modifications de type oxydatif a été observée à la fois au niveau des préparations
d’albumine glyquée in vitro par le glucose ou le MGO, mais également dans la protéine lorsqu’elle purifiée à partir de patients diabétiques. En
particulier, une altération des propriétés antioxydantes de piégeage des radicaux libres et de fixation des métaux a été mise en évidence pour
l’albumine provenant de diabétiques.
Conclusion. – Ce travail contribue à montrer l’importance de l’albumine comme un biomarqueur majeur à privilégier pour le développement de
stratégies nutritionnelles ou pharmaceutiques afin de limiter les désordres inhérents à la pathologie diabétique.
© 2011 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
Mots clés : Albumine ; Produits de glycation avancée ; Stress oxydant ; Diabète
1. Introduction human), the nature and concentration of carbohydrates (glucose,

methylglyoxal [MGO]) and the duration of incubation (3 weeks
Non-enzymatic glycation is one of the underlying modifi- or more) [16]. These heterogeneous glycation products derived
cation factors that contribute to various alterations of intrinsic from albumin are often used as glycation models in studies deal-
protein functions. It is the result of covalent binding of glucose ing with the involvement of AGEs in cellular pathophysiology
to amino groups of circulating proteins, such as haemoglobin in the context of diabetes. However, the question remains as
(HbA1c ) and albumin, or proteins present in the extracellular to whether these glycated albumins in vitro constitute relevant
matrix (such as collagen and laminin) [1]. Because of its long models in diabetes-associated cellular disorders. For this reason,
half-life (about 21 days) compared with other proteins and its it was important to compare the structural and functional differ-
high concentrations in the circulatory system, serum albumin is ences between in vitro glycated albumins and albumin purified
a plasmatic protein that is highly sensitive to glycation. Elevated from diabetic patients.
levels of glycated albumin (two- to threefold increases) in cases The present study examined the differential structural and
of diabetes mellitus can lead to irreversible damage associated functional aspects of albumin purified from diabetic and non-
with metabolic disorders such as retinopathy, nephropathy, neu- diabetic subjects. The study was also extended to compare
ropathy and coronary artery disease [2,3]. The development of commercial albumin glycated by glucose and MGO incubation.
these diabetic complications is attributed to the formation of
deleterious and irreversible conjugates called “advanced glyca- 2. Methods
tion end-products” (AGEs) during the glycation process [3].
The two main clinical parameters used for chronic glycaemic 2.1. Materials
control are glycated HbA1c levels and SMBG [4]. Measurement
of glucose in blood, a short-term indicator, reflects the diabetic The bicinchoninic acid, albumin from human serum
status over a 24-hour period, while the HbA1c value represents (96 to 99%), MGO solutions (40% aqueous), anti-DNPH
a long-term glycaemic indicator. However, the HbA1c is not (dinitrophenyl hydrazine) antibody, 2,2′ -azobis-(2-methy-
always a relevant indicator of glycaemic control in patients with lpropionamidine) dihydrochloride (AAPH) and 3,3′ ,5,5′ -
diabetes-associated pathologies that affect erythrocyte lifespan, tetramethylbenzidine liquid substrate system for the enzyme-
such as haemolytic or renal anaemia and liver cirrhosis [5,6]. In linked immunosorbent assay (Elisa) tests were all obtained
such cases, glycated albumin appears to be an alternative marker from Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). ECLTM anti-rabbit
for glycaemic control: the glycated albumin level is thought to immunoglobulin G (IgG) and HRP-linked whole antibody
indicate blood glucose status over a short period (2 to 4 weeks), (from donkey) were purchased from GE Healthcare Ltd (Little
while HbA1c reflects the glycaemic state over a longer period Chalfont, Buckinghamshire, UK), and the monoclonal anti-AGE
(2 months). Indeed, numerous studies support the use of gly- antibody was from Cosmo Bio Co., Ltd (Tokyo, Japan).
cated albumin levels in the detection of short-term changes in
glycaemic control [7–9]. 2.2. Purification of albumin
Albumin is known to have a set of diverse beneficial func-
tions, including oncotic pressure regulation, and binding and Blood was obtained from a pool of diabetic patients and
transport capacities for a wide variety of metabolites, includ- non-diabetic subjects, and anticoagulated in EDTA tubes (BD
ing those of therapeutic drugs [10,11]. For this reason, albumin Vacutainer® ) in the biochemistry laboratory of our insti-
can play an important role in drug disposition and efficacy [12]. tution in Saint-Denis, Réunion. Albumin purification was
However, the most prominent property of albumin is its major conducted using pooled serum from 15 diabetic patients (HbA1c :
antioxidant activity in a circulatory system that is constantly sub- 12.0 ± 1.8%) and 38 non-diabetic subjects (HbA1c : 5.3 ± 0.3%).
jected to powerful oxidative stress [13]. Previous reports from Included in the diabetic pool were only those patients with
our group have demonstrated impairment of these properties high albuminaemia levels (> 40 g/L) but no acute inflam-
with the glycation process [14,15]. In these studies, modified matory syndrome (C-reactive protein [CRP] levels < 2 mg/L),
albumin in vitro exhibited different structural and functional acute coronary syndrome (troponin Ic < 0.03 ␮g/L) and high
properties attributed to the heterogeneous products formed by hypertriglyceridaemia (> 3.5 g/L) in the 2 months prior to the
glycation, depending on the nature of albumin used (bovine or analysis (Table S1, Supplementary data). Patients with HbA1c
A. Guerin-Dubourg et al. / Diabetes & Metabolism 38 (2012) 171–178 173
abnormalities and/or hyperleukocytosis were excluded from the Various concentrations of l -cysteine (10 to 100 nmol) were used
plasma pool. to perform the standard curve. Thiol group content was measured
Purification of serum albumin from fresh human plasma was by reading the absorbance at 412 nm. Results were expressed as
based on extensive dialysis against 50 mM Tris/HCl (pH 7.4) the number of free–SH groups per mol of bovine serum albumin
followed by affinity chromatography using Cibacron Blue 3G (BSA).
linked to agarose (Amersham catalogue number 17-0948-01) as
a ligand for albumin. A 1.5-M NaCl (pH 7.4) buffer was used for 2.7. 2,4,6-trinitrobenzene sulphonic acid (TNBS) assay
the desorption of bound albumin from Cibacron Blue–agarose,
following the elution of other plasma proteins using a 50-mM The TNBS assay is a sensitive method for determining the
Tris/HCl (pH 7.4) buffer. Each fraction of eluate was examined primary free amino groups in proteins [20]. Again, this method
by gel electrophoresis, and the most purified and concentrated has been described in detail elsewhere [16].
extracts were pooled before extensive dialysis against phosphate
buffered saline (PBS), then stored at –80 ◦ C. 2.8. Methacrylamido phenylboronic acid (MPBA)
polyacrylamide gel
2.3. Preparation of advanced glycation end-products
(AGEs) Discriminating analysis between glycated and non-glycated
albumin has previously been performed using MPBA polyacry-
AGEs were prepared, as described elsewhere [15], by incu- lamide electrophoresis [21]. MPBA-resolving acrylamide gels
bating 0.37 mM of HSA-C and purified HSA from a HSA-ND were prepared by adding 1% (w/v) of MPBA (provided by J. van
pool without and with glucose (100 mM) in PBS (pH 7.4) under den Elsen, Department of Biology and Biochemistry, University
sterile conditions at 37 ◦ C for 3 weeks or with MGO (10 mM) for of Bath, UK) to 8% acrylamide solution. The 4% stacking acry-
2 days. The proteins were dialysed against PBS, sterile-filtered lamide gel was prepared without boronic acid. Albumin samples
with a 0.2-␮m Millipore filter and stored at –80 ◦ C. (20 ␮g) were applied to the gel in denaturing sodium dodecyl
sulphate (SDS) and reductive dithiothreitol (DTT) buffers.
2.4. Fructosamine assay and albuminaemia
Albumin concentrations were determined using an albumin 2.9. Copper-binding affinity

reagent kit (ALB2, COBAS® ) based on a colorimetric assay
at 570 nm of albumin mixed with bromocresol green (BCG, The capacity of albumin to bind copper ions can be mea-
3′ ,3′′ ,5′ ,5′′ -tetrabromo-m-cresolsulphonephthalein) [17]. Fruc- sured spectrophotometrically using bathocuproinedisulphonic
tosamine was determined by the method developed by Johnson acid (BCS, Fluka #11870) [22,23]. AGE preparations (40 nmol
et al. [18] using a commercial reagent kit (FRA, COBAS® ). The in 0.15 M of NaCl) were incubated in triplicate for 2 h with
results were expressed as mmol/L of 1-deoxy-1-morpholino- 50 nmol CuSO4 in a final volume of 500 ␮L. The unbound
d-fructose (DMF), a synthetic ketoamine used as a primary ligand fractions were separated from the albumin-linked lig-
standard. and fractions by ultrafiltration, using the Amicon© Ultra system
(Millipore, Billerica, MA, USA), with centrifugation at 3000 g
2.5. Quenching of tryptophan and 1-anilino-8-naphthalene for 20 min. The concentration of copper bound to albumin was
sulphonic acid (ANSA) fluorescences determined by adding BCS (1.2 mM) diluted in 1 mM of sodium
ascorbate solution, followed by an absorbance reading at 480 nm
Fluorescence spectra were carried out on a Perkin-Elmer after 5 min of incubation at room temperature. The concentra-
LS55 spectrometer with protein samples at a concentration of tions of copper bound to modified albumins were calculated
10 ␮M in PBS. Tryptophan emission spectra were obtained in using a calibration standard curve by increasing the amount of
the range of 250 to 600 nm under excitation at 270 nm. All CuSO4 up to 100 nmol.
fluorescence spectra were corrected for their different respective
absorptions. 2.10. Enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa)
1-anilino-8-naphthalene sulphonic acid (ANSA) was dis- quantification of carbonylated proteins
solved in 5-␮M albumin samples at an ANSA/albumin ratio of
approximately 0.4 (mol/mol) to ensure that the dye was linked The degree of carbonylation of glycoxidized albumin was
to the hydrophobic sites of albumin. ANSA–protein complex determined by carbonyl Elisa assay based on recognition of
emission fluorescence spectra were performed in the range of protein-bound DNPH in carbonylated proteins with an anti-DNP
350 to 700 nm under an excitation wavelength of 470 nm. antibody. This method has been described in detail in previous
published studies from our group [16,24].
2.6. Oxidative modification of –SH
2.11. Haemolysis test
Thiol groups in native and modified albumin were mea-
sured by Ellman’s assay using 5,5′ -dithiobis-(2-nitrobenzoic Each well of a 96-well plate was filled with 100 ␮L (about
acid) (DTNB) [19], as has been well described elsewhere [14]. 1.108 erythrocytes; final concentration: 400,000 cells/␮L) of a
diluted solution of red blood (1/10 in 0.15 M of NaCl). Differ- were determined using one-way analysis of variance (Anova)
ent albumin samples (final concentration: 10 ␮M) were added followed by Tukey’s test for multiple comparisons, with a P
in triplicate. Haemolysis was initiated by adding 100 ␮L of value < 0.05 required for significance.
0.45 M of AAPH solution to each well. Turbidimetry at 450 nm
was recorded at 10-min intervals using a 37 ◦ C thermostated 3. Results
microplate reader. Results were expressed as 50% of maximum
haemolysis time (HT50 ) in min. 3.1. Biochemical characterizations of human serum
albumin (HSA) samples
2.12. Statistical analysis
Clinical and biochemical characteristics of the diabetic
Data were expressed as the means ± standard deviation (SD) plasma samples are presented in Table S1, Supplemen-
of a minimum of three experiments. Statistical significances tary data. All purified albumin samples exhibited approximately
Fig. 1. Characterization of purified human serum albumin from non-diabetic patients (HSA-ND) and human serum albumin from diabetic patients (HSA-D) and
commercial human serum albumins (HSA-C) modified by glycation; a: coomassie staining of human serum albumin (HSA) samples separated by sodium dodecyl
sulphate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) (12%); b: electrophoretic migration profile of native polyacrylamide gel electrophoresis (12%); c:
advanced glycation end-product (AGE) content of human serum albumin samples as assessed by Western blotting (WB); d: separation of human serum albumin
samples using phenylboronate acrylamide gel electrophoresis (mPAGE).
identical molecular weights (about 66 kDa), with a slight vari- with glucose. Significant differences in the levels of free thiol
ation of a few Daltons for modified HSA corresponding to and amino groups and carbonyl rate were also found between
attachment to the protein of one or several glucose (162 Da) albumin from non-diabetic subjects (HSA-NDG0 ) and diabetic
or MGO (54 Da) units (Fig. 1a). In contrast, these albumins patients (HSA-D). Their free amino group modification level
differed in their net charge, as confirmed by native polyacry- and carbonyl rate values were similar to the values obtained for
lamide gel electrophoresis (PAGE, Fig. 1b). In this situation, the HSA-NDG100 . In contrast, free thiol content was more affected
protein charge constituted the main factor affecting its migra- in diabetic albumin than in MGO-modified albumin in vitro
tion. A higher migration was observed for albumins (HSA-ND compared with non-modified and non-diabetic albumins.
and HSA-C) modified by glucose and MGO compared with Fructosamine levels (␮g/g of HSA) were significantly
native HSA. Indeed, electrophoretic migration was dramatically enhanced in albumin from diabetic patients compared with the
enhanced for albumin modified by MGO. Such enhanced migra- controls. In comparison to diabetic albumin, fructosamine levels
tions for HSA-ND and HSA-C modified by glucose and MGO vs increased markedly with modification by glucose in vitro and, to
native HSA indicate impairment of the isoelectric point of albu- a lesser extent, by MGO of both albumins (HSA-ND and HSA-
min following glycation. Also, there was a decrease in cationic C). The lower fructosamine level for HSAMGO can be explained
charges in albumin after glycation that could be attributed to the by the higher reactivity of MGO compared with glucose, thereby
involvement of positively charged residues (arginine and lysine) giving rise more quickly to AGE formation.
in condensation with carbohydrate [14]. In numerous studies, boronate affinity chromatography has
The end stage of the glycation process gives rise to irre- proved its efficacy in separating Amadori products (ketoamine)
versible conjugates known as AGEs [3]. Of these AGEs, from non-modified albumin [14,27]. According to Morais
N␧ -carboxymethyl-lysine (CML) and N␧ -carboxyethyl-lysine et al. [21], Amadori products such as fructosamine can also
(CEL) were formed during the incubation of albumin with glu- be directly characterized by using phenylboronate incorpo-
cose and MGO, respectively. Western blotting (Fig. 1c) revealed rated into acrylamide gel electrophoresis. Phenylboronic acid
that using antibodies directed against AGEs showed enhanced has also shown its capacity to function as a saccharide
signals only for HSA modified by 100 mM of glucose, whereas receptor in the aqueous solution of many sensory systems
no signal was observed for HSA purified from the plasma of [26,27].
diabetic patients. The lack of signal for MGO-modified albu- In mPAGE gel profiles (Fig. 1d), a shift in the main protein
min suggests that our AGE antibody was directed against CML band to a higher molecular weight (> 90 kDa) was observed for
rather than CEL. modified commercial and purified HSA, and accompanied by
Several oxidative parameters in our albumin preparations are broadening for MGO-modified HSA. A slight shift in the protein
shown in Table 1. As expected, levels of free thiol and amino band (≈ 80 kDa) was observed for diabetic HSA.
groups decreased significantly in albumin after glycation by
glucose and MGO. For both parameters, the decrease was more 3.2. Fluorescence studies
evident with MGO HSA-ND (HSA-C) modification than with
glucose, although such severe decreases with MGO have been Tryptophan fluorescence emission (at 350 nm) decreased
previously reported [25]. Similarly, the increase in carbonyl rate, in both modified HSA (HSA-NDG100 and HSA-NDMGO ) and
attributed to enhanced oxidation of albumin HSA-ND (HSA-C) diabetic HSA (HSA-D). The quenching of fluorescence was
with in vitro modification, was more marked with MGO than stronger for HSA-NDMGO than for HSA-NDG100 in comparison
Table 1
Oxidation parameters for various albumin preparations from three independent experiments.
Methods Frutosamine/human serum Thiols/human serum Free amino groups Carbonyl rate increase
albumin (HSA) (␮g/g) albumin (HSA) (mol/mol) (% /control) (% /control)
Purified HSA-NDa
HSA-NDG0 1.96 ± 0.08 0.483 ± 0.023 100.00 ± 4.70 100.00 ± 5.72
HSA-NDG100 45.77 ± 1.83*** 0.371 ± 0.019* 60.39 ± 6.72*** 87.12 ± 11.25
HSA-NDMGO 31.02 ± 1.24*** 0.307 ± 0.016** 29.43 ± 1.39*** 593.76 ± 16.39***
Purified HSA-Da
HSA-DG0 5.65 ± 0.10*** 0.263 ± 0.003*** 79.07 ± 3.20** 195.66 ± 19.39***
Commercial HSAb
HSA-CG0 2.62 ± 0.23 0.372 ± 0.004 100.00 ± 5.05 100.00 ± 7.96
HSA-CG100 47.54 ± 1.90*** 0.325 ± 0.006** 61.45 ± 2.35*** 86.55 ± 8.13
HSA-CMGO 29.76 ± 1.19*** 0.329 ± 0.008* 21.99 ± 3.39*** 348.13 ± 22.33***
Fructosamine levels were obtained by nitroblue tetrazolium (NBT assay); free thiol group content was assessed by Ellman’s method; unmodified primary amino
group content in proteins was by trinitrobenzene sulphonic acid (TNBS) assay; carbonyl rate (%) was assessed by Elisa carbonyl assay; all data are expressed as
means ± SD; *** P < 0.001, ** P < 0.01, * P < 0.05.
a Effect of glycation or diabetes in purified human serum albumin (HSA) (vs HSA-ND ).
G0
b Effect of glycation in commercial human serum albumin (vs HSA-C ).
G0
enhanced ANSA fluorescence in comparison to non-modified

albumin. These data show the differential conformational
changes induced by glucose- and MGO-induced glycation.
3.3. Functional properties
To assess the effect of glycation on the antioxidant proper-

ties of albumin, their free-radical-scavenging properties were
investigated in a free-radical-induced haemolysis test. In the
test, the intrinsic capacity of albumin to protect erythro-
cytes from haemolysis induced by free radicals was evidenced
by a higher haemolysis half-time (HT50 ) vs a PBS con-
trol (Fig. 2a). While in vitro glycoxidation of both albumins
by glucose and MGO did not significantly affect their anti-
radical activity, this protective effect was partially lost in
the case of diabetic HSA. Compared with HSA-NDG0 , a
reduction of about 20% (P < 0.05) in HT50 for HSA-D was
observed.
The antioxidant capacity of albumin is also related to its affin-
ity to several metals. Copper deserves special consideration as
most mammalian albumins bind to this cation more tightly and
more specifically than in other animals [28]. Copper absorbed
through the intestines is transported by albumin in the portal cir-
culation before being incorporated in ceruloplasmin in the liver
[29]. While glucose-mediated glycation did not affect albumin
affinity for copper (0.5 mol of copper per mol of albumin), modi-
fication by MGO drastically increased albumin capacity to bind
to the metal (1.1 mol of copper per mol of albumin; Fig. 2b).
Albumin affinity for copper was also significantly affected in
cases of diabetes. HSA-D showed a significant decrease (–16%,
P < 0.05) in its copper affinity compared with non-diabetic
HSA.
4. Conclusion
Glycation-induced albumin structural and functional changes

are of particular interest as numerous studies in vivo have
Fig. 2. Impairment of functional albumin properties in diabetes; a: antioxidant reported the strong involvement of glycated albumin in the devel-
activities as assessed by free-radical-mediated blood haemolysis test (HT): his- opment and progression of chronic diabetes complications. Most
tograms represent haemolysis test half-time (HT50 in min) expressed as the
means ± SD of three separate experiments. The thin line allows comparison
of these studies were focused on the structural and functional
with controls (no albumin). Statistical analyses were performed using one-way changes of commercial BSA-induced glycoxidation in vitro.
Anova for multiple comparisons. * Effect of HSA-ND or HSA-C (vs. con- However, only a few studies compared the structural and func-
trol): ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05; effect of glycation in commercial tional changes between models of glycoxidation of human
human serum albumin (vs HSA-CG0): b: copper-binding capacity of human albumin in vitro with albumin in hyperglycaemia in vivo. For
serum albumin (HSA) samples as assessed by the bathocuproinedisulphonic
(BCS) method: histograms represent copper-binding capacity of modified albu-
this reason, the present study was undertaken to evaluate the
min (nmol/␮mol albumin). Data are expressed as means ± SD (n = 3); statistical suitability of in vitro models of glycation mimicking diabetic
analyses were performed using one-way Anova for multiple comparisons. Effect pathology.
of glycation or diabetes in purified human serum albumin (vs HSA-NDG0 ): Using different techniques, modifications in intrinsic proper-
** P < 0.01, * P < 0.05. Effect of glycation in commercial human serum albumin
ties were studied in HSA induced by glycation in vitro with
(vs HSA-CG0 ): ## P < 0.01.
glucose (100 mM) and with MGO (10 mM). Comparison of
these modifications with those observed in diabetic albumin
to native HSA-ND, while HSA-D samples had an intermediate could constitute a key factor in helping investigators to choose
fluorescence emission that was in between those of both gly- the most suitable glycation model for cellular physiology stud-
cated HSA-ND samples (Supplementary data, Fig. S1a). While ies. Of albumin properties, the redox state, scavenging capacity
the emission fluorescence spectra (Supplementary data, Fig. and binding affinity of the protein were also investigated. As
S1b) showed extrinsic fluorescence quenching at 300 nm for expected and consistent with previous studies, the incubation
MGO-modified HSA and diabetic HSA, glycation by glucose of human albumin with glucose and MGO in vitro contributed
to the increase in fructosamine and carbonyl rates, indicat- cardiovascular complications. Also, activated macrophage cells
ing the formation of Amadori products accompanied by an lines, key elements of atherosclerosis development, may be
oxidation process. This increase in oxidative state was con- the most suitable cell model for evaluating the physiological
firmed by the impaired redox states of the single thiol group in impact of the in vivo diabetic albumin model. While considering
albumin (Cys 34). The glycation of albumin also induced a glycated HbA1c levels from SMBG as the best indicator of dia-
decrease in free amino group levels, indicating the involve- betic status, glycated albumin would appear to be a suitable
ment of several exposed negatively charged lysine and arginine marker for the monitoring of diabetes-associated complications.
residues that were neutralized by glucose and MGO during gly- Albumin plays an important role in the systemic distribu-
cation. The increase in the net negative electrical charge has tion of many therapeutic drugs [35,36]. A reduced affinity of
already been described for oxidized lipoproteins increasingly albumin for drugs with a narrow therapeutic index can result in
involved in atherosclerosis [30]. The tertiary structure is also their toxic effect because of an increase in concentrations in their
partially affected by in vitro glycation by glucose or a deriva- free forms and the impact of their pharmacological properties. It
tive, as confirmed by tryptophan and ANSA fluorescence results. would be of great interest to extend the present study to an anal-
Overall modification of the three-dimensional structure was also ysis of albumin affinity for specific therapeutic drugs relevant to
induced by glycation with, in particular, a conformation change diabetes to obtain a better understanding of the impact of dia-
in hydrophobic pockets. Consequently, these structural changes betes on the pharmacokinetic and pharmacodynamic properties
associated with modification of the redox state have a direct bear- of these drugs.
ing on the intrinsic biological functionality of albumin, including
its free-radical-scavenging properties and copper-binding affin-
Disclosure of interest
ity. In albumin, the single reduced cysteine unit constitutes an
important redox regulator in extracellular compartments [31,32].
The authors declare that they have no conflicts of interest
Under our experimental conditions, glucose-mediated glyca-
concerning this article.
tion did not affect albumin antioxidant activity, as assessed by
the haemolysis test, as also observed elsewhere [16]. On the
other hand, in MGO-modified albumins, alteration of the pro- Acknowledgements
tective effect of albumin was consistent with the redox state of
cysteine. These results could be attributed to the different ter- This work was supported by the Ministère de l’Enseignement
tiary structures of HSAG100 and HSAMGO , as revealed by the Supérieur et de la Recherche (Department for Higher Education
fluorescence results of the ANSA probe. The partial unfold- and Research), the Ministère de l’Outre-Mer (Department of
ing of hydrophobic pockets of albumin induced by incubation Overseas Territories), the Regional Council of Réunion and the
with glucose revealed specific amino acids, previously buried University of Réunion.
in the native conformation of HSA, to be potential free-radical Author contributions: A. Guerin-Dubourg researched data,
scavengers. contributed discussion, reviewed the manuscript. A. Catan
The antioxidant capacity of albumin also depends on the researched data. E. Bourdon contributed discussion, reviewed
protein’s capacity to bind copper ions. HSA contains one high- the manuscript. P. Rondeau researched data, wrote, reviewed
affinity site for copper, the N-terminal tripeptide Asp-Ala-His and edited the manuscript.
[33]. Protein sequestration of copper ions has been shown to pre-
vent reactive oxygen species (ROS)-generating reactions [34].
Given that albumin conformation plays a key role in its transport Appendix A. Supplementary data
capacity, the significant increase in affinity for copper observed
in MGO-modified albumin can be attributed to the specific ter- Supplementary material (Table S1 and Fig. S1) associated
tiary structure induced by glycation. with this article can be found at http://www.sciencedirect.com,
Regarding the data for diabetic HSA, the fundamental ques- at doi:10.1016/j.diabet.2011.11.002.
tion to emerge was: are the structural and functional properties of
models in vitro relevant to diabetic HSA characteristics? While References
most quantitative changes in oxidative and structural parameters
were observed in glucose- or MGO-modified albumins, signif- [1] Charonis AS, Reger LA, Dege JE, Kouzi-Koliakos K, Furcht LT,
icant impairment of albumin function (free-radical-scavenging Wohlhueter RM, et al. Laminin alterations after in vitro nonenzymatic
and copper-binding capacities) was demonstrated in HSA puri- glycosylation. Diabetes 1990;39:807–14.
[2] Brownlee M. The pathological implications of protein glycation. Clin Invest
fied from diabetics. However, these findings showed different Med 1995;18:275–81.
structural and functional features in diabetic HSA compared [3] Cohen MP. Intervention strategies to prevent pathogenetic effects of gly-
with in vitro models. cated albumin. Arch Biochem Biophys 2003;419:25–30.
As for structural and biological results, glycated albumin in [4] Roohk HV, Zaidi AR. A review of glycated albumin as an interme-
vivo appears to be the most relevant model for mimicking hyper- diate glycation index for controlling diabetes. J Diabetes Sci Technol
2008;2:1114–21.
glycaemia or diabetes. The diabetic model of HSA in vivo may be [5] Ichikawa H, Nagake Y, Takahashi M, Nakazono H, Kawabata K, Shikata
more suitable than in vitro cellular physiology studies examining K, et al. What is the best index of glycemic control in patients with diabetes
the relationship between albumin status and diabetes-associated mellitus on hemodialysis? Nippon Jinzo Gakkai Shi 1996;38:305–8.
[6] Panzer S, Kronik G, Lechner K, Bettelheim P, Neumann E, Dudczak R. [21] Morais MP, Mackay JD, Bhamra SK, Buchanan JG, James TD, Fossey JS,
Glycosylated hemoglobins (GHb): an index of red cell survival. Blood et al. Analysis of protein glycation using phenylboronate acrylamide gel
1982;59:1348–50. electrophoresis. Proteomics 2009;10:48–58.
[7] Yoshiuchi K, Matsuhisa M, Katakami N, Nakatani Y, Sakamoto K, [22] Argirova MD, Ortwerth BJ. Activation of protein-bound copper ions
Matsuoka T, et al. Glycated albumin is a better indicator for glucose during early glycation: study on two proteins. Arch Biochem Biophys
excursion than glycated hemoglobin in type 1 and type 2 diabetes. Endocr 2003;420:176–84.
J 2008;55:503–7. [23] Bourdon E, Loreau N, Lagrost L, Blache D. Differential effects of cys-
[8] Okumura A, Mitamura Y, Namekata K, Nakamura K, Harada C, Harada T. teine and methionine residues in the antioxidant activity of human serum
Glycated albumin induces activation of activator protein-1 in retinal glial albumin. Free Radic Res 2005;39:15–20.
cells. Jpn J Ophthalmol 2007;51:236–7. [24] Ramful D, Tarnus E, Rondeau P, Robert Da Silva C, Bahorun T, Bourdon E.
[9] Nagayama H, Inaba M, Okabe R, Emoto M, Ishimura E, Okazaki S, Citrus fruit extracts reduce advanced glycation end products (AGEs)- and
et al. Glycated albumin as an improved indicator of glycemic control H2 O2 -induced oxidative stress in human adipocytes. J Agric Food Chem
in hemodialysis patients with type 2 diabetes based on fasting plasma 2010;58:11119–29.
glucose and oral glucose tolerance test. Biomed Pharmacother 2009;63: [25] Faure P, Troncy L, Lecomte M, Wiernsperger N, Lagarde M, Ruggiero D,
236–40. et al. Albumin antioxidant capacity is modified by methylglyoxal. Diabetes
[10] Scatchard G, Batchelder AC, Brown A. Chemical, clinical, and immuno- Metab 2005;31:169–77.
logical studies on the products of human plasma fractionation. Vi. The [26] James TD. Boronic acids in organic synthesis and chemical biology. In:
osmotic pressure of plasma and of serum albumin. J Clin Invest 1944;23: Hall DG, editor. Weinheim: Wiley-VCH; 2005.
458–64. [27] James TD, Shinkai S. Artificial receptors as chemosensors for carbohy-
[11] Waldmann TA. Albumin structure, function and uses. In: Rothschild MAE, drates. Top Curr Chem 2002;218:159–200.
editor. New York: Pergamon Press; 1977. [28] Peters TJ. All about albumin – biochemistry, genetics and medical appli-
[12] Kratz F. Albumin as a drug carrier: design of prodrugs, drug conjugates cations. San Diego: Academic Press; 1996.
and nanoparticles. J Control Release 2008;132:171–83. [29] Gordon DT, Leinart AS, Cousins RJ. Portal copper transport in rats by
[13] Halliwell B. Albumin – an important extracellular antioxidant? Biochem albumin. Am J Physiol 1987;252(3 Pt 1):E327–33.
Pharmacol 1988;37:569–71. [30] Bourdon E, Loreau N, Davignon J, Bernier L, Blache D. Involvement
[14] Chesne S, Rondeau P, Armenta S, Bourdon E. Effects of oxidative modifi- of oxysterols and lysophosphatidylcholine in the oxidized LDL-induced
cations induced by the glycation of bovine serum albumin on its structure impairment of serum albumin synthesis by HEPG2 cells. Arterioscler
and on cultured adipose cells. Biochimie 2006;10:1467–77. Thromb Vasc Biol 2000;20:2643–50.
[15] Rondeau P, Singh N, Caillens H, Bourdon E. Oxidative stresses induced [31] Carballal S, Alvarez B, Turell L, Botti H, Freeman BA, Radi R. Sulfenic
by glycated human or bovine serum albumins on human monocytes. Free acid in human serum albumin. Amino Acids 2007;32:543–51.
Radic Biol Med 2008;45:799–812. [32] Gutteridge JM. Antioxidant properties of the proteins caeruloplasmin,
[16] Rondeau P, Navarra G, Cacciabaudo F, Leone M, Bourdon E, Militello V. albumin and transferrin. A study of their activity in serum and syn-
Thermal aggregation of glycated bovine serum albumin. Biochim Biophys ovial fluid from patients with rheumatoid arthritis. Biochim Biophys Acta
Acta 2010;1804:789–98. 1986;869:119–27.
[17] Rodkey FL. Direct spectrophotometric determination of albumin in human [33] Laussac JP, Sarkar B. Characterization of the copper (II)- and nickel (II)-
serum. Clin Chem 1965;11:478–87. transport site of human serum albumin. Studies of copper (II) and nickel
[18] Johnson RN, Metcalf PA, Baker JR. Fructosamine: a new approach to the (II) binding to peptide 1-24 of human serum albumin by 13 C and 1H NMR
estimation of serum glycosylprotein. An index of diabetic control. Clinica spectroscopy. Biochemistry 1984;23:2832–8.
Chimica Acta 1983;127:87–95. [34] Roche M, Rondeau P, Singh NR, Tarnus E, Bourdon E. The antioxidant
[19] Ellman GL. Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem Biophys properties of serum albumin. FEBS Lett 2008;582:1783–7.
1959;82:70–7. [35] Kragh-Hansen U. Molecular aspects of ligand binding to serum albumin.
[20] Snyder SL, Sobocinski PZ. An improved 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic Pharmacol Rev 1981;33:17–53.
acid method for the determination of amines. Anal Biochem 1975;64: [36] Otagiri M. A molecular functional study on the interactions of drugs with
284–8. plasma proteins. Drug Metab Pharmacokinet 2005;20:309–23.
SUPPLEMENTARY DATA
Non diabetics (ND) Diabetics (D)
N (females) 38 (21) 15 (8)
Age (years) 46.2 ± 18.5 48.5 ± 16
HbA1c (%) 5.3 ± 0.3 12.0 ± 1.8***
Fructosamines (ng/mL) 202.1 ± 17.1 419.1 ± 90.0***
Creatinin (µmol/L) 79.8 ± 13.9 97.3 ± 29.5**
Albumin (g/L) 43.5 ± 3.4 40.5 ± 4.6*
Total proteins (g/L) 73.1 ± 6.1 71.6 ± 5.9
CRP (mg/L) 5.6 ± 6.8 14.0 ± 14.2**
Table S1: Clinical and biochemical characteristics of diabetic and non diabetic patients
and plasma samples.
Data are expressed as means ± SD and are compared using Student’s t test for unpaired
samples. ***p<0.001, **p<0.01,*p<0.05.
Figure S1: a) Fluorescence spectra of tryptophan with excitation wavelength at 270 nm; b)
ANSA emission fluorescence spectra at excitation wavelength of 470 nm for HSA-NDG0 (—),
HSA-NDG100 (…...), HSA-NDMGO (– – –) and HSA-D (--). Fluorescence spectra of all samples
are shown after having normalized the data.
Article 2: Impaired drug binding capacit ies of in vit ro and in vivo glycat ed albumin. Biochimie
2012 ; 94 : 1960‐1967. J. Baraka ‐Vidot, A. Guerin‐Dubourg, E. Bourdon, P. Rondeau.
97
98
Bioch im ie 94 (2012) 1960e 1967
Contents lists available at SciVerse ScienceDirect
Bioch im ie
j o u r n al h o m ep ag e: w w w .el sev i er .co m /l o cat e/b i o ch i
Research paper
Im paired drug-bin din g capacities of in vitro an d in vivo glycated album in

Jen n ifer Baraka-Vidot a , Alexis Guerin -Dubourg a , b , Em m an uel Bourdon a , Ph ilippe Ron deau a , *
a
Groupe d ’Etude sur l’In fla m m a tion Chronique et l’Obésité (GEICO), Structure fédéra tive Environnem ent Biodiversité Sa nté-FED4126, Université de La Réunion,
Pla teform e CYROI, 15, a venue René Ca ssin e BP 7151, 97715 Sa int Denis Messa g Cedex 09, La Réunion, Fra nce
b
Unité fonctionnelle de recherche Biochim ie, Centre Hospita lier Universita ire Félix Guyon, Sa int Denis de La Réunion, Fra nce
a r t i c l e i n f o a b s t r a c t
Article history: Album in , th e m ajor circulatin g protein in blood, can un d ergo in creased glycation in diabetes. On e of th e
Received 13 February 2012 m ain properties of th is plasm a protein is its stron g affin ity to bin d m any th erapeutic dru gs, in cludin g
Accepted 9 May 2012 w arfarin an d ketoprofen . In th is stu dy, w e in vestigated w h eth er or n ot th ere w ere any sign ifican t ch an ges
Available on lin e 22 May 2012
related to in vitro or in vivo glycation in th e structural properties an d th e bin din g of h um an album in to both
th erapeutic drugs. Structural param eters, in cludin g redox state an d ketoam in e con ten ts of in vitro an d
Keyw ords:
in vivo glycated purified album in s, w ere in vestigated in parallel w ith th eir affin ity for w arfarin an d keto-
Hum an album in
profen . High -perform an ce liquid ch rom atography w as used to determ in e th e free drug con cen tration s an d
Diabetes
Warfarin
dissociation con stan ts accordin g to th e Scatch ard m eth od . An altern ative m eth od based on fluorescen ce
Ketoprofen spect roscopy w as also used to assess drug-bin d in g properties. Oxidation an d glycat ion levels w ere foun d to
Glycation be en h an ced in album in purified from diabetic patien ts or glycated w ith glucose or m ethylglyoxal, after
determ in ation of th eir ketoam in e, free th iol, am in o group an d carbonyl con ten ts. In parallel, sign ifican t
im pairm en ts in th e bin din g affin ity of in vitro an d in vivo glycated album in , as in dicated by th e h igh er
dissociation con stan t values an d con firm ed by h igh er free drug fraction s, w ere observed. To a lesser exten t,
th is alteration also sign ifican tly affected diabetic album in affin ity, in dicated by a low er static quen ch in g in
fluorescen ce spectroscopy. Th is w ork provides usefu l in form ation sup portin g in vivo diabetic album in
could be th e best m od el of glycat ion for m on itorin g diabetic physiopath ology an d sh ould be valuable to
kn ow if glycation of album in could con tribute to variability in drugs respon se durin g diabetes.
Ó 2012 Elsevier Masson SAS. All righ ts reserved.
1. Int r oduct i on adducts in duce irreversible dam age associated w ith th e m etabolic
disorders observed in diabetes m ellitus, such as retin opathy,
Diabetes h as reach ed pan dem ic proportion s an d affects aroun d n eph ropathy, n europathy, an d coron ary artery disease [2,3].
6%of th e w orld’s adult population in 20 06. Th is disease is con sid- Am on g th e blood protein s, h em oglobin an d album in are th e
ered to be on e of th e w orld’s m ost im portan t causes of expen diture, m ost com m on protein s th at are likely to be glycated. Th e glycated
m ortality, disability, an d lost econ om ic grow th . Diabetes m ellitus is h em oglobin (HbA1C) level is con sidered as on e of th e m ain clin ical
ch aracterized by an elevated level of glucose in th e blood, w h ich param eters used for m on itorin g ch ron ic glycem ic con trol via blood
can affect th e m ain circulatin g protein s th rough a n on -en zym atic glucose m easurem en ts (Self-Mon itorin g of Blood Glucose, SMBG)
process kn ow n as glycation or glycoxidation . Th is con den sation [4]. W ith a sh orter h alf-life th an h em oglobin in blood, glycated
reaction in volves circulatin g protein s an d glucose an d leads to th e h um an serum album in (HSA) appears to be an altern ative m arker
form ation of Am adori products, w h ich can give rise to irreversible for glycem ic con trol as it can in dicate blood glucose status over
con jugates called advan ced glycation en d products (AGE) in th e a sh ort period (2e 4 w eeks) [5,6]. In vivo , th e proportion of glycated
case of un ch ecked hyperglycem ia [1]. Elevated levels of th ese album in in h ealthy people is in th e ran ge of betw een 1% an d 10%
[7,8], an d in th e case of diabetes m ellitus, th is proportion can
in crease tw o- to th ree-fold [9].
Abbrevia tions: AGE, advan ced glycation en d-products; HSA, h um an serum Hum an serum album in (HSA), as th e m ost prom in en t protein in
album in ; HSA-ND an d HSA-D, purified h um an serum album in from n on -diabetic plasm a, is th e m ajor carrier of various en dogen ous an d exogen ous
an d diabetic patien ts, respectively; HbA1C, glycated h em oglobin level; PBS, ph os- m etabolites in blood th rough out th e body. This plasm a protein could
ph ate-buffered salin e; SMBG, self-m on itorin g of blood glucose; TNBS, 2,4,6-
serve as a circulating depot for m any drugs [10]. In particular, it could
trin itroben zen esulfon ic acid.
* Correspon din g auth or. Tel.: þ33 262 262 93 86 48; fax: þ33 262 262 93 82 37. play a m ajor role in affectin g therapeutic drug absorption, distribu-
E-m a il a ddress: roph il@un iv-reun ion .fr (P. Ron deau). tion , m etabolism , an d excretion [11]. In deed, binding to h um an
030 0-9084/$ e see fron t m atter Ó 2012 Elsevier Masson SAS. All righ ts reserved.
doi:10.1016/j.bioch i.2012.05.017
J. Ba ra ka -Vidot et a l. / Biochimie 94 (2012) 1960 e 1967 1961
album in in creases th e lifetim e of a drug before it is m etabolized, an d

it also allow s som e hydroph obic drugs to becom e m ore soluble in
blood [12,13]. After delivery by album in , unbound drugs could easily
reach target organs through th e plasm a. In contrast, bound drugs can
h ardly reach th e action site th rough the blood w ith out losin g their
pharm acological activities an d toxicity. Am on g th e therapeutic
drugs, som e h ave a n arrow th erapeutic in dex, such as w arfarin , an d
are easily toxic in th e unbound state. In deed, it w as established th at
Min im al Effective Con cen tration (MEC) of w arfarin is com prised
betw een 1 an d 7 mg/m L, w h ile its Min im al Toxic Con cen tration (MTC)
is above 10 mg/m L [14]. Som e path ological states, w hich im pair liver
or ren al fun ctions, triggerin g hypoalbum inem ia, could in crease the
effects of drugs h igh ly bound to album in [15].
Fi g. 1. Structures of w arfarin an d ketoprofen .
Album in h as tw o m ajor bin din g sites for drugs called Sudlow
site I an d Sudlow site II [16]. Because of its large size an d adapt- 2.2. Hum a n a lbum in purifica tion
ability, site I ten ds to bin d bulky h eterocyclic com poun ds in cludin g
sulfon am ides, salicylate an d coum arin com poun ds such as w arfarin Blood w as obtain ed from a pool of diabetic patien ts an d n on -
[17,18]. In con trast, site II, w h ich is sm aller an d less flexible, in duces diabetic subjects an d an ticoagulated in EDTA tubes (BD Vacu-
th e m ore stereospecific bin din g of arom atic carboxylic acids an d tain er) at th e Bioch em istry laboratory of th e Cen tre Hospitalier
profen s such as ibuprofen or ketoprofen [19,20]. Th e in teraction of Un iversitaire (CHU, Sain t-Den is, La Réun ion ). Th e procedures an d
drugs w ith album in can be affected by m odification s of th e protein th e collection of h um an m aterials w ere approved by th e local
such as glycation or oxidation [21,22]. Several reports h ave foun d govern m en tal Fren ch Eth ical Com m ittee. Th e album in w as purified
th at th e m ain glycation reaction s occur n ear both Sudlow sites usin g pooled serum from 39 diabetic (%HbA1C ¼ 11.0 1.9) an d 14
[23,24]. But con flictin g results h ave been reported on th e im pact of n on -diabetic (% HbA1C ¼ 5.5 0.4) patien ts. Pool of diabetics
th e glycation of album in on its affin ity to several drugs in cludin g in cludes patien ts w ith both types of diabetes. Patien ts w ith
w arfarin [11,25e 27]. Th ese con tradictory fin din gs h ave resulted a h em oglobin abn orm ality an d/or hyperleukocytosis w ere
from several differen ces in : th e m ode of album in purification , th e excluded from th e pool of plasm a. All biological data related to both
w ay th at in vitro glycation is perform ed, an d th e m eth ods used for pools are given in Table 1.
th e m easurem en t of ligan d bin din g. Th ese previous studies h igh - Th e purification of serum album in from fresh h um an plasm a
ligh t th e im portan ce of h avin g accurate kn ow ledge of th e prepa- w as based on exten sive dialysis again st Tris/HCl (pH 7.4; 50 m M)
ration of in vitro glycated album in m odels an d th e n ecessity of follow ed by affin ity ch rom atography usin g Cibacron Blue 3G lin ked
usin g an in vitro m odel of album in w ith bioch em ical ch aracteristics to agarose (Am ersh am cat# 17-0948-01) as a ligan d for th e album in .
typical of th ose expected of serum album in in diabetes. A NaCl (pH 7.4; 1.5 M) buffer w as used for th e desorption of boun d
Few studies h ave reported th e bin din g affin ities of album in album in from Cibacron Blue-agarose follow in g th e elution of oth er
in vivo , in case of ch ron ic hyperglycem ia, for m any th erapeutic drugs. plasm a protein s w ith a Tris/HCl (pH 7.4; 50 m M) buffer. Each
Regardin g th ese previous fin din gs, th e drug-bin din gs properties of fraction of eluate w as exam in ed by gel electroph oresis an d th e
in vitro glycated album in m odels sh ould be investigated an d m ost purified an d con cen trated extracts w ere pooled before th e
com pared w ith glycated album in from diabetic patients. This drug- rem ain in g im m un oglobulin s w ere rem oved w ith seph arose-
bin din g study should be perform ed on three differen t in vitro gly- protein A, follow ed by exten sive dialysis again st PBS an d th en
cation m odels. Tw o of th em , w h ich are com m on glycated album in storage at 80 C.
m odels, are considered controversial an d use suprapathological
concentration s of glucose (10 0 m M) or m ethylglyoxal (10 m M). The
th ird m odel, w h ich uses a path ological concentration of glucose 2.3. Prepa ra tion of in vitro glyca ted HSA
(25 m M), is m ore typical of diabetic album in . The bin din g param eters
of th ese in vitro m odels sh ould be com pared w ith n ative an d diabetic Advan ced glycation en d products (AGE) w ere prepared as
HSA. Tw o th erapeutic drugs w ere selected for th is study. Warfarin , an previously described [28] by in cubatin g 0.37 m M purified HSA from
an ti-coagulan t drug, an d ketoprofen (Fig. 1), a n on-steroidal an ti- a n on -diabetic pool (HSA-ND) w ith out an d w ith glucose (25 m M or
inflam m atory drug w ith an algesic an d an tipyretic effects, w ere 10 0 m M) in PBS, pH 7.4, un der sterile con dition s, at 37 C for 3
ch osen as site-selective probes for Sudlow sites I an d II, respectively. w eeks, or w ith m ethylglyoxal (10 m M) for 2 days. Th e protein s
The aim of th is study is to iden tify differences betw een in vitro an d
in vivo m odified album in m odels th rough th e determ ination of their
Tabl e 1
bin din g properties for tw o probes. The w arfarin an d ketoprofen Clin ical an d bioch em ical ch aracteristics of diabetic an d n on -diabetic patien ts an d
bin din g ch aracteristics obtain ed for our different album in prepara- plasm a sam ples.
tion s, by usin g h igh -perform an ce liquid ch rom atography an d fluo-
Com poun ds Non diabetic (ND) Diabetic (D)
rescence spectroscopy, as w ell, could provide a better know ledge of
N (fem ales) 14 (7) 39 (16)
album in structural m odification s durin g its glycation process. Age 33 9 51.5 20.1**
HbA1c (%) 5.5 0.4 11.0 1.9***
2. Mat er i al and m et hods Fructosam in es (n g/m L) 218.3 10.9 390.0 131.5***
Creatin in (mm ol/L) 89.8 12.3 88.0 16.2
Album in (g/L) 46.4 2.6 38.8 5.5***
2.1. Chem ica ls a nd rea gents
Total protein (g/L) 73.8 4.0 67.7 7.7**
CRP (m g/L) 2.6 2.5 7.0 8.0*
Aqueous m ethylglyoxal solution s (40%), D-glucose, an ti- Ch olesterol (m m ol/L) 4.6 0.7 4.5 1.3
din itroph enyl hydrazin e (DNPH) an tibody, th e 3,3 0 ,5,5 0 -tetra- Triglycerides (g/L) 0.9 0.4 1.6 1.0***
m ethyl-ben zidin e liquid substrate (TMB) system for ELISA, w arfarin Data are expressed as m ean s SD an d w ere com pared usin g th e Studen t’s t test for
an d ketoprofen w ere all purch ased from Sigm a. un paired sam ples; ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05.
1962 J. Ba ra ka -Vidot et a l. / Biochimie 94 (2012) 1960 e 1967
w ere dialyzed again st PBS, sterile-filtered th rough a 0.2 mm Milli- residue (Trp-214). Differen t series of assay solution s w ere prepared
pore filter an d stored at 80 C. by m ixin g 10 mM of n ative or diabetic HSA w ith w arfarin or keto-
profen at variable con cen tration s ran gin g from 5 to 70 mM. Each
2.4. Structura l a na lysis of m odified a lbum ins solution w as h eated for 5 m in at 37 C an d tran sferred in to a quartz
cell. Th e fluorescen ce spectra w ere recorded in th e ran ge of
Fructosam in e an d ketoam in e derivatives, useful in dex of dia- 250e 50 0 n m un der excitation at 283 n m . Th e bin din g param eters
betic con trol, w ere determ in ed usin g th e m eth od developed by ( i.e. th e bin din g con stan t KA an d th e bin din g site n um ber n ) for both
Joh n son et al. [29] w ith th e n itroblue tetrazolium (NBT) reagen t. drugs w ere obtain ed from th e equation given below [37]:
Th e th iol groups in n ative, m odified album in w ere m easured by
Ellm an ’s assay usin g 5,5 0 -dith iobis-(2-n itroben zoic acid) (DTNB) ðF0 FC Þ
log ¼ log KA þ n log½C
[30], w h ich w as w ell described in a previous study [31]. FC
Th e 2,4,6-trin itroben zen esulfon ic acid (TNBS) assay is a sen si- w h ere F0 an d FC are th e tryptoph an fluorescen ce in ten sities in th e
tive m eth od for determ in in g th e prim ary free am in o groups in absen ce an d presen ce of a drug at con cen tration [C], respectively,
protein s [32]. Th is m eth od w as described in detail in a previous an d KA is th e form ation con stan t of th e com plex form ed betw een
study by our group [33]. Th e degree of carbonylation of glycoxi- th e drug an d album in , expressed as L/m ol.
dized album in w as determ in ed by th e carbonyl ELISA assay based
on th e recogn ition of protein -boun d DNPH in carbonylated protein s
w ith an an ti-DNP an tibody. Th is m eth od w as described in detail in 2.7. Sta tistica l a na lysis
previous studies by our group [33,34].
Th e data are expressed as th e m ean s stan dard deviation (SD)
2.5. Affinity study: experim enta l design for the HPLC m ethod from a m in im um of th ree experim en ts. Statistical sign ifican ces
w ere determ in ed usin g on e-w ay ANOVA (follow ed by th e Studen t’s
Th e experim en tal design for th is study drew its in spiration from t test) for m ultiple com parison s; a p value of less th an 0.05 w as
a w ork con ducted by Olsen about th e drug-bin din g capacity of required for sign ifican ce.
ph arm aceutical grade album in s [35], an d is described below.
Stock solution s of w arfarin (10 0 m M) an d ketoprofen (10 0 m M) 3. Resul t s
w ere prepared in NaOH (0.1 M). A stan dard ran ge of con cen tration s
from 0.01 to 2 m M w as prepared from th ese stock solution s in PBS 3.1. Biochem ica l cha ra cteriza tion of the glyca ted HSA sa m ples
1X, for both drugs.
Th e sam ples w ere prepared in Eppen dorf tubes, w h ere Th ree in vitro m odels of glycated album in w ere prepared an d
150 n m ol of protein s of differen t album in sam ples w ere in cubated com pared w ith n ative an d in vivo diabetic album in . Th e HSA-NDG25
at 37 C, for 30 m in w ith 60, 80, 10 0, 120, 130, 140, 150, 160, 150 0 an d HSA-NDG10 0 m odels w ere prepared w ith 25 m M an d 10 0 m M
an d 30 0 0 n m ol of w arfarin or ketoprofen . After in cubation , th e of glucose, w h ile th e HSA-NDMGO m odel correspon ded to HSA
fraction s of free drugs an d drugs boun d to album in w ere separated in cubated w ith 10 m M of m ethylglyoxal, a side-product of differen t
by ultrafiltration usin g th e Am icon Ó Ultra system (Millipore) an d m etabolic path w ays, such as th e degradation process of glucose.
cen trifugation for 20 m in at 13,0 0 0 rpm . Th e percen tage of free Th e group of Th orn alley h as sh ow n th at physiological glycation
drug fraction s recovered usin g th is m eth od w as about 93%(2.1). processes also in volve th e m odification of protein s by reactive a -
Then, th e unbound (free) drug concentrations w ere determ ined oxoaldehydes such as m ethylglyoxal. Th ese derivatives could also
by h igh perform an ce liquid ch rom atography (HPLC), coupled to a UV be form ed durin g glucose-in duced protein glycation [38]. At th e
spectroph otom eter. A solution of acetonitrilee Trise HCl (pH 7.4; first step of glycation process, glucose m odification of album in
50 m M) (35:65, v/v) w as used as th e m obile phase, delivered at a flow gives rise to th e form ation of fructosam in e w h ile m ethylglyoxal
rate of 1 m L/m in in a LiCh rosph er 100 RP-18 colum n (250 4.6 m m in duces th e gen eration of an oth er ketoam in e derivative n am ed as
i.d., s-5, 5 mm ) (Merck, Darm stadt, Germ any) at 30 C. The pum p w as early glycation product.
m ain tain ed at 147 bars an d th e an alysis w as perform ed on 50 mL of As sh ow n in Table 2, th e glycated album in obtain ed un der
each sam ple. The m easurem en ts took place at 254 n m . typical hyperglycem ia con dition s (HSA-NDG25 ) h ad a low er level of
ketoam in e, of 5.07 (0.35) m ol/m ol HSA, th an th e oth er in vitro
2.6. Affinity study: experim enta l design of the fluorescence glycated album in m odels. Th ese album in m odels w ere prepared
spectroscopy m ethod w ith suprapath ological con cen tration s of glucose (HSA-NDG10 0 ) or
m ethylglyoxal (HSA-NDMGO) an d con tain ed 12.43 (1.88) an d 9.25
Th is m eth od is based on th e quen ch in g of album in fluorescen ce (1.46) m ol of ketoam in e/m ol HSA, respectively. If its ketoam in e
in duced by its in teraction w ith drugs [36]. Th e in trin sic fluores- level is sign ifican tly h igh er (2.13 0.58 m ol) th an th at of n ative
cen ce of h um an album in is m ain ly attributed to th e tryptoph an album in (HSA-NDG0 ) (1.11 0.12 m ol), diabetic HSA (HSA-D) h as
Tabl e 2
Oxidation param eters in various album in preparation s.
Meth ods Ketoam in e/HSA (m ol/m ol) Th iols/HSA (m ol/m ol) Free am in o groups/HSA (m ol/m ol) Carbon yl rate in crease (%/con trol)
Purified HSA-ND
HSA-NDG0 1.11 0.12 0.609 0.013 13.36 0.98 100.00 7.35
HSA-NDG25 5.07 0.35*** 0.333 0.067** 12.44 0.83 111.42 10.89
HSA-NDG100 12.43 1.88*** 0.286 0.011*** 10.42 0.20** 224.84 13.93***
HSA-NDMGO 9.25 1.46*** 0.250 0.026*** 5.10 0.54*** 455.67 69.68***
Purified HSA-D
HSA-DG0 2.13 0.58* 0.307 0.012*** 10.38 0.80* 95.66 3.90**
1) Ketoam in e levels obtain ed w ith th e NBT assay; 2) free th iol group con ten t as assessed by Ellm an ’s m eth od; 3) prim ary am in o group con ten ts in protein s by th e TNBS assay;
4) percen tage carbon yl rate as assessed by th e ELISA carbon yl assay. All data are expressed as m ean s SD from th ree in depen den t experim en ts.
Effect of glycation or diabetes on purified HSA (vs. HSA-NDG0 ); ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05.
a very low level of glycation in com parison to HSA-NDG25 . Th e

relatively low er ketoam in e level of HSAMGO, in com parison to HSA-
NDG10 0 could be explain ed by a h igh er reactivity of m ethylglyoxal,
w h ich gives rise to a m ore rapid form ation of AGE.
Several oxidative param eters in th ese album in preparations are
also reported in Table 2. As expected, th e levels of free th iol an d
am in o groups sign ifican tly decreased in album in w ith in vitro gly-
cation by glucose or m ethylglyoxal an d in vivo glycation , w h ereas
th e carbonyl level in creased, except in diabetic album in . Th e
un expected h igh er carbonylation level for HSA-NDG0, in com par-
ison w ith diabetic album in , could be partially explain ed by th e 3
w eeks in cubation of n ative HSA at 37 C (diabetic album in did n ot
un dergo th is in cubation step). Durin g th is in cubation tim e, oxida-
tion process could occur.
Th is oxidative state w as m ore m arked in th e case of
m ethylglyoxal-m odified HSA. Sim ilarly, th e rate of in crease of
carbonyl, attributed to th e en h an ced oxidation of album in w ith
in vitro m odification , w as m ore m arked w ith m ethylglyoxal th an
w ith glucose. As expected, th e oxidative param eters observed for
diabetic HSA correspon ded to th ose obtain ed for album in m odified
w ith 25 m M of glucose. Both types of album in displayed quite
sim ilar global n et ch arges, as attested by th e electroph oretic
m igration profile in n ative page electroph oresis (data n ot sh ow n ).
3.2. Binding of both drugs to glyca ted a lbum ins
As sh ow n in Fig. 2a an d b, w arfarin an d ketoprofen w ere h igh ly

boun d to n ative h um an album in w ith un boun d drug fraction s of 3.9
an d 2.7%, respectively. As n oticed for both drugs, th e free fraction s
w ere h igh er for both in vitro an d in vivo glycated album in s. Th is
in crease, w h ich w as m ore m arked for HSA-NDMGO, w as by
approxim ately eigh t an d seven tim es for w arfarin an d ketoprofen ,
w h ereas th e diabetic album in exh ibited a free drug fraction of
aroun d tw ice h igh er as w ell for w arfarin (7.3%) as for ketoprofen
(5.4%) in com parison w ith n ative album in .
Hum an album in , glycated or n ot, h as a low er affin ity for keto-
profen th an for w arfarin . Deeper an alyses w ere perform ed to Fi g. 2. Percen tage of un boun d w arfarin an d ketoprofen con cen tration s in various
album in preparation s. All data are expressed as m ean s SD from th ree in depen den t
obtain m ore in form ation on th e bin din g param eters for differen t
experim en ts. *Effect of glycation or diabetes on purified HSA (vs. HSA-NDG0 );
glycated HSA sam ples w ith both drugs. Fig. 3 sh ow s th e results of ***p < 0.0 01, *p < 0.05.
th e bin din g studies, in a Scatch ard plot form , at various con cen -
tration s of w arfarin (Fig. 3a) an d ketoprofen (Fig. 3b) w ith HSA-
NDG0 , HSA-NDMGO, an d HSA-D. Th e Scatch ard plot w as perform ed an d w arfarin ( Kd ¼ 11.74 mm ol/L). Th is partial loss of affin ity w as n ot
over a ran ge of drug con cen tration s, givin g an r value (m ol n um ber accom pan ied by an in crease in th e n um ber of bin din g sites (aroun d
of boun d drug per m ol of album in ) of betw een 0.4 an d 1.1, corre- 1.3 for both drugs).
spon din g to th e specific bin din g study. As seen in Fig. 3, th e drug-
bin din g yielded straigh t lin es w ith correlation coefficien ts ( r ) above 3.3. Binding of both drugs to in vivo glyca ted a lbum in
0.985, w h ich could in dicate th e n um ber of specific bin din g sites ( n )
an d th e dissociation con stan t ( Kd ). Th ese bin din g param eters for In order to strength en th e previous fin din gs, th e in teraction s
w arfarin an d ketoprofen are sum m arized in Table 3. Th e sm aller is betw een w arfarin an d ketoprofen an d th e n ative an d diabetic HSA
th e dissociation con stan t, th e stron ger is th e bin din g betw een th e w ere also in vestigated usin g an altern ative m eth od based on
ligan d (drug) an d th e receptor (album in ). As observed for previous fluorescen ce quen ch in g. Fluorescen ce quen ch in g corresponds to
un boun d drug results, album in exerted a h igh er affin ity for keto- a process th at reduces th e in ten sity of fluorescen ce. As sh ow n in
profen ( Kd ¼ 6.98 mm ol/L) th an for w arfarin ( Kd ¼ 9.52 mm ol/L). th e fluorescen ce em ission spectrum of Fig. 4a an d b, th e m axim um
Th ese results also sh ow ed sign ifican t variation s betw een n ative fluorescen ce in ten sity of n ative album in at 337 n m , attributed to
HSA an d in vitro or in vivo glycated HSA. For both drugs, an in crease tryptoph an , decreased w ith in creasin g con cen tration s of w arfarin
in Kd values w as observed w ith th e in vitro glycation of album in , an d ketoprofen . Both drugs acted as quen ch ers via in teraction s
w h ich w as m ore m arked for HSA-NDMGO, in dicatin g a loss of w ith th e protein . How ever, th e m axim um tryptoph an em ission
affin ity. Th e bin din g affin ity for w arfarin w as reduced, accordin g to w avelen gth of aroun d 337 n m for n ative HSA w ith out drugs (th ick
an in crease in Kd values an d th e n um ber of bin din g sites (betw een lin es) w as n ot affected in th e presen ce of w arfarin or ketoprofen .
1.55 an d 2.80). In con trast, th e bin din g affin ity for ketoprofen w as Th e log plots ((F0 FC)/ FC) of HSA-NDG0 an d HSA-D versus drug
affected, w ith glycation , but w ith out sign ifican t ch an ges in th e con cen tration (log [C]) are sh ow n in Fig. 5a for w arfarin an d Fig. 5b
n um ber of bin din g sites (betw een 1.43 an d 1.67). Sim ilar to in vitro for ketoprofen . Th ese plots exh ibit a good lin earity w ith th e
glycated album in , but to a lesser exten t, in vivo glycated album in correlation coefficien ts ( r ) above 0.986 (Table 4). Th e n um bers of
from diabetic patien ts h ad a low er affin ity for both drugs w ith bin din g site n an d th e bin din g con stan ts KA, listed in Table 4 for
elevated dissociation con stan ts for ketoprofen ( Kd ¼ 9.98 mm ol/L) w arfarin an d ketoprofen , w ere calculated usin g th ese plots. Th e
Fig. 3. Scatch ard plots of w arfarin an d ketoprofen in various album in preparation s.

Scatch ard plot of: (a) w arfarin an d (b) ketoprofen bin din g in n ative h um an album in HSA-
NDG0 ( - ), in vitro glycated album in HSA-NDMGO (A ) an d diabetic album in HSA-D (C ). Fi g. 4. Effects of w arfarin an d ketoprofen on th e fluorescen ce em ission sp ectrum of
n ative HSA (HSA-NDG0 ). Native album in at 10 mM w as in cubated w ith out (th ick curve)
an d w ith differen t con cen tration s of (a) w arfarin an d (b) ketoprofen of betw een 5 an d
bin din g site n correspon ds to th e slope an d log KA to th e in tercept. 70 mM at 37 C for 5 m in .
Th e bin din g con stan t relative to n ative HSA w ith ketoprofen

( KA ¼ 6.15 10 6 L/m ol) is h igh er th an th e on e calculated for
Th ese bin din g site n um bers are listed in Table 4 an d are quite
w arfarin ( KA ¼ 2.23 10 6 L/m ol), as w as foun d w ith th e HPLC
sim ilar to th ose obtain ed by th e HPLC m eth od.
m eth od. In com parison to th e n ative HSA, a decrease in th e bin din g
con stan t of diabetic album in can be observed, w h ich dropped
con siderably w ith both w arfarin (120 tim es low er) an d ketoprofen 4. Di scussi on
(20 0 tim es low er). Th ese results suggest a partial loss in th e affin ity
of diabetic album in for both drugs, w h ich w as con firm ed by th e Un con trolled hyperglycem ia in severely diabetic patien ts is th e
reduced n um ber of bin din g sites to aroun d n ¼ 1.03 ( n ¼ 1.08) w ith m ain cause of th e advan ced glycation process of plasm a protein s
th e in vivo glycation of w arfarin (ketoprofen ) in com parison to th e such as h em oglobin an d album in . Th ese glycation -in duced struc-
n ative album in , w h ich h ad aroun d n ¼ 1.44 ( n ¼ 1.55) bin din g sites. tural an d fun ction al ch an ges in album in are of particular in terest
because n um erous in vivo studies h ave reported th e strong
in volvem en t of glycated album in in th e developm en t an d
Tabl e 3 progression of ch ron ic diabetic com plication s [2,3]. Furth erm ore,
Bin din g param eters of w arfarin an d ketoprofen in various album in preparation s. th is en h an ced glycation process could poten tially con tribute to an
Dissociation con stan t Kd (mm ol/L) Specific bin din g sites (n )
alteration of th e bin din g properties of album in for m any drugs,
w ith a con sequen t ch an ge in th e ph arm acokin etic an d ph arm aco-
W arfarin Ketoprofen W arfarin Ketoprofen
dyn am ic properties of th ese drugs. Th ere are several causes for th e
Purified HSA-ND decreased bin din g of album in , such as h igh con cen tration s of bili-
HSA-NDG0 9.52 0.57 6.98 1.49 1.55 0.14 1.43 0.1
HSA-NDG25 13.3 1.64** 6.65 2.19 1.60 0.02 1.49 0.02
rubin or free fatty acids, w h ich can displace drugs from th e bin din g
HSA-NDG100 24.0 4.14*** 14.3 5.07* 1.99 0.06 2.10 0.07 sites of album in , or also hypoalbum in em ia [39]. Th is w ay, glycation
HSA-NDMGO 120 24.1*** 58.5 4.57*** 2.80 0.04 1.67 0.13 is on e of several m ech an ism s th at could in duce an in crease in
Purified HSA-D un boun d circulatin g fraction s of m any album in -boun d drugs. Th e
HSA-DG0 11.74 1.46* 9.98 1.86* 1.31 0.1 1.35 0.1
un boun d drug, w h ich is con sidered to be ph arm acologically active,
Th e bin din g studies w ith w arfarin an d ketoprofen w ere perform ed w ith 0.5 m M appears to be respon sible for dose-related th erapeutic effects an d
album in sam ples. Th e bin din g param eters: specific bin din g site ( n ) an d dissociation also th e adverse drug reaction s. Glycation , in th e diabetic con text,
con stan t Kd w ere calculated accordin g to Scatch ard. All data are expressed as
m ean s SD from four or five in depen den t experim en ts.
could in duce an alteration in th e ph arm acological properties of
Effect of glycation or diabetes on purified HSA ( vs. HSA-NDG0 ): ***p < 0.001, album in for m any drugs associated w ith adverse con sequen ces.
**p < 0.01, *p < 0.05. Th is effect of glycation on album in affin ity could be m ore relevan t
on th e in teraction betw een album in an d w arfarin . For in stan ce, in

on e study, th e affin ity of w arfarin for th e bin din g site I w as sh ow n
to be un affected in th e case of h um an album in glycated w ith
glucose (2 m ol glucose/m ol album in ) [22], w h ereas a decrease in
bin din g w ith early stage glycated album in , w h ich w as attributed to
con form ation al ch an ges or to steric h in dran ce of th e protein , w as
reported in oth er studies [40,41]. In con trast, an excessive glycation
(60 days) of album in w ith a large am oun t of glucose (9 m ol glucose/
m ol album in ) w as sh ow n to en h an ce w arfarin bin din g to
recom bin an t album in [26]. On ly a few studies h ave focused on th e
drug-bin din g properties of in vivo glycated HSA.
In th is study, w e first ch aracterized our differen t glycated
album in m odels ( in vitro an d in vivo ) by ch eckin g th eir redox status
via th eir th iol an d carbonyl con ten ts an d by assessin g th e glycation
level th rough ketoam in e an d TNBS assays. Th en , w e in vestigated
th e in teraction betw een tw o th erapeutic drugs an d m odified
album in m odels by usin g tw o com pletely differen t tech n iques.
Th ree in vitro glycation m odels w ere ch aracterized an d
com pared w ith un m odified album in (n ative) an d in vivo glycated
album in purified from a pool of plasm a from diabetic patien ts w ith
very h igh glycated h em oglobin levels (HbA1C ¼ 11.0% 1.9). Th e
HSA-NDG25 m odel, prepared usin g path ological con cen tration s of
glucose, closely reflects th e con dition s foun d in diabetes, w h ereas
HSA-NDG10 0 an d HSA-NDMGO are w idely used m odels th at greatly
differ from th is path ological con dition . As expected, both
suprapath ological glycation m odels displayed a con siderable level
of glycation associated w ith an in creased oxidative state.
Furth erm ore, com pared to th e data obtain ed for in vivo glycated
HSA (HSA-D), in vitro glycated HSA w ith 25 m M of glucose (HSA-
NDG25 ) appeared to be th e m ost relevan t in vitro m odel for
m im ickin g hyperglycem ia or th e diabetes m odel. How ever, our
in vivo glycated album in rem ain ed th e m ost suitable m odel for
drug-bin din g studies.
Fig. 5. Th e log plots (( F0 FC)/ FC) vs. log [C] for w arfarin an d ketoprofen bin din g w ith
n ative an d diabetic album in . F0 an d FC are th e tryptoph an fluorescen ce in ten sities of
Th e affin ity of album in for both th erapeutic drugs w as also
n ative album in , HSA-NDG0 ( - ) an d diabetic album in , HSA-D (C ) in th e absen ce an d evaluated w ith th e h elp of bin din g param eters (dissociation
presen ce of (a) w arfarin or (b) ketoprofen at differen t con cen tration s [C]. con stan t an d th e n um ber of bin din g sites) an d th e determ in ation of
free drug con cen tration s. Th e un boun d fraction s of w arfarin an d
ketoprofen w ere m easured by HPLC after ultrafiltration . An alter-
for drugs th at are h igh ly boun d (> 95%) to album in an d h ave a low n ative w ould h ave been to perform an equilibrium dialysis in stead
th erapeutic in dex, such as w arfarin . Warfarin is an an ti-coagulan t of ultrafiltration in order to recover th e un boun d drug fraction .
w ith a very low th erapeutic in dex, w h ich could trigger severe Lagran ge et al. reported th at both experim en tal m odes gen erated
h em orrh agin g if th e correct degree of its ph arm acological effect is quite sim ilar data in th e bin din g capacity of ketoprofen for HSA [20].
n ot m ain tain ed. In con trast to w arfarin , ketoprofen , a com m on Alth ough th e experim en tal con dition s used in our study w ere
m edication for th e treatm en t of in flam m ation or pain , h as a w ide quite sim ilar to th ose used by Olsen et al. [35], th ere w ere som e
th erapeutic in dex. Major studies focused on th e im pact of glycation differen ces in th e results obtain ed for th e in teraction betw een
on th e bin din g properties of album in for th erapeutic drugs w ere n ative HSA an d w arfarin . In deed, th e free fraction of w arfarin w as
exclusively based on in vitro m odels of glycation , w h ich do n ot five tim es h igh er (3.9%) th an foun d by Olsen et al. in purified
n ecessarily m eet th e biological con dition s expected in th e con text h um an album in (0.7%). Th is differen ce could be attributed to th e
of diabetes. Moreover, am on g th ese n um erous studies, som e of m ode of purification of album in in our study. After th e ch rom ato-
th em h igh ligh ted con flictin g fin din gs about th e effect of glycation graph ic purification an d im m un oglobulin rem oval steps, our
album in sam ples w ere n ot defatted. Free fatty acids can reduce th e
bin din g affin ity of album in w h en th ey are boun d to album in .
Tabl e 4 Besides th is, th e presen t study dem on strated th at th e in crease in
Bin din g param eters of w arfarin an d ketoprofen in n ative an d diabetic album in free drug fraction s foun d for w arfarin an d ketoprofen w ith th e
preparation s obtain ed by spectroscopy. glycation process w as in agreem en t w ith th e bin din g param eter
Bin din g con stan t Bin din g Correlation values obtain ed by th e Scatch ard m eth od. In parallel w ith an eigh t-
KA (L/m ol) sites ( n ) coefficien t ( r ) fold in crease in th e free w arfarin fraction for th e HSA-NDMGO m odel
Wa rfa rin ( vs. n ative HSA), th ere w as an eleven -fold decrease in th e stren gth
HSA-NDG0 2.23 10 6 1.44 0.10 0.988 of th is bin din g, as in dicated by th e dissociation con stan t values. Th e
HSA-DG0 1.77 10 4 1.03 0.07 0.986
sign ifican t decrease in bin din g for th e m ost in vitro glycated albu-
Ketoprofen
HSA-NDG0 6.15 10 6 1.55 0.05 0.995 m in s could be explain ed by th e m ajor structural ch an ges in HSA
HSA-DG0 2.97 10 4 1.08 0.03 0.989 after glycation . In particular, th e tertiary structure con form ation , as
Th e bin din g studies of w arfarin an d ketoprofen w ere in vestigated w ith 10 mM
detected by tryptoph an fluorescen ce, w as sign ifican tly affected by
album in sam ples. Th e bin din g param eters: bin din g site n um ber (n ) an d bin din g glycation (data n ot sh ow n ). Th is structural m odification h as been
con stan t KA w ere calculated as described in th e Materials an d m eth ods section . sh ow n to be accom pan ied by a partial open in g of hydroph obic
pockets, as detected by 1-an ilin on aph th alen e-8-sulfon ate (ANS) static quen ch in g m ode th ere is a groun d state form ation of a n on -
fluorescen ce [42], am on g w h ich are hydroph obic cavities in th e fluorescen ce com plex betw een th e fluoroph ore an d th e quen ch er.
subdom ain s IIA an d IIIA of album in , w h ere Sudlow sites I an d II are In th e dyn am ic quen ch in g m ode, follow in g th e collision of
located. As expected, th e glycation of album in un der con dition s a quen ch er durin g th e lifetim e of th e exited state, th e fluoroph ore
th at m ost closely resem ble th ose th at occur in th e blood durin g return s to groun d state, w ith out th e em ission of ph oton s. Previous
hyperglycem ia led to few er ch an ges in th e bin din g of both drugs studies reported th at th e quen ch in g m ech an ism of HSA by keto-
com pared to th e suprapath ological m odels. Th e reduced affin ities profen or w arfarin w as due to com plex form ation in th e static m ode
for w arfarin an d ketoprofen observed in th ese latter glycation rath er th an by dyn am ic collision [36,50].
m odels featured con form ation al ch an ges in th e Sudlow bin din g In th e presen ce of ketoprofen or w arfarin , a quen ch in g of
sites I an d II, respectively. Th ese im pairm en ts, w h ich occurred tryptoph an fluorescen ce occurred for both n ative an d diabetic
durin g th e glycation process, resulted in an in creased bin din g site album in w ith out any sh ift in th e m axim um em ission w avelen gth .
n um ber. Results in th e literature h ave reported th at w arfarin an d Th is result suggests com plex form ation betw een th e drugs an d
ketoprofen on ly bin d to on e h igh ly specific bin din g site (Sudlow album in , in volving ch an ges in th e m icroenviron m ent aroun d
sites I an d II, respectively) [16]. In th is study, specific bin din g site tryptoph an . Furth erm ore, w e foun d th at th e bin din g con stan t
values of betw een 1.43 an d 1.55 w ere calculated, in dicatin g th e relative to n ative HSA w ith ketoprofen ( KA ¼ 6.15 10 6 L/m ol) w as
existence of a secon dary bin din g site w ith a low er affin ity. Several m arkedly h igh er th an th e on e calculated ( KA ¼ 1.17 10 4 L/m ol) in
auth ors h ave suggested th e existen ce of a secon dary bin din g site a recen t study by Bi et al. [36]. Th ough th e experim en tal con dition s
for w arfarin [43,44] an d ketoprofen [20]. Th e in crease in th e w ere quite sim ilar to th ose in our study, th is large differen ce could
n um ber of bin din g sites for h igh ly glycated album in could in dicate be explain ed by th e use of com m ercial HSA by th is group in stead of
a displacem en t of drugs from th eir ch an ged prim ary bin din g sites fresh , purified album in from plasm a. In previous studies w e
to bin din g sites w ith a low er specificity. In a recen t study, w e reported th at com m ercial album in is often m ore oxidized th an
sh ow ed th at album in tertiary structure of album in w as m ore fresh , purified album in [28,45]. Oxidation is on e of several delete-
affected by m ethylglyoxal-in duced glycation th an by glucose [45]. rious effects th at could im pact on th e bin din g properties of plasm a
We observed a drastic alteration in album in tertiary structure protein s [21].
associated w ith ch an ge in th e protein hydroph obicity. Th is alter- Usin g th is m eth odology, w e focused on th e differen ces in th e
ation could im pair affin ity of th e Sudlow site I for w arfarin in in teraction betw een drugs an d n ative album in an d diabetic
album in an d could lead to form ation of a n ew un specific bin din g album in by assessin g th e n um ber of bin din g sites an d th e affin ity
site h avin g low affin ity. con stan t. In accordan ce w ith th e bin din g results calculated in th e
Moreover, regardin g diabetic album in , our study h igh ligh ts Scatch ard m eth od, th e in vivo glycated album in affin ities appeared
in terestin g fin din gs. In deed, th e specific bin din g of w arfarin w as to be sign ifican tly an d con siderably im paired. In deed, a reduction
sign ifican tly reduced in diabetic album in an d w as quite sim ilar to in th e bin din g con stan t associated w ith a low er n um ber of bin din g
th e glycation m odel m ost typical of th e con dition s in diabetes sites w as foun d for diabetic album in . Fin ally, th e h igh er affin ity of
(HSA-NDG25 ). Th is partial loss of affin ity w as con firm ed by a h igh er album in for ketoprofen com pared to w arfarin , as determ in ed by
free w arfarin fraction , w h ich w as m ore m arked for diabetic fluorescen ce spectroscopy, w as in agreem ent w ith th e results
album in . Th is dow nw ard trend w as also foun d for ketoprofen , obtain ed by th e HPLC m eth od (Table 2).
except for HSA-NDG25 , w h ich did n ot sh ow a sign ifican t differen ce Th e presen t study dem on strated th e reduced bin din g capacity
to n ative album in w ith respect to th e bin din g properties. Th us, of glycated h um an album in for w arfarin an d ketoprofen , w h ich
th ese results are in agreem ent w ith a m arked in crease in th e free w ere used as probes for th e m ain drug-specific sites of th is protein .
fraction s of both drugs, w h ich w ere n early doubled betw een th e Th ese results could provide supplem en tary in form ation about th e
diabetic an d n ative album in . It could be hypoth esized th at, in th e im pact of glycation on ch an ges in th e structure of album in ,
case of diabetes, th is m in or loss in affin ity could sign ifican tly particularly aroun d both Sudlow sites. Moreover, th e relevan t
im pact th e biological respon ses of m any drugs h igh ly boun d to fin din gs obtain ed for glycated album in an d, in particular, for th e
album in such as w arfarin or ketoprofen . Up to n ow, n o study h as in vivo glycated album in , em ph asize th e im portan ce to assess th e
establish ed any clin ical relevan ce for th is hypoth esis in h um an biological respon se of m any drugs in diabetic path ology. Th is could
ph arm acology con text. Warfarin con stitutes a drug exh ibitin g be of utm ost im portan ce for th erapeutic drugs h igh ly boun d to
n arrow th erapeutic w in dow an d im portan t in ter-in dividual an d album in an d w ith n arrow th erapeutic in dex, such as w arfarin
in ter-eth n ic differen ces in th e dose required for its an ticoagulation w h ose dosin g adjustm en t rem ain s ch allen gin g in path ological
effect [46]. Th e m ain factors (40%) con tributin g to th is in ter- con text.
in dividual variation rem ain un kn ow n [47]. Th erefore, it is at
utm ost im portan ce to determ in e th e con tribution of album in Aut hor cont r i but i ons
m odification s in th ese factors.
Th e effect of glycation on th e in teraction betw een both drugs J.B.V. researched data, con tributed discussion , review ed m an u-
an d album in w as determ in ed usin g th e fluorescen ce quen ch in g script. A.G.D. research ed data, con tributed discussion , review ed
techn ique. Th e in teraction of w arfarin or ketoprofen w ith album in m an uscript. E.B. con tributed discussion , review ed m an uscript. P.R.
m olecules leads to a quen ch in g of tryptoph an fluorescen ce. Th ere researched data, w rote, review ed an d edited m an uscript.
are m any reason s to accoun t for such quen ch in g, in cludin g
m olecular rearran gem en t or a ch an ge in th e m icroen viron m en t Ack now ledgem ent s
aroun d tryptoph an as a result of an un foldin g process. For in stan ce,
th e glycation process of album in leads to a quen ch in g of tryptoph an Th is w ork w as supported by th e Min istère de l’En seign em en t
fluorescen ce, as reported in n um erous studies [9,33,45]. It can be Supérieur et de la Rech erch e, th e Min istère de l’Outre-Mer, th e
n oted th at th e sole tryptoph an residue of h um an album in is located Con seil Région al de La Réun ion an d Europe, th e Un iversité de La
in subdom ain IIA n ear Sudlow site I [48]. In th ese in teraction s Réun ion an d th e fédération Environ nem en t Biodiversité San té-
betw een th e quen ch er (w arfarin or ketoprofen ) an d th e fluo- FED4126. Th e correspon din g auth or particularly ackn ow ledges Dr
roph ore (album in ), fluorescen ce quen ch in g can occur via tw o Bertran d Payet of LCSNSA for h is valuable advice con cern in g HPLC
differen t m ech an ism s: static an d dyn am ic, respectively [49]. In th e tech n iques.
Ref er ences serum album in as revealed by recom bin an t m utan ts, Bioch im . Bioph ys. Acta
1623 (2003) 88e 97.
[27] N. Okabe, T. Nakasaka, Drug bin din g properties of glycosylated bovin e serum
[1] P. Ron deau, E. Bourdon , Th e glycation of album in : structural an d fun ction al
album in as m easured by circular dich roism , Biol. Ph arm . Bull. 17 (1994)
im pacts, Bioch im ie 93 (2011) 645e 658.
1505e 1507.
[2] M. Brow n lee, Th e path ological im plication s of protein glycation , Clin . In vest.
[28] P. Ron deau, N. Sin gh , H. Caillen s, E. Bourdon , Oxidative stresses in duced by
Med. 18 (1995) 275e 281.
glycated h um an or bovin e serum album in s on h um an m on ocytes, Free Radic.
[3] M.P. Coh en , In terven tion strategies to preven t path ogen etic effects of glycated
Biol. Med. 45 (2008) 799e 812.
album in , Arch . Bioch em . Bioph ys. 419 (2003) 25e 30.
[29] R.N. Joh n son , P.A. Metcalf, J.R. Baker, Fructosam in e: a n ew approach to th e
[4] H.V. Rooh k, A.R. Zaidi, A review of glycated album in as an in term ediate gly-
estim ation of serum glycosylprotein . An in dex of diabetic con trol, Clin ica
cation in dex for con trollin g diabetes, J. Diabetes Sci. Tech n ol. 2 (2008)
Ch im . Acta 127 (1983) 87e 95.
1114e 1121.
[30] G.L. Ellm an , Tissue sulfh ydryl groups, Arch . Bioch em . Bioph ys. 82 (1959)
[5] K. Yosh iuch i, M. Matsuh isa, N. Katakam i, Y. Nakatan i, K. Sakam oto,
70e 77.
T. Matsuoka, Y. Um ayah ara, K. Kosugi, H. Kan eto, Y. Yam asaki, M. Hori, Gly-
[31] S. Ch esn e, P. Ron deau, S. Arm en ta, E. Bourdon , Effects of oxidative m odifica-
cated album in is a better in dicator for glucose excursion th an glycated
tion s in duced by th e glycation of bovin e serum album in on its structure an d
h em oglobin in type 1 an d type 2 diabetes, En docr. J. 55 (2008) 503e 507.
on cultured adipose cells, Bioch im ie 10 (2006) 1467e 1477.
[6] H. Nagayam a, M. In aba, R. Okabe, M. Em oto, E. Ish im ura, S. Okazaki,
[32] S.L. Sn yder, P.Z. Sobocin ski, An im proved 2,4,6-trin itroben zen esulfon ic acid
Y. Nish izaw a, Glycated album in as an im proved in dicator of glycem ic con trol
m eth od for th e determ in ation of am in es, An al. Bioch em . 64 (1975)
in h em odialysis patien ts w ith type 2 diabetes based on fastin g plasm a glucose
284e 288.
an d oral glucose toleran ce test, Biom ed. Ph arm acoth er. 63 (2009) 236e 240.
[33] P. Ron deau, G. Navarra, F. Cacciabaudo, M. Leon e, E. Bourdon , V. Militello,
[7] T.J. Peters, All about Album in e Bioch em istry, Gen etics, an d Medical Appli-
Th erm al aggregation of glycated bovin e serum album in , Bioch im . Bioph ys.
cation s, Academ ic Press, San Diego, 1996.
Acta Protein s Proteom ics 1804 (2010) 789e 798.
[8] N. Sh aklai, R.L. Garlick, H.F. Bun n , Non en zym atic glycosylation of h um an
[34] D. Ram ful, E. Tarn us, P. Ron deau, C. Robert Da Silva, T. Bah orun , E. Bourdon ,
serum album in alters its con form ation an d fun ction , J. Biol. Ch em . 259 (1984)
Citrus fruit extracts reduce advan ced glycation en d products (AGEs)- an d
3812e 3817.
H2O2-in duced oxidative stress in h um an adipocytes, J. Agric. Food Ch em . 58
[9] E. Bourdon , N. Loreau, D. Blach e, Glucose an d free radicals im pair th e an ti-
(2010) 11119e 11129.
oxidan t properties of serum album in , Faseb J. 13 (1999) 233e 244.
[35] H. Olsen , A. An dersen , A. Nordbo, U.E. Kon gsgaard, O.P. Borm er, Ph arm aceu-
[10] U. Kragh -Han sen , Structure an d ligan d bin din g properties of h um an serum
tical-grade album in : im paired drug-bin din g capacity in vitro, BMC Clin .
album in , Dan Med. Bull. 37 (1990) 57e 84.
Ph arm acol. 4 (2004) 4.
[11] K.S. Joseph , D.S. Hage, Th e effects of glycation on th e bin din g of h um an serum
[36] S. Bi, L. Yan , Y. Sun , H. Zh an g, In vestigation of ketoprofen bin din g to h um an
album in to w arfarin an d L-tryptoph an , J. Ph arm . Biom ed. An al. 53 (2010)
serum album in by spectral m eth ods, Spectroch im . Acta A Mol. Biom ol.
811e 818.
Spectrosc. 78 410e 414.
[12] G. Colm en arejo, In silico prediction of drug-bin din g stren gth s to h um an
[37] A. Marty, M. Boiret, M. Deum ie, How to illustrate ligan d-protein bin din g in
serum album in , Med. Res. Rev. 23 (2003) 275e 301.
a class experim en t: an elem en tary fluorescen t assay, J. Ch em . Educ. 63 (1986).
[13] F. Herve, S. Urien , E. Alben gres, J. Duch e, J. Tillem en t, Drug bin din g in plasm a.
[38] N. Ah m ed, P.J. Th orn alley, J. Daw czyn ski, S. Fran ke, J. Strobel, G. Stein ,
A sum m ary of recen t tren ds in th e study of drug an d h orm on e bin din g, Clin .
G.M. Haik, Meth ylglyoxal-derived h ydroim idazolon e advan ced glycation en d-
Ph arm acokin et. 26 (1994) 44e 58.
products of h um an len s protein s, In vest. Oph th alm ol. Vis. Sci. 44 (2003)
[14] M. Sch ulz, A. Sch m oldt, Th erapeutic an d toxic blood con cen tration s of m ore
5287e 5292.
th an 800 drugs an d oth er xen obiotics, Ph arm azie 58 (2003) 447e 474.
[39] J. McKich an , In fluen ce of protein bin din g an d use of un boun d (free) drug
[15] J.P. Tillem en t, F. Lh oste, J.F. Giudicelli, Diseases an d drug protein bin din g, Clin .
con cen tration s, in : Mich ael E. Burton , LMS, J.J.S, W illiam E. Evan s (Eds.),
Ph arm acokin et. 3 (1978) 144e 154.
Applied Ph arm acokin etics an d Ph arm acodyn am ics: Prin ciples of Th erapeutic
[16] G. Sudlow , D.J. Birkett, D.N. W ade, Furth er ch aracterization of specific drug
Drug Mon itorin g, Lippin cott W illiam s & W ilkin s, Baltim ore, 2006, pp. 82e 120.
bin din g sites on h um an serum album in , Mol. Ph arm acol. 12 (1976)
[40] K. Koizum i, C. Ikeda, M. Ito, J. Suzuki, T. Kin osh ita, K. Yasukaw a, T. Han ai,
1052e 1061.
In fluen ce of glycosylation on th e drug bin din g of h um an serum album in ,
[17] M. Dockal, D.C. Carter, F. Ruker, Con form ation al tran sition s of th e th ree
Biom ed. Ch rom atogr. 12 (1998) 203e 210.
recom bin an t dom ain s of h um an serum album in depen din g on pH, J. Biol.
[41] K. Mera, K. Takeo, M. Izum i, T. Maruyam a, R. Nagai, M. Otagiri, Effect of
Ch em . 275 (2000) 3042e 3050.
reactive-aldeh ydes on th e m odification an d dysfun ction of h um an serum
[18] M. Fasan o, S. Curry, E. Terren o, M. Gallian o, G. Fan ali, P. Narciso, S. Notari,
album in , J. Ph arm . Sci. 99 (2010) 1614e 1625.
P. Ascen zi, Th e extraordin ary ligan d bin din g properties of h um an serum
[42] N. Sattarah m ady, A.A. Moosavi-Movah edi, F. Ah m ad, G.H. Hakim elah i,
album in , IUBMB Life 57 (2005) 787e 796.
M. Habibi-Rezaei, A.A. Saboury, N. Sh eiban i, Form ation of th e m olten globule-
[19] P. Ascen zi, A. Bocedi, S. Notari, G. Fan ali, R. Fesce, M. Fasan o, Allosteric
like state durin g prolon ged glycation of h um an serum album in , Bioch im .
m odulation of drug bin din g to h um an serum album in , Min i Rev. Med. Ch em . 6
Bioph ys. Acta 1770 (2007) 933e 942.
(2006) 483e 489.
[43] G. Sudlow , D.J. Birkett, D.N. W ade, Th e ch aracterization of tw o specific drug
[20] F. Lagran ge, F. Pen h ourcq, M. Matoga, B. Ban n w arth , Bin din g of ketoprofen
bin din g sites on h um an serum album in , Mol. Ph arm acol. 11 (1975) 824e 832.
en an tiom ers in various h um an album in preparation s, J. Ph arm . Biom ed. An al.
[44] J.P. Tillem en t, R. Zin i, P. d ’ Ath is, G. Vassen t, Bin din g of certain acidic drugs to
23 (2000) 793e 802.
h um an album in : th eoretical an d practical estim ation of fun dam en tal
[21] K. Oettl, R.E. Stauber, Ph ysiological an d path ological ch an ges in th e redox
param eters, Eur. J. Clin . Ph arm acol. 7 (1974) 307e 313.
state of h um an serum album in critically in fluen ce its bin din g properties, Br. J.
[45] A. Guerin -Dubourg, A. Catan , E. Bourdon , P. Ron deau, Structural m odification s
Ph arm acol. 151 (2007) 580e 590.
of h um an album in in diabetic con text, Diabetes Metab. (2012).
[22] N. Okabe, N. Hash izum e, Drug bin din g properties of glycosylated h um an
[46] H.J. Ch o, K.H. Soh n , H.M. Park, K.H. Lee, B. Ch oi, S. Kim , J.S. Kim , Y.K. On ,
serum album in as m easured by fluorescen ce an d circular dich roism , Biol.
M.R. Ch un , H.J. Kim , J.W . Kim , S.Y. Lee, Factors affectin g th e in terin dividual
Ph arm . Bull. 17 (1994) 16e 21.
variability of w arfarin dose requirem en t in adult Korean patien ts, Ph arm a-
[23] A. Lapolla, D. Fedele, R. Reitan o, N.C. Arico, R. Seraglia, P. Traldi, E. Marotta,
cogen om ics 8 (2007) 329e 337.
R. Ton an i, En zym atic digestion an d m ass spectrom etry in th e study of
[47] D.E. Jon as, H.L. McLeod, Gen etic an d clin ical factors relatin g to w arfarin
advan ced glycation en d products/peptides, J. Am . Soc. Mass Spectrom . 15
dosin g, Tren ds Ph arm acol. Sci. 30 (2009) 375e 386.
(2004) 496e 509.
[48] X.M. He, D.C. Carter, Atom ic structure an d ch em istry of h um an serum
[24] D.L. Men dez, R.A. Jen sen , L.A. McElroy, J.M. Pen a, R.M. Esquerra, Th e effect of
album in , Nature 358 (1992) 209e 215.
n on -en zym atic glycation on th e un foldin g of h um an serum album in , Arch .
[49] J. Lakow itcz, Prin ciples of Fluorescen ce Spectroscopy, Spin ger, New York,
Bioch em . Bioph ys. 444 (2005) 92e 99.
2006.
[25] G. Fitzpatrick, P. Duggan , Th e effect of n on -en zym ic glycation on ligan d
[50] M. Th om as, G. Nelson , G. Paton ay, I. W arn er, An alysis of drug bin din g sites on
bin din g to h um an serum album in , Bioch em . Soc. Tran s. 15 (1987) 267e 268.
h um an serum album in usin g m ultidim en sion al fluorescen ce m easurem en ts,
[26] K. Nakajou, H. W atan abe, U. Kragh -Han sen , T. Maruyam a, M. Otagiri, Th e
Spectroch im i. Acta Part B: At. Spectrosc. 43 (1988) 651e 660.
effect of glycation on th e structure, fun ction an d biological fate of h um an

1.3. Discussion

Nous avons pu met t re en évidence dans ces deux art icles de nombreuses modificat ions
st ruct urales et fonct ionnelles de l’albumine au cours de la pat hologie diabét ique.
L’originalit é de ces t ravaux a ét é de t ravailler essent iellement sur de l’albumine modifiée in
vivo , ext rait e et purifiée de plasma de pat ient s diabét iques. Si les modificat ions st ruct urales
et fonct ionnelles observées présent ent de nombreux point s communs avec des modèles
couramment ut ilisés d’albumine glyquée in vit ro par du glucose ou encore du M GO, nous
const at ons que les niveaux d’expression de ces modificat ions se dist inguent
part iculièrement in vivo.

En effet , si nous nous concent rons sur les modificat ions st ruct urales l’albumine au cours du
diabèt e, nous const at ons premièrement un niveau de glycat ion élevé, exprimé par les
dosages des résidus amines libres et des fruct osamines, mais qui rest e moindre sinon
équivalent comparat ivement aux modèles de glycat ion par le glucose 100 mM ou le M GO.
Ceci s’explique aisément par un niveau d’imprégnat ion glycémique des pat ient s diabét iques
qui, même s’ils sont en sit uat ion d’hyperglycémie chronique, rest e bien inférieur à des
concent rat ions de l’ordre de 100 mM d’hexose. En revanche, à niveau de glycat ion
équivalent , les modificat ions d’ordre oxydat if, exprimées par le dosage de la cyst éine (t hiols
libres) ou le dosage des résidus carbonyles, s’expriment beaucoup plus franchement pour
l’albumine glyquée in vivo . Ces résult at s sont en faveur de modificat ions oxydat ives plus
import ant es d’albumine in vivo liées à des processus oxydat ifs plus nombreux et plus
complexes.
Les modificat ions des st ruct ures t ridimensionnelles visualisées au t ravers des propriét és
spect rales de l’albumine sont elles aussi majeures et s’expriment de manière plus int ense
sur l’albumine modifiée in vivo, ét ayant un peu plus l’hypot hèse de réarrangement
st ruct uraux plus nombreux et plus complexes de cet t e prot éine in vivo .

L’ensemble de ces observat ions confirme bien que les mécanismes combinés
d’hyperglycémie et de st ress oxydant observés au cours du diabèt e sont à l’origine de la
107
format ion de t rès nombreuses formes d’albumine issues des phénomènes combinés de
glycat ion et de réarrangement s oxydat ifs complexes et mult iples. Nous ret rouvons, en effet ,
en plus des formes fruct osamines correspondant aux formes glyquées simple du t ype
produit d’Amadori, t rès cert ainement de nombreuses formes glycoxydées d’albumine du
t ype AGEs.

Si les t echniques classiques d’élect rophorèse en gel SDS‐PAGE, ne permet t ent pas de
séparer et quant ifier ces différent es formes d’albumine aux masses moléculaires proches,
des t echniques plus résolut ives comme l’HPLC‐M S/ M S ou encore l’élect rophorèse capillaire,
peuvent êt re ut ilisées pour séparer, ident ifier voir même quant ifier ces formes modifiées
100,101,102
d’albumine au cours du diabèt e .

L’ét ude des modificat ions fonct ionnelles de l’albumine au cours du diabèt e mont re elle aussi
des résult at s qui dist inguent clairement les formes modifiées in vivo des formes modifiées in
vit ro . Nous avons ét udié ici deux fonct ions essent ielles de l’albumine à savoir sa capacit é de
prot ect ion cont re le st ress oxydant et ses propriét és de t ransport .

La capacit é de liaison de l’albumine est t rès impact ée au cours du diabèt e. Nous observons
en effet une t rès fort e diminut ion de la capacit é t ot ale de fixat ion de l’albumine d’ions
2+
bivalent s comme le Cu parallèlement à une modificat ion de l’affinit é de l’albumine pour
cert ains médicament s qui se lient sur le sit e I ou II de Sudlow .

Si les modificat ions de la capacit é de liaison de l’albumine aux médicament s ét ait at t endue
car l’albumine présent e des sit es glycat ion sur ses deux sit es de liaison, la baisse de la
2+
capacit é de liaison d’ions bivalent s comme le Cu est beaucoup plus marquée pour les
formes d’albumine modifiées in vivo . Cet t e modificat ion est à met t re en lien avec
l’import ance des réarrangement s oxydat ifs combinés à la glycat ion observés au cours du
diabèt e. La capacit é de liaison aux ions bivalent s est en effet reliée au niveau d ‘oxydat ion de
la part ie N‐t erminale de la prot éine et aussi au niveau d’oxydat ion de la Cys34 de l’albumine
70,71
.
108
Ne disposant pas encore de mét hode direct e de séparat ion et de quant ificat ion des formes
glycoxydées d’albumine en élect rophores capillaire ou en HPLC‐M S/ M S au laborat oire, nous
nous sommes appuyés dans la suit e de nos t ravaux sur cet t e pert e significat ive de capacit é
de liaison aux ions bivalent s, pour apprécier indirect ement la quant it é d’albumine au cours
du diabèt e. Pour cela nous nous sommes inspirés des t ravaux de Bar ‐Or et al . qui ont
précédemment mis au point une mét hode de quant ificat ion de l’albumine modifiée par
l’ischémie (IM A : Ischemia M odified Albumin) au cours des syndromes coronariens aigus au
2+ 69,103
moyen de la mesure de la capacit é de liaison du Co à l’albumine .

Concernant l’ét ude de la capacit é ant ioxydant e de l’albumine modifiée au cours du diabèt e,
nous observons une diminut ion t rès import ant e de celle‐ci pour l’albumine modifiée in vivo .
Ces résult at s sont en accord avec la proport ion import ant e des réarrangement s oxydat ifs
également observée sur l’albumine ext rait e de pat ient s diabét iques. Cet t e diminut ion peut
êt re également reliée à la baisse de la capacit é de liaison de l’albumine aux ions bivalent s,
puisque l’on sait qu’ils jouent un rôle cent ral dans la générat ion de ROS circulant s. Cet t e
baisse de capacit é ant ioxydant e de l’albumine modifiée in vivo t émoigne bien de
l’import ance des réarrangement s glycoxydat ifs auxquels est confront ée l’albumine au cours
du diabèt e.
1.4. Conclusion

Les différences observées ent re l’albumine modifiée in vivo et les modèles de glycat ion in
vit ro couramment ut ilisés confirment bien l’hypot hèse que ces modèles ne sont que t rès
part iellement représent at ifs des mécanismes de réarrangement glycoxydat ifs observés au
cours de la pat hologie diabét ique.

Nous nous sommes at t achés dans la deuxième part ie de nos t ravaux à caract ériser les effet s
cellulaires de l’albumine modifiée au cours du diabèt e. En effet si les formes modifiées
d’albumine peuvent const it uer le reflet de la pression glycoxydat ive au cours du diabèt e
not re object if a ét é de définir si elles présent ent des effet s cellulaires dist inct ifs et si elles
109
peuvent avoir par conséquent un rôle dans la physiopat hologie du diabèt e et de ses
complicat ions cardiovasculaires dont on sait que le st ress oxydant joue un rôle cent ral.
110
2. EFFETS CELLULAIRES DE L’ALBUMINE MODIFIEE AU COURS
DU DIABETE
2.1. Introduction

Le st ress oxydant se définit comme un déséquilibre ent re la product ion de ROS et la capacit é
56,57
de défense ant ioxydant e de l’organisme . Le st ress oxydant est aujourd’hui ident ifié
comme un des mécanismes menant à une dysfonct ion endot héliale. Au cours du diabèt e, le
st ress oxydant circulant est donc considéré comme ét ant au cœur des mécanismes
physiopat hologiques des complicat ions cardiovasculaires puisqu’il est en cont act direct avec
102
l’endot hélium vasculaire .

De nombreuses ét udes ident ifient ce st ress oxydant comme une cible t hérapeut ique
privilégiée. Une diminut ion de ce st ress au cours du diabèt e pourrait limit er l’apparit ion des
complicat ions vasculaires chroniques du diabèt e de t ype 2, c’est pourquoi de nombreuses
t ravaux port ent aujourd’hui sur l’ut ilisat ion de molécules ant ioxydant es comme
t hérapeut iques adjudant es à la prise en charge habit uelle des pat ient s diabét iques de t ype
66
2 .

L’albumine const it ue une des principales défenses cont re le st ress oxydant circulant .
Précédemment , nous avons pu mont rer qu’au cours du diabèt e, l’albumine subit des
modificat ions glycoxydat ives avec format ion de formes avancées de glycat ion. Ces formes
modifiées d’albumine ont également une capacit é de défense ant ioxydant e fort ement
diminuée ce qui les place de façon indirect e dans les processus physiopat hologiques menant

98,99,63
à une dysfonct ion endot héliale puis à des complicat ions chroniques cardiovasculaires .

L’object if de l’ét ude suivant e a ét é d’ident ifier si ces formes modifiées d’albumine au cours
du diabèt e présent aient également des effet s sur des cult ures cellulaires d’adipocyt es et de
macrophages. Ces cellules, impliquées dans la physiopat hologie du diabèt e et de ses
complicat ions sont connues pour réagir en présence d’AGEs via une réponse inflammat oire
104
régulée par le récept eur RAGE . Là encore, nous avons comparé les effet s cellulaires
111
observés en présence d’albumine modifiée in vivo au cours du diabèt e de t ype 2 à ceux
produit s par des formes d’albumines humaines de pat ient s non diabét iques modifiées ou
non in vit ro .
2.2. Résultats

Article 3: New insight s int o delet erious impact s of in vivo glycat ion on albumin ant ioxydant
act ivit ies. Biochimica et Biophysica Act a 2013 ; 1830 : 3342‐3351. J. Baraka ‐Vidot, A. Guerin‐
Dubourg, F. Dubois, B. Payet, E. Bourdon, P. Rondeau.
112
Bioch im ica et Bioph ysica Acta 1830 ( 2013) 3532–3541
Contents lists available at SciVerse ScienceDirect
Bioch im ica et Bioph ysica Acta

j o u r n al h o m ep ag e: w w w . el s ev i er . c o m / l o c at e/ b b ag en
New in sigh ts in to deleterious im pacts of in vivo glycation on album in

an tioxidan t activities
Jen n ifer Baraka-Vidot a , Alexis Guerin -Dubourg a,b
, Fan n y Dubois a , Bertran d Payet c,
Em m an uel Bourdon a , Ph ilippe Ron deau a,⁎
a
Groupe d'Etude sur l'In fla m m a tion Chronique et l'Obésité ( GEICO) , Structure fédéra tive Environnem ent Biodiversité Sa nté-FED4126, Université de La Réunion, Pla teform e CYROI,
Sa int Denis de La Réunion , Fra nce
b
Unité fonctionnelle de recherche biochim ie, Centre Hospita lier Universita ire Félix Guyon , Sa int Denis de La Réunion, Fra nce
c
La bora toire de chim ie des substa nces na turelles et sciences des a lim ents, Université de La Réunion, Sa int Denis de La Réunion, Fra nce
a r t i c l e i n f o a b s t r a c t
Article history: Ba ckground: Album in con stitutes th e m ost abun dan t circulatin g an tioxidan t an d preven ts oxidative dam ages.
Received 16 Decem ber 2012 How ever, in diabetes, th is plasm atic protein is exposed to several oxidative m odification s, w h ich im pact on
Received in revised form 17 Jan uary 2013 album in an tioxidan t properties.
Accepted 18 Jan uary 2013 Methods: Most studies dealin g on album in an tioxidan t activities w ere con ducted on in vitro m odified protein .
Available on lin e 31 Jan uary 2013
Here w e tried to deciph er w h eth er reduced an tioxidan t properties of album in could be eviden ced in vivo. For
th is, w e com pared th e an tioxidan t properties of album in purified from diabetic patien ts to in vitro m odels of
Keyw ords:
Album in
glycated album in .
Glycation Results: Both in vivo and in vitro glycated album in s displayed im paired antioxidant activities in the free
Advan ced glycation en d-products radical-in duced h em olysis test. Surprisingly, th e ORAC m ethod ( Oxygen Radical Antioxidan t Capacity) show ed
Diabetes an enh an ced antioxidant activity for glycated album in . Faced w ith this paradox, w e investigated antioxidant
An tioxidan t and anti-inflam m atory activities of our album in preparation s on cultured cells ( m acrophages and adipocytes).
In flam m ation Reduced cellular m etabolism and enh an ced intracellular oxidative stress w ere m easured in cells treated w ith al-
bum in from diabetics. NF-kB –m ediated gen e induction w as h igher in m acroph ages treated w ith both type of
glycated album in com pared w ith cells treated w ith n ative album in . An ti inflam m atory activity of native album in
is significantly im paired after in vitro glycation and album in purified from diabetics significantly enh an ced IL6
secretion by adipocytes. Expression of receptor for advan ced glycation products is significantly enh an ced in
glycated album in-treated cells.
Conclusions a nd general significance: Our results bring n ew evidences on th e deleterious im pairm en ts of album in
im portant fun ction s after glycation and em phasize th e im portance of in vivo m odel of glycation in studies relied
to diabetes path ology.
© 2013 Elsevier B.V. All righ ts reserved.
1. Int r oduct i on our body and contribute to m aintain the intracellular redox hom eostasis.
Am ong endogenous antioxidants, album in represents a very abundant
Free radicals are essential to the physiological control of living organ- and im portant circulating antioxidant in plasm a [3,4], a body com part-
ism s [1]. But at high concentrations, free radicals becom e hazardous and m ent know n to be exposed to continuous oxidative stress [5]. But in par-
lead to dam ages in all m ajor biological con stituents [2]. Oxidative dam - ticular in vivo situation, album in can incur som e dam age that affects its
ages are frequently observed in num erous states of diseases. Oxidative antioxidant properties [6,7]. These m odifications could occur in diabetes
stress occurs w h en reactive oxygen species (ROS) production overpass m ellitus w hich is one of the pathological conditions associated w ith early
antioxidant defenses. Antioxidants can either be of exogenous origin, occurrence of vascular com plications, together w ith functional alter-
such as active m olecules present in foods or endogenously produced by ations of album in [8]. In this com plex pathology, album in undergoes in-
creased glycation. This phenom enon corresponds to the non-enzym atic
attachm ent of a glucose m olecule to a free prim ary am ine residue.
Abbrevia tions: AGE, advanced glycation end-products; HSA, hum an serum album in; Am adori rearrangem ent of the glycated protein gives rise to the deleteri-
HSA-ND and HSA-D, purified hum an serum album in from non-diabetic and diabetic patients, ous advanced glycation end products (AGEs) [9]. It is now very w ell
respectively; HbA1C, glycated hem oglobin level; PBS, phosphate-buffered saline established that in teraction of AGEs w ith their receptors (RAGE) induces
⁎ Correspon ding author at: GEICO-Université de la Réun ion 15, avenue René Cassin, BP
7151-97715 Saint Den is Messag Cedex 09, La Réunion , Fran ce. Tel.: + 33 262 93 86 48;
several cellular phenom ena potentially relating to diabetic com plications
fax: + 33 262 93 82 37. [10,11]. Many study h ave evidenced an AGEs-m ediated inflam m atory re-
E-m a il a ddress: roph il@un iv-reun ion .fr ( P. Ron deau) . sponses in circulating cells involving up-regulating m ultiple sign aling
0304-4165/$ – see fron t m atter © 2013 Elsevier B.V. All righ ts reserved.
h ttp://dx.doi.org/10.1016/j.bbagen .2013.01.019
J. Ba ra ka -Vidot et a l. / Biochim ica et Biophysica Acta 1830 ( 2013) 3532 –3541 3533
pathw ays via RAGE [12,13]. These studies generally use glycated album in results are expressed as m m ol/L of 1-deoxy-1-m orpholin ofructose
as the source of AGEs. If plethora of studies focuses on AGE–cell interac- ( DMF), w h ich is a synth etic ketoam in e used as a prim ary standard.
tions, very few try to elucidate the im pact of in vivo glycation phenom e- TNBS ( 2, 4, 6-trin itroben zen esulfon ic acid) assay allow s th e quan -
non on album in antioxidan t activities. tification of prim ary free am in o groups in proteins [17]. Th is m eth od
Here, for th e first tim e an d by usin g several com plem en tary bio- w as described in detail in a previous study by our group [18]. Various
logical tests, w e in vestigated w h eth er in vitro or in vivo glycation of con cen tration s of L-glycin e ( 10 to 200 n m ol) w ere used to defin e th e
h um an serum album in ( HSA) m igh t alter its an tioxidan t properties stan dard curve.
in cellular an d in n on cellular assays. Thiol groups in n ative or m odified album in w ere m easured by
Ellm an's assay using 5, 5′-dithiobis, 2-n itroben zoic acid ( DTNB) [19]
2. Mat er ial s and m et hods as described previously [20]. A standard curve w as perform ed using
various con centration s of L-cysteine ( 10 to 100 n m ol) ( Sigm a). The con -
2.1. Ma teria ls tent of thiol groups for HSA sam ple w as m easured in duplicate on tw o
differen t quan tities of BSA by reading the absorban ce at 412 n m . Results
Hum an SW872 liposarcom a cells w ere purchased from Am erican are expressed as the n um ber of free \ SH groups per m ol of HSA.
Type Culture Collection (Rockville, MD). Mouse m acrophage RAW-Blue Protein carbon ylation w as determ ined by th e carbon yl ELISA assay
cells w ere purchased from InvivoGen (San Diego). Dulbecco's Modified based on th e recogn ition of protein -boun d DNPH in carbon ylated
Eagle's Medium (DMEM) high glucose, fetal bovine serum (FBS) and all protein s w ith an an ti-DNP an tibody. Th is m eth od w as described in
m edium nutrients w ere purchased from PAN Biotech Gm bh (Aidenbach). detail in previous studies [18,21].
The rabbit polyclonal anti h um an RAGE antibody, m eth ylglyoxal AGE-related m odification s w ere determ ined by th e m easure of
solution s ( 40%aq.) , D-glucose, 2, 2′-azobis ( 2-m ethylam idinopropan e) glycophore [14,22] and tryptophan fluorescen ce [23]. The fluorescence
or AAPH ( 440914) , fluorescein , p-n itroph en yl-phosph ate ( PNPP) , spectra w ere carried out on Horiba Scientific Fluorom ax-4 spectrom e-
dichlorofluorescin diacetate ( DCF-DA) and 3-( 4,5-dim ethylthiazol-2- ter. The form ation of glycophore w as m on itored at 355 n m excitation
yl)-2,5-diphen yl tetrazolium brom ide ( MTT), w ere all provided from w avelength and in 360–600 n m em ission range. The results w ere
Sigm a-Aldrich. expressed as %increase of glycophore level and calculated as follow :
2.2. Pa tient's recruitm ent ðF1 −F0 Þ

%Glycophore increa se ¼ 100
ðF0 Þ
Plasm a sam p les w ere obtain ed from th irt y n in e d iabetic p atien ts
( % HbA1C = 11.0 ± 1.9) and anoth er pool w as from fourteen non- w h ere F0 is the m axim um fluorescence of HSA-NDG0 and F1 is the m ax
diabetic subject (%HbA1C = 5.5 ± 0.4) at th e Bioch em istry laboratory of fluorescen ce of in vitro or in vivo glycated album in .
the Centre Hospitalier Universitaire ( CHU, Saint-Den is, La Réun ion). Di- Tryptoph an em ission spectra w ere obtain ed in th e ran ge of
abetic panel included DID (n = 6) an d DNID (n = 33) patien ts w ith a di- 280–430 n m em ission w avelen gth ran ge after excitation at 270 n m
agnostic establish ed for m ore than one year. All diabetic patien ts [24,25].
follow ed an an tidiabetic treatm ent. Th e procedures an d the collection
of hum an m aterials w ere approved by the local governm en tal French 2.5. Ma ss spectroscopic a na lysis
Eth ical Com m ittee. Patients w ith a h em oglobin abnorm ality an d/or
hyperleukocytosis, acute coronary syndrom e, renal failure, in fectious All m ass spectroscopic m easurem en ts w ere perform ed at th e
or inflam m atory syn drom e w ere excluded. All biological data related Molecular Bioph ysics Un it ( MBU) of th e In dian In stitute of Scien ce
to both pools are given in Table S1 (Supplem entary data). ( Ban galore, In dia) . Average m olecular w eigh ts of both glycated albu-
m in sam ples w ere determ in ed by electrospray ion ization m ass spec-
2.3. Hum a n a lbum in prepa ra tions trom etry ( ESI/MS) . ESI/MS w as perform ed on Agilen t 1100 LC
coupled to Bruker Esquire3000plus operatin g in positive ion m ode.
Th e purification of serum album in from fresh h um an plasm a w as Com plete ESI/MS settin gs w ere: h igh voltage capillary, 4000 V; h igh
based on exten sive dialysis again st 50 m M-Tris/HCl, pH 7.4, follow ed voltage en d plate offset, − 500 V; n ebulizer gas pressure, 28 psi; dry
by affin ity ch rom atograph y usin g Cibacron Blue 3G lin ked to agarose gas flow rate, 7.00 l/m in ; dry gas tem perature, 340 °C an d capillary
( Am ersh am cat# 17-0948-01) as a ligan d for th e album in . A 1.5 M exit, 196.0 V; Trap Drive, 120.6. Mass spectra w ere processed by
NaCl, pH 7.4 buffer w as used for th e desorption of boun d album in usin g decon volution algorith m in order to reveal peaks w ith apparen t
from Cibacron Blue-agarose follow in g th e elution of oth er plasm atic m /z ration for m ain com ponen ts.
protein s w ith a 50 m M-Tris/HCl, pH 7.4 buffer. Each fraction of eluate
w as exam in ed by gel electroph oresis an d th e m ost purified an d con - 2.6. Red blood cell hem olysis test
cen trated extracts w ere pooled before th e rem ain in g im m un oglobu-
lin s w ere rem oved w ith seph arose-protein A, follow ed by exten sive Th e an tioxidan t properties of m odified album in s w ere exam in ed
dialysis again st PBS an d th en storage at -80 °C. Advan ced glycation w ith th e free radical-in duced blood h em olysis test [26]. Hum an
en d products ( AGE) w ere prepared as previously described [14] by blood sam ples w ere obtain ed from th e Bioch em istry departm ent of
in cubatin g 0.37 m M com m ercial h um an serum album in ( HSA-C) th e local h ospital cen ter ( CHU Felix Guyon ) an d w ere taken on
an d purified HSA from a n on -diabetic pool ( HSA-ND) w ith out an d EDTA substrate as an ticoagulan t. Th en plasm a w as rem oved an d
w ith glucose ( 25 m M an d 100 m M) in PBS, pH 7.4, un der sterile con - eryth rocytes w ere w ash ed w ith an isoton ic solution ( NaCl 0.15 M) .
dition s, at 37 °C for 3 w eeks, or w ith m eth ylglyoxal ( 10 m M) for Each w ell of a 96 w ell-plate w as filled w ith 100 μl ( about 1.10 8 eryth -
2 days. Th e protein s w ere dialysed again st PBS, sterile-filtered rocytes, 400,000 cells/μl fin al con cen tration ) of diluted solution of red
th rough a 0.2 μm Millipore filter an d stored at − 80 °C. blood ( 1/10 in 0.15 M NaCl) . Differen t album in sam ples ( 10 μM fin al
con cen tration ) w ere added in triplicates. Hem olyses w ere started by
2.4. Biochem ica l cha ra cterization of hum a n a lbum in prepa rations addin g 0.45 M of AAPH in each w ell. Turbidim etry at 450 n m w as
recorded in every 10 m in usin g a 37 °C-th erm ostated m icroplate
Fructosam in e w as determ in ed usin g the m ethod developed by reader. Results w ere expressed as 50% of m axim al h em olysis tim e
Joh nson et al. [15] usin g the n itroblue tetrazolium ( NBT) reagen t. The ( HT50 in m in ) w h ich represen ts th e total defen se again st free radicals
protocol w as described in a previous study from our group [16]. The in h um an an d an im al m odels subm itted to oxidative stress [27].
3534 J. Ba ra ka -Vidot et a l. / Biochim ica et Biophysica Acta 1830 ( 2013) 3532 –3541
2.7. ORAC test stained by incubation w ith eosin solution for 7 m in. Cells w ere im aged
using a Nikon eclipse m icroscope and NIS-Elem ent softw are (Nikon).
The oxygen radical absorban ce capacity ( ORAC) developed by Ou et
al. [28] assay h as been w idely accepted as a standard tool to m easure 2.11. Determ ina tion a nd qua ntifica tion of intra cellula r ROS levels
the antioxidant activity in the n utraceutical, pharm aceutical, and food
in dustries [29]. The ORAC assay using fluorescein as th e fluorescent After 24 h of treatm en t, cells w ere w ash ed tw ice w ith PBS, and in cu-
probe m easures the antioxidan t capacity of sam ples to protect fluores- bated w ith 10 μM dich lorofluorescin diacetate ( DCF-DA) at 37 °C. After
cein from AAPH-in duced oxidative dam age. Th e autom ated ORAC assay 30 m in , cells w ere w ash ed on ce w ith PBS, and th e fluorescen ce in tensi-
w as carried out on an Infin ite M200 pro spectrofluorom etric analyzer ty of the oxidized form of DCF w as m easured in a m icroplate-reader at
( TECAN) at an excitation w avelen gth of 485 n m and an em ission w ave- 492 n m ( excitation ) an d 520 n m ( em ission). Fluorescen ce values
length of 530 n m . The reaction w as carried out in phosph ate buffer w ere calculated after backgroun d subtraction ( using identical con di-
( 75 m M, pH 7.4) con tain in g each album in sam ple ( 25 μl) in six repli- tion s w ithout DCF) . Intracellular gen eration of ROS w as also evaluated
cates and fluorescein solution ( 80 n M, 150 μl). Trolox solution s at dif- by fluorescen ce m icroscopy in precultured SW872 cells on glass cover
ferent con cen tration ( 6–50 μM) w ere used as calibration standards. slips in cubated w ith 10 μM of DCF-DA at 37 °C for 1 h follow ing by a
The fluorescen ce kinetic of fluorescein w as follow ed for 1 h at 37 °C stim ulation w ith 80 μM of HSA sam ples ( HSA-NDG0 and HSA-NDMGO)
after addin g autom atically AAPH solution ( 150 m M, 25 μl) in each for 20 m in .
w ell. The fluorescen ce w as recorded every 2 m in . An tioxidan t curves
( fluorescen ce vs. tim e) w ere first n orm alized to th e curve of the blan k 2.12. NFκB a nd AP-1 a ctiva tion
( ph osph ate buffer in stead of sam ples or trolox). Then th e area under
the fluorescen ce decay curve ( AUC) w as determ in ate. The antioxidan t RAW-Blue™ cells ( in vivogen, France) h ave been stably tran sfected
activity ( ORAC value) of sam ples w as calculated by usin g trolox calibra- RAW 264.7 m acrophages w ith a con struct in w hich NF-kB and AP1
tion standards as follow : activation s lead to the secretion of secreted em bryon ic alkaline
phosph atase ( SEAP) . RAW-Blue™ cells w ere m ain tain ed in DMEM
ðAUCsa mple −AUCbla nkÞ supplem en ted w ith FBS 10%and 100 m g/m l Zeocin in a 5%CO2 in cuba-
ORACvalue ¼ ð½Trolox=½Sample Þ:
ðAUCTroloxð50μM Þ−AUCbla nkÞ tor. RAW-Blue™ cells previously platted in 96-w ell plate ( 100,000 cells/
w ell) w ere exposed to n orm al culture m edium ( FBS 1%) or treated w ith
LPS ( 1 μg/m l) or/an d m odified album in sam ples ( 20 μM or 80 μM) at
37 °C in a 5% CO2 in cubator for 24 h . After in cubation, 1 ∙ 10 −3 M of
2.8. Culture of SW872 a nd RAW-Blue ™ cells p-n itrophenyl-ph osph ate ( PNPP) ( dissolved in 0.1 M glycin e buffer
con tain in g 1 m M MgCl2 , 1 m M ZnCl2 , pH 10.4) w as added to 40 μl of
Hum an SW872 liposarcom a cells w ere cultured in com pleted DMEM each supern atan t at 37 °C for 120 m in .
m edium ( 10%FBS, pen icillin ( 100 U/m l), streptom ycin ( 100 U/m l) an d PNPP + H2 O in th e presen ce of SEAP are con verted to para-
L-glutam in e ( 2 m M) ). Cells w ere grow n in a 5%CO2 incubator at 37 °C. n itroph en ol ( PNP) + Ph osph ate. PNP is yellow in alkalin e m edium
Mouse m acroph ages RAW-Blue™ cells derived from RAW 264.7 w ere an d assayed to determ in e SEAP levels usin g a spectroph otom eter at
m ain tained in sam e con dition s supplem en ted w ith 100 m g/m l of 460 n m .
Zeocin ( in vivogen) . For MTT and DCF experim en tation s cells w ere cul-
tured 24 h in 96-w ell plate ( 10,000 cells/w ell) w ith 200 μl DMEM
2.13. Qua ntifica tion of RAGE expression by rea l tim e q-PCR
contain in g 1%FBS and treated w ith m odified album in sam ples (20 μM
or 80 μM) for 24 h.
After treatm en t, total RNA w as extracted from cell cultures usin g
Trizol reagen t ( In vitrogen) . 6 μg of RNA w as reversed tran scripted
2.9. MTT proliferation a ssa y
to cDNA usin g Ran dom prim ers ( Sigm a) an d Molon ey Murin e Leuke-
m ia Virus ( MMLV, In vitrogen) . Th e cDNA w as am plified by PCR on an
The MTT-assay, usin g th e standard 3-( 4,5-dim ethylth iazol-2-yl) -
ABI PRISM 7000 th erm al cycler ( Applied Biosystem s, Fran ce) usin g
2,5-diphenyl tetrazolium brom ide ( Sigm a) , w as chosen to evaluate
th e SYBR green m aster-m ix ( Eurogen tec, Belgium ) an d specific
the effect of m odified album in sam ples ( 20 μM or 80 μM) on cell prolif-
h um an RAGE prim ers purch ased from Eurogentec. Each PCR cycle
eration [30]. This assay is based on th e cleavage of yellow tetrazolium
w as con ducted for 15 s at 95 °C an d 1 m in at 60 °C. RNA am ounts
salt MTT into purple form azan by m etabolically active cells, w h ich can
w ere calculated w ith relative stan dard curves for each m RNA of in ter-
be photom etrically quan tified. An in crease in th e n um ber of livin g
est an d 18S ribosom al RNA ( rRNA) gen e as referen ce. Norm alization
cells results in an in crease in total m etabolic activity, w h ich leads to a
to 18S w as con ducted to accoun t for variability in quality an d con cen -
h igher color form ation. After overn igh t of cell in cubation s in the
tration of total RNA, an d RT efficien cy. Th e results w ere an alyzed
presen ce of different reagen ts ( treatm en t w ith H2 O2 ( 500 μM) or/an d
usin g ABI Prism 7000 SDS softw are. Th e prim er sequen ces used
m odified album in sam ples ( 20 μM or 80 μM) ), 20 μl of th e MTT dye
w ere as follow s:
( 5 m g/m l) w as added into each w ell follow ed by 4 h of in cubation.
After discarding the m edia, 200 μl of DMSO w as added in to each w ell
18S
and plates w ere agitated in the dark for 30 m in to solubilize dark blue
form azan crystals. The plates w ere read usin g a m icroplate reader at a Forw ard prim er: 5′-CGCCGCTAGAGGTGAAATTCT-3′
w avelength of 595 n m . The n egative con trol w ell ( m edium alon e w ith Reverse prim er: 5′-CATTCTTGGCAAATGCTTTC-3′
n o cell and n o reagen t) w as used for zeroin g absorbance. RAGE
Forw ard prim er: 5′-GCCAGAAGGTGGAGCAGTAG-3′
2.10. Hem a toxylin –eosin sta ining Reverse prim er: 3′-CCAGTGGATTTGAGGAGAGG-5′
SW 872 cells w ere seeded on glass cover slips in 4 w ell plates and 2.14. Flow cytom etry a na lysis
treated w ith 80 μM of HSA sam ples (control cells w ere untreated). After
24 h of treatm ent, cells w ere fixed in p -form aldhyde 4%at room tem per- Cells w ere cultured in 6-w ells plate at a den sity of 3 · 10 5 cells/w ell
ature for 20 m in and stained w ith hem atoxylin solution (Vector®). Cells w ith 20 μM of glycated album in sam ples or w ith PBS for 6 h in
w ere w ashed 10 tim es in 2%glacial acetic solution, rinsed w ith w ater and DMEM/FBS 1%. Cells w ere th en w ash ed w ith PBS, detached and
in cubated w ith blockin g buffer ( PBS/BSA 1%) for 30 m in, follow ed by an ( sh ifted up to 430 n m for HSA-NDMGO). Th is could be attributed to alter-
in cubation w ith rabbit anti-RAGE polyclonal antibody ( 1: 200 dilution ation in album in con form ation follow in g glucose- or m eth ylglyoxal-
in PBS/BSA 1%) for 1 h an d an in cubation w ith PE-con jugated secondary in duced glycation. Concern in g diabetic album in , n o quen ch in g of
IgG ( Molecular Probes) for 30 m in . After a last w ash, SW872 cells w ere fluorescence is observed. AGE fluorescen ce in our sam ples is reported
analyzed by flow cytom etry usin g FACScan flow cytom eter ( Becton in Fig. 1b. For HSA-NDG25 an d HSA-D, an increased in glycophore fluo-
Dickin son) . Cells w ere gated for an alysis based on ligh t-scattering prop- rescen ce is observed at 450 n m , w h ile a sh ift of th e m axim um is eviden t
erties and fluorescence intensity ( FL2) w as assayed after coun tin g for HSA-NDMGO w h ich exhibits tw o m ajor fluorescen ce em issions at
10,000 events. Th e results w ere expressed as the m edian fluorescen ce 392 nm and 513 n m . Th ese data attested th e in crease of AGE level for
of labeled cells w ith respect to th e sign al obtain ed for con trol ( SW872 in vitro an d in vivo glycated album in s as in dicated in Table 1.
cells in cubated w ith PBS) . Average m olecular w eights of m ain HSA sam ples ( HSA-NDG0 ,
HSA-NDG25 , HSA-NDMGO and HSA-D) w ere assessed by ESI/MS
2.15. Secreted interleukin-6 qua ntifica tion ( Table 2 and Fig. S2). As expected, in vitro glycation of album in w ith glu-
cose or m ethylglyoxal induces an in creased in average m olecular w eigh t
Th e proinflam m atory cytokin e interleukin -6 ( IL-6) secreted in of HSA. In com parison w ith m olecular m ass of native album in
SW872 m edia after 24 h of treatm en t w ith LPS ( 1 μg/m l) in the presen ce ( 66,567 Da) , HSA-NDG25 an d HSA-NDMGO exh ibit th e m ost abun dant
of m odified album in sam ples ( 20 μM) w as quan tified using a Hum an species m olecular m ass at respectively 66,734 Da ( + 167) and
IL-6 ELISA Kit ( eBioscience). 66,733 Da ( + 166), correspon din g to album in attachm ent w ith about
on e glucose un it ( 162 Da for glucose) and th ree m ethylglyoxal un its
2.16. Sta tistical a na lysis ( 54 Da for MGO). With an average m olecular w eigh t of 66,623 Da, th e
m ost abun dant species for diabetic HSA w as in creased to approxim ately
Data w ere expressed as th e m ean s ± stan dard deviation ( SD) from 56 Da. Moreover, in vitro and in vivo glycated album ins presen t m any
a m in im um of th ree experim en ts. Statistical sign ifican ces w ere deter- very h igh m olecular m ass species ( above 67,000 Da) correspon din g to
m in ed usin g on e-w ay ANOVA ( follow ed by a studen t's test) for m ul- h ighly m odified album in form s ( Fig. S2 see supplem en tary data) .
tiple com parison s, w ith a P value of less th an 0.05 required for The antioxidan t properties of th ese glycated HSA sam ples w ere first
sign ifican ce. in vestigated usin g tw o n on cellular assays. On e test is based on the in-
trin sic capacity of album in to protect eryth rocytes from free
3. Resul t s radical-in duced h em olysis. Results reported in Fig. 2a show a h igher h e-
m olysis h alf-tim e ( HT50 ) for unm odified HSA ( vs. PBS con trol) , w h ich
This study w as con ducted on three album in preparations reflecting attests of the antioxidant capacity exerted by n ative album in in th is
different in vitro glycation m odels and com pared w ith album in purified test. This protected action of n ative HSA is partially ( −64%, p b 0.05
from diabetic or control subjects. Tw o of our in vitro glycation for HSA-NDG100 ) or totally ( −100%, p b 0.001 for HSA-NDMGO) lost
preparations constitute com m on glycated album in m odels and use w h en the protein w as in vitro glycoxidized. A m arked and significan t
suprapathological concentrations of glucose (100 m M) or m ethylglyoxal decrease ( −87%, p b 0.001) in album in antiradical properties w ere ob-
(10 m M). The third m odel, w hich uses a pathological concen tration of served for the protein purified from diabetics ( HSA-D). The secon d
glucose ( 25 m M), is m ore typical of diabetic album in. The carbonyl n on cellular test n am ed ORAC show ed rath er a strengthen in g of albu-
levels, free am ino and thiol groups and fructosam in e contents in th e dif- m in antioxidan t properties w ith glycoxidation m odification s ( Fig. 2b).
ferent preparations of album in are reported in Table 1. En hanced ORAC values are about 50% for HSA-NDMGO ( + 49.7%,
Sign ifican t m odification s w ere m easured especially in album in p b 0.001) and aroun d 15%for diabetic HSA ( + 15.6%, p b 0.001) w h en
glycated w ith supraph ysiological con cen trations of glucose, w ith com pared w ith n ative HSA. Secon dly, actions of our differen t glycated
MGO an d also ( at a low er exten t) in album in purified from diabetics HSA sam ples w ere in vestigated on cellular system s con stituted by adi-
in com parison w ith n ative album in . pocytes and m acroph ages. The MTT assay m eth od en ables evaluation
Sim ilarly, en h an ced REM an d aggregation of h igh m olecular ban ds of cell proliferation by quantification of relative cellular m etabolic
w ere observed on n ative PAGE gel for album in glycated w ith activity.
supraph ysiological con cen tration s of glucose, w ith MGO an d, at a We ch oose tw o types of cell types presen t in th e adipose tissue
low er exten t, in album in purified from diabetics in com parison w ith exertin g a determ in an t role in in flam m ation associated to diabetes/
n ative album in ( Fig. S1 see supplem en tary data) . obesity disorders: adipocytes ( SW872 cells lin e) an d m acroph ages
Fluorescence study w as perform ed in order to m on itor th e form ation ( RAW cell lin e) [14,31,32]. As observed in Fig. 3, both cellular m odels
of glycoph ore and th e quenchin g of tryptoph an fluorescen ce in album in display differen t biological respon ses w h en stim ulated w ith HSA
preparation s ( Fig. 1). As eviden t in Fig. 1a, th e fluorescence spectra re- sam ples. If a protective role album in is n oticed in adipocyte m odel,
vealed that in vitro m odified HSA ( HSA-NDG25 an d HSA-NDMGO) un der- th is property is n ot eviden ced in m acroph ages. SW872 an d RAW
go a decrease in th e tryptophan fluorescen ce em ission aroun d 340 nm cells sh ow ed sign ifican t low er m etabolic activity w h en in cubated in
Tabl e 1
Oxidative param eters in th e differen t album in preparation s.
Meth od s Carbon yl rate in crease Free am in o groups/HSA Ketoam in e/HSA Th iols/HSA Glycoph ore fluorescen ce in crease
( %con trol) ( m ol/m ol) ( m ol/m ol) ( m ol/m ol) ( %con trol)
HSA-NDGO 100.0 ± 7.3 13.3 ± 0.98 1.11 ± 012 0.609 ± 0.013 100
HSA-NDG25 111 .4 ± 10.8 12.4 ± 0.83 5.07 ± 0.35⁎⁎⁎ 0.333 ± 0.067⁎⁎ 249
HSA-NDG100 224.8 ± 13.9 10.4 ± 0.20⁎⁎ 12.4 ± 1.88⁎⁎⁎ 0.286 ± 0.011⁎⁎⁎
HSA-NDMGO 455.6 ± 69.6 5.10 ± 0.54⁎⁎⁎ 9.25 ± 1.46⁎⁎⁎ 0.250 ± 0.026 205 & 203
HSA-DG0 95.6 ± 3.9⁎⁎ 10.4 ± 0.80⁎ 2.13 ± 0.58⁎ 0.307 ± 0.012⁎⁎⁎ 259
1) Percen tage carbon yl rate as assessed by th e ELISA carbon yl assay; 2) prim ary am in o group con ten ts in protein s by th e TNBS assay; 3) ketoam in e levels obtain ed w ith th e NBT
assay; 4) free th iol group con ten t as assessed by Ellm an 's m eth od; an d 5) in crease of AGE level obtain ed by m axim um glycoph ore fluorescen ce em ission at excitation w avelen gth of
355 n m . All data are expressed as m ean s ± SD from th ree in depen den t experim en ts. ⁎Effect of glycation or diabetes on purified HSA ( vs. HSA-NDG0 ) .
⁎⁎⁎ p b 0.001, ⁎⁎ p b 0.01, ⁎ p b 0.05.
Fig. 1. a) Flu or e sce n ce sp e ct r a of t r yp t op h an ( 2 7 0 n m e xcit at ion w ave le n gt h ) ;

b ) Glycop h or e e m ission flu or e sce n ce sp e ct r a ( 3 70 n m e xcit at ion w avele n gt h ) Fi g. 2. Differential effect of glycated album in in tw o in vitro free radical-scavenging activity
for HSA- NDG0 ( — ) , HSA-NDG2 5 ( ……) , HSA-NDMGO ( − − −) an d HSA-D ( —) . tests. a) Effect of in vitro or in vivo glycoxidation on antiradical properties of album in w as
Flu ore sce n ce sp e ct ra of all sam p le s ar e sh ow n aft er d at a n orm alizat ion assessed by the free radical-m ediated blood hem olysis test. Histogram s represent half-tim e
accord in g t o t r yp t op h an m axim al ab sorp t ion . hem olysis (HT50 in m in) expressed as m eans ± sd (n = 3). b) Antioxidant properties of
glycoxidized album in were assessed using the ORAC test. Histogram s represent ORAC values
expressed as m eans ± sd (n = 6).
th e presen ce of 80 μM diabetic album in in com parison w ith cells in -

cubated w ith n ative album in ( Fig. 3a an d b) . As sh ow n in Fig. 4, To assess th e effect of glycated album in in in tracellular free radical
MTT assay in dicated also th e protective role exerted by n ative HSA gen eration , w e m easured dich lorofluorescein diacetate ( DCF-DA)
for preven ting partially cellular death in th e presen ce of H2 O2 fluorescen ce in adipocyte cells treated w ith 20 μM n ative or glycated
( 250 μM or 500 μM) in both cell lin es. If th is ben eficial role is partially HSA. As sh ow n in Fig. 5a, un der n orm al con dition s ( w ith 20 μM of n a-
lost upon in vitro glycoxidation , it w as n ot sign ifican tly m odified for tive HSA) , SW 872 an d RAW 264.7 cells exh ibited low er ROS levels
diabetic album in ( vs n ative album in ) in adipocyte cells ( Fig. 4b) . In th an con trol cells ( PBS) . Treatm en t w ith 20 μM of glycoxidized albu-
m acrophagic cells, th e protective role of album in is altered for m in for 24 h sign ifican tly in creased in tracellular ROS levels, th is w as
HSA-NDMGO an d for HSA-D, as w ell ( Fig 4a) . particularly observed in adipocytes treated w ith HSA-NDG100
SW872 cell m orph ology appears m odified w h en incubated in the ( + 7.2%, p b 0.05 vs. HSA-NDG0 ) an d w ith HSA-D ( + 8.1%, p b 0.05 vs.
presen ce of glycoxidized album in . HSA-NDMGO or HSA-D adipocytes HSA-NDG0 ) . Th is in tracellular ROS in crease in SW 872 in cubated
lose their typical fibroblastic m orph ology ( observed w ith HSA-NDG0) w ith 80 μM of HSA-NDMGO w as also observed by fluorescen ce m icros-
and exhibit a m ore round sh ape ( Fig. 4c). copy ( Fig. 5c) . Sim ilar in crease in in tracellular ROS form ation is ob-
served in m acrophages treated w ith in vitro glycated HSA an d
HSA-D ( + 18.2%, p b 0.05 vs. HSA-NDG0 ) ( Fig. 5b) .
Tabl e 2 Because glycated HSA sam ples stim ulate intracellular ROS produc-
ESI m ass an alysis of in vitro an d in vivo HSA. tion , NF-κB activation w as m easured in the RAW-Blue™ cell lin e.
HSA-NDG0 HSA-NDG25 HSA-NDMGO HSA-D RAW-Blue™ cells are derived from RAW 264.7 m acrophages w ith ch ro-
Num ber of com pon en ts 6 13 16 9
m osom al in tegration of a secreted em bryonic alkalin e ph osph atase
Molecular m ass of m ajor ( SEAP) reporter construct in ducible by NF-κB and AP-1. As show n in
com pon en ts ( Da) Fig. 6, cell in cubation in th e presen ce of 20 μM or 80 μM glycated albu-
A 66,567 66,734 66,733 66,623 m in s or LPS ( 1 μg/m l) sign ificantly in duced NF-κB activation . Th e m ost
B 66,756 66,910 66,626 67,901
sign ificant en han cem ents in NF-κB activation w ere m easured in cells
C 66,453 67,007 66,570 66,557
Average m olecular m ass ( Da) 66,679 66,905 68,065 66,751 treated w ith album in glycated w ith 100 m M of glucose and also w ith al-
bum in purified from diabetics.
Average m olecular m ass ( Da) of th e differen t preparations of HSA w as obtain ed by ESI/MS.
Num ber of com ponent w ith the m olecular m asses ( Da) w as determ in ed for each sam ple.
The im pact of glycoxidation on album in anti-inflam m atory properties
Average m olecular m ass determ in ation takes into account all the com pon en ts and th eir w as also evaluated in LPS-treated cells through the SEAP assay. As show n
respective abundan ces. in Fig. 7, NF-κB activation induced by LPS w as significantly reduced in
Fig. 3. Album in from diabetics im paired cellular viability an d m orph ology. Th e relative viability ( %) of cells ( vs. con trol PBS) in cubated 24 h w ith 20 μM or 80 μM of HSA-ND,
HSA-AGEs or HSA-D w as determ in ed by MTT assay. a) in RAW 264.7 m acroph age cells; b) in SW 872 adipocyte cells; c) H&E stain in g of a 70%con fluen ce culture of SW 872 in cu-
bated w ith 80 μM of HSA-ND, HSA-NDMGO or HSA-D. Scale bars corresp on d to 20 μm .
RAW-Blue™ cells incubated w ith 20 μM of native album in (-24%, p b 0.05

vs. LPS control), evidencing the protective anti-inflam m atory property of
the protein. As previously observed in the red blood hem olysis test, this
protective effect is progressively lost after in vitro album in glycation. In
our experim ental conditions (20 μM HSA) album in purified from dia-
betics do not show significant m odification on LPS-induced NFκΒ induc-
tion. But both in vitro glycated album in and album in purified from
diabetics exert significant enhancem ent in LPS-induced IL-6 secretions
by cells (Fig. 8).
Th e previous data revealed an in flam m atory effect of glycated HSA
in volvin g NFκB tran scription factor. Th e possible role of RAGE in in -
flam m atory respon se of SW 872 upon derived HSA–AGE stim ulation
w as in vestigated th rough its gen e expression by real tim e PCR an d
its cell surface protein expression by flow cytom etry.
As sh ow n in Fig. 9a, RAGE gen e expression is sign ifican tly en han ced
in adipocytes in cubated w ith diabetic album in (+ 193%vs. HSA-NDG0 ,
p b 0.05). To our kn ow ledge, RAGE expression at th e surface of
liposarcom a SW872 cells h as n ever been reported before.
Regardin g RAGE protein expression determ in ed by FACS, typical
dot-plot graph s for differen t m odified-HSA treated SW 872 cells an d
correspondin g m edian RAGE fluorescen ce values are reported in
Fig. 9b an d c, respectively. If after 24 h treatm en t in th e presen ce of
HSA-NDG25 , th e percen tage of cells w h ich expressed RAGE did n ot
vary sign ifican tly com pared to n ative album in con dition , th e corre-
spon din g overall even ts exh ibit a sign ifican t h igh er m edian fluores-
cen ce value ( + 20%vs. HSA-NDG0 , p b 0.05) . In con trast, th e m ajority
of SW 872 treated w ith HSA-NDMGO boun d RAGE an tibody on th eir
surface th ereby attestin g a h igh expression of th is receptor in th is
con dition . Th is elevated expression is con firm ed by th e correspon d-
in g m edian fluorescence value w h ich is 4-tim es h igh er in com parison
w ith oth er album in con dition s ( Fig. 9c) .
4. Di scussi ons
Fig. 4. Im paired protective action of album in after glycation. The relative viability (%) of cells
(vs. control DMEM wo H2O2) incubated 24 h with 80 μM of HSA sam ples in presence of H2O2 Album in is th e m ajor an tioxidan t an d th e m ost abun dan t protein
(250 μM or 500 μM) w as determ ined by MTT assay. a) in RAW 264.7 cells; b) in SW 872 cells. in th e circulatory system ( for com preh en sible review s on album in
Fig. 5. Album in from diabetics en h an ced in tracellular oxidative stress. In tracellular ROS production in m acroph ages an d adipocyte cells w as determ in ed by DCF fluorescen ce assay.
Th e relative in crease ( %) of DCF fluorescen ce ( vs. HSA-NDG0 ) w as determ in ed for cells in cubated 24 h w ith 20 μM of HSA-ND, HSA-AGEs or HSA-D. Data are expressed as m ean ± sd
( n = 6) . a) in RAW 264.7 cells; b) in SW 872 cells; c) fluorescen ce of DCF produced by SW 872 in th e presen ce of HSA-NDMG0 ( 80 μM for 20 m in ) an d captured by fluorescen ce
m icroscopy. Scale bars correspon d to 20 μm .
structure–fun ction relation sh ips: [3,4]) . Th e h igh lysin e an d argin in e in vestigate an d discuss th e poten tial im pairm en t of an tioxidan t prop-
residue con ten ts in album in prim ary structure m ake th e protein a erties of h um an album in after in vitro an d in vivo glycation .
h igh poten tial target for glycoxidation . Most studies h ave rath er Previous results, just based on th e red blood hem olysis test h ave
focused on th e biological im pact of album in derived AGE th an th e reported a stren gth enin g of radical trappin g capacities in bovin e
glycation effect on th e in trin sic an tioxidan t or an ti-in flam m atory serum album in glycated w ith glucose [8,14,18] w h ereas an im pairm en t
properties of th e plasm atic protein . Th is study w as un dertaken to of th ese properties w as n oticed upon aggregation process [33]. In th e
present study usin g th e sam e assay, suprapath ological conditions of glu-
cose or m ethylglyoxal in duce the lost of album in an tioxidan t properties,
w hich could be partially relied to th e aggregative state in duced by th e
protein glycation process. Faure et al. h ave already reported deleterious
effects of m eth ylglyoxal on bovin e album in [34]. This im pairm en t is also
associated w ith th e redox state of th e only on e reduced cystein ( Cys-34)
w hich is prone to oxidation upon glycation process and is able to scav-
en ge h ydroxyl radicals [35]. If in vivo diabetic album in is sim ilarly affect-
ed, its equivalen t in vitro m odel h as rath er a m ore m arked antiradical
property. Con clusion arisin g from this first set of data is th at th e red h e-
m olysis test is n ot sufficient to assess th e overall an tioxidant action of
th e protein . Th e oxygen radical antioxidant capacity ( ORAC) m eth od,
w hich is con sidered as a standard tool in the m easurem en t of antioxi-
dant activity in n utraceutical, ph arm aceutical, an d food areas [29],
gives con trary results. Accordin g to the data obtain ed by th is m ethod,
glycation process influences positively th e an tioxidan t activity of albu-
m in , for in vitro an d in vivo m odels, as w ell. Th ese conflictin g results
obtain ed by th ese m eth ods based also on th e free radical th eory
Fig. 6. Album in from diabetics en h an ced NFκB activation . NFκB activation w as deter-
m in ed in RAW-Blue cells after 24 h of in cubation w ith 20 μM or 80 μM of HSA-ND,
suggested th at th e scaven gin g properties of album in depend n ot on ly
HSA-AGEs or HSA-D. Data are presen ted as % con trol ( PBS) an d are expressed as on th e redox status of Cys-34, but also on th e structural con form ation
m ean ± sd ( n = 3) . of the protein . The conform ation al structure of glycated HSA revealed
in duced by LPS and this protective role seem s to be affected upon

glycation. On one han d, supraphysiological glycation m odels an d diabet-
ic album in could induced an activation of NF-κB quite sim ilar to LPS, on
the oth er hand an d con trary to native album in, these sam e in vitro
m odels could not hold dow n the inflam m ation induced by LPS. These
data are in accordan ce w ith the increased intracellular oxidative stress
observed previously and support the idea that album in AGE could
upregulate cellular inflam m ation th rough the ROS pathw ay and th e acti-
vation of NF-κB and AP-1 [41]. It is im portant to n otice that in vivo dia-
betic album in is the only glycation m odel w hich does not exhibit
paradoxal results. Indeed, w ith the low est an tioxidan t activities deter-
m in ed by red blood cells and ORAC tests, in vivo glycation of HSA induces
a decrease of cell viability associated w ith an increase of oxidative stress
and a NF-κB activation. Such deleterious im pairm ents in album in im por-
Fig. 7. Im paired an ti-in flam m atory activity of album in after glycation . NFκB activation tant functions after in vivo glycation, em phasizes the im portance of in
w as m easured in RAW-Blue cells after a 24 h in cubation w ith LPS ( 1 μg/m l) plus 20 μM vivo m odel of glycation in studies related to diabetes path ology. Indeed,
of HSA-ND, HSA-AGEs or HSA-D. Data is presen ted as %con trol ( w ith on ly LPS) an d are m ost of the available in vitro studies on the biological effects of glycated
expressed as m ean ± sd ( n = 3) . album in on cellular physiology w ere perform ed w ith in vitro AGE
m odels, w hich do not reflect th e physiopathology of a hyperglycem ic sit-
uation. In order to obtain significant cellular responses, glycated album in
specific am in o acids, previously buried in n ative con form ation, w h ich m odels have been obtained by incubating album in w ith an excessive
can im prove the free radicals trappin g capacity of th e protein as assayed am ount of glucose (up to 1 M) beyon d th e ph ysiological (5 m M) an d
in ORAC test. How ever, th e an tagon ist results sh ow ed by ORAC m eth od path ological (25 m M) concentrations, w h ich can be encountered in a
seem to be in accordance w ith previous studies w h ich h ave reported an norm al subject or diabetic patien ts, respectively. For instance, Stolzin g
in volvem en t of Maillard products in th e increase in antioxidant activity et al. focused on the ability of m icroglial cells to degrade extracellular
in m an y food system s [36–38]. Neverth eless, th e paradoxal results AGE m odified album in prepared w ith 1 M of glucose [42]. In addition ,
raised th e question of th e clin ical relevan ce of th e ORAC m eth od. It is the m ajority of the literature in this area reports the use of bovin e
n ecessary to perform cellular assays, such as viability test to get m ore in - serum album in instead of the hum an form in an in vitro m odel of
form ation on h ow antioxidant activity of album in is im pacted. glycation. A recent com parative study reported the differential biological
Th rough MTT assay, it is w ell establish ed th at album in con tributes responses of m onocyte cell lines treated w ith in vitro glycation m odels
to th e m etabolic activity of SW872 cells deprived of SVF an d also pro- derived from both BSA an d HSA [14]. In that particular study, glycated
tects again st H2 O2 deleterious effect. Th is en h an ced m etabolic activity BSA appeared to enhan ce proteolytic activities in THP-1 cells, w hereas
observed for som e glycated m odels, sh ould n ot be con sidered as a glycated HSA induced an inh ibition of these proteosom al activities.
protective action of glycated album in . In deed, th e MTT assay also Man y studies dealin g on cell activation by RAGE h ave em ployed al-
eviden ced a lost of protective effect of album in upon in vitro bum in h igh ly m odified by AGEs (30–40 m odified groups per protein) .
glycation . Th e oxidative stress in duced by som e glycated album in Protein s m odified so high ly are rarely foun d in tissues and body fluids
sam ples w h ich trigger th e cellular m etabolic activity could explain in vivo [43].
th is in crease of cell viability. Th is h ypoth esis is com forted by th e si- In th e presen t study, im paired anti-oxidant and anti-in flam m atory
m ultan eous in tracellular oxidative stress an d m etabolic activity en - properties w ere observed in album in purified from diabetics in tw o dif-
h an cem en ts observed in cells in cubated in th e presen ce of HSAG100 . ferent cellular m odels: adipocyte ( SW872) and m onocyte ( RAW) cell
Several studies have reported that glycated products are related to lin es. RAGE expression at th e surface of liposarcom a SW872 cells h as
the increase of system ic levels of inflam m atory m ediators such as n ever been reported before. Here and for th e first tim e, an en hanced ex-
TNF-α or IL-6 [39,40]. The inflam m atory response of th ese cytokin es m e- pression of RAGE receptor w as eviden ced in both SW872 and RAW cells
diated th rough the activation of the transcription factors NF-κB an d in cubated w ith album in purified from diabetics in com parison w ith
AP-1, support the clinical relevan ce of the involvem ent of AGE in m any cells treated w ith th e protein purified from con trols.
pathological processes. Here, th e SEAP activity induced in RAW-Blue™ In con clusion , our results clearly h igh ligh t stron g differences be-
cells clearly sh ow that album in can prevent from NF-κB activation tw een in vitro and in vivo m odels of glycated HSA eviden ced by th e dif-
ferential im pact of glycation in th e antioxidan t and anti-inflam m atory
properties of album in . Im portan tly and for th e first tim e very detrim en -
tal effects w ere eviden ced for the in vivo glycated form of album in con -
tributin g to th e con cept that oxidized form of the protein m ay act as a
biom arker of oxidative stress in diabetes. Furth er studies are h igh ly
w arran ted to reach a better un derstandin g of the im pact of in vivo oxi-
dative m odification on album in properties.
Aut hor cont r i but i ons
J.B.V. research ed data, con tributed to th e discussion, an d review ed

th e m an uscript.
A.G.D. researched data, con tributed to th e discussion, and review ed
m an uscript.
F.D. research ed data an d review ed th e m an uscript.
B.P. research ed data an d review ed th e m an uscript.
Fig. 8. Album in from diabetics en h an ced IL6 secretion by adipocytes. IL6 secretion w as
m easured in SW872 cells after 24 h in cubation w ith LPS ( 1 μg/m l) plus 20 μM of
E.B. con tributed to th e discussion, an d review ed an d edited
HSA-ND, HSA-AGEs or HSA-D. Data is presen ted as % con trol ( w ith on ly LPS) an d are m an uscript.
expressed as m ean ± sd ( n = 3) . P.R. research ed data, an d w rote, review ed an d edited m an uscript.
Fig. 9. RAGE sign alin g in flam m ation path w ay of glycoxidized HSA. a) RAGE m RNA expression levels determ in ed by real tim e q-PCR; b) RAGE cellular surface expression in duced by
PBS, HSA-NDG0 , HSA-NDG25 an d HSA-NDMGO in SW872 cells. SW 872 cells are iden tified as even ts labeled w ith RAGE in a dot plot of FL2 vs. SSC; c) Relative quan tification m edian
fluorescen ce of RAGE surface expression determ in ed by FACS. Data is presen ted as %con trol ( PBS) an d are expressed as m ean ± sd ( n = 3) .
Ack now l edgem ent s Refer ences

[1] W. Droge, Free radicals in th e ph ysiological con trol of cell fun ction , Ph ysiol. Rev.
Th is w ork w as supported by th e Ministère de l'En seignem en t 82 ( 2002) 47–95.
Supérieur et de la Recherch e, th e Min istère de l'Outre-Mer, th e Con seil [2] H. Sies, Oxidative stress: from basic research to clin ical application , Am . J. Med. 91
( 1991) 31S–38S.
Région al de La Réunion , the Université de La Réun ion an d l'Europe. JBV
[3] T.J. Peters, All About Album in — Bioch em istry, Gen etics, an d Medical Application s,
is supported by a fellow sh ip from th e Con seil Régional de La Réunion Academ ic Press, San Diego, 1996.
and l'Europe. Special th anks to A. Septem ber-Malaterre for h er h elp [4] G. Fanali, A. di Masi, V. Trezza, M. Marino, M. Fasano, P. Ascenzi, Hum an serum album in:
from bench to bedside, Mol. Aspects Med. 33 (2012) 209–290.
and excellen t expertise on th e ORAC m ethod.
[5] B. Halliw ell, Album in—an im portant extracellular an tioxidan t? Bioch em . Ph arm acol.
37 ( 1988) 569–571.
Appendi x A. Supplem ent ar y dat a [6] P. Atukeren , S. Aydin , E. Uslu, M.K. Gum ustas, U. Cakatay, Redox h om eostasis of
album in in relation to alph a-lipoic acid an d dih ydrolipoic acid, Oxid. Med. Cell.
Lon gev. 3 ( 2010) 206–213.
Supplem en tary data to th is article can be foun d on lin e at h ttp:// [7] M. Roch e, P. Ron deau , N.R. Sin gh , E. Tarn us, E. Bourdon , Th e an tioxidan t proper-
dx.doi.org/10.1016/j.bbagen .2013.01.019. ties of serum album in , FEBS Lett. 582 ( 2008) 1783–1787.
[8] E. Bourdon , N. Loreau, D. Blach e, Glucose an d free radicals im pair th e an tioxidan t [28] B. Ou, M. Ham psch -Woodill, R.L. Prior, Developm en t an d validation of an im -
properties of serum album in , FASEB J. 13 ( 1999) 233–244. proved oxygen radical absorban ce capacity assay usin g fluorescein as th e fluores-
[9] P. Ron deau, E. Bourdon , Th e glycation of album in : structural an d fun ction al cen t probe, J. Agric. Food Ch em . 49 ( 2001) 4619–4626.
im pacts, Bioch im ie 93 ( 2011) 645–658. [29] D. Huan g, B. Ou, M. Ham psch -Woodill, J.A. Flan agan , R.L. Prior, High -th rough put
[10] S. Horiuch i, Y. Sakam oto, M. Sakai, Scaven ger receptors for oxidized an d glycated assay of oxygen radical absorban ce capacity ( ORAC) usin g a m ultich an n el liquid
protein s, Am in o Acids 25 ( 2003) 283–292. h an dlin g system coupled w ith a m icroplate fluorescen ce reader in 96-w ell for-
[11] N. Sh an m ugam , Y.S. Kim , L. Lan tin g, R. Natarajan , Regulation of cyclooxygen ase-2 m at, J. Agric. Food Ch em . 50 ( 2002) 4437–4444.
expression in m on ocytes by ligation of th e receptor for advan ced glycation en d [30] T. Mosm ann , Rapid colorim etric assay for cellular grow th an d survival: application
products, J. Biol. Ch em . 278 ( 2003) 34834–34844. to proliferation and cytotoxicity assays, J. Im m unol. Methods 65 ( 1983) 55–63.
[12] H. Vlassara, Th e AGE-receptor in th e path ogen esis of diabetic com plication s, [31] K.P. Karalis, P. Gian n ogon as, E. Kodela, Y. Koutm an i, M. Zoum akis, T. Teli, Mech a-
Diabetes Metab. Res. Rev. 17 ( 2001) 436–443. n ism s of obesity an d related path ology: lin kin g im m un e respon ses to m etabolic
[13] S.F. Yan , R. Ram asam y, Y. Naka, A.M. Sch m idt, Glycation , inflam m ation , an d RAGE: stress, FEBS J. 276 ( 2009) 5747–5754.
a scaffold for th e m acrovascular com plication s of diabetes an d beyon d, Circ. Res. [32] E. Tarn us, H. Wassef, J.F. Carm el, P. Ron deau, M. Roch e, J. Davign on , L. Bern ier, E.
93 ( 2003) 1159–1169. Bourdon , Apolipoprotein E lim its oxidative stress-in duced cell dysfun ction s in
[14] P. Ron deau, N. Sin gh , H. Caillen s, E. Bourdon , Oxidative stresses in duced by h um an adipocytes, FEBS Lett. 583 ( 2009) 2042–2048.
glycated h um an or bovin e serum album in s on h um an m on ocytes, Free Radic. [33] P. Ron deau, S. Arm en ta, H. Caillen s, S. Ch esn e, E. Bourdon , Assessm en t of tem per-
Biol. Med. 45 ( 2008) 799–812. ature effects on beta-aggregat ion of n ative an d glycated album in by FTIR spec-
[15] R.N. Joh n son , P.A. Metcalf, J.R. Baker, Fructosam in e: a n ew approach to th e esti- troscopy an d PAGE: relation s betw een structural ch an ges an d an tioxidan t
m ation of serum glycosylprotein . An in dex of diabetic con trol, Clin . Ch im . Acta properties, Arch . Bioch em . Bioph ys. 460 ( 2007) 141–150.
127 ( 1983) 87–95. [34] P. Faure, L. Tron cy, M. Lecom te, N. Wiern sperger, M. Lagarde, D. Ruggiero, S.
[16] A. Guerin -Dubourg, A. Catan , E. Bourdon , P. Ron deau, Structural m odification s of Halim i, Album in an tioxidan t capacity is m odified by m eth ylglyoxal, Diabetes
h um an album in in diabetic con text, Diabetes Metab. 38 ( 2012) 171–178. Metab. 31 ( 2005) 169–177.
[17] S.L. Sn yder, P.Z. Sobocin ski, An im proved 2,4,6-trin itroben zen esulfon ic acid [35] S. Carballal, B. Alvarez, L. Turell, H. Botti, B.A. Freem an , R. Radi, Sulfen ic acid in
m eth od for th e determ in ation of am in es, An al. Bioch em . 64 ( 1975) 284–288. h um an serum album in , Am in o Acids 32 ( 2007) 543–551.
[18] P. Ron deau, G. Navarra, F. Cacciabaudo, M. Leon e, E. Bourdon , V. Militello, Th erm al [36] M.D. del Castillo, J.M. Am es, M.H. Gordon , Effect of roastin g on th e an tioxidan t ac-
aggregation of glycated bovin e serum album in , Bioch im . Bioph ys. Acta Protein tivity of coffee brew s, J. Agric. Food Ch em . 50 ( 2002) 3698–3703.
Proteom ics 1804 ( 2010) 789–798. [37] H.M. Woffen den , J.M. Am es, S. Ch an d ra, M. An ese, M.C. Nicoli, Effect of kiln in g on
[19] G.L. Ellm an , Tissue su lfh ydryl groups, Arch . Bioch em . Bioph ys. 82 ( 1959) 70–77. th e an tioxidan t an d pro-oxidan t activities of pale m alts, J. Agric. Food Ch em . 50
[20] S. Ch esn e, P. Ron deau, S. Arm en ta, E. Bourdon , Effects of oxidative m odification s ( 2002) 4925–4933.
in duced by th e glycation of bovin e serum album in on its structure an d on cul- [38] Q. Zh an g, J.M. Am es, R.D. Sm ith , J.W. Bayn es, T.O. Metz, A perspective on th e
tured adipose cells, Bioch im ie 10 ( 2006) 1467–1477. Maillard reaction an d th e an alysis of protein glycation by m ass spectrom etry:
[21] D. Ram ful, E. Tarnus, P. Ron deau, C. Robert Da Silva, T. Bah orun , E. Bourdon , Citrus probin g th e path ogen esis of ch ron ic disease, J. Proteom e Res. 8 ( 2009) 754–769.
fruit extracts reduce advan ced glycation end products (AGEs)- and H2 O2 -in duced [39] S.-S. Nah , I.-Y. Ch oi, B. Yoo, Y.G. Kim , H.-B. Moon , C.-K. Lee, Advan ced glycation
oxidative stress in h um an adipocytes, J. Agric. Food Chem . 58 ( 2010) 11119–11129. en d products in creases m atrix m etalloprotein ase-1, -3, an d -13, an d TNF-Î± in
[22] T. Ogin o, S. Okada, Oxidative dam age of bovin e serum album in an d oth er en zym e h um an osteoarth ritic ch on drocytes, FEBS Lett. 581 ( 2007) 1928–1932.
protein s by iron –ch elate com plexes, Bioch im . Bioph ys. Acta 1245 ( 1995) [40] Z. Rash eed, N. Akh tar, T.M. Haqqi, Advan ced glycation en d products in duce th e
359–365. expression of in terleukin -6 an d in terleukin -8 by receptor for advan ced glycation
[23] M. Brow n lee, H. Vlassara, A. Ceram i, Non en zym atic glycosylation an d th e path o- en d product-m ediated activation of m itogen -activated protein kin ases an d n ucle-
gen esis of diabetic com plication s, An n . In tern . Med. 101 ( 1984) 527–537. ar factor-kappaB in h um an osteoarth ritis ch on drocytes, Rh eum atology ( Oxford)
[24] V. Vetri, V. Militello, Th erm al in duced con form ation al ch an ges in volved in th e ag- 50 ( 2011) 838–851.
gregation path w ays of beta-lactoglobulin , Bioph ys. Ch em . 113 ( 2005) 83–91. [41] M.P. Coh en , E. Sh ea, S. Ch en , C.W. Sh earm an , Glycated album in in creases oxida-
[25] V. Militello, V. Vetri, M. Leone, Con form ation al changes involved in therm al aggregative stress, activates NF-kappa B an d extracellular sign al-regulated kin ase
tion processes of bovine serum album in, Bioph ys. Chem . 105 ( 2003) 133–141. ( ERK) , an d stim ulates ERK-dep en den t tran sform in g grow th factor-beta 1 produc-
[26] M. Prost, Process for the Determ ination by Means of Free Radicals of the Antioxidant tion in m acroph age RAW cells, J. Lab. Clin . Med. 141 ( 2003) 242–249.
Prop erties of a Livin g Organ ism or a Poten t ially Aggressive Agen t s, U.S. Pat en t [42] A. Stolzin g, R. Widm er, T. Jun g, P. Voss, T. Grun e, Degradation of glycated bovin e
5,135,850, 1992. ( USA) . serum album in in m icroglial cells, Free Radic. Biol. Med. 40 ( 2006) 1017–1027.
[27] F. Girodon , D. Blach e, A.L. Mon get, M. Lom bart, P. Brun et-Lecom pte, J. Arn aud, M.J. [43] P.J. Thorn alley, S. Battah , N. Ahm ed, N. Karachalias, S. Agalou, R. Babaei-Jadidi, A.
Rich ard, P. Galan , Effect of a tw o-year supplem en tation w ith low doses of an tiox- Daw n ay, Quantitative screen in g of advan ced glycation endproducts in cellular an d
idan t vitam in s an d/or m in erals in elderly subjects on levels of n utrien ts an d an ti- extracellular proteins by tandem m ass spectrom etry, Bioch em . J. 375 ( 2003)
oxidan t defen se param eters, J. Am . Coll. Nutr. 16 ( 1997) 357–365. 581–592.
SUPPLEMENTARY DATA
Compounds Non diabetic Diabetic

(ND) (D)
N (females) 14 (7) 39 (16)
Age 33 ± 9 51.5 ± 20.1**
HbA1c (%) 5.5 ± 0.4 11.0 ± 1.9***
Fructosamines (ng/mL) 218.3 ± 10.9 390.0 ± 131.5***
Creatinin (µmol/L) 89.8 ± 12.3 88.0 ± 16.2
Albumin (g/L) 46.4 ± 2.6 38.8 ± 5.5***
Total protein (g/L) 73.8 ± 4.0 67.7 ± 7.7**
CRP (mg/L) 2.6 ± 2.5 7.0 ± 8.0*
Cholesterol (mmol/L) 4.6 ± 0.7 4.5 ± 1.3
Triglycerides (g/L) 0.9 ± 0.4 1.6 ± 1.0***
Table S1: Clinical and biochemical characteristics of diabetic and non-diabetic patients
and plasma samples.

Figure S1: Characterization of purified (HSA-ND and HSA-D) modified albumin by native
PAGE electrophoresis (12%)
Relative Electrophoretic Migration (REM) of modified human albumin after glycoxidation were
analyzed by native Polyacrylamide Gel (12 % of acrylamide) and stained by Coomassie blue
according to Laemmli’s method [6].

Figure S2: Mass spectroscopy analysis of native, in vitro and in vivo glycoxidized HSA.
Mass spectra was obtained by electrospray ionisation mass spectrometry (ESI/MS) and a
deconvolution was performed in order to obtain molecular mass of albumin species (m/z). a)
HSA-NDG0; b) HSA-NDG25; c) HSA-NDMGO; HSA-D.
126

2.3. Discussion
Au cours de cet t e ét ude port ant sur des lignées RAW ‐blue de macrophages de souris et sur
des lignées SW872 de liposarcome humain (adipocyt es), nous avons pu met t re en évidence
plusieurs effet s d’int érêt de l’albumine modifiée in vivo provenant de pat ient s diabét ique de
t ype 2.

Premièrement la pert e de la capacit é ant ioxydant e de l’albumine au cours du diabèt e
mont rée précédemment à part ir d’un t est d’hémolyse induit e de globules rouges a pu
98
également êt re mise en évidence à part ir de t est de viabilit é sur des macrophages en
présence d’une source de ROS. Ces observat ions confirment bien que les modificat ions
glycoxydat ives de l’albumine au cours du diabèt e ont un impact sur sa st ruct ure et sur ses
propriét és fonct ionnelles, se t raduisant par des effet s indirect s sur des cult ures cellulaires en
présence d’un st ress oxydant .

Ce qui est int éressant dans cet t e ét ude, est que nous avons pu mont rer des effet s direct s de
l’albumine modifiée au cours du diabèt e sur des macrophages et des adipocyt es. En effet , en
présence d’albumine purifiée de pat ient s diabét iques nous avons pu mont rer sur ces cellules
à la fois :
 Une augment at ion de la concent rat ion int racellulaire de ROS

 Une act ivat ion du NF‐B, fact eur de t ranscript ion pro ‐inflammat oire
 Une baisse de l’act ivat ion du NF‐B en présence de LPS sur les macrophages
 Une augment at ion de sécrét ion d’IL‐6 en présence de LPS sur les adipocyt es
 Une act ivat ion de la synt hèse (mRNA) et une augment at ion de l’expression du
récept eur RAGE à la surface des adipocyt es

Ces propriét és prooxydant es et inflammat oires de l’albumine ext rait e de pat ient s
diabét iques sur les adipocyt es et les macrophages nous mont rent bien que cert aines formes
modifiées de l’albumine au cours du diabèt e présent ent un effet direct sur ces cellules et
qu’elles peuvent donc êt re direct ement impliquées dans les processus physiopat hologiques
pouvant mener à l’at hérosclérose et aux complicat ions vasculaires du diabèt e.
127
Il est à not er que ces observat ions se dist inguent de celles obt enues à part ir d’albumine
purifiée de pat ient s non diabét iques mais aussi de formes glyquées in vit ro simulant les
condit ions physiopat hologiques du diabèt e (glucose 25 mM ).

Nous confirmons là encore que les mécanismes de glycat ion et d’oxydat ion de l’albumine in
vivo au cours du diabèt e sont nombreux et complexe et qu’il est donc plus pert inent de
t ravailler à part ir de modèles d’albumine ext rait es et purifiées de pat ient diabét ique pour en
mesurer les modificat ions st ruct urales et fonct ionnelles.
2.4. Conclusion
Au cours du diabèt e, les formes modifiées d’albumine par des mécanismes glycoxydat ifs
présent ent de nombreux effet s délét ères : pert es de capacit é ant ioxydant e et ant i ‐
inflammat oire, effet s int racellulaire prooxydant et pro ‐inflammat oire, act ivat ion de
l’expression du récept eur RAGE.

Ces effet s observés sur des macrophages mont rent que ces formes modifiées ont un rôle
probable dans les mécanismes menant à l’at hérosclérose et aux complicat ions
cardiovasculaires du diabèt e. La recherche d’effet s similaires sur des modèles cellules
endot héliales présent erait un int érêt indéniable. Nous pourrions ainsi évaluer si ces formes
modifiées d’albumine circulant e sont impliquées dans les mécanismes menant à la
dysfonct ion endot héliale et relier ainsi les mécanismes glycoxydat ifs aux complicat ions du
diabèt e. De t elles ét udes sont act uellement en cours au laborat oire GEICO à part ir d’un
modèle de barrière hémat o ‐encéphalique (BHE).

Compt e t enu de leur implicat ion dans les mécanismes physiopat hologique menant à
l’at hérosclérose, les formes modifiées d’albumine peuvent donc const it uer des
biomarqueurs d’int érêt , venant en complément des fact eurs de risque habit uellement suivis,
dans le dépist age ou l’évaluat ion des at t eint es vasculaires au cours du diabèt e. En effet , ces
formes modifiées d’albumine, incluant cert ainement des formes AGEs, sont le reflet à la fois
de la glycat ion mais aussi du fort st ress oxydant circulant ret rouvés au cours du diabèt e de
t ype 2 et pourraient donc se dist inguer de biomarqueurs usuels de glycat ion t el que l’HBA1c.
128
Nous avons donc cherché, dans une dernière part ie de ce t ravail à évaluer l’int érêt des
formes modifiées de l’albumine en t ant que biomarqueur pot ent iel des at t eint es vasculaires
du diabèt e, à t ravers une ét ude clinique descript ive sur des sujet s diabét iques de t ype 2
fort ement déséquilibrés (HbA1c > 7,5%).
129
130

3. ETUDE PILOTE D’ASSOCIATION DES FORMES MODIFIEES DE

L’ALBUMINE (AGES, GA ET IMA) AUX ATTEINTES VASCULAIRES
DES PATIENTS DIABETIQUES : ERMIES-ALBOX
3.1. Etat actuel des connaissances
3.1.1. Les complications vasculaires du diabète de type 2

Le diabèt e de t ype 2 est une maladie mét abolique chronique en pleine expansion liée à l’âge
et à l’évolut ion des modes de vie : sédent arit é et apport s énergét iques inadapt és. La
prévalence du diabèt e de t ype 2 t rait é est part iculièrement fort e à La Réunion puisqu’elle
105,7
t ouche près de 20% de la populat ion de plus de 30 ans .
106
(at hérosclérose, syndromes coronariens, AVC,…). En effet , le risque d’at t eint e vasculaire est
fort ement augment é et les complicat ions cardiovasculaires associées (AVC, IM ) sont
responsables de 80% des décès des personnes diabét iques.
3.1.2. Prévention des complications vasculaires du diabète

Le suivi médical et la prise en charge du diabét ique de t ype 2 se focalisent essent iellement
sur un bon cont rôle de la glycémie vérifié au moyen de marqueurs usuels de glycat ion, ainsi
que sur la prise en charge des fact eurs de risque habit uellement associés : surpoids,
dyslipidémie, HTA, t abagisme. L’hyperglycémie chronique, t raduit e par une élévat ion
significat ive de l’HbA1c supérieure ou égale à 7,5% est couramment ut ilisée comme
marqueur prédict if des at t eint es vasculaires des pat ient s diabét iques, cependant près de
25% des pat ient s présent ant une at t eint e vasculaire ne sont ident ifiés par ce marqueur en
1,107
associat ion ou non aux fact eurs de risques convent ionnels suscit és .
131
Il exist e donc aujourd’hui un réel besoin d’ident ifier d’aut res marqueurs précoces associés à
un risque accru de l’at t eint e vasculaire dans le diabèt e. L’ut ilisat ion de marqueurs
direct ement impliqués dans les mécanismes physiopat hologiques des at t eint es vasculaires
dans le diabèt e qui pourraient par la suit e const it uer des cibles pharmacologiques d’int érêt
1 ,108
est à privilégier .
3.1.3. Glycation des protéines et stress oxydatif dans le diabète

Au cours du diabèt e de t ype 2, l’hyperglycémie chronique amène à la format ion de produit s
de glycat ion t els l’hémoglobine glyquée ou les fruct osamines par la réact ion de M aillard
63
dans un premier t emps . Il est également const at é une augment at ion du st ress oxydat if
dans la pat hologie diabét ique. Ce st ress oxydat if t ransforme ces produit s de glycat ion en
produit s avancés de glycat ion (AGEs) dans un second t emps par réarrangement s oxydat ifs
irréversibles. On parle communément de phénomène glycoxydat ion . Il a ét é mont ré in

77
vit ro que les phénomènes de glycat ion et d'oxydat ion sont à l'origine de modificat ions
st ruct urales et fonct ionnelles des prot éines dans le diabèt e et plus part iculièrement de
98,99
l'albumine qui est la prot éine circulant e la plus abondant e du plasma . Les différent es
formes d'albumine glyquée – Glycat ed Albumin (GA) ‐ ou oxydée – Ischemia M odified

69,71
Albumin (IM A) – sont reconnues aujourd'hui comme des biomarqueurs respect ivement
109,110
de niveau de glycat ion et de l'équilibre glycémique (GA) et du niveau de st ress oxydat if
111,112
du plasma dans le diabèt e .

Le st ress oxydat if et les AGEs associés ont mont ré in vit ro et in vivo une act ivit é pro ‐
inflammat oire sur les macrophages et sur les cellules endot héliales, par act ivat ion de
113
récept eurs spécifiques aux AGEs : RAGE . En plus, ils ent rainent une inhibit ion de
l’angiogénèse et des modificat ions épigénét iques « pro ‐inflammat oires » à long‐t erme, qui
persist ent à la normalisat ion de la glycémie.

On considère donc aujourd’hui que le phénomène de glycoxydat ion (glycat ion et
réarrangement oxydat ifs irréversibles) conjoint ement au st ress oxydat if (hyperproduct ion de
ROS) occupe une place cent rale dans les mécanismes physiopat hologiques des at t eint es
vasculaires rencont rées not amment dans le diabèt e de t ype 2.
132
Une augment at ion significat ive de l’IM A ét ait observée chez les pat ient s diabét iques de t ype
114
2 et plus récemment une ét ude a pu mont rer une augment at ion significat ive de l’IM A
chez les pat ient s diabét iques de t ype 2 déséquilibrés (HbA1C >7,5%) souffrant
115
d’art ériopat hie oblit érant e des membres inférieurs (AOM I) . M ais si une augment at ion
significat ive de l’IM A a pu êt re mont rée au cours d’at t eint es vasculaires profondes et
irréversibles comme l’AOM I, il n’en est pas de même pour les aut res complicat ions micro ‐ et
macrovasculaires du diabèt e pour un même niveau de déséquilibre glycémique. Il apparaît
nécessaire d’évaluer l’int érêt du dosage de l’IM A dans le cadre d’at t eint es vasculaires
prévalent es micro et macroangiopat hique au sein d’une populat ion de pat ient s diabét iques
présent ant un déséquilibre glycémique avéré.

Une augment at ion des concent rat ions plasmat iques de marqueurs de glycoxydat ion et du
st ress oxydat if pourrait êt re associée à une augment at ion du risque d’at t eint e
116 102
vasculaire , et les marqueurs associés à la glycoxydat ion (AGEs) et au st ress oxydat if
(IM A) pourraient représent er des biomarqueurs pot ent iels pour la prédict ion du risque
55,86,117
d’at t eint e vasculaire .
3.2. Objectifs de la recherche

L’object if principal de ce projet de recherche est d’ét udier l’associat ion ent re un
biomarqueur plasmat ique du st ress oxydat if, à savoir l’IM A (Ischemia M odified Albumin) et
t out es formes d’at t eint es vasculaires du diabèt e (microangiopat hie, macroangiopat hie)
versus aucune at t eint e, dans une populat ion de pat ient s ayant un diabèt e de t ype 2 mal
cont rôlé (HbA1c 7,5%).

Les object ifs secondaires sont les suivant s :

- Et udier l’expression de l’IM A (concent rat ion plasmat ique moyenne) en fonct ion du
niveau d’at t eint es vasculaires (Crit ère composit e à 4 cat égories) :
o Pat ient s sans aucune at t eint e vasculaire (groupe t émoin)
133
o Pat ient s avec microangipat hie diabét ique seule (rét inopat hie et / ou,
néphropat hie et / ou, neuropat hie et / ou, lésions du pied diabét ique)
o Pat ient s avec macroangiopat hie diabét ique seule (Syndrome coronarien aigu
SCA et / ou, Angor St able et / ou, Infarct us du myocarde IM et / ou, Angioplast ie
Coronaires et / ou, AOM I et / ou, Accident s vasculaires cérébraux AVC)
o Pat ient s avec macroangiopat hie diabét ique et microangiopat hie diabét ique
(at t eint es vasculaires combinées).

- Comparer la valeur discriminant e de l’IM A à celle des biomarqueurs usuels de
glycat ion (HbA1c, fruct osamine), pour l’ident ificat ion des at t eint es vasculaires
prévalent es du diabèt e.

- Et udier l’associat ion ent re le dosage plasmat ique des produit s avancés de glycat ion
et les at t eint es vasculaires du diabèt e.

- Et udier l’associat ion ent re le dosage plasmat ique de l’albumine glyquée (GA) et les
at t eint es vasculaires du diabèt e.

- Est imer les corrélat ions ent re les concent rat ions plasmat iques des AGEs (marqueur
de glycoxydat ion), des marqueurs de glycat ion (HbA1c, fruct osamines, GA) et le
dosage de l’IM A (marqueur du st ress oxydat if).
3.3. Aspects Méthodologiques
3.3.1. Schéma de la recherche

Il s’agit d’une ét ude t ransversale d’associat ion, ancillaire de la cohort e expériment ale
ERM IES, réalisée à part ir des données à l’ent rée dans la cohort e (sérot hèque / recueil) pour
les pat ient s inclus à la dat e du 10/ 04/ 2014.
Le prot ocole de recherche biomédicale ERM IES est un essai randomisé mult icent rique
d’int ervent ion éducat ive st ruct urée ambulat oire dans le diabèt e de t ype 2 insuffisamment
cont rôlé à La Réunion. Ce prot ocole a fait l’objet d’un financement DGOS‐PHRC int er ‐
134
régional (campagne 2010). Cet t e ét ude et la collect ion biologique associée font l’object ion
d’un référencement :

 Numéro ID_RCB : 2011‐A00046‐35
 Numéro d’enregist rement dans Clinicalt rials.gov : NCT01425866
L’analyse st at ist ique à visée explorat oire a port é sur des caract érist iques cliniques recueillies
en pré‐inclusion ou en inclusion (évènement s vasculaires prévalent s), ainsi que sur les
mesures biologiques prat iquées en inclusion d’ERM IES (HbA1c%, fruct osamine, bilan
lipidique) ou issues de la sérot hèque ERM IES au même moment (biomarqueurs).

A ce jour, l’ét at d’avancement de la recherche ERM IES ne permet pas d’exploit er les
données du suivi diabét ologique t rimest riel (sur 2 ans) et ainsi d’approcher le caract ère
pronost ique des biomarqueurs d’int érêt . La t aille de l’ét ude correspond à l’ensemble des
pat ient s inclus dans ERM IES à la dat e du 10/ 04/ 2014.

Les dosages de biomarqueurs issus de la sérot hèque ERM IES ont ét é effect ués à part ir d’un
aliquot de sérum dest iné au laborat oire de Biochimie du CHU La Réunion – Félix Guyon
(part enaire scient ifique de l’ét ude ERM IES) à des fins de recherche conformément au
prot ocole de l’ét ude ERM IES : amendement n°2 version 2.2 du 03 Aout 2012.
3.3.2. Critères d ‘éligibilité
3.3.2.1. Crit ères d’inclusion (ERM IES) :
 Diabèt e de t ype 2, défini suivant les crit ères de l’OM S
 HbA1c 7,5% depuis 3 mois ou plus
 Pat ient s âgés de plus de 18 ans
 Trait és par ADO et / ou analogues de la GLP‐1 et / ou insulinot hérapie depuis au moins
1 an
 Schéma t hérapeut ique st able depuis au moins 3 mois
 Résidant à La Réunion
135
 Affilié à un régime de sécurit é sociale
 Ayant signé un consent ement de part icipat ion de l’ét ude
 Période d’inclusion : oct obre 2011 – avril 2014

3.3.2.2. Crit ères de non inclusion (ERM IES) :
 Trait ement en cours ou programmé suscept ible d’influer sur le cont rôle glycémique
 Hospit alisat ion en cours ou récent e (<3 mois) en lien avec le diabèt e
 Complicat ion évolut ive sévère : rét inopat hie ischémique ou proliférat ive, insuffisance
rénale chronique, insuffisance coronarienne évolut ive, lésion du pied diabét ique
 Grossesse en cours
 Cancer évolut if
 Part icipat ion concomit ant e à un essai t hérapeut ique
3.3.3. Critères d’évaluations

3.3.3.1. Exposit ion principale :
Dosage de l’albumine modifiée par l’ischémie (IM A : mét hode colorimét rique – Albumin

103,69
Cobalt Binding Test )
L’IM A est un marqueur du st ress oxydat if qui n’est pas spécifique d’un organe ou d’une
localisat ion part iculière. Un regroupement de complicat ions est donc envisageable pour
améliorer la puissance st at ist ique des analyses de données.

3.3.3.2. Exposit ions secondaires :
 Dosage des AGEs plasmat iques (mét hode ELISA)
 Dosage de l’albumine glyquée GA (mét hode ELISA)
 Dosage de l’albumine plasmat ique (mét hode colorimét rique)
 Dosage de l’HbA1c et de la fruct osamine
 Tout e at t eint e vasculaire (t erminée ou en cours) relevée spécifiquement à l’inclusion
d’ERM IES :
o M icroangiopat hies :
 Lésion du pied diabét ique (t erminées < à 1an)
136
 Néphropat hie diabét ique t ous st ades d’évolut ion (en cours
uniquement )
 Rét inopat hie diabét ique t ous st ades d’évolut ion
 Neuropat hie diabét ique hors AOM I (en cours uniquement )
o M acroangiopat hies (en cours ou t erminées il y a moins d’une année) :

 Accident coronarien aigu
 Angor
 Coronaropat hie ischémique silencieuse
 Pont age coronarien
 Angioplast ie coronaire
 Accident ischémique cérébral
 AOM I
3.3.4. M éthodes analytiques

3.3.4.1. Dosage de l’HbA1c et fruct osamines

Le dosage de l’hémoglobine glyquée HbA1c est effect ué à part ir d’un échant illon de sang
t ot al prélevé sur t ube EDTA (BD Vacut ainer). La mét hode de dosage ut ilisée est
l’élect rophorèse capillaire sur aut omat e Capillarys Flex du laborat oire Sebia validée sur sit e
au laborat oire de Biochimie du CHU La Réunion – Hôpit al Félix Guyon. Les échant illons ont
t ous ét é analysés dans les 48 heures suivant le prélèvement et conservés 4°C en at t ent e
d’analyse.

3.3.4.2. Analyses biochimiques

Les dosages des prot éines plasmat iques t ot ales, de l’albuminémie, de la CRP, du Cholest érol
Tot al, de la t riglycéridémie, de l’HDL‐Cholest érol, du LDL‐Cholest érol, de l’ApoA1, de l’ApoB
et des fruct osamines ont ét é réalisés à part ir de plasma prélevé sur t ube EDTA (BD
Vacut ainer). Ces analyses ont ét é réalisées dans les 6 heures suivant le prélèvement sanguin,
échant illons conservés à t empérat ure ambiant e ent re le prélèvement et l’analyse.
137

Le dosage de la glycémie à jeun a ét é réalisé à part ir de plasma prélevé sur t ube Fluorure
Oxalat e (BD Vacut ainer), analyse réalisée dans les 6 heures suivant le prélèvement sanguin,
échant illons conservés à t empérat ure ambiant e ent re le prélèvement et l’analyse.

Le dosage de la microalbuminurie a ét é réalisé à part ir d’échant illons urinaires prélevés par
mict ion sur flacon st érile. Les urines sont conservées à t empérat ure ambiant e jusqu’à
analyse biochimique dans les 6 heures suivant le prélèvement .

Tout es les analyses biochimiques décrit es ci ‐dessus ont ét é effect uées à part ir de coffret s
réact ifs Cobas Roche par mét hode colorimét rique sur un aut omat e Cobas C501 du
laborat oire RocheDiagnost ic au laborat oire de Biochimie du CHU La Réunion – Hôpit al Félix
Guyon.

3.3.4.3. Dosage de l’IM A

Le dosage de l’IM A a ét é adapt é pour le dosage en plaque 96 puit s à part ir de la mét hode de
69
référence décrit e précédemment par Bar ‐Or et al. Not re object if a ét é d’améliorer la
reproduct ibilit é de cet t e mét hode par l’ut ilisat ion de pipet t es mult icanaux ét alonnées et la
réalisat ion simult anée de l’ensemble des dosages t out en limit ant la prise d’essai échant illon
(50μl pour un t est en t riplicat a cont re 200μl pour un seul essai en mét hode de référence) et
le volume d’essai final (200μl cont re 1,5ml en mét hode de référence). Ces dosages ont ét é
réalisés à part ir de plasmas de pat ient s prélevés sur t ube de sang EDTA décant és après
cent rifugat ion 10 min à 2000g et conservés à ‐80°C avant analyse.

Chaque échant illon a ét é dilué au ¼ dans du t ampon PBS 1X (50μl de prise d’essai dans un
2+
volume final de 200μl). Un volume de 20μl d’échant illon est mélangé avec un excès de Co
2+
15μl d’une solut ion de Co à 0,1% préparée à part ir de chlorure de cobalt anhydre (Acros
Organics). Un volume de 125μl de t ampon PBS 1X est ajout é, puis le mélange est placé 15
min à 37°C sous agit at ion lent e. A la fin de la première agit at ion, une première lect ure
opt ique est effect uée à 470nm (Fluost ar Opt ima, BM G LabTech) DO pour évaluer le bruit de
fond avant réact ion colorimét rique. Après incubat ion, un volume de 20μl de DTT (DL‐
138
Dit hiot reilt ol, Sigma ref : D0632) à 1,5mg/ ml est ajout é. La réact ion colorimét rique formée
2+
par le complexe DTT‐Co est st oppée après 2 min par ajout de 20 μl de NaCl à 0,9M . Une
lect ure opt ique D1 à 470nm est réalisée immédiat ement après l’arrêt de la réact ion.

La valeur de l’IM A est exprimée en densit é opt ique ΔD = D1‐D0. Elle représent e la quant it é
2+
de Co résiduel non lié à l’albumine. Chaque échant illon a ét é t est é en t riplicat a à part ir de
la dilut ion init iale. Les valeurs moyennes ont fait l’objet de l’analyse.

La valeur de l’IM A est direct ement proport ionnelle à la quant it é d’albumine modifiée par
mécanismes oxydat ifs et inversement proport ionnelle à la concent rat ion plasmat ique en
albumine, c’est pourquoi nous avons rapport é la valeur de l’IM A à celle de l’albumine dans
cet t e ét ude à part ir de la formule suivant e :

IM A/ ALB (G/ L) = ΔD / (1/ (Alb (G/ L)) = ΔD x (Alb) (G/ L)

3.3.4.4. Dosage de l’albumine glyquée (GA) et AGEs

Les dosages de GA et d’AGEs ont ét é réalisés par mét hode ELISA à part ir de plasma de sang
prélevé sur t ube EDTA conservés à ‐80°C. Les coffret s réact ifs ut ilisés sont : Human AGEs
Elisa kit et Human GA Elisa kit (Sunred Bio). Les lect ures opt iques des réact ions
colorimét riques ont ét é effect uées sur spect rofluorimèt re Fluost ar Opt ima (BGM LabTech).
3.3.5. Analyse statistique des données

L’analyse st at ist ique des données a ét é réalisée au CIC de la Réunion, à l’aide des logiciels
SAS v9.2 ® et St at a v10.0. ®

La t aille d’ét ude at t endue (N 75 pat ient s) ne repose sur aucune hypot hèse et calcul de
nombre de sujet s nécessaire, mais sur la disponibilit é des données recueillies et saisies à la
dat e de point , à l’ét ape de l’inclusion dans l’essai ERM IES. Ainsi, les analyses st at ist iques ont
réalisées selon une démarche explorat oire à la recherche d’associat ions privilégiées ent re
139
biomarqueur IM A et événement s cliniques prévalent s d’int érêt (object if principal), ce qui
permet t ra d’argument er la réalisat ion d’un prot ocole de recherche ad hoc (suivi de cohort e)
pour l’ét ude de la valeur pronost ique de ce biomarqueur.

La populat ion des pat ient s diabét iques sélect ionnés pour cet t e ét ude est décrit e
(dénombrement , pourcent age, moyenne, écart ‐t ype, médiane et aut res percent iles) : niveau
de glycat ion, niveau des biomarqueurs de glycoxydat ion et du st ress oxydat if (ét ude de
dist ribut ion), anciennet é‐durée du diabèt e et complicat ions micro et mascrovasculaires
(t erminées ou en cours).

Les analyses comparat ives (au seuil de risque α = 5 %) ent re groupes de complicat ions font
appel aux t est s non paramét riques sur séries indépendant es : t est de Wilcoxon (2 groupes)
ou t est de Kruskal ‐Wallis (> 2 groupes). L’évaluat ion de la capacit é discriminant e globale des
biomarqueurs candidat s nécessit era un calcul d’aire sous la courbe ROC (AUC + IC95%), ainsi
que le recours à un t est non paramét rique de comparaison des AUC (module roccomp de
St at a v10.0). Enfin, l’ét ude de corrélat ion ent re biomarqueurs est dét erminée à l’aide du
coefficient de corrélat ion de Spearman.

Cet t e analyse st at ist ique est unique et réalisée sur des données de pré‐inclusion ou
d’inclusion d’un échant illon de pat ient s recrut és de façon consécut ive dans l’essai
d’int ervent ion ERM IES jusqu’à la dat e de point .
140

3.4. Résultats
3.4.1 Description générale de la population observée

L’ensemble des données clinico ‐biologiques de l’échant illon de pat ient s diabét iques de t ype
2 issus de l’ét ude ERM IES observés dans cet t e ét ude figure dans le t ableau n°1.

75 pat ient s d’âge moyen 59 ans ont ét é observés (53 femmes pour 22 hommes). La grande
majorit é des pat ient s présent e au minimum un surpoids (IM C = 30 +/ ‐ 6). En accord avec les
crit ères d’inclusion d’ERM IES, t ous les pat ient s présent ent un diabèt e de t ype 2 déséquilibré
avec une valeur d’HbA1c supérieure à 7,5% (9,1 +/ ‐ 1,1%). Ces valeurs sont , elles aussi, en
accord avec des t aux de fruct osamines et de glycémie à jeun élevés.

Concernant les at t eint es vasculaires relevées à l’inclusion, on compt e 31 pat ient s sans
complicat ion microangiopat hie et sans macroangiopat hie. 30 pat ient s présent ent au moins
une complicat ion microangiopat hique. 3 pat ient s présent ent une at t eint e
macroangiopat hique seule et 12 pat ient s ont à la fois une complicat ion microangiopat hique
et une complicat ion macroangiopat hique relevées à l’inclusion d’ERM IES. A not er que la
durée moyenne du diabèt e est t rès élevée (18 +/ ‐ 9 ans).

Afin d’avoir des groupes de pat ient s avec des effect ifs st at ist iquement significat ifs, nous
avons choisi de présent er l’ensemble des résult at s de cet t e ét ude en dist inguant 2 groupes
principaux. Un groupe t émoin de pat ient s sans complicat ion vasculaire relevée à l’inclusion
d’ERM IES (n = 31) et un groupe de pat ient s présent ant t ous t ypes de complicat ion
cardiovasculaire relevée à l’examen clinique d’inclusion d’ERM IES (n = 44).

L’ensemble des paramèt res biologiques ut ilisés présent ent une répart it ion selon une loi
normale hormis les dosages des AGEs et de GA. Les données relat ives à ces deux marqueurs
biochimiques ne sont donc pas présent ées sous forme de moyenne +/ ‐ écart ‐t ype.
141

Tableau 1 : ERM IES données générales d’inclusion (moyennes + / ‐ écart ‐t ype)
Fe mme (n) 53
Ho mme (n) 22
Ab se nc e d 'a tte inte va sc ula ire (n) 31
Mic ro a ng io p a thie se ule (n) 30
Ma c ro a ng io p a thie se ule (n) 3
Mic ro a ng io p a thie e t ma c ro a ng io p a thie (n) 11
IMC 30 +/- 6
Ag e (a ns) 59 +/- 11
Duré e d u d ia b è te (a ns) 18 +/- 9
Pro té ine s To ta le s (G / L) 71 +/- 5
Alb umine (G / L) 42 +/- 3
C RP (mG / L) 6 +/- 9
Fruc to sa mine s ( μmo l/ L) 339 +/- 61
Hb A1c (%) 9,1 +/- 1,1
G lyc é mie (mmo l/ L) 9,14 +/- 2,99
C ho le sté ro l To ta l (mmo l/ L) 4,14 +/- 1,04
HDL-c ho le sté ro l (mmo l/ L) 1,12 +/- 0,29
LDL-c ho le sté ro l (mmo l/ L) 2,50 +/- 0,90
Trig lyc é rid e s (mmo l/ L) 1,60 +/- 1,09
Ap o A (mmo l/ L) 1,30 +/- 0,22
Ap o B (mmo l/ L) 0,89 +/- 0,25
Pro té ine s urina ire s (G / L) 0,16 +/- 0,21
Mic ro a lb uminurie (mG / L) 74 +/- 173
IMA (DO ) 0,410 +/- 0,115
IMA/ ALB (G / L) 17,3 +/- 4,8
G A (mG / L) 4,39
AG E (nG / mL) 1146

Les données biologiques relat ives aux deux sous‐groupes formés à part ir des relevés
cliniques d’inclusion d’ERM IES sont présent ées dans le t ableau n°2.
142

Ent re les deux groupes de pat ient s avec ou sans at t eint e vasculaire aucune différence
significat ive d’expression des paramèt res biologiques ét udiés n’est relevée. Seuls le dosage
de l’IM A/ ALB présent e une discrèt e différence ent re les deux groupes de pat ient s sans
t out efois présent er de significat ivit é st at ist ique (p<0,2).

Not ons que les données relat ives aux AGEs et GA, ne répondant pas à une loi normale de
répart it ion ne peuvent êt re présent ées dans ce t ableau ni comparées aux aut res paramèt res
biologiques selon le t est t de St udent .

Tableau 2 : données biologiques (moyenne+/ ‐écart ‐t ype) présent ées par sous‐groupes
d’at t eint es vasculaires relevées à l’inclusion d’ERM IES (absence d’at t eint e vasculaire vs.
Complicat ion vasculaire comparaison). Les variables sont comparées selon le t est de
Wilcoxon (en gras, p < 0,15).

Ab se nc e d 'a tte inte Au mo ins une c o mp lic a tio n
va sc ula ire à l'inc lusio n va sc ula ire à l'inc lusio n
n = 31 n = 44
Mo ye nne +/ - é c a rt-typ e Mo ye nne +/ - é c a rt-typ e p va lue

Pro té ine s To ta le s (G / L) 71 +/ - 5 70 +/ - 4 0,3369
Alb umine (G / L) 42 +/ - 3 43 +/ - 3 0,1565
C RP (mG / L) 4 +/ - 5 7 +/ - 11 0,1602
Hb A1c (%) 9,0 +/ - 1,2 9,1 +/ - 1,1 1,0000
Fruc to sa mine s ( μmo l/ L) 339 +/ - 73 339 +/ - 53 0,7085
G lyc é mie (mmo l/ L) 9,0 +/ - 2,9 9,2 +/ - 3,1 0,7548
C ho le sté ro l To ta l (mmo l/ L) 4,17 +/ - 0,84 4,11 +/ - 1,17 0,8071
HDL-c ho le sté ro l (mmo l/ L) 1,13 +/ - 0,30 1,12 +/ - 0,28 0,8823
LDL-c ho le sté ro l (mmo l/ L) 2,49 +/ - 0,79 2,52 +/ - 0,97 0,8870
Trig lyc é rid e s (mmo l/ L) 1,61 +/ - 1,34 1,60 +/ - 0,90 0,9690
Ap o A (mmo l/ L) 1,30 +/ - 0,22 1,30 +/ - 0,22 1,0000
Ap o B (mmo l/ L) 0,89 +/ - 0,21 0,88 +/ - 0,28 0,8665
Pro té ine s urina ire s (G / L) 0,14 +/ - 0,14 0,16 +/ - 0,25 0,6878
Mic ro a lb uminurie (mG / L) 61 +/ - 145 82 +/ - 191 0,6063
IMA (DO ) 0,391 +/ - 0,127 0,423 +/ - 0,105 0,2347
IMA/ Alb umine (G / L) 16,3 +/ - 5,1 18,0 +/ - 4,5 0,1296

143
3.4.2 Corrélations des marqueurs biochimiques

A l’analyse des corrélat ions ent re les différent s biomarqueurs de glycat ion, d’oxydat ion ou
de glycoxydat ion dosés au cours de cet t e ét ude clinique, 3 observat ions sont remarquables :

 L’IM A n’est corrélée à aucun biomarqueur de glycat ion (HbA1c, fruct osamine, GA) ni
à aucun biomarqueur de glycoxydat ion (AGEs). Seuls sont corrélés l’IM A (DO) et
l’IM A rapport ée à la concent rat ion plasmat ique d’albumine (r = 0,90398 ; p<0,001) .

 Aucune corrélat ion n’est ret rouvée ent re les dosages des AGEs ou de la GA et ceux
des biomarqueurs convent ionnels de glycat ion des prot éines (HbA1c et
fruct osamines)

 Le dosage des AGEs et de la GA sont fort ement corrélés (r =0,84227 ; p <0,001)

Tableau 3 : Coefficient s de corrélat ion de Spearman ent re biomarqueurs de glycat ion (HbA1c,
fruct osamines, GA), d’oxydat ion (IM A, IM A/ ALB) et de glycoxydat ion (AGEs). (* p <0,001)

IM A (DO) IM A/ ALB (G/ L) AGE (nG/ mL) GA (mG/ L)
IM A (DO) 1 0,90398* 0,08296 0,05351
IM A/ ALB (G/ L) 1 0,00077 0,03035
AGE (nG/ mL) 1 0,84227*
GA (mG/ L) 1
HbA1c (%) 0,02645 0,03545 0,04283 0,01544
Fruct osamines (mmol/ L) 0,07378 0,0995 0,01233 0,0529
Fruct osamines/ prot éines

0,08695 0,0913 0,03211 0,06719
(mmol/ G)

144
3.4.3 IM A et atteintes vasculaires
En comparant les niveaux d’expression des différent s biomarqueurs de glycat ion(HbA1c),
d’inflammat ion (CRP), d’oxydat ion (IM A/ ALB) et de dyslipidémie (LDL) ent re les pat ient s ne
présent ant aucune complicat ion vasculaire relevée à l’inclusion d’ERM IES et ceux présent ant
au moins une at t eint e vasculaire micro et / ou macroangiopat hique (figure n°17), aucune
différence significat ive n’est ret rouvée (t est de Wilcoxon, p <0,05).

Figure n°17 : Valeurs comparat ives de concent rat ions plasmat iques de biomarqueurs
(moyenne +/ ‐ écart ‐t ype) ent re les groupes sans complicat ion vasculaire vs. avec
complicat ion vasculaire.

Egalement , si l’on compare la capacit é discriminant e globale de l’IM A (DO) à celle de l’HBA1c
dans l’ident ificat ion des at t eint es vasculaires relevées à l’inclusion de l’ét ude au moyen de
courbes ROC (figure n°19), on ne const at e pas de différence significat ive ent re ces deux
biomarqueurs. Les valeurs d’aire sous la courbe respect ivement de 0,5766 et de 0,5459
pour l’HbA1c et l’IM A t émoignent d’une capacit é faiblement discriminant e de ces
biomarqueurs pour dist inguer des pat ient s avec ou sans complicat ion vasculaire relevée à
l’inclusion du prot ocole ERM IES.
145

Figure n°18 : Dist ribut ion des valeurs d’IM A (DO) et d’IM A/ Albumine ent re les groupes sans
complicat ion vasculaire et avec complicat ion vasculaire relevée à l’inclusion d’ERM IES.
Représent at ion en box‐plot (valeur minimale, 25 percent ile, valeur médiane, 75
ème ème
percent ile et valeur maximale).

On remarque malgré t out , bien que non significat ive, une t endance à l’augment at ion des
valeurs de l’IM A/ ALB chez les pat ient s présent ant une at t eint e vasculaire (figure n°17). Cet t e
t endance n’est pas ret rouvée pour les aut res paramèt res biochimiques dosés hormis pour la
CRP, marqueur de l’inflammat ion, mais dont la dispersion des valeurs rest e t rès import ant e
(écart ‐t ype supérieur à la valeur moyenne).

Si on observe la dist ribut ion des valeurs d’IM A et d’IM A/ ALB ent re les deux groupes avec ou
sans at t eint e vasculaire (figure n°18), on ret rouve cet t e t endance à l’augment at ion
conjuguée à une augment at ion de la dispersion des valeurs d’IM A chez les pat ient s avec
at t eint e vasculaire.
146

Figure n° 19 : Courbes ROC (Receiver Operat ing Charact erist ic) des paramèt res biologiques
IM A et de l’HbA1c rapport ées à l’ident ificat ion des at t eint es vasculaires relevées à l’inclusion
d’ERM IES. Données comparées d’aire sous la courbe.

3.4.4 GA, AGEs et atteintes vasculaires

La dist ribut ion des valeurs des AGEs et de GA ent re les différent s groupes avec ou sans
at t eint e vasculaire révélée à l’inclusion d’ERM IES sont présent és sur la figure n°20.

On ne const at e pas de différence significat ive de valeurs des AGEs ni de GA ent re ces
différent s groupes, la dist ribut ion des valeurs ent re chaque groupe ét ant ent ièrement
chevauchant e.

La dist ribut ion des valeurs des AGEs et de GA semble moins hét érogène dans le groupe de
pat ient s avec at t eint e vasculaire. Il est à not er que les dist ribut ions des valeurs de GA et des
AGEs, bien que ces paramèt res aient des ordres de grandeur différent s sont quasiment
superposables dans chaque groupe.
147

Figure n°20 : Dist ribut ion des valeurs des AGEs et de GA ent re les groupes sans complicat ion
vasculaire et avec complicat ion vasculaire relevée à l’inclusion d’ERM IES. Représent at ion en
box‐plot (valeur minimale, 25 percent ile, valeur médiane, 75 percent ile et valeur
ème ème
maximale).

3.5. Discussion, conclusions et perspectives

Au regard des résult at s présent és, nous pouvons premièrement const at er le caract ère
indépendant , relevé par l’absence de corrélat ion, des différent s biomarqueurs de glycat ion
(HbA1c et fruct osamines), du st ress oxydant (IM A) et de glycoxydat ion (AGEs) ét udiés au
cours de ces t ravaux. Ce premier résult at nous confort e sur le fait que ces marqueurs sont
issus de processus physiopat hologiques différent s et que le dosage de l’IM A et des AGEs
apport ent des informat ions complément aires et non redondant es aux dosages de l’HBA1c
ou des fruct osamines .

Nous observons au cont raire une t rès fort e corrélat ion ent re les valeurs des AGEs et de GA.
Ce résult at peut apparaît re surprenant ce d’aut ant plus que nous nous at t endions plus
vraisemblablement à un rapprochement des valeurs de GA à ceux d’HbA1c et des
fruct osamines. En effet , l’albumine glyquée (GA) est un produit de glycat ion non
148
enzymat ique (produit d’Amadori) au même t it re que l’hémoglobine glyquée (HbA1c) et les
fruct osamines (prot éines glyquées plasmat iques). Les AGEs et la GA sont ici dosés à part ir de
kit s commerciaux ELISA dont nous pouvons clairement remet t re en cause la mét hode et le
développement puisque les dét erminant s ant igéniques ut ilisés pour ce dosage
immunologique semblent clairement croisés sinon chevauchant . En l’absence de corrélat ion
avec les marqueurs de glycat ion ou du st ress oxydant et de précisions sur les dét erminant s
ant igéniques ut ilisés dans la concept ion de ces kit s réact ifs, il nous apparaît clairement
impossible de savoir ce que nous dosons précisément avec ces 2 mét hodes de dosage. Les
résult at s en sont donc inexploit ables et leur ut ilisat ion sera évit ée pour nos projet s de
recherche fut urs.

L’IM A, marqueur du st ress oxydant , ne présent e pas de variat ion significat ive d’expression
ent re les pat ient s avec at t eint e vasculaire et ceux sans at t eint e vasculaire ; seule une
t endance à une augment at ion des valeurs de l’IM A est ret rouvée ent re les 2 groupes que
nous avons const it ué au cours de cet t e ét ude. Des résult at s cont radict oires ont pu êt re
observés sur d’aut res publicat ions port ant sur des pat ient s diabét iques de t ype 2 souffrant
118
d’AOM I ou encore de pat ient s ayant présent é des AVC73. Dans ces ét udes, les pat ient s
diabét iques de t ype 2 souffrent de pat hologies cardiovasculaires (macroangiopat hie) sévères
récent es voir évolut ives au moment du dosage de l’IM A et d’aut res marqueurs de glycat ion
(HbA1c).

Dans le projet ERM IES, les pat ient s souffrant de complicat ions cardiovasculaires graves
récent es (IM , AVC, SCA inférieures à un an) ou évolut ives ont ét é exclus. Cet t e ét ude est
descript ive et nous permet d’observer les données des pat ient s inclus à un t emps donné.
Nous nous sit uons donc dans ce t ravail soit a priori soit a post eriori d’événement s
cardiovasculaires graves ce qui nous dist ingue des ét udes cit ées précédemment . Au regard
des résult at s observés, nous ne pouvons conclure sur l’exist ence d’une associat ion ent re des
valeurs élevées d’IM A et un niveau quelconque d’at t eint e vasculaire. Les résult at s observés
aujourd’hui et ceux des ét udes cit és ci ‐dessus nous poussent donc à envisager une ét ude
clinique prospect ive nous permet t ant d’évaluer les modificat ions d’expression sur plusieurs
années (5 à 10 ans) des marqueurs du st ress oxydant (IM A) et de la glycoxydat ion (AGEs)
chez des pat ient s diabét iques de t ype 2.
149

De plus, la populat ion observée au cours de cet t e ét ude réalisée à part ir des données
d’inclusion d’ERM IES est const it uée de pat ient s ayant un diabèt e de t ype 2 t rès ancien,
compliqué et déséquilibré (durée du diabèt e supérieure à 10ans et HbA1c supérieure à
7,5%) associé syst émat iquement à un syndrome mét abolique (IM C >25). Si l’on peut
dist inguer deux groupes d’at t eint es vasculaires à part ir des recueils cliniques réalisés à
l’inclusion de l’ét ude ERM IES, compt e t enu de la durée du diabèt e, il semble donc t rès
probable que la majeure part ie des pat ient s inclus aient pu présent er des événement s
vasculaires ant érieurs au début de ce prot ocole.

Afin d’évaluer le caract ère discriminant des différent s biomarqueurs de glycat ion, du st ress
oxydant et de glycoxydat ion dans l’ident ificat ion des at t eint es vasculaires init iales des
pat ient s diabét iques de t ype 2, voir d’évaluer un caract ère prédict if d’at t eint e vasculaire
chez les pat ient s diabét iques de t ype 2 à part ir de ces différent s biomarqueurs ; il semble
nécessaire d’élaborer un projet de recherche clinique permet t ant un recueil de données
clinico ‐biologiques prospect if de pat ient s diabét ique de t ype 2 nouvellement pris en charge
à l’aide d’out ils permet t ant de caract ériser le niveau d’at t eint e vasculaire de ce ces pat ient s.
119
L’épaisseur int ima‐media carot idienne (IM T) mesurée par echot racking ou encore
120
l’est imat ion de la rigidit é art érielle par mesure de la vit esse d’onde de pouls sont
considérés aujourd’hui comme des crit ères de jugement subst it ut ifs pert inent s du niveau
d’at t eint e vasculaire et sont donc prédict ifs du développement d’at hérosclérose et
d’évènement s cardiovasculaires. L’ut ilisat ion de t els marqueurs phénot ypiques permet t rait
d’évaluer précisément le niveau d’at t eint e vasculaire des pat ient s suivis facilit ant ainsi
l’évaluat ion de biomarqueurs circulant s d’oxydat ion et de glycoxydat ion en associat ion aux
biomarqueurs usuels de glycat ion et aux aut res fact eurs de risque cardiovasculaire
convent ionnels. La durée d’une t elle ét ude devra êt re suffisamment longue pour const at er
la survenue d’évènement s cardiovasculaires au cours du diabèt e de t ype 2 (5 à 10 ans).

Les valeurs de dosage de l’IM A ret rouvées dans cet t e ét ude port ant sur des pat ient s
diabét iques de t ype 2 déséquilibrés ne sont pas comparables à celles ret rouvées dans des
ét udes ant érieures port ant sur des populat ions de même t ype. En effet , la valeur moyenne
d’IM A (DO) ret rouvée ici est de 0,410 +/ ‐ 0,115 cont re 0,535 +/ ‐ 0,125 (n= 80) dans l’ét ude
150
de Kaeffer et al et de 0,536 +/ ‐ 0,250 (n=290) dans l’ét ude de Shao Gang et al 114 . Ces deux
115
ét udes port ent t out es deux sur des populat ions de pat ient s diabét iques de t ype 2 à
différent s niveaux d’HbA1c et différent s niveaux d’at t eint es vasculaires. Nous const at ons
donc à la lect ure de ces art icles que les valeurs d’IM A ret rouvées sont faiblement
reproduct ibles d’une ét ude à l’aut re. Une des causes pouvant expliquer cet t e faible
reproduct ibilit é est le manque de st andardisat ion de cet t e mét hode qui consist e en une
2+
mesure opt ique simple de la colorat ion résult ant de la réact ion ent re un excès de Co après
103
réact ion colorée avec du DTT . Les out ils ut ilisés (spect rophot omèt re) et la qualit é des
2+
solut ions mères de Co et de DTT (t ampon, qualit é et conservat ion des subst ances pures)
varient d’un laborat oire à l’aut re.

L’int érêt nouveau de l’IM A dans l’évaluat ion du st ress oxydant et du risque cardiovasculaire
72,731,18
suscit e aujourd’hui des ét udes de plus en plus nombreuses . La st andardisat ion de
cet t e mét hode de dosage aux moyens de solut ions réact ives commerciales st andardisées et
l’ut ilisat ion d’ét alons permet t rait d’améliorer l’analyse des différent s t ravaux port ant sur
l’IM A et d’en met t re plus facilement en évidence l’int érêt comme biomarqueur du risque
CVD.

En dehors du dosage de l’IM A, le développement de mét hodes analyt iques de séparat ion et
de dosage des différent es fract ions d’albumine modifiée au cours du diabèt e semble
nécessaire pour ident ifier quelles fract ions sont direct ement impliquées dans les
mécanismes physiopat hologiques des complicat ions cardiovasculaires du diabèt e. Dans cet
opt ique, l’ut ilisat ion de mét hodes élect rophorét iques comme l’élect rophorèse capillaire ou
encore de mét hodes chromat ographiques comme l’HPLC‐M SM S semble t out à fait indiquée.

151
152
CONCLUSION

Les complicat ions cardiovasculaires représent ent la principale cause de mort alit é du diabèt e
de t ype 2. Ces at t eint es vasculaires peuvent , même en l’absence d’expression clinique, êt re
d’apparit ion précoce et évoluer progressivement t out au long de cet t e maladie mét abolique
chronique du vieillissement . L’ensemble des pat hologies cardiovasculaires ret rouvées au
cours du diabèt e de t ype 2 t rouvent leur origine dans le dysfonct ionnement init ial des
cellules de l’endot hélium vasculaire.

Le dysfonct ionnement endot hélial est dû au st ress oxydant , via les effet s direct s néfast es des
ROS sur la biodisponibilit é du NO ou encore par act ivat ion du RAGE sit ué à la surface de ces
cellules.

Au cours du diabèt e de t ype 2, l’hyperglycémie est associée à un st ress oxydant import ant lié
à une hyperproduct ion de ROS. Nous avons pu mont rer que, ces phénomènes combinés,
amènent à des modificat ions st ruct urales et fonct ionnelles complexes de l’albumine par
mécanisme glycoxydat if. Nous pouvons en effet ret rouver au cours du diabèt e de t ype 2 à la
fois des formes glyquées, des formes oxydées et des formes glycoxydées (AGEs) d’albumine.

L’ensemble des modificat ions de l’albumine au cours du diabèt e va alt érer sa capacit é de
liaison aux molécules endogènes et exogènes ainsi que son pouvoir ant ioxydant . Au delà de
ces effet s, nous avons pu aussi met t re en évidence que les formes modifiées de l’albumine
pouvaient générer des effet s cellulaires pro ‐inflammat oires et pro ‐oxydant s sur des
monocyt es et des adipocyt es par act ivat ion de la voie du NF‐κB et par une augment at ion de
l’expression du RAGE par ces cellules. Ces observat ions rest ent néanmoins à confirmer sur
un modèle de cellules endot héliales avec des out ils d’analyse mécanist ique des voies
d’act ivat ion du RAGE. Néanmoins, ces élément s confort ent l’hypot hèse selon laquelle les
formes modifiées de l’albumine et plus cert ainement les formes AGEs auraient une
implicat ion direct e dans la physiopat hologie des complicat ions vasculaires du diabèt e en
init iant le phénomène de dysfonct ion endot héliale.
153

Les formes modifiées d’albumine pourraient donc const it uer des biomarqueurs pert inent s
du dépist age précoce de l’at t eint e vasculaire et permet t raient d'améliorer ainsi la prise en
charge et la prévent ion des complicat ions des pat ient s diabét iques de t ype 2. Il serait
t out efois ut ile d’ident ifier si cert aines de ces formes d’albumine modifiées sont plus
direct ement impliquées dans ces effet s cellulaires pro ‐oxydant s et pro ‐inflammat oires :
formes glyquées, formes oxydées ou encore formes glycoxydées (AGEs)?

Dans un second t emps la mise au point d’une mét hode de dosage rapide, st andardisée et
aut omat isable de ces fract ions par mét hode séparat ive, colorimét rique ou encore
immunologique permet t rait d'en évaluer plus facilement l'int érêt au cours d'une ét ude
clinique prospect ive orient ée sur le suivi vasculaire d'une cohort e de pat ient s diabét iques de
t ype 2 sur plusieurs années.

Pour finir, les voies glycoxydat ives qui mènent aux modificat ions de prot éines circulant es ou
encore à l'act ivat ion des cellules endot héliales par ces mêmes prot éines modifiées
pourraient également const it uer des cibles pharmacologiques d'int érêt permet t ant de
ret arder l'apparit ion des complicat ions vasculaires du diabèt e de t ype 2.
154
155
156
BIBLIOGRAPHIE

1 Joseph JJ, Golden SH. Type 2 diabet es and cardiovascular disease: w hat next ?.]. Curr
Opin Endocrinol Diabet es Obes April 2014 2014; 21 : 109–20.
2 Execut ive Summary: St andards of M edical Care in Diabet es‐‐2012. Diabet es Care
2011; 35 : S4–10.
3 Cosson E. [Diagnost ic crit eria for gest at ional diabet es mellit us]. J Gynécologie
Obst ét rique Biol Reprod 2010; 39 : S239–50.
4 M onnier L. Diabét ologie. Issy‐les‐M oulineaux: Elsevier M asson, 2010.
5 Fédérat ion Int ernat ional du Diabèt e. At las du Diabèt e 6ème Edit ion. 2013.
ht t p:/ / w w w .idf.org/ sit es/ default / files/ FR_6E_At las_full.pdf.
6 Fagot ‐Campagna A, Romon I, Fosse S, Roudier C. Prévalence et incidence du diabèt e,
et mort alit é liée au diabèt e en France – Synt hèse épidémiologique. 2010; : 12.
7 Favier F, Jaussent I, M oullec NL, et al. Prevalence of Type 2 diabet es and cent ral
adiposit y in La Reunion Island, t he REDIA St udy. Diabet es Res Clin Pract 2005; 67 : 234–42.
8 Fagot ‐Campagna A, Romon I, Fosse S, Roudier C. Prévalence et incidence du diabèt e,
et mort alit é liée au diabèt e en France – Synt hèse épidémiologique. 2010; : 12.
9 Execut ive Summary: St andards of M edical Care in Diabet es‐‐2012. Diabet es Care
2011; 35 : S4–10.
10 American Diabet es Associat ion. St andards of medical care in diabet es‐‐2008.
Diabet es Care 2008; 31 Suppl 1 : S12–54.
11 Procopiou M . [HbA1c: review and recent development s]. Rev M édicale Suisse 2006;
2 : 1473–4, 1476–9.
12 Gillery P. [Assays of HbA1c and Amadori product s in human biology]. Ann Pharm Fr
2014; 72 : 330–6.
13 Kow all B, Rat hmann W. HbA1c for diagnosis of t ype 2 diabet es. Is t here an opt imal
cut point t o assess high risk of diabet es complicat ions, and how w ell does t he 6.5% cut off
perform? Diabet es M et ab Syndr Obes Target s Ther 2013; : 477.
14 Féry F, Paquot N. [Et iopat hogenesis and pat hophysiology of t ype 2 diabet es]. Rev
M édicale Liège 2005; 60 : 361–8.
15 Donat h M Y, Shoelson SE. Type 2 diabet es as an inflammat ory disease. Nat Rev
157
Immunol 2011; 11 : 98–107.
16 M uoio DM , New gard CB. M echanisms of disease: molecular and met abolic
mechanisms of insulin resist ance and bet a‐cell failure in t ype 2 diabet es. Nat Rev M ol Cell
Biol 2008; 9 : 193–205.
17 Pinget M , Boullu ‐Sanchis S. [Physiological basis of insulin secret ion abnormalit ies].
Diabet es M et ab 2002; 28 : 4S21–32.
18 Shoelson SE, Lee J, Goldfine AB. Inflammat ion and insulin resist ance. J Clin Invest
2006; 116 : 1793–801.
19 M onnier L, Thuan J‐F. [Type 1 diabet es of t he child and t he adult . Type 2 diabet es of
t he adult . Complicat ions of diabet es]. Rev Prat 2007; 57 : 653–64.
20 Forbes JM , Cooper M E. M echanisms of Diabet ic Complicat ions. Physiol Rev 2013; 93 :
137–88.
21 M urray CJ, Lopez AD. Global mort alit y, disabilit y, and t he cont ribut ion of risk fact ors:
Global Burden of Disease St udy. Lancet 1997; 349 : 1436–42.
22 Romon I, Fosse S, Eschw ège E, et al. Prevalence of macrovascular complicat ions and
cardiovascular risk fact ors in people t reat ed for diabet es and living in France: t he ENTRED
st udy 2001. Diabet es M et ab 2008; 34 : 140–7.
23 Kannel WB. Framingham st udy insight s on diabet es and cardiovascular disease. Clin
Chem 2011; 57 : 338–9.
24 Joseph JJ, Golden SH. Type 2 diabet es and cardiovascular disease: w hat next ?.
[M iscellaneous Art icle]. Curr Opin Endocrinol Diabet es Obes April 2014 2014; 21 : 109–20.
25 Lago RM , Nest o RW. Type 2 diabet es and coronary heart disease: focus on
myocardial infarct ion. Curr Diab Rep 2009; 9 : 73–8.
26 St rat t on IM , Adler AI, Neil HA, et al. Associat ion of glycaemia w it h macrovascular and
microvascular complicat ions of t ype 2 diabet es (UKPDS 35): prospect ive observat ional st udy.
BM J 2000; 321 : 405–12.
27 Adler AI, St rat t on IM , Neil HA, et al. Associat ion of syst olic blood pressure w it h
macrovascular and microvascular complicat ions of t ype 2 diabet es (UKPDS 36): prospect ive
observat ional st udy. BM J 2000; 321 : 412–9.
28 Colhoun HM , Bet t eridge DJ, Durringt on PN, et al. Primary prevent ion of
cardiovascular disease w it h at orvast at in in t ype 2 diabet es in t he Collaborat ive At orvast at in
Diabet es St udy (CARDS): mult icent re randomised placebo ‐cont rolled t rial. Lancet 2004; 364 :
158
685–96.
29 Diehm C, Kareem S, Law all H. Epidemiology of peripheral art erial disease. VASA Z Für
Gefässkrankh 2004; 33 : 183–9.
30 Set hi A, Arora RR. M edical management and cardiovascular risk reduct ion in
peripheral art erial disease. Exp Clin Cardiol 2008; 13 : 113–9.
31 WHO | The w orld healt h report 2003 ‐ shaping t he fut ure. WHO. 2014; published
online July 8. ht t p:/ / w w w .w ho.int / w hr/ 2003/ en/ (accessed July 8, 2014).
32 Bonora E, Tessari R, M icciolo R, et al. Int imal ‐medial t hickness of t he carot id art ery in
nondiabet ic and NIDDM pat ient s. Relat ionship w it h insulin resist ance. Diabet es Care 1997;
20 : 627–31.
33 Shah AS, Dolan LM , Kimball TR, et al. Influence of durat ion of diabet es, glycemic
cont rol, and t radit ional cardiovascular risk fact ors on early at herosclerot ic vascular changes
in adolescent s and young adult s w it h t ype 2 diabet es mellit us. J Clin Endocrinol M et ab 2009;
94 : 3740–5.
34 Park SW, Kim SK, Cho Y‐W, et al. Insulin resist ance and carot id at herosclerosis in
pat ient s w it h t ype 2 diabet es. At herosclerosis 2009; 205 : 309–13.
35 Coccheri S. Approaches t o prevent ion of cardiovascular complicat ions and event s in
diabet es mellit us. Drugs 2007; 67 : 997–1026.
36 M ulvany M J, Aalkjaer C. St ruct ure and funct ion of small art eries. Physiol Rev 1990;
70 : 921–61.
37 M ichiels C. Endot helial cell funct ions. J Cell Physiol 2003; 196 : 430–43.
38 Robert s AC, Port er KE. Cellular and molecular mechanisms of endot helial dysfunct ion
in diabet es. Diabet es Vasc Dis Res Off J Int Soc Diabet es Vasc Dis 2013; 10 : 472–82.
39 Sena CM , Pereira AM , Seiça R. Endot helial dysfunct ion — A major mediat or of
diabet ic vascular disease. Biochim Biophys Act a BBA ‐ M ol Basis Dis 2013; 1832 : 2216–31.
40 Galkina E, Ley K. Immune and inflammat ory mechanisms of at herosclerosis (* ). Annu
Rev Immunol 2009; 27 : 165–97.
41 Koulikoff F, Jeunemaît re X. Coupe schémat ique d’une art ère saine et d’une art ère
at héroscléreuse. Dossier Inserm  : At herosclerose. .
42 M ünzel T, Daiber A, Ullrich V, M ülsch A. Vascular Consequences of Endot helial Nit ric
Oxide Synt hase Uncoupling for t he Act ivit y and Expression of t he Soluble Guanylyl Cyclase
and t he cGM P‐Dependent Prot ein Kinase. Art erioscler Thromb Vasc Biol 2005; 25 : 1551–7.
159
43 Rask‐M adsen C, King GL. Vascular Complicat ions of Diabet es: M echanisms of Injury
and Prot ect ive Fact ors. Cell M et ab 2013; 17 : 20–33.
44 deGoma EM , Leeper NJ, Heidenreich PA. Clinical significance of high ‐densit y
lipoprot ein cholest erol in pat ient s w it h low low ‐densit y lipoprot ein cholest erol. J Am Coll
Cardiol 2008; 51 : 49–55.
45 Yusuf S, Haw ken S, Ounpuu S, et al. Effect of pot ent ially modifiable risk fact ors
associat ed w it h myocardial infarct ion in 52 count ries (t he INTERHEART st udy): case‐cont rol
st udy. Lancet 2004; 364 : 937–52.
46 Walldius G, Jungner I. The apoB/ apoA‐I rat io: a st rong, new risk fact or for
cardiovascular disease and a t arget for lipid ‐low ering t herapy‐‐a review of t he evidence. J
Int ern M ed 2006; 259 : 493–519.
47 Holman RR, Paul SK, Bet hel M A, Neil HAW, M at t hew s DR. Long‐t erm follow ‐up aft er
t ight cont rol of blood pressure in t ype 2 diabet es. N Engl J M ed 2008; 359 : 1565–76.
48 Lee WL, Cheung AM , Cape D, Zinman B. Impact of diabet es on coronary art ery
disease in w omen and men: a met a‐analysis of prospect ive st udies. Diabet es Care 2000; 23 :
962–8.
49 Bullen C. Impact of t obacco smoking and smoking cessat ion on cardiovascular risk
and disease. Expert Rev Cardiovasc Ther 2008; 6 : 883–95.
50 Yusuf S, Haw ken S, Ounpuu S, et al. Obesit y and t he risk of myocardial infarct ion in
27,000 part icipant s from 52 count ries: a case‐cont rol st udy. Lancet 2005; 366 : 1640–9.
51 ANAES. M ét hodes d’évaluat ion du risque cardiovasculaire. 2004.
52 Wilson PW, D’Agost ino RB, Levy D, Belanger AM , Silbershat z H, Kannel WB. Predict ion
of coronary heart disease using risk fact or cat egories. Circulat ion 1998; 97 : 1837–47.
53 Haffner SM , Leht o S, Rönnemaa T, Pyörälä K, Laakso M . M ort alit y from coronary
heart disease in subject s w it h t ype 2 diabet es and in nondiabet ic subject s w it h and w it hout
prior myocardial infarct ion. N Engl J M ed 1998; 339 : 229–34.
54 Assmann G, Cullen P, Schult e H. Simple scoring scheme for calculat ing t he risk of
acut e coronary event s based on t he 10‐year follow ‐up of t he prospect ive cardiovascular
M ünst er (PROCAM ) st udy. Circulat ion 2002; 105 : 310–5.
55 Vinereanu D. Risk fact ors for at herosclerot ic disease: present and fut ure. Herz 2006;
31 Suppl 3 : 5–24.
56 Haleng J, Pincemail J, Defraigne JO, Charlier C, Chapelle JP. [Oxidat ive st ress]. Rev
160
M édicale Liège 2007; 62 : 628–38.
57 Gillery P. [Oxidat ive st ress and prot ein glycat ion in diabet es mellit us]. Ann Biol Clin
(Paris) 2006; 64 : 309–14.
58 Delat t re J, Bonnefont ‐Rousselot D, Bordas‐Fonfrèdre M , Jaudon M . [Diabet es mellit us
and oxidat ive st ress]. Ann Biol Clin (Paris) 1999; 57 : 437–44.
59 Chiarelli F, M ohn A. Angiopat hy in children w it h diabet es. M inerva Pediat r 2002; 54 :
187–201.
60 Bonnefont ‐Rousselot D. Glucose and react ive oxygen species. Curr Opin Clin Nut r
M et ab Care 2002; 5 : 561–8.
61 Bonnefont ‐Rousselot D, Beaudeux J‐L, Thérond P, Peynet J, Legrand A, Delat t re J.
[Diabet es mellit us, oxidat ive st ress and advanced glycat ion endproduct s]. Ann Pharm Fr
2004; 62 : 147–57.
62 Bourdon E, Blache D. The import ance of prot eins in defense against oxidat ion.
Ant ioxid Redox Signal 2001; 3 : 293–311.
63 Rondeau P, Bourdon E. The glycat ion of albumin: St ruct ural and funct ional impact s.
Biochimie 2011; 93 : 645–58.
64 Roche M , Rondeau P, Singh NR, Tarnus E, Bourdon E. The ant ioxidant propert ies of
serum albumin. FEBS Let t 2008; 582 : 1783–7.
65 Bourdon E, Loreau N, Lagrost L, Blache D. Different ial effect s of cyst eine and
met hionine residues in t he ant ioxidant act ivit y of human serum albumin. Free Radic Res
2005; 39 : 15–20.
66 Aruoma OI, Landes B, Ramful ‐Baboolall D, et al. Funct ional benefit s of cit rus fruit s in
t he management of diabet es. Prev M ed 2012; 54, Supplement : S12–6.
67 Hat ia S, Sept embre‐M alat erre A, Le Sage F, et al. Evaluat ion of ant ioxidant propert ies
of major diet ary polyphenols and t heir prot ect ive effect on 3T3‐L1 preadipocyt es and red
blood cells exposed t o oxidat ive st ress. Free Radic Res 2014; 48 : 387–401.
68 Place des produit s de glycat ion avancés (AGEs) dans les complicat ions du diabèt e.
EM ‐Consult e. 2014; published online July 9. ht t p:/ / w w w .em ‐
consult e.com/ art icle/ 277761/ figures/ place‐des‐produit s‐de‐glycat ion ‐avances‐lagesr ‐dan
(accessed July 9, 2014).
69 Bar–Or D, Lau E, Winkler JV. A novel assay for cobalt ‐albumin binding and it s
pot ent ial as a marker for myocardial ischemia—a preliminary report . J Emerg M ed 2000; 19 :
161
311–5.
70 Bar ‐Or D, Curt is G, Rao N, Bampos N, Lau E. Charact erizat ion of t he Co2+ and Ni2+
binding amino ‐acid residues of t he N‐t erminus of human albumin. Eur J Biochem 2001; 268 :
42–8.
71 Bar ‐Or D, Rael LT, Bar ‐Or R, et al. The cobalt –albumin binding assay: Insight s int o it s
mode of act ion. Clin Chim Act a 2008; 387 : 120–7.
72 Zhong Y, Wang N, Xu H, Hou X, Xu P, Zhou Z. Ischemia‐modified albumin in st able
coronary at herosclerot ic heart disease: clinical diagnosis and risk st rat ificat ion. Coron Art ery
Dis 2012; 23 : 538–41.
73 Gunduz A, Turedi S, M ent ese A, et al. Ischemia‐modified albumin levels in
cerebrovascular accident s. Am J Emerg M ed 2008; 26 : 874–8.
74 Dominguez‐Rodriguez A, Abreu ‐Gonzalez P. Current role of ischemia‐modified
albumin in rout ine clinical pract ice. Biomarkers 2010; 15 : 655–62.
75 Piw ow ar A, Knapik‐Kordecka M , Warw as M . Ischemia‐M odified albumin level in t ype
2 diabet es mellit us—Preliminary report . Dis M arkers 2008; 24 : 311–7.
76 Baraka‐Vidot J, Navarra G, Leone M , Bourdon E, M ilit ello V, Rondeau P. Deciphering
met al ‐induced oxidat ive damages on glycat ed albumin st ruct ure and funct ion. Biochim
Biophys Act a BBA ‐ Gen Subj 2014; published online Feb 17.
DOI:10.1016/ j.bbagen.2013.12.017.
77 Rondeau P, Singh NR, Caillens H, Tallet F, Bourdon E. Oxidat ive st resses induced by
glycoxidized human or bovine serum albumin on human monocyt es. Free Radic Biol M ed
2008; 45 : 799–812.
78 Gillery P. [Advanced glycat ion end product s (AGEs), free radicals and diabet es]. J
Sociét é Biol 2001; 195 : 387–90.
79 Anguizola J, M at suda R, Barnaby OS, et al. Review : Glycat ion of human serum
albumin. Clin Chim Act a 2013; 425 : 64–76.
80 Gillery P, Jaisson S. Post ‐t ranslat ional modificat ion derived product s (PTM DPs): t oxins
in chronic diseases? Clin Chem Lab M ed 2014; 52 . DOI:10.1515/ cclm ‐2012 ‐0880.
81 Waut hier J. Produit s avancés de glycat ion AGE et complicat ions vasculaires dans le
diabèt e. médecine/ sciences 1994; 10 : 1165.
82 Waut ier J‐L, Waut ier M ‐P. Produit s de glycat ion avancée et syst ème vasculaire.
/ dat a/ revues/ 19572557/ 00040006/ 633/ 2010; published online Dec 30. ht t p:/ / w w w .em ‐
162
consult e.com/ en/ art icle/ 277760 (accessed July 9, 2014).
83 Place des produit s de glycat ion avancés (AGEs) dans les complicat ions du diabèt e.
EM ‐Consult e. ht t p:/ / w w w .em ‐consult e.com/ art icle/ 277761/ figures/ place‐des‐produit s‐de‐
glycat ion ‐avances‐lagesr ‐dan (accessed July 9, 2014).
84 Singh R, Kaur N, Kishore L, Gupt a GK. M anagement of diabet ic complicat ions: a
chemical const it uent s based approach. J Et hnopharmacol 2013; 150 : 51–70.
85 Bourdon E, Loreau N, Blache D. Glucose and free radicals impair t he ant ioxidant
propert ies of serum albumin. FASEB J Off Publ Fed Am Soc Exp Biol 1999; 13 : 233–44.
86 Chilelli NC, Burlina S, Lapolla A. AGEs, rat her t han hyperglycemia, are responsible
for microvascular complicat ions in diabet es: A ‘glycoxidat ion ‐cent ric’ point of view . Nut r
M et ab Cardiovasc Dis 2013; 23 : 913–9.
87 Grossin N, Boulanger E, Waut ier M ‐P, Waut ier J‐L. The different isoforms of t he
recept or for advanced glycat ion end product s are modulat ed by pharmacological agent s.
Clin Hemorheol M icrocirc 2010; 45 : 143–53.
88 Kalea AZ, Schmidt AM , Hudson BI. RAGE: a novel biological and genet ic marker for
vascular disease. Clin Sci Lond Engl 1979 2009; 116 : 621–37.
89 Gillery P. [Advanced glycat ion end product s (AGEs), free radicals and diabet es]. J
Sociét é Biol 2001; 195 : 387–90.
90 Schmidt AM , Yan SD, Yan SF, St ern DM . The mult iligand recept or RAGE as a
progression fact or amplifying immune and inflammat ory responses. J Clin Invest 2001; 108 :
949–55.
91 Waut hier J. Produit s avancés de glycat ion AGE et complicat ions vasculaires dans le
diabèt e. médecine/ sciences 1994; 10 : 1165.
92 Gaw dzik J, M at hew L, Kim G, Puri TS, Hofmann Bow man M A. Vascular remodeling
and art erial calcificat ion are direct ly mediat ed by S100A12 (EN‐RAGE) in chronic kidney
disease. Am J Nephrol 2011; 33 : 250–9.
93 Chaw la D, Bansal S, Banerjee BD, M adhu SV, Kalra OP, Tripat hi AK. Role of advanced
glycat ion end product (AGE)‐induced recept or (RAGE) expression in diabet ic vascular
complicat ions. M icrovasc Res 2014; 95C: 1–6.
94 Yan SD, St ern D, Kane M D, Kuo YM , Lampert HC, Roher AE. RAGE‐Abet a int eract ions
in t he pat hophysiology of Alzheimer’s disease. Rest or Neurol Neurosci 1998; 12 : 167–73.
95 Taguchi A, Blood DC, del Toro G, et al. Blockade of RAGE‐amphot erin signalling
163
suppresses t umour grow t h and met ast ases. Nat ure 2000; 405 : 354–60.
96 Daffu G, del Pozo CH, O’Shea KM , Anant hakrishnan R, Ramasamy R, Schmidt AM .
Radical roles for RAGE in t he pat hogenesis of oxidat ive st ress in cardiovascular diseases and
beyond. Int J M ol Sci 2013; 14 : 19891–910.
97 Cart er DC, Ho JX. St ruct ure of Serum Albumin. In: C.B. Anfinsen JTE, Frederic M .
Richards and David S. Eisenberg, ed. Advances in Prot ein Chemist ry. Academic Press, 1994:
153–203.
98 Guerin ‐Dubourg A, Cat an A, Bourdon E, Rondeau P. St ruct ural modificat ions of
human albumin in diabet es. Diabet es M et ab 2012; 38 : 171–8.
99 Baraka‐Vidot J, Guerin ‐Dubourg A, Bourdon E, Rondeau P. Impaired drug‐binding
capacit ies of in vit ro and in vivo glycat ed albumin. Biochimie 2012; 94 : 1960–7.
100 Zmat liková Z, Sedláková P, Lacinová K, Eckhardt A, Pat aridis S, M ikšík I. Non ‐
enzymat ic post t ranslat ional modificat ions of bovine serum albumin by oxo ‐compounds
invest igat ed by high ‐performance liquid chromat ography‐mass spect romet ry and capillary
zone elect rophoresis‐mass spect romet ry. J Chromat ogr A 2010; 1217 : 8009–15.
101 Ahmad W, Li L, Deng Y. Ident ificat ion of AGE‐precursors and AGE format ion in
glycat ion ‐induced BSA pept ides. BM B Rep 2008; 41 : 516–22.
102 Thornalley PJ, Rabbani N. Det ect ion of oxidized and glycat ed prot eins in clinical
samples using mass spect romet ry — A user’s perspect ive. Biochim Biophys Act a BBA ‐ Gen
Subj 2014; 1840 : 818–29.
103 Lee E, Eom J‐E, Jeon K‐H, et al. Evaluat ion of albumin st ruct ural modificat ions t hrough
cobalt ‐albumin binding (CAB) assay. J Pharm Biomed Anal 2014; 91 : 17–23.
104 Cohen M P, Shea E, Chen S, Shearman CW. Glycat ed albumin increases oxidat ive
st ress, act ivat es NF‐κB and ext racellular signal ‐regulat ed kinase (ERK), and st imulat es ERK‐
dependent t ransforming grow t h fact or ‐β1 product ion in macrophage RAW cells. J Lab Clin
M ed 2003; 141 : 242–9.
105 Albert i KGM M , Zimmet P, Shaw J. Int ernat ional Diabet es Federat ion: a consensus on
Type 2 diabet es prevent ion. Diabet M ed J Br Diabet Assoc 2007; 24 : 451–63.
106 Ndong JR, Romon I, Druet C, et al. Caract érist iques, risque vasculaire, complicat ions
et qualit é des soins des personnes diabét iques dans les départ ement s d’out re‐mer et
comparaison à la mét ropole : Ent red 2007‐2010, France. 2010
ht t p:/ / opac.invs.sant e.fr/ index.php?lvl=not ice_display& id=502.
164
107 WHO | Use of glycat ed haemoglobin (HbA1c) in t he diagnosis of diabet es mellit us.
WHO. 2014; published online Jan 13.
ht t p:/ / w w w .w ho.int .gat e2.inist .fr/ diabet es/ publicat ions/ diagnosis_diabet es2011/ en/
(accessed Jan 13, 2014).
108 Fox CS. Cardiovascular Disease Risk Fact ors, Type 2 Diabet es M ellit us, and t he
Framingham Heart St udy. Trends Cardiovasc M ed 2010; 20 : 90–5.
109 Furusyo N, Hayashi J. Glycat ed albumin and diabet es mellit us. Biochim Biophys Act a
BBA ‐ Gen Subj 2013; 1830 : 5509–14.
110 Song SO, Kim KJ, Lee B‐W, Kang ES, Cha BS, Lee HC. Serum glycat ed albumin predict s
t he progression of carot id art erial at herosclerosis. At herosclerosis 2012; 225 : 450–5.
111 Roy D, Kaski JC. Ischemia‐M odified Albumin: The Import ance of Oxidat ive St ress. J Am
Coll Cardiol 2007; 49 : 2375–6.
112 Sbarouni E, Georgiadou P, Voudris V. Ischemia modified albumin changes – review
and clinical implicat ions. Clin Chem Lab M ed 2011; 49 . DOI:10.1515/ CCLM .2011.037.
113 Baraka‐Vidot J, Guerin ‐Dubourg A, Dubois F, Payet B, Bourdon E, Rondeau P. New
insight s int o delet erious impact s of in vivo glycat ion on albumin ant ioxidant act ivit ies.
Biochim Biophys Act a BBA ‐ Gen Subj 2013; 1830 : 3532–41.
114 Shao ‐gang M a, Shao ‐gang M a, Yao Jin, et al. Evaluat ion of Ischemia‐M odified
Albumin and C‐React ive Prot ein in Type 2 Diabet ics Wit h and Wit hout Ket osis. Biomark
Insight s 2012; : 19.
115 Kaefer M , Piva SJ, De Carvalho JAM , et al. Associat ion bet w een ischemia modified
albumin, inflammat ion and hyperglycemia in t ype 2 diabet es mellit us. Clin Biochem 2010;
43 : 450–4.
116 Giacco F, Brow nlee M . Oxidat ive St ress and Diabet ic Complicat ions. Circ Res 2010;
107 : 1058–70.
117 Ho E, Karimi Galougahi K, Liu C‐C, Bhindi R, Figt ree GA. Biological markers of oxidat ive
st ress: Applicat ions t o cardiovascular research and pract ice. Redox Biol 2013; 1 : 483–91.
118 M a S‐G, Wei C‐L, Hong B, Yu W ‐N. Ischemia‐modified albumin in t ype 2 diabet ic
pat ient s w it h and w it hout peripheral art erial disease. Clinics 2011; 66 : 1677–80.
119 Kat akami N, Kanet o H, Shimomura I. Carot id ult rasonography: A pot ent t ool for
bet t er clinical pract ice in diagnosis of at herosclerosis in diabet ic pat ient s. J Diabet es Invest ig
2014; 5 : 3–13.
165
120 Liao J, Farmer J. Art erial st iffness as a risk fact or for coronary art ery disease. Curr
At heroscler Rep 2014; 16 : 387.

166
167
168
Abstract
Structural and functional impairments of albumin in type 2 diabetes – Focus on

cardiovascular disease-associated biomarker identification

Type 2 diabet es is dramat ically associat ed w it h an enhanced cardiovascular complicat ion risk. The
ident ificat ion of novel biomarkers associat ed w it h endot helial dysfunct ion remains highly w arrant ed
t o improve diabet es screening and prevent ion. Oxidat ive st ress and prot ein modificat ions are
frequent ly observed in numerous disease st at es. Albumin, t he major circulat ing prot ein in blood, can
undergo increased glycoxidat ion in diabet es. Object ives of my t hesis w ere t o clarify t he impact of
glycoxidat ive modificat ion of albumin on it s st ruct ure and it s funct ions and t o det ermine w het her
such impairment s may be encount ered in albumin purified from diabet ics. The occurrence of
oxidat ive modificat ions w as found t o be enhanced in vit ro glycoxidized HSA and albumin purified
from diabet ics, aft er det erminat ion of t heir free t hiol group cont ent , relat ive elect rophoret ic
migrat ion, carbonyl cont ent , and ant ioxidant act ivit ies. In addit ion, glycoxidized albumin exhibit ed
impaired pharmaceut ic molecule binding capacit ies. Cells t reat ed w it h glycoxidized albumin exhibit ed
a proinflammat ory st at e at t est ed by an overgenerat ion of int racellular react ive oxygen species,
enhancement s in RAGE expression, and an accumulat ion of carbonylat ed prot eins. M et hods t o det ect
IM A (ischemia modified albumin) w ere developed and applied t o diabet ics pat ient s. Relat ionships
have been est ablished bet w een specific pat hological paramet ers (cardiovascular disorders,
hyperglycemia…) w it h an enhanced glycoxidat ive modificat ion of albumin in diabet ics. We t hus
propose t hat impaired albumin st ruct ure and funct ion in relat ion in t he enhanced oxidant st ress
observed in diabet ics might be involved in t he increased mort alit y risk of t hese pat ient s.

Subject : Biochemist ry and molecular biology

Keyw ords : Type 2 Diabet es, endot helial dysfunct ion, albumin, oxydat ive st ress, glycoxydat ion, AGEs,
RAGE, IM A
169
Résumé
Etude des modifications structurales et fonctionnelles de l’albumine dans le

diabète de type 2 : identification de biomarqueurs de glycoxydation et de facteurs de
risque de complications vasculaires
La mort alit é du diabèt e de t ype 2 est liée à ses complicat ions cardiovasculaires (CVD). L’ident ificat ion
de nouveaux biomarqueurs associés à la dysfonct ion endot héliale, permet t rait d ‘en améliorer le
dépist age, la prévent ion.
Au cours du diabèt e de t ype 2, l’hyperglycémie est associée à un fort st ress oxydant . Nous nous
sommes proposés ici d’évaluer l’impact de la glycoxydat ion sur la principale prot éine circulant e,
l’albumine, et d’ident ifier si les modificat ions glycoxydat ives de l’albumine dans le diabèt e avait un
rôle dans la physiopat hologie des CVD du diabèt e de t ype 2. Nous avons pu met t re en évidence des
modificat ions st ruct urales et fonct ionnelles import ant es de l’albumine au cours du diabèt e de t ype 2
avec la format ion ent re aut res de produit s avancés de glycat ion (AGEs). Ces modificat ions
glycoxydat ives sont associées à des effet s cellulaires pro ‐oxydant et pro ‐inflammat oire via une
augment at ion de l’expression du RAGE.
Ces observat ions suggèrent que les formes glycoxydées d’albumine présent ent un rôle cent ral dans
les mécanismes menant à la dysfonct ion endot héliale. Il rest e néanmoins à évaluer l’int érêt du
dosage des formes modifiées de l’albumine dans le dépist age des CVD au cours d’une ét ude clinique
prospect ive de grande ampleur. Le développement d’une mét hode de dosage rapide et reproduct ible
des fract ions d’albumine modifiées, comme celui de l’IM A (albumine modifiée par l’ischémie), en
facilit erait la mise en œuvre.

Discipline: Biochimie et biologie moléculaire

M ot s‐clés : Diabèt e t ype 2, dysfonct ion endot héliale, albumine, st ress oxydant , glycoxydat ion, AGEs,
RAGE, IM A
170

2014lare0017 DGuerin PDF

Hochgeladen von

Dokumentinformationen

Originaltitel

Copyright

Verfügbare Formate

Dieses Dokument teilen

Dokument teilen oder einbetten

Freigabeoptionen

Stufen Sie dieses Dokument als nützlich ein?

Sind diese Inhalte unangemessen?

Copyright:

Verfügbare Formate

2014lare0017 DGuerin PDF

Hochgeladen von

Copyright:

Verfügbare Formate

 voisp

Spécialité : BIOCHIM IE

Etude des modifications structurales et fonctionnelles de l’albumine

dans le diabète de type 2 : identification de biomarqueurs de

glycoxydation et de facteurs de risque de complications vasculaires

Dr. M COURNOT Docteur et Praticien Hospitalier, CH G.M artin, St Paul Examinateur

Pr E. BOURDON Professeur, Université de la Réunion Directeur

DrHDR P. RONDEAU Ingénieur d’Etudes, Université de la Réunion Co ‐Directeur

GEICO‐UFR Sant é‐Universit é de La Réunion et du laborat oire de Biochimie du CHU La

Réunion ‐Hôpit al Félix Guyon.

la créat ion sinon aux premières heures du CHU et de l’UFR‐Sant é Universit é de La Réunion:

Réunion ne disposerait pas aujourd’hui d’out ils performant s d’encadrement pédagogique en

sciences de la sant é, en biochimie et en recherche clinique.

accompagné durant ces 4 années de t ravail :

dans la recherche et de finaliser ce t ravail de t hèse.

avenir dans la recherche scient ifique.

vos sourires qui m’ont t oujours accueillis.

laborat oire, qui m’ont aidé à recueillir les prélèvement s nécessaires à cet t e ét ude.

idées. Bon courage à t oi pour la fin de t on projet de t hèse.

Figure n°2 M ort alit é liée au diabèt e chez les individus de moins de 60 ans

Figure n°3 M écanismes int racellulaires de l’insulinorésist ance

Figure n°4 St ruct ure de la paroi vasculaire et place de l’endot hélium vasculaire

Figure n°7 Coupure Homolyt ique d’une molécule et product ion d’espèces radicalaires

Figure n° 9 Principaux sit es de l’albumine impliqués dans son act ivit é ant ioxydant e

Figure n°12 Différent es formes d’AGEs rencont rés au cours du diabèt e

Figure n°15 Récept eurs RAGE – Principales Isoformes

percent ile, valeur médiane, 75 percent ile et valeur maximale)

percent ile, valeur médiane, 75 percent ile et valeur maximale)

1.1. Définit ion ................................................................................................................... 23

1.2.2. Epidémiologie en France .................................................................................... 26

1.3. Diagnost ic et suivi...................................................................................................... 27

1.4. Et iologie et immunopat hologie du diabèt e de t ype 2 .............................................. 28

1.4.1. Les fact eurs génét iques...................................................................................... 29

1.4.2. Les fact eurs environnement aux......................................................................... 29

1.5. Complicat ions chroniques du diabèt e...................................................................... 34

1.5.1. Complicat ions microangiopat hiques.................................................................. 35

1.5.2. Complicat ions macroangiopat hiques................................................................. 36

2. COM PLICATIONS CARDIOVASCULAIRES DU DIABETE DE TYPE2 ...................................... 37

2.1. Les complicat ions cardiovasculaires du diabèt e ....................................................... 37

2.1.1. Cardiopat hie ischémique ................................................................................... 37

2.1.2. Art érit e des membres inférieurs........................................................................ 39

2.1.3. At hérosclérose carot idienne .............................................................................. 39

2.2. Complicat ions vasculaires et fonct ion endot héliale ................................................. 40

2.2.1. L’endot hélium vasculaire : rôle physiologique .................................................. 40

3. Evaluat ion du risque cardiovasculaire et pat hologie diabét ique : fact eurs de risque..... 46

3.1. Fact eurs de risques cardiovasculaires convent ionnels............................................. 46

3.1.2. L’hypert ension art érielle .................................................................................... 47

3.1.3. L’âge et le sexe ................................................................................................... 48

3.1.4. Le t abagisme ...................................................................................................... 48

3.2. Evaluat ion du risque vasculaire................................................................................. 49

3.2.2. Risque cardiovasculaire et diabèt e de t ype 2 .................................................... 49

3.3. Améliorer le dépist age du risque cardiovasculaire................................................... 51

4.1 Hyperglycémie chronique et st ress oxydant .............................................................. 53

4.1.1. Définit ions des radicaux libres. .......................................................................... 53

4.1.2. Diabèt e de t ype 2 et hyperproduct ion de radicaux libres ................................. 54

4.1.3. Les défenses ant ioxydant es. .............................................................................. 57

4.1.4. Conséquences de l’hyperproduct ion d’espèces réact ives de l’oxygène. .......... 62

4.2. Hyperglycémie chronique et AGEs (advanced glycat ion end ‐product s)................... 65

4.2.1. Format ion des AGEs : phénomène de Glycoxydat ion........................................ 65

4.2.2. Effet s des AGEs sur la mat rice ext racellulaire, les prot éines circulant es et

4.2.3. Les Récept eurs aux AGEs. .................................................................................. 72

PARTIE EXPERIM ENTALE .......................................................................................................... 81

1. ETUDES DES M ODIFICATIONS STRUCTURALES ET FONCTIONNELLES DE L’ALBUM INE AU