Laboratorio de Microbiología

INTERACCIONES MICROBIANAS
Luna-Cardenas, V1* Villamil-Fernández, N2*.

* Universidad El Bosque, Programa de Ingeniería Ambiental, Facultad de Ingeniería,
Av. 9 #131a2, Bogotá-Colombia.
Resumen
La práctica de laboratorio número tres realizada en el laboratorio, tuvo como objetivo observar
diferentes interacciones negativas que tienen los microorganismos, y para ello se realizaron 3
diferentes pruebas. El primer procedimiento es el de enfrentamiento dual entre los cultivos de
Trichoderma (controlador) y Fusarium (patógeno), en agar PDA (Agar papa dextrosa). El siguiente
procedimiento se basa en la técnica de Gauze la cual analiza el crecimiento 3 cultivos, Bacillus sp
(patógeno), E. Coli (patógeno) y S. aureus (patógeno), en una siembra masiva en el agar de
Streptomyces sp (controlador), en agar AV (Agar avena). Por último se realiza la técnica de Igarashi
la cual evalúa el crecimiento de Fusarium (patógeno) en un medio de Trichoderma (controlador), en
agar AV (Agar avena) y PDA (Agar papa dextrosa). Las placas en donde se realizaron los
procedimiento anteriormente descritos se dejan incubar a 22°C durante 7 días, con el fin de
proporcionar las condiciones necesarias para el crecimiento de los microorganismos. Según los
resultados obtenidos en el laboratorio se pudo verificar la presencia de diferentes agentes
controladores que inhibieron por completo el crecimiento de microorganismo patógenos en los agares
seleccionados, además de identificar una serie de interacciones negativas donde uno de los
microorganismos fue afectado por las acciones del otro, esto se pudo evidenciar tanto en hongos como
en bacterias. Para la coloración bacteriana se tuvo en cuenta la tinción de Gram, metodología usada
para la visualización de bacterias Gram positivas, que son aquellas que poseen una pared celular con
una amplia capa de peptidoglicano, y para la tinción de hongos se utilizó la tinción con azul de
lactofenol, estas metodologías nos permitieron encontrar la morfología microscópica de S. aureus y de
Fusarium.
Introducción
Las diferentes investigaciones que se han realizado de los cultivos puros de microorganismos han
arrojado resultados sobre el metabolismo microbiano y los ciclos biogeoquímicos, sin embargo hay
que tener en cuenta las relaciones que se logran dar entre las comunidades microbianas.El
conocimiento de las relaciones entre los microorganismos permite un estudio más amplio y completo
del mundo microbiológico lo que a su vez también permite el estudio de las relaciones ecológicas que
se dan en el entorno. Los microorganismos establecen innumerables interacciones con otros
organismos, y también entre ellos. Estas interacciones se pueden clasificar, según el beneficio o
perjuicio que reciben los individuos participantes, en relaciones negativas, positivas y neutras [1].
Dentro de las relaciones positivas se encuentra el comensalismo, la protocooperación y la simbiosis.
En las relaciones negativas se encuentra la competencia, el amensalismo, la depredación y el
parasitismo y por último en las relaciones neutras se encuentra el neutralismo.
En el siguiente informe se describirán 3 procedimientos que dan evidencia de las interacciones
negativas.
Técnica enfrentamiento dual: Establece la capacidad inhibitoria de los diferentes aislamientos.[3].
Para determinar esta capacidad se enfrenta el fitopatógeno y el antagonista.
Técnica de Gauze: Estudia las interacciones actinobacteria-hongo.[4]
Técnica de Igarashi: Interacción entre antagonista y fitopatógeno. [5]
En cada una de estas técnicas se detecta la presencia de un agente biocontrolador que inhibe el
crecimiento de un patógeno, esto se denomina como control biológico. El empleo de este control
1
biológico puede ser usado como estrategia para reducir enfermedades de las plantas o de los cultivos
que tienen gran susceptibilidad a hongos patógenos. Al momento de realizar el control biológico se
debe tener en cuenta el funcionamiento del antagonista frente al ecosistema donde se realizará la
aplicación así se evitarán los riesgos potenciales.[6]
Metodología
Para poder diferenciar las diferentes relaciones entre microorganismos fue necesario realizar 3
procedimientos.
Enfrentamiento dual: Inicialmente se tomaron 2
discos de agar de los cultivos de Trichoderma
Harzianum y Fusarium Oxysporum, después de que
se obtuvieron los discos, estos se sembraron en el agar
de PDA. Fue importante que los discos se ubicaran
simétricamente para que se pudiera ver un buen
resultado de la técnica. Al finalizar el procedimiento
la caja de petri se deja incubar a 22ºC durante 7 días.
Figura 1. Enfrentamiento dual en Agar PDA
Técnica de Gauze: Se realizó una siembra masiva de

Streptomyces sp en el agar avena, luego se tomó un
disco correspondiente a cada caja de Bacillus sp, E
Coli y S. Aureus, y fueron llevados a la siembra que
se hizo inicialmente de Streptomyces. La caja de petri
con el cultivo se dejó incubar a 22ºC durante 7 días.
Figura 2. Técnica de Gauze en Agar PDA
Figura 3. Técnica
de Igarashi en Agar PDA y AV
Técnica de Igarashi: Se realizó en agar PDA y AV. Primero de dibujo en el centro de la caja de petri
un cuadro de 3x3 cm, luego se siembro por punción al microorganismo patógeno, en este caso se
2
sembró a Fusarium Oxysporum en todo el centro del cuadro, por último se siembro masivamente
Trichoderma Harzianum teniendo en cuidado de no ponerlo dentro del cuadro donde se había
sembrado el patógeno. La caja de petri se dejó incubar a 22ºC durante 7 días.
Resultados
1. Técnica de enfrentamiento dual
Figura 4. Montaje de la prueba de enfrentamiento dual Figura 5. Crecimiento libre de Fusarium
Figura 6. Resultado del enfrentamiento dual
Tabla 1. Antagonismo in vitro de Trichoderma harzianum sobre F. oxysporum

Microorganismo Crecimiento libre (mm) Crecimiento influenciado (mm)
Fusarium oxysporum 43 31
%𝑃
Promedio del crecimiento radial de 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 (𝑃𝑃) − 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃
=
Trichoderma 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 (
𝑃𝑃𝑃𝑃 43 𝑃𝑃 − 31 𝑃𝑃
%𝑃= 𝑃100
𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 𝑃𝑃𝑃 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 (1𝑃𝑃 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 + 243 𝑃𝑃
𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃)
= % 𝑃 = 27.90 %
2
42 𝑃𝑃+44 𝑃𝑃
𝑃𝑃𝑃𝑃 = = 43 𝑃𝑃 (Figura 5.)
2
3
2. Técnica de Gauze
Figura 7.
Montaje de la técnica de Gauze Figura 8. Resultados de la técnica de Gauze
Tabla 2. Antagonismo in vitro de Streptomyces.sp sobre E. coli, Bacillus sp y S. aureus

Microorganismo Halos de inhibición en Halos de inhibición en Halos de inhibición en
mm de E. coli mm de Bacillus sp. mm de S. aureus
Streptomyces sp - 19 -
3. Técnica de Igarashi
Figura
9. Montaje de la técnica de Igarashi Figura 10. Crecimiento libre de Fusarium
4
Figura 11.
Resultado de la prueba en Agar AV Figura 12. Resultado de la prueba en Agar PDA
Tabla 3. Antagonismo in vitro de Trichoderma harzianum sobre F. oxysporum

Microorganismo mm en crecimiento radial agar avena mm en crecimiento radial agar PDA
Fusarium oxysporum 1 4
Agar AV Agar PDA
%𝑃 %𝑃
𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 (𝑃𝑃) − 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃
𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃
𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃
𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 (𝑃𝑃)
(𝑃𝑃) − 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃
= = 𝑃 100
𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 (𝑃𝑃) 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 (
62 𝑃𝑃 − 1𝑃𝑃 62 𝑃𝑃 − 3𝑃𝑃
%𝑃= 𝑃100 %𝑃= 𝑃100
62 𝑃𝑃 62 𝑃𝑃
% 𝑃 = 98.39 % % 𝑃 = 95.16 %
Coloración de Gram para S. aureus
Figura 12. Coloración de Gram, para S. aureus
5
Coloración fúngica
Figura 13. Coloración fúngica

para Fusarium oxysporum
Análisis
Técnica de enfrentamiento dual

Según los resultados de la Tabla 1 se logra evidenciar la actividad controladora que tiene Trichoderma
sobre Fusarium. Para conocer esta actividad se compara el crecimiento radial de Trichoderma, que en
este caso fue de 43 mm sobre el crecimiento radial de Fusarium que fue de 31 mm. El crecimiento
radial antagonista(RCA) y patógeno (RCP) dan evidencia de la competencia por nutrientes y espacio
que se da entre los dos cultivos de bacterias[7]. Asimismo esta medición determina el porcentaje de
inhibición de Trichoderma dando como resultado un 27.90 %. Este valor se encuentra dentro de la
escala de evaluación de la capacidad antagonista de Trichoderma sobre Fusarium propuesta por Bell
et ál., 1982; Calistru et ál., 1997; Ortiz y Orduz, 2001. [2]
Aunque el porcentaje es bajo con

con respecto a la capacidad
antagónica de Trichoderma, este da
evidencia de que hubo inhibición
es decir hubo una interacción
negativa entre Trichoderma y
Fusarium. Otras investigaciones
que se han realizado para comparar
las poblaciones de estas dos
bacterias también sustentan el
crecimiento acelerado que tuvo
Trichoderma frente a Fusarium. La investigación realizada por la Universidad Nacional, donde se
evalúa la capacidad antagónica que tiene Trichoderma sp sobre Fusarium oxysporum, verifica la
evidencia de la actividad controladora del hongo (Trichoderma) sobre el patógeno (Fusarium)[5].
6
Por otro lado también se tiene en cuenta el proceso de micoparasitismo (cuando los aislamientos del
antagonista, logran crecer sobre la superficie del micelio de F. oxysporum) que puede o no darse en
los diferentes cultivos, en este caso, como se muestra en la Figura 6, no se logró evidenciar este
proceso ya que la quitina de la pared celular de F. oxysporum, que está cubierta por una capa proteica,
previene la degradación por quitinasas y β-1-3-glucanasas que produce T. harzianum[7].Trichoderma
se ha reportado como hiperparásito de un gran número de hongos fitopatógenos al atacar directamente
y producir la lisis de micelio y también de esclerocios de hongos[8]. Este proceso de micoparasitismo
puede o no darse en los diferentes cultivos.
Técnica de Gauze
Esta técnica es de tipo antagonista ya que se dan interacciones actinobacteria-hongo, pero en nuestro
caso se planteó la práctica entorno a interacciones actinobacteria-bacteria. El antagonismo microbiano
está dado por la inhibición, deterioro o muerte de alguna especie de microorganismos por la acción de
otra; o una relación entre dos poblaciones en la cual una de ellas causa efectos deletéreos o negativos
a la otra [9]. En el caso del laboratorio el antagonista escogido es Streptomyces sp que es una bacteria
filamentosa que habita principalmente en el suelo donde tiene que competir por su supervivencia con
el resto de los organismos que existen y una manera de hacerlo es producir una gran cantidad de
antibióticos para matar a otros organismos que compiten con él y que incluso utiliza como nutrientes
para su propio desarrollo [10]; este se sembró por todo el Agar avena (AV), esperando que inhibiera
el crecimiento de tres microorganismos patógenos (Bacillus sp., S. aureus y E. coli) como se
evidencia en la Figura 7, donde se evidencia la colocación equidistante de los patógenos, sobre un
medio antagonista. Con los resultados obtenidos con la técnica de gauze (Figura 8.) se pudo
evidenciar que el Streptomyces sp. (antagonista), logró inhibir el desarrollo de S. aureus y E. coli,
mientras que el Bacillus sp. creció, pero no de una manera significativa, es decir que se nota un
crecimiento radial de aproximadamente 19 mm (Tabla 2.), lo cual deja entre dicho que el antagonista
no logra controlar por completo el crecimiento del Bacillus sp. Una de las razones por la cual el
Streptomyces sp. no pudo controlara a Bacillus sp., es que Bacillus sp. incluye especies responsables
del control biológico de enfermedades y plagas que atacan a los cultivos, es decir que actúan como
bacterias bioprotectoras (antagonista) y promotoras del crecimiento vegetal [11]. Es por esto que el
Bacillus sp. se comporta como antagonista depende de la especie y no logra inhibirse por la presencia
de otro antagonista, aunque este tenga un potencial de inhibición mayor.
Técnica de Igarashi.
El uso de Trichoderma como biocontrolador de microorganismos patógenos es muy usado y existen

varias técnicas que logran la identificación de esta capacidad inhibidora, Igarashi es una de estas
técnicas. En esta técnica se deben tener en cuenta dos factores principalmente, el porcentaje de
inhibición micelial (%MI), que es su mayoría es mayor al 50%, y la formación de un halo de
inhibición alrededor del crecimiento del patógeno que debe ser menor o igual a 1 cm.[5]. Con
respecto a los resultados obtenidos en el laboratorio, se puede ver en la Figura 11, agar AV, que lo
halos de inhibición alrededor del patógeno son mínimos y al momento de determinar el %MI da un
resultado muy alto, 98.39%. Además de esto se puede ver que el crecimiento de Fusarium se logra dar
en otras zonas lo que se puede explicar por el proceso de micoparasitismo donde el patógeno pasa a
ser alimento del antagonista.[7] Por otro lado en la Figura 12 se puede ver el agar con PDA que tiene
unos halos de inhibición un poco más significativos que en el otro agar. Al momento de realizar el
cálculo del % MI el resultado también es bastante alto, 95.16%. Estos porcentajes calculados dan
7
evidencia del gran proceso de inhibición que tuvo Trichoderma sobre Fusarium que se da gracias al
amensalismo. En esta interacción negativa se puede ver como Trichoderma produce sustancias o
toxinas que inhiben el crecimiento de Fusarium.
Al comparar la técnica de igarashi con la técnica de enfrentamiento dual se logra distinguir un aspecto
importante, la cantidad de recurso que tiene el patógeno. Por un lado en el enfrentamiento dual los dos
cultivos de microorganismos tienen la misma cantidad de recurso que pueden disponer, ya que las dos
colonias se siembran con una determinada distancia entre ellas, que es proporcional para las dos. Esta
asociación se conoce como competencia. Por otro lado está la técnica de igarashi en la cual se ve un
recurso más limitado para el patógeno ya que al sembrarlo por punción en un espacio determinado
será más difìcil la competencia por el recurso, además el antagonista ha sido sembrado masivamente
para inhibir el crecimiento lo que limita aún más el crecimiento del patógeno.
Coloración de Gram
El género Staphylococcus aureus está formado por cocos Gram positivos (Figura 12.), con un
diámetro de 0.5 a 1.5 μm, agrupados como células únicas, en pares, tétradas, cadenas cortas o
formando racimos de uvas. Son bacterias no móviles, no esporuladas, no poseen cápsula, aunque
existen algunas cepas que desarrollan una cápsula de limo, son anaerobias facultativas. La mayoría de
los estafilococos producen catalasa (enzima capaz de desdoblar el peróxido de hidrógeno en agua y
oxígeno libre) [12].
Coloración fúngica
Los resultados obtenidos de la coloración arrojaron la presencia masiva de conidios, que son
mitosporas asexuales, externas e inmóviles que se forman a partir de una célula conidiógena o hifa
fértil. En el caso del Fusarium oxysporum, este se caracteriza por producir colonias de rápido
crecimiento, con una tasa diaria cercana a un centímetro en medio papa- dextrosa agar (PDA) a 25°C.
El hongo produce tres clases de esporas: Microconidias: Esporas generalmente unicelulares, sin
septas, hialinas, elipsoidales a cilíndricas, rectas o curvadas; se forman sobre fiálides laterales, cortas,
simples o sobre conidióforos poco ramificados. Las microconidias tienen S- 12 prn de largo por 2.5-
3.5 prn de ancho. Macroconidias: Esporas de paredes delgadas, fusiformes, largas, moderadamente
curvadas en forma de hoz, con varias células y de 3 a 5 septas transversales, con la célula basal
elongada y la célula apical atenuada; las macroconidias tiene un tamaño de 27 a 46 IJm de largo por
3.0 a 4.5 IJm de ancho. Clamidosporas: Esporas formadas a partir de la condensación del contenido de
las hifas y de las conidias, de paredes gruesas. Se forman simples o en pares, terminales o intercalares:
poseen un tamaño de 5 a 15 IJm de diámetro [13]. Según lo anteriormente descrito se establece que lo
evidenciado en la Figura 13. no es lo suficientemente claro para entrar a realizar la clasificación, para
esto se tendría que llevar a cabo un análisis más profundo de lo obtenido.
Conclusiones
8
- Por medio de las técnicas realizadas en el laboratorio se concluye que la mayoría de
organismos fitopatógenos tienen antagonistas biológicos. En el caso de la primera técnica se
encontró como agente biocontrolador a Trichoderma.
- El porcentaje de inhibición de cada patógeno es importante ya que nos permite conocer el
crecimiento de este frente a un antagonista, este porcentaje se aplicó en dos de las técnicas
realizadas (enfrentamiento dual y técnica de Igarashi), mientras el porcentaje de inhibición se
encuentre más cerca a 100%, el antagonista tiene mejor capacidad de control sobre el
patógeno. En el caso del enfrentamiento dual entre Fusarium y Trichoderma el porcentaje fue
de 27,90% lo cual indica una inhibición por parte del antagonista sobre el patógeno, aunque
no sea el resultado esperado por lo descrito con anterioridad. En la técnica de Igarashi el
porcentaje de inhibición fue de 95.16% en el agar PDA y 98.39 % en el agar AV, lo cual
indica que la técnica empleada fue de gran efectividad por el valor correspondiente al
porcentaje de inhibición.
- En la técnica de Gauze se esperaba que el Streptomyces inhibiera por completo el crecimiento
del Bacillus sp., ya que algunas especies de este pueden actuar también como antagonistas,
dificultado la inhibición por otro controlador, es por esto que en los resultados obtenidos se
evidencia un crecimiento radial de este microorganismo a pesar de la presencia de un
biocontrolador natural como el Streptomyces
- Trichoderma sp. se caracteriza por llevar a cabo un proceso de micoparasitismo con algunos
microorganismos patógenos como lo es Fusarium sp. lo que a su vez logra la inhibición de
estos organismos.
- Lo que diferencia la técnica de enfrentamiento dual con respecto a la técnica de Igarashi el la
cantidad de recurso disponible que tiene el patógeno, siendo mayor en el enfrentamiento dual
que en Igarashi. Sin embargo hay que tener en cuenta los porcentajes de inhibición que se
lograron obtener, ya que tuvieron una diferencia elevada, que pudo ser causada por
contaminación de la muestra o por efecto de los agares usados.
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[10]Rocío Pérez-y-Terrón, T. S.-M.-R. (agosto de 2014). Antagonismo microbiano asociado a cepas
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Recuperado el 15 de MARZO de 2019, de Fusarium oxysporum EL HONGO QUE NOS FALTA
CONOCER: file:///C:/Windows/system32/config/systemprofile/Downloads/63462-326379-1-PB.pdf
10

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Figura 2. Técnica de Gauze en Agar PDA

1. Técnica de enfrentamiento dual

Figura 4. Montaje de la prueba de enfrentamiento dual Figura 5. Crecimiento libre de Fusarium

Figura 6. Resultado del enfrentamiento dual

Tabla 1. Antagonismo in vitro de Trichoderma harzianum sobre F. oxysporum

Tabla 2. Antagonismo in vitro de Streptomyces.sp sobre E. coli, Bacillus sp y S. aureus

Tabla 3. Antagonismo in vitro de Trichoderma harzianum sobre F. oxysporum

Coloración de Gram para S. aureus

Figura 12. Coloración de Gram, para S. aureus

Figura 13. Coloración fúngica

Técnica de enfrentamiento dual

Aunque el porcentaje es bajo con

El uso de Trichoderma como biocontrolador de microorganismos patógenos es muy usado y existen

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