PRÁCTICA No.

2- CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

DENISE ISABEL VERONA TAMAYO

ROSA ISELA ESCUDERO VERONA

TUTORA

DIANA EDHT MOLINA SOLER

BIOTECNOLOGIA

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD

ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGÍA E INGENIERÍA

PROGRAMA INGENIERÍA DE ALIMENTOS

2018
OBJETIVO.
 Estudiar la curva de crecimiento de Saccharomyces Cerevisiae.
 Usar la medición de la absorbancia como método de identificación
del crecimiento microbiano.


1. RESUMEN DEL LABORATORIO

En la práctica se pudo desarrollar el manejo de un cultivo bacteriano, el

uso de diluciones, mediante el uso del siguiente método:

El caldo nutritivo de E Coli estuvo preparado desde 24 horas antes en un

chequer para mantener la estabilidad del caldo. Estuvo demasiado
concentrado que al realizarlas diluciones no permitió que se pudieran leer
en el espectofotómetro y realizar el recuento mediante el método de
Turbidimetría

INTRODUCCIÓN
La célula microbiana es esencialmente una maquinaria de síntesis capaz
de duplicarse a sí misma. El proceso de síntesis para el crecimiento
bacteriano involucra unas 2000 reacciones químicas de una amplia
variedad. Una vez sintetizados los polímeros, el crecimiento continúa con
el ensamblaje y formación de nuevas estructuras celulares que finalizan
con la división en dos células hijas. En un medio apropiado física y
nutricionalmente, un cultivo se reproduce continuamente como células
vegetativas, los nutrientes absorbidos y metabolizados permiten crecer al
microorganismo.
MATERIALES Y MÉTODOS.
Curva de crecimiento.
Cuña de c/u de las cepas de Saccharomyces Cerevisiae en medio malta-
agarizado (18 h)
Erlenmeyers de 100 ml con 20 ml de medio extracto de malta, estériles
(2)
Erlenmeyers de 250 ml con 48 ml de medio extracto de malta, estériles
(9)
Placas de medio extracto de malta-agar (10)
Tubos de ensayo con 9 ml de solución salina estéril (80)
Reactivo 3,5-dns 500 ml o reactivos del fenol sulfúrico 500 ml
Puntas estériles para las pipetas automáticas. En su defecto
Pipetas de 1 y 5 ml, estériles. (35 de c/u)
Placas de medio extracto de malta-agar (80)
Tubos de ensayos de 15 x 150 mm (30)
Fotocolorímetro
Centrífuga
Zaranda orbital (shaker)
Vortex
Microscopios
 Metodología
Los estudiantes formarán grupos de tres estudiantes, máximo cinco,
quienes serán responsables de la ejecución de la práctica, los
implementos de laboratorio y la elaboración del informe final que deberán
entregar al tutor que dirija la práctica.
Procedimiento: 1. Preparación del inoculo
1.1. Prepare una suspensión de microorganismos a cultivar por lavado de
un tubo con agar inclinado de 18 h de incubación con 5 ml de agua
destilada estéril.
1.2. De la suspensión, inocule asépticamente 1 ml en Erlenmeyer de 100
ml que conteniendo 19 ml de medio líquido apropiado (caldo nutritivo).
1.3 incube por 18-20 h con agitación. Este será el inoculo.
2. Determinación de la Cinética de crecimiento
Transfiera 10 ml de inóculo a frascos Erlenmeyer de 250 ml con 50 ml del
mismo medio estéril, e incube con agitación a 37 °c. (Agitación
magnética). Tome asépticamente 2 ml de cultivo a las 0; 0,5; 1,0; 1,5;
2,0; 2,5; y 3 horas y lea la D.O. a 600 nm en un espectrofotómetro y
consigne los datos. Grafique la absorbancia en función del tiempo.
La muestra debe desecharse en un frasco conteniendo fenol al 5 % y la
cubeta lavada con solución de fenol en cada medición. Emplee como
blanco medio sin inocular.

RESULTADOS.

ABSORBANCIA ABSORBANCIA
TIEMPO (min) LECTURA 1 LECTURA 2
600nm 600nm
0 0.100 0,102
60 0.109 0,110
165 0.131 0,135
285 0.159 0,162
360 0.262 0,264
450 0.265 0,267
1155 0.268 0,269
1275 0.198 0,200
DESARROLLO DEL CUESTIONARIO.
1. (Grafique producción de biomasa contra el tiempo, e
identifique las diferentes fases de crecimiento escala normal
y semilogaritmica), con los siguientes datos:

ABSORBANCIA ABSORBANCIA
TIEMPO (min) LECTURA 1 LECTURA 2
600nm 600nm
0 0.100 0,102
60 0.109 0,110
165 0.131 0,135
285 0.159 0,162
360 0.262 0,264
450 0.265 0,267
1155 0.268 0,269
1275 0.198 0,200

ABSORBANCIA LECTURA 2 600nm

0.264 0.267 0.269
Axis Title

0.2
0.162
0.135
0.102 0.11

0.100 0.109 0.131 0.159 0.262 0.265 0.268 0.198

0 60 165 285 360 450 1155 1275

ABSORBANCIA LECTURA 2 600nm

2. Informe cuáles fueron los factores que influyeron en los

resultados obtenidos el domingo en la práctica y de las
recomendaciones que se deben tener en cuenta para poder
realizar correctamente la curva de crecimiento microbiano.
 Inicialmente el medio nutritivo donde se inoculo el microorganismo
estaba muy turbio, lo que permitió que el haz de luz del
espectrofotómetro se desviara y mostrara error en la lectura. Para
dar una mejor precisión en la lectura y se pueda dar la curva de
crecimiento esperada, se debe diluir el medio en concentraciones
más bajas para permitir que el espectrofotómetro pueda hacer la
lectura correcta.

3. Mencione los métodos directos e indirectos que pueden ser

utilizados para cuantificar la producción de biomasa.

• Método gravimétrico (directo): La cantidad de biomasa

presente en una muestra, se mide en peso seco por unidad de
volumen (sólidos en suspensión totales o sólidos en suspensión
volátiles). Las células se separan del líquido por filtración o
centrifugación.

• Método espectrofotométrico (directo): Relación directa

entre el número total de microorganismos presentes en una
muestra y su valor de turbidez, entre más turbia se encuentre el
medio mayor será el resultado, expresado en unidades de
absorbancia

4. ¿Explique los factores que afectan el crecimiento

microbiano?

Los factores ambientales afectan el crecimiento de los

microorganismos, ya que determinan la distribución de los
microorganismos en la naturaleza y nos permiten controlar sus
actividades.
Los principales factores que afectan el crecimiento son: pH,
temperatura, actividad acuosa, disponibilidad del sustrato, si los
anteriores parámetros para una bacteria determinada superan el
límite adecuado del que la bacteria utiliza para su activación y
reproducción, es posible que dicha bacteria sufra estrés y muera.

ANÁLISIS DE RESULTADOS
 En esta práctica, los resultados obtenidos estuvieron muy variables
debido a que el inóculo estaba muy concentrado.
  Se debió realizar disoluciones más claras para la concentración de
diluyera y permitiera hacer la lectura de la absorbancia en el
espectofotómetro y determinar así la cinética de crecimiento del
microorganismo.
 Los métodos espectroscópicos se basan en la capacidad de las
sustancias de absorber (o emitir) radiación electromagnética.
 El espectrofotómetro detecta la cantidad de luz transmitida o
absorbida a través de la solución en la celda y la compara con la
que se transmite o absorbe a través de una solución de referencia
denominada “blanco”.

CONCLUSIONES:

BIBLIOGRAFÍA
 Testak. DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA, MICROBIOLOGÍA Y
PARASITOLOGÍA FACULTAD DE FARMACIA, Cinética de la fase
exponencial de la curva de crecimiento microbiano. Recuperado de
http://www.testak.org/microbiologia/crecimiento/cinetica.pdf
 Wikis paces. Cinética crecimiento. Recuperado de
https://microorganismosusoindustrial.wikispaces.com/H.+CINETIC
A+CRECIMIENTO
 UNAD. Guía para el desarrollo del componente práctico
Biotecnología. Recuperado de
http://campus07.unad.edu.co/ecbti34/mod/folder/view.php?id=14
90
 Slideshare. Tapias Rojas, Yeralda. Factores que afectan el
crecimiento bacteriano. Recuperado de
https://es.slideshare.net/yerasleo/factores-que-afectan-el-
crecimiento-de-microorganismos
 PRÁCTICA No. 3– CUANTIFICACIÓN DE AZUCARES

DENISE ISABEL VERONA TAMAYO

ROSA ISELA ESCUDERO VERONA

TUTORA

DIANA EDHT MOLINA SOLER

BIOTECNOLOGIA

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD

ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGÍA E INGENIERÍA

PROGRAMA INGENIERÍA DE ALIMENTOS

2018
OBJETIVO.
 Entender la importancia de conocer el metabolismo de los
microorganismos promisorios a nivel industrial
 Establecer los métodos para cuantificar el consumo de diferentes
tipos de sustrato por diferentes microorganismos
 Analizar estadísticamente las diferencias existentes en el consumo
de diferentes tipos de azúcar por diferentes cepas comerciales de
levaduras.

RESUMEN DEL LABORATORIO

El laboratorio se desarrolló con el fin de que los estudiantes identificaran
lo que es la diauxia, que no es mas que el consumo del sustrato de mayor
agrado por parte de los microrganismos hasta agotarlo
Los microorganismos consumen diferentes tipos de sustratos, pero
poseen preferencia por un tipo particular de sustrato y algunos resultan
no consumibles para algunas cepas de una especie en particular. Cuando
dos o más sustratos están presentes en el medio de cultivo, los
microorganismos no los consumen por igual, sino que consumen
preferencialmente uno de ellos hasta agotarlo. Solo en este punto inician
el consumo del siguiente sustrato preferido.
Esa preferencia por un sustrato en particular es diferente para cada una
de las cepas de un organismo, y puede ser medida como la variación en
la velocidad de crecimiento, consumo de sustrato o generación de
producto.

2. INTRODUCCIÓN

Con la realización de esta práctica se pudo reconocer los diferentes

sustratos que utilizan los microorganismos para su crecimiento.
El uso del azúcar a diferentes concentraciones permitió identificar por
medio de la absorbancia, como un microrganismo agota su alimento.
También tiene que ser capaz de aplicar el conocimiento sobre el
metabolismo de un microorganismo y valorar su papel ecológico, su
función biogeoquímica y su utilidad en procesos industriales. En este
sentido, al finalizar la asignatura el estudiantado tiene que demostrar
tener una visión global de la importancia de los microorganismos en la
obtención de productos y procesos de interés industrial y ambiental.
El trabajo al laboratorio pretendió también motivar e involucrar el
estudiante para que participe activamente en el aprendizaje de los
contenidos de la asignatura, reconocimiento de varios reactivos como son
el 1 mL fenol y ácido sulfúrico
MATERIALES Y MÉTODOS
 8 x 2 g de levadura seca o húmeda de cerveza o de panadería.
Preferiblemente 3 grupos de laboratorio deben trabajar con el
mismo tipo de levadura.
 200 cm3 de solución de fructosa 0.2M
 200 cm3 de solución de galactosa 0.2M
 200 cm3 de solución de glucosa 0.2M
 200 cm3 de solución de lactosa 0.2M
 200 cm3 de solución de maltosa 0.2M
 200 cm3 de solución de rafinosa 0.2M
 200 cm3 de solución de sucrosa 0.2M
 8 x 0.5g de ortofosfato dihidrogeno de amonio
 8 x 0.5g de sulfato de amonio
 (Alternativamente puede emplearse 1g de nutriente de levadura
disponible comercialmente, para reemplazar las dos sales de
amonio)
 8 x 250 cm3 Erlenmeyers
 8 x tapones de caucho con dos orificios
 Varillas de vidrios
 Bureta de 50 cm3
 Jeringas aforadas de 25 cm3 o equivalentes para muestreo
 8 x 100 cm3 Erlenmeyers para titulación
 Solución de hidróxido de sodio 0.1M (alrededor de
 400cm3) Solución indicadora de fenolftaleína y gotero.

Metodología
Los estudiantes formarán grupos de tres estudiantes, máximo cinco,
quienes serán responsables de la ejecución de la práctica, los
implementos de laboratorio y la elaboración del informe final que deberán
entregar al tutor que dirija la práctica.
Procedimiento: 3.2 Curva patrón (Concentración de azucares totales)
A partir de caldo estéril (5 g/l = 5000 mg/l = 5.000.000 ug/l) obtenga
una solución de 150 ug/l (solución estándar)
A partir de la solución estándar prepare diluciones de 100 ug/l, 70 ug/l,
50 ug/l, 25 ug/l, 10 ug/l, y 5ug/l.
En un Erlenmeyer de 50 ml y se le añade 1 ml de solución de fenol al 5
%, mezclándolos bien. Se añade entonces 5 ml de ácido sulfúrico al 95%
se esperan 30 minutos y se lee la absorbancia a 489 nm.
Consigne los datos de absorbancia como se muestra en la siguiente tabla
para cada uno de los azucares.

De En Excel obtenga la ecuación de regresión lineal que relaciona la

Concentración de azúcar con la absorbancia, con punto de corte en 0,0
y = ax
y= absorbancia,
x = concentración azúcar

3.3 Cuantificación de azúcar consumido

De los tiempos 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; y 3 horas colecte muestras para
cuantificar azucares totales. Colecte 100mlts y dilúyalos hasta 3ml de esta
muestra tome 1ml en un Erlenmeyer de 50 ml y se le añade 1 ml de
solución de fenol al 5 %, mezclándolos bien. Añada 5 ml de ácido sulfúrico
al 95%. Se esperan 30 minutos y se lee la absorbancia a 489 nm.

Aplique la ecuación (x= y/a). Y el resultado divídalo por 0.33 (factor de

Disolución) elabore una gráfica en donde relacione producción de biomas
y consumo de sustrato.

4: Variables de respuesta

2,3 (log x2 - log x1)

= -----------------------------
t2 - t 1
yx/s = - (x2 –x1) / (s2 – s1)
RESULTADOS.

Solución de Agua esteril Absorbancia

Tubo
azúcar (mL) (mL) Fenol H2SO4
(490nm)
1 0,2 3,8 1 5 0,073
2 0,5 3,5 1 5 0,219
3 1 3 1 5 0,311
4 1,5 2,5 1 5 0,497
5 2 2 1 5 0,669
6 2,5 1,5 1 5 0,865
7 3 1 1 5 0,910
8 3,5 0,5 1 5 1,258
9 4 0 1 5 1,420

ABSORBANCIA
TIEMPO (min) LECTURA 1
490nm
0 2,220
60 2,070
165 1,895
285 1,423
360 0,646
450 0,265
1155 0,178
1275 0,144

DESARROLLO DEL CUESTIONARIO

1. Grafique la curva de calibración realizada con glucosa para evaluar

el consumo de sustrato de la E. Coli, con los siguientes datos

Solución de Agua esteril Absorbancia

Tubo
azúcar (mL) (mL) Fenol H2SO4
(490nm)
 1 0,2
2 0,5
3 1
4 1,5
5 2
6 2,5
7 3
8 3,5
9 4
3,8 1 5 0,073
3,5 1 5 0,219
3 1 5 0,311
2,5 1 5 0,497
2 1 5 0,669
1,5 1 5 0,865
1 1 5 0,910
0,5 1 5 1,258
0 1 5 1,420

Tener en cuenta que se preparó la glucosa con 3g/100mL de agua

destilada y luego se realizaron las diluciones como se indican en
la tabla

Concentración de Azúcar Vs
Absorbancia

4
3.5
3
2.5 y = 0.1679x - 0.1479
2 R² = 0.9837
y = 0.4867x - 0.4111 1.5 1.258 1.420
1 0.865 0.91
0.5 R² = 0.9983 0.497 0.669
0.2
0.073 0.219 0.311
1 2 3 4 5 6 7 8 9

Solución de azúcar (mL) Absorbancia (490nm)

Linear (Solución de azúcar (mL)) Linear (Absorbancia (490nm))

2. Grafique el consumo de sustrato durante el tiempo, y

explique cómo se relaciona con la formación de biomasa.

ABSORBANCIA
TIEMPO (min) LECTURA 1
490nm
0 2,220
60 2,070
165 1,895
285 1,423
360 0,646
450 0,265
1155 0,178
1275 0,144
 Consumo de sustrato durante el tiempo
1400

1200 y = 103.03x
R² = -0.969
1000

800

600

400

200

0
0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500

A medida que el microorganismo se va multiplicando el consumo de micro

y macromunientes del medio de sustrato es elevado, esto se da en la fase
de crecimiento exponencial, pero a medida que llega a esa fase
estacionaria y posterior muerte el consumo de sustrato se baja.
Se nota el agotamiento del sustrato por parte del microrganismo

Factores que alteraron los resultados de la práctica

 La medición de las concentraciones de azúcar y agua

 La calidad y pureza del reactivo entregado en la practica
 No seguir la guía de la práctica
 Desconocer las concentraciones y frescura de la glucosa y lactosa usada
 Mala adición del reactivo a los tubos de ensayo por parte de los estudiantes

ANÁLISIS DE RESULTADOS
 En esta práctica, los resultados obtenidos estuvieron muy variables
debido a no se siguió el protocolo en los siguientes puntos: En un
erlenmeyer de 50 ml y se le añade 1 ml de solución de fenol al 5 %
 mezclar bien
 Añadir 5 ml de ácido sulfúrico al 95%
 Esperar 30 minutos
  Las disoluciones se tornaron oscuras y no permitieron hacer la
lectura de la absorbancia en el espectofotómetro y el consumo del
sustrato.
BIBLIOGRAFÍA:

 Slideshare. Tapias Rojas, Yeralda. Factores que afectan el

crecimiento bacteriano. Recuperado de
https://es.slideshare.net/yerasleo/factores-que-afectan-el-
crecimiento-de-microorganismos
 UNAD. Guía para el desarrollo del componente práctico
Biotecnología. Recuperado de
http://campus07.unad.edu.co/ecbti34/mod/folder/view.php?id=14
90
 García-Mateos, Rosario Diferencias Entre Metabolitos Primarios Y
Secundarios. Recuperado 30 de abril de 2018 de
ttps://www.google.com.co/search?q=diferencias+entre+metabolit
os+primarios+y+secundarios&oq=diferencias+entre+metabolitos
+&aqs=chrome.1.69i57j0.16029j1j7&sourceid=chrome&ie=UTF-8
 Harborne, J. B. 1989. Recent advances in chemical ecology. Natural.
Natural Products Reports 6: 85-108.
 Maldonado, R. 1985. Los productos en las plantas. Vol. I. Centro de
Investigación en Química Aplicada. Coahuila. México.
 Petiard, V. Bariaud-Fontanel, A. 1987. El cultivo de células. Mundo
Científico 7: 730-736.
 Piñol, M. T.; Palazón, J. 1993. Metabolismo secundario. En:
Fisiología y Bioquímica Vegetal. Azcon-Bieto, J.; Talón, M. (eds)
Editorial Interamericana McGraw Hill. España.
 PRÁCTICA No.4 – AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
PRODUCTORES DE AMILASA

DENISE ISABEL VERONA TAMAYO

ROSA ISELA ESCUDERO VERONA

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DIANA EDHT MOLINA SOLER

BIOTECNOLOGIA

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ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGÍA E INGENIERÍA

PROGRAMA INGENIERÍA DE ALIMENTOS

2018
OBJETIVOS

 Comprender y analizar la metodología establecida para la

determinación de la actividad enzimática de la glucosa oxidasa.
 Analizar la relación entre la concentración de sustrato y su influencia
en la actividad enzimática.
 Conocer el procedimiento experimental para la obtención de los
parámetros cinéticos de la glucosa oxidasa.
 Determinar el tipo de inhibición enzimática presentada y su
fundamento bioquímico según los modelos matemáticos
establecidos.

RESUMEN DEL LABORATORIO

Para realizar este laboratorio ya se contaba con la dilución de 1g de
tierra seca con 15 mL de agua esterilizada y ya se había realizado los
siguientes pasos por parte del personal de la La Salle

Ya se le había realizado la incubación a 30°C durante 48 horas. También

la siembra en superficie en una placa de agar nutriente/almidón y el
extendido de la muestra por toda la superficie.
Las cajas de Petri estaban sobre el mesón a esperas del oportuno conteo
de las colonias antes de ser coloridas con yodo.
Por parte de los estudiantes no se procede a realizar el conteo previo,
evitando una comparación posterior.
Al proceder a teñir las placas con yodo inicialmente se tornan azul oscuro,
pero a medida que iba pasó el tiempo se notó aclaramiento de las placas,
una más que otras
Se miraron las colonias en él cuenta colonias para identificar la
degradación del almidón comparado con las otras dos unidades pues se
notaba un color marrón claro después de haber agregado el yodo y Se
realizó conteo de aquellas colonias que presentaron halos de hidrólisis
alrededor de las mismas
INTRODUCCIÓN

Con esta práctica, se aumentó el conocimiento sobre la cinética

enzimática, que estudia la velocidad de las reacciones químicas que
son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cinética y de la dinámica
química de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo
catalítico, su papel en el metabolismo, cómo es controlada su actividad
en la célula y cómo puede ser inhibida su actividad
por fármacos o venenos o potenciada por otro tipo de moléculas
Las enzimas, en su mayoría, proteínas con la capacidad de manipular
otras moléculas, denominadas sustratos.
El conocimiento adquirido acerca de la estructura de las enzimas ha sido
de gran ayuda en la visualización e interpretación de los datos cinéticos.
Por ejemplo, la estructura puede sugerir cómo permanecen unidos
sustrato y producto durante la catálisis, qué cambios conformacionales
ocurren durante la reacción, o incluso el papel en particular de
determinados residuos aminoácidos en el mecanismo catalítico. Algunas
enzimas modifican su conformación significativamente durante la
reacción.
Materiales y métodos.
 50 ml de agua destilada previamente esterilizada o agua peptonada
0.1% (p/v)
 Pipeta de 10 ml
 Pipetas de vidrio 1 ml estéril
 1 gr de tierra seca recogida 1 cm por debajo de la superficie, de
diferentes sitios o también a diferentes alturas o se pueden tomar
muestras de diferentes tipos de suelo (Se debe colocar en bolsas
estériles y rotular). Mínimo utilizar tres muestras
 Una solución de yodo
 Bastoncillos de algodón estéril
 Cajas de Petri estéril con 15 a 20 mm con nutriente de agar
preparado con 0,2 de almidón soluble
 Rotulador
Metodología
Los estudiantes formarán grupos de tres estudiantes, máximo cinco,
quienes serán responsables de la ejecución de la práctica, los
implementos de laboratorio y la elaboración del informe final que
deberán entregar al tutor que dirija la práctica.
Procedimiento:
1. Mezclar un gramo de tierra seca y diluirlo con 15 ml de agua
esterilizada.
2. Sembrar en superficie en una placa de agar nutriente / almidón y
extender la muestra uniformemente por toda la superficie.
3. Rotular la caja Petri con el nombre del grupo, fecha y sitio de
muestra.
4. Incubar a 30 grados durante 48 horas.
5. Realizar el recuento de todas las colonias, de cada uno de los sitios.
6. Vierta con mucho cuidado la dilución de yodo sobre las placas
inoculadas hasta cubrir completamente la superficie del agar. Las
zonas en que todavía quede almidón se teñirán de un color entre azul
y negro. Sí los microorganismos han degradado el almidón aparecerán
zonas de color marrón claro.
7. Realice el recuento de aquellas colonias que presenten halos de
hidrólisis alrededor de las mismas. Este recuento corresponderá a las
colonias con actividad amilo lítico.
8. Mida con una regla el diámetro en milímetros (mm) de cada uno de
los halos. Teniendo en cuenta la siguiente fórmula: C= A-B en donde:
A. Diámetro de la colonia más el halo de hidrólisis en mm.
B. Diámetro de la colonia en mm.
C. Diámetro del halo de la hidrólisis en mm.
9. Escriba los resultados de los puntos 5, 7 y 8 en la tabla.
 RESULTADOS

En una de las cajas de petri se pudo observar que se presentó mejor

degradación del almidón comparado con las otras dos unidades pues se
notaba un color marrón claro después de haber agregado el yodo:
En las otras dos la degradación del almidón no fue tan efectiva, pues más
del 50% del tamaño de la caja se tornaban azul oscuro.

ANÁLISIS DE RESULTADOS Y CONCLUSIONES

El desempeño de un microrganismo se ve afectado por el tiempo de
incubación y la temperatura
Se desconoce si el tiempo y la temperatura fueron controlados, además
si las proporciones de tierra y agua están acordes a la indicación.
No se pudo clarificar cuanto tiempo había transcurrido entre la hora en
que se sacaron las muestras de la incubadora y la posterior lectura
Gran falla no determinar el contero inicial de colonias antes de someter
los medios a la coloración con yodo para realizar un comparativo del antes
y del después del tratamiento
Desconocer las características morfológicas de las enzimas no permitió
hacer una caracterización mas detallada del como se comportó el ensayo,
pues solo la tutora pudo identificarlas.
Por simple observación, se identificó cual microorganismo fue mas
eficiente en la degradación de los almidones

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

 Revista virtual pro. Producción y aplicación de enzimas

industriales. Recuperado de
https://www.revistavirtualpro.com/biblioteca/produccion-y-
aplicacion-de-enzimas-industriales
 Blogspot. Enzimas microbianas y aplicaciones en la industria
alimentaria. Recuperado de
http://requetefritos.blogspot.com.co/2011/11/enzimas-
microbianas-y-aplicaciones-en.html
PRÁCTICA No. 5. IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
CAUSANTES DE ETAS

DENISE ISABEL VERONA TAMAYO

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2018
OBJETIVO

Reconocer la importancia de las técnicas de ingeniería genética

aplicadas al desarrollo Biotecnológico.

RESUMEN DEL LABORATORIO

Existen diferentes procedimientos para extraer ADN; esta requiere de una

serie de etapas básicas: En primer lugar, se hizo un proceso de macerado,
que consiste en romper la pared celular y la membrana plasmática para
poder acceder al núcleo de la célula. A continuación, se debe romper
también la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Para minimizar la
actividad de nucleasas (enzimas que degradan ADN) es muy importante
tomar bien la muestra a partir de la cual se desea hacer la extracción y
almacenarla de manera adecuada (refrigeración), seguido de la
eliminación de grasas o lípidos presente usando detergentes, y por último
la recuperación del ADN precipitándolo con alcohol

INTRODUCCIÓN

El ácido desoxirribonucleico (ADN) contiene las instrucciones genéticas

usadas en el desarrollo y el funcionamiento de todos los organismos vivos
conocidos y también de los virus, excepto algunos cuyo material genético
es ARN (retrovirus). La función principal de las moléculas de ADN es el de
ser portador y transmisor entre generaciones de información genética.

Para realizar cualquier análisis molecular: genética forense, clonación,

secuenciación, diagnóstico de enfermedades, producción y/o detección de
organismos transgénicos, estudios de ecogenotoxicología; entre otros, el
primer paso es extraer el ADN de las células que lo contienen.

Materiales y métodos
Fase 1: Aislamiento y cultivo de microorganismo.
Fase 2. Extracción de ADN.
Fase 3. Identificación del Microorganismo.

Fase 1: Aislamiento y cultivo del Microorganismo.

Si se desea identificar una bacteria:
1. Prepare un medio de caldo nutritivo (10 ml). Colocar en autoclave
o en su defecto a ebullición en un tubo de ensayo tapado. No
destapar hasta que el medio se utilice. Mida mediante un
espectrofotómetro la absorbancia.

2. Para el Aislamiento y cultivo de los microorganismos, tome el

alimento contaminado, corte un pedazo pequeño y colóquelo en los
10 ml de caldo nutritivo previamente esterilizado. Se deja
incubando a 37 ºC durante 24-48 Horas. De no tener incubadora se
deja incubando a temperatura ambiente 48 horas.

3. Identificar la turbidez del medio de cultivo, para ello medir por

espectrofotometría el medio incubado a la misma longitud de onda.
La diferencia en la absorbancia indicará el crecimiento del
microorganismo. Mientras más alta sea la absorbancia mayor será
el crecimiento.
Fase 2: Extracción del ADN microbiano.
4. Se procede al rompimiento de las células microbianas, para ello
coloque el medio de cultivo que contiene las células en un mortero,
agregue perlas de vidrio y proceda a su maceración en mortero
aproximadamente durante 30 minutos.

5. Centrifugue a 10 rpm durante aproximadamente 15 minutos, en

caso de no poseer centrifuga, deje precipitar los restos celulares.

6. Tome el sobrenadante y agrega SDS al 10%. En caso de no tener

este agente (SDS) agregue 5 gotas de lavaplatos líquido, estos
detergentes son buenos para poder eliminar la los lípidos presentes
que forman parte de la pared y membrana celular del
microorganismo y participan en el rompimiento de estas.

7. Procede a la filtración, con ayuda de un filtro de 0,2 micrómetros o

en su defecto un filtro desechable para cafetera. Asegúrese que el
tamaño del poro sea lo suficientemente pequeño para que no pases
grumos.

8. Agregue una cantidad mínima de ablandador de carnes, esto

detendrá las endonucleasas que digieren el ADN. Agregue 200 μL
de NaCl (5M), para preparar esta solución se puede utilizar sal
común o sal de cocina. Este reactivo permitirá precipitar proteínas
y evitar la desintegración del ADN.

9. Posteriormente centrifugue durante 20 minutos a 7000 rpm o en su

defecto deje duran 1 hora en reposo para producir la precipitación
proteica.

10. Transfiera el sobrenadante a otro tubo.

11. Se agrega 2 volúmenes de etanol 100% frío, y se agita por

inversión. hasta ver un grumo o línea blancuzca. (Este grumo o
línea blanca es el ADN, su abundancia dependerá de la eficiencia de
la extracción)

Si se desea almacenar el ADN

12. Centrifugue a 13000 rpm por 20 min en Microcentrífugar.
 13. Deseche el sobrenadante y seque por inversión o deposite en
baño seco (Torrey pines Scientific ®) a 60°C por 10 min (puede
incrementar el tiempo según la presencia de etanol).

14. Adicione 100 μL de Buffer TE, agite suavemente por vortex

durante 10 seg

Fase 3: Identificación del Microorganismo patógeno.

Para la identificación del microrganismo, se debe enviar este ADN a su

secuenciación, puede ser en cualquier entidad que tenga un secuenciador
de ADN. Este servicio lo prestan diferentes entidades como Macrogen en
estados Unidos.
Para simplificar el laboratorio supongamos que se mandó a secuenciar el
ADN extraído en el laboratorio dando el siguiente código genético.
RESULTADO DE LA SECUENCIACIÓN.
ESCHERICHIA COLI

Resultados
Desarrollo del Cuestionario
- Realice un diagrama de flujo sobre los procedimientos que
utilizó para desarrollar la práctica, puede utilizar esquemas
ó fotografías.
Desarrolle la fase 3 que se encuentra en la guía de laboratorio, y
responda todas las preguntas que se encuentran en la guía
Fase 3: Identificación del Microorganismo patógeno.

ESCHERICHIA COLI.
Por lo general, las bacterias Escherichia coli (E. coli) viven en los
intestinos de las personas y de los animales sanos. La mayoría de las
variedades de Escherichia coli son inofensivas o causan diarrea breve en
términos relativos. Sin embargo, algunas cepas particularmente
peligrosas, como la Escherichia coli O157:H7, pueden causar cólicos
abdominales intensos, diarrea con sangre y vómitos.

Puedes estar expuesto a la Escherichia coli proveniente del agua o de los

alimentos contaminados, sobre todo de los vegetales crudos y de la carne
de res molida poco cocida. Los adultos sanos se recuperan de la infección
por la Escherichia coli O157:H7 en una semana, pero los niños pequeños
y otros adultos corren un riesgo más elevado de manifestar una forma de
insuficiencia renal que puede poner en riesgo la vida, denominada
«síndrome urémico hemolítico».

1. Que enfermedades puede causar

 Cistitis
 Pielonefritis aguda
 Neumonía típica
 Intoxicación alimentaria bacteriana
 Colecistitis aguda
 Gastroenteritis por E. coli enterotoxígeno
 Prostatitis aguda bacteriana
 Gastroenteritis por E. coli enteropatógeno
 Gastroenteritis por E. coli enterohemorrágico
 Gastroenteritis por E. coli enteroinvasivo
 Aneurisma infeccioso
 Prostatitis crónica
 Abscesos anorrectales
 Peritonitis bacteriana secundaria
 Colangitis
 Epididimitis bacteriana no ETS
 Neumonía intrahospitalaria o nosocomial
 Endometritis puerperal
 Artritis sépticas
 Osteomielitis aguda
 Epididimitis
 Anemia hemolítica por infecciones bacterianas
 Peritonitis bacteriana espontánea
 Gastritis flemonosa aguda
 Absceso hepático por infecciones bacterianas
 Sepsis puerperal
  Entero hemorrágica

2. Cuáles son los síntomas y después de cuánto tiempo pueden

aparecer
Existen cientos de cepas de Escherichia coli, la mayoría inofensivas,
pero también hay un grupo, denominado E. coli Entero
hemorrágica, que pueden producir una potente toxina (toxinas de
Shiga o verotoxinas) que daña los glóbulos rojos y los riñones.

En el caso del brote infeccioso detectado en Alemania, se sospecha

que el patógeno causante es el E. coli O104, un serogrupo poco
usual, aunque en un principio se relacionó con la E. coli O157:H7,
una variedad similar y mucho más frecuente.

Estas bacterias se transmiten al ser humano principalmente a

través del consumo de alimentos contaminados, tales como carne
picada poco cocinada (la E. coli O157:H7 fue detectada por primera
vez en Estados Unidos en 1982, asociada a una intoxicación masiva
por consumo de hamburguesas); leche sin hervir, agua
contaminada, o por contacto directo con animales o personas
infectadas.

Síntomas

Los síntomas de la infección por E. coli Entero hemorrágica incluyen

fuerte dolor abdominal, diarrea intensa y a menudo con sangre y a
veces náuseas, vómitos y fiebre leve. Esta sintomatología suele
aparecer tres o cuatro días después del contagio, aunque también
pueden hacerlo entre 1 y 10 días después.

La mayoría de los pacientes se recuperan en diez días, aunque en

algunos casos el enfermo desarrolla el llamado Síndrome Hemolítico
Urémico (SHU), una complicación que produce anemia por la
destrucción de los glóbulos rojos e insuficiencia renal súbita. El
resultado puede ser un deterioro renal crónico o incluso el
fallecimiento.

Las personas con sistemas inmunes débiles, los ancianos y los niños
son, por lo general, los más vulnerables, aunque en el actual brote
de Alemania los más afectados están siendo adultos y en especial
mujeres. En general, para tratar a los enfermos, no se recomienda
 el tratamiento con antidiarreicos ni antibióticos, que podrían
empeorar la situación.

3. Cuáles podrían ser las causas de la contaminación y cómo

prevenirlas.
La bacteria conocida como Escherichia coli es uno de los organismos
contaminantes más peligrosos, dado que es el micro-organismo que
causa (entre otros problemas de salud) el Síndrome Urémico
Hemolítico (también conocido como SUH). La forma de contagio
más extendida en el caso de la Escherichia coli es por el contacto
con alimentos que ya estén contaminados o por el contacto de
persona a persona en condiciones de higiene precaria. Actualmente
se sigue recomendando como método preventivo de esta
enfermedad el lavado frecuente de manos con agua y jabón
(especialmente en caso de estar en contacto con una gran cantidad
de personas, como sucede en jardines o geriátricos)
Como la temperatura es uno de los elementos que destruye por
completo a la Escherichia coli, uno de los métodos más seguros y
confiables para eliminar los riesgos de contaminación al ingerir
alimentos es el cocinar las comidas a altas temperaturas. Otro de
los factores de importancia a tener en cuenta al momento de
prevenir la contaminación por esta bacteria es el de la
contaminación cruzada. Este tipo de contaminación se produce
cuando se establece un contacto entre dos elementos alimentarios
de distintos origen (estando uno de ellos contaminado). En todos
los casos se recomienda tener tablas para picar diferentes (para
productos cárnicos, vegetales, etc.).
Al momento de manipular alimentos es necesario tomar algunas
medidas preventivas para reducir riesgos de contaminación con
Escherichia coli. Es bueno lavarse las manos con agua y jabón antes
y después de la preparación de comidas (como en las ocasiones en
las que nos sentamos a la mesa para comer). Lavar las frutas y
verduras con agua potable (en caso de duda hervirlas para eliminar
cualquier riesgo de contaminación). Hay que recordar que los
alimentos más seguros son los que están muy fríos o muy calientes
(dado que impide el desarrollo de la bacteria).

4. Cuáles son las ventajas de utilizar técnicas de biología

molecular para la detección de ETAS.
La identificación de los patógenos de transmisión alimentaria
mediante métodos moleculares se ha vuelto cada vez más popular
en aspectos de calidad y seguridad, y en la producción de alimentos,
debido a que estas técnicas suelen ofrecer muchas ventajas (Tabla
4). La PCR, una de las técnicas más utilizadas en la detección e
identificación de bacterias causantes de ETA, es fiel exponente de
tales alcances; presenta rapidez, buen límite de detección,
especificidad y sensibilidad, fácil automatización y capacidad de
procesamiento de grandes cantidades de muestras. Para el caso de
algunos microorganismos, la PCR no requiere condiciones
anaeróbicas en comparación con el método de cultivo clásico.
Adicionalmente, a través de los métodos moleculares se identifican
microorganismos que no pueden ser estudiados por técnicas
convencionales o que no pueden cultivarse en substratos
artificiales.

Asimismo, no se puede pasar por alto que los microorganismos

transmitidos por alimentos están cambiando constantemente,
debido a su inherente capacidad de evolucionar y su sorprendente
habilidad para adaptarse a las diferentes formas de estrés. Por lo
tanto, la seguridad alimentaria debe ser vista como un proceso
continuo, influenciado por factores ambientales, socioeconómicos,
políticos y culturales. En este sentido, los métodos moleculares, sin
duda alguna, pueden ayudar en la detección de patógenos en
alimentos. Muchas de estas técnicas son mejoradas con el fin de
subsanar los inconvenientes encontrados, dando paso a nuevos y
variados métodos. Por ejemplo, la nanotecnología se está
convirtiendo en el estándar para los ensayos de diagnóstico y su
combinación con anticuerpos monoclonales, junto a la técnica de la
PCR, ha generado resultados muy específicos y sensibles.

Entre las desventajas (Tabla 4) de los métodos moleculares se

puede citar, en primer lugar, que aún no están ampliamente
incorporados en los métodos estandarizados, por lo cual resultan
inadecuados en algunos casos. Adicionalmente, requieren, en
comparación con los métodos de cultivo, equipos y reactivos
costosos.

Estas técnicas también son relativamente complicadas; necesitan

experticia y utilizan productos químicos peligrosos, por lo que el
análisis rutinario de muchas muestras resulta poco práctico. Debido
a la falta de protocolos estandarizados y a la calidad variable de
equipos y reactivos, la metodología tiene dificultades para pasar de
expertos a usuarios finales de los laboratorios.

Otros factores que limitan la aplicación de PCR, y de otros métodos

moleculares, en la detección e identificación de microorganismos
patógenos en alimentos, destaca la presencia de sustancias que
pueden ejercer un efecto inhibitorio sobre la reacción. La existencia
de tales inhibidores en alimentos, muestras clínicas y ambientales
ha sido reportada por varios autores. Estos pueden actuar a
diferentes niveles durante el proceso de extracción y amplificación
de los ácidos nucleicos y, en consecuencia, puede producir la
subestimación de la carga bacteriana, así como resultados falsos
negativos (2,20). En los métodos basados en la PCR, la ADN
polimerasa es probablemente el sitio blanco más importante de las
sustancias inhibidoras. La generación de resultados positivos por la
amplificación in vitro de ADN procedente de organismos muertos,
presentes en muestras de alimentos, es otra limitación potencial
(6,9). No obstante, la utilización del ARNr como secuencia blanco
puede ofrecer una solución a este inconveniente.
 5. Qué otras técnicas se podrían utilizar para detectar el
microorganismo causante de la ETA.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

La enumeración de patógenos transmitidos por alimentos es un aspecto

principal del diagnóstico molecular microbiológico, especialmente si
quiere utilizarse para la evaluación cuantitativa del riesgo. La reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) es la técnica de diagnóstico molecular más
ampliamente utilizada debido a su protocolo rápido y de fácil uso.Por lo
general, 2-3 h son necesarias para completar una PCR, pero hoy en día
se están desarrollando sistemas de PCR más avanzados para generar un
resultado en cuestión de minutos.

6. AMPLIFICACIÓN BASADA EN LA SECUENCIA DE ÁCIDOS

NUCLEICOS
Aunque menos desarrollada que la PCR, hay una serie de reportes en la
literatura sobre los ensayos de amplificación basada en la secuencia de
ácidos nucleicos (NASBA), incluyendo algunos que utilizan la metodología
de tiempo real, para detectar ARNm de patógenos asociados a
alimentos (30). Otros informes sobre el uso de esta tecnología para la
detección de patógenos en alimentos se prevén con mucho interés (10),
debido a su capacidad para detectar organismos viables. Sin embargo, en
un trabajo realizado por Rodríguez (2004) (31) la sensibilidad del ensayo
NASBA a tiempo real fue pobre, durante la detección de Mycobacterium
avium subsp. Paratuberculosis (MAP) en muestras de leche
artificialmente inoculadas. Se requirió más de 5×10 células, y la reacción
3

tampoco diferenció el ARN del ADN, reduciendo así la ventaja principal del
NASBA para la detección de células vivas solamente (9).

ELECTROFORESIS EN GEL DE CAMPO PULSADO

La electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) se ha utilizado para la

caracterización de Salmonella, Listeria y otros patógenos de transmisión
alimentaria. La base de datos de estos patógenos se almacena en Pulse-
Net y Food Net, a las cuales puede accederse a través del Centro para el
Control y Prevención de Enfermedades (CDC), la Administración de
Alimentos y Drogas (FDA) y el Departamento de Agricultura de los
Estados Unidos (USDA) (6).

Esta técnica se ha utilizado satisfactoriamente en la tipificación

de Salmonella, aislada a partir de alimentos de origen animal y
pacientes humanos (32). La PFGE también ha sido extensamente
utilizada a nivel mundial para la vigilancia e investigación de los
brotes de E. coli O157:H7, el trazado de las vías de transmisión y
el rastreo de las fuentes de brotes de restaurantes, granjas, aguas
contaminadas, animales, humanos, y/o equipos

ANALISIS DE RESULTADOS Y CONCLUSIONES

Muchas variables interfirieron en la extracción del ADN a partir de cepas
de E Coli y sthaphylococus aereus
La primera variable a considerar en el medio ambiente ene l qe se
desarrolló la extracción, pues por muchos instantes no contó con la
asepsia necesaria ni con un mechero encendido.
La calidad del macerado o extracción, fe realizado por varias manos, no
fue regular el proceso.
En el proceso de Extracción del ADN microbiano después de romper las
células y de la precipitación de los restos celulares, se toma el
sobrenadante, la solución SDS o detergentes son buenos para poder
eliminar la los lípidos presentes que forman parte de la pared y membrana
celular del microorganismo y participan en el rompimiento de estas.
En la practica se contaba con soluciones buffer que no se supo para que
eran o cual era su papel dentro del proceso
Se cambio los parámetros de centrifugación respecto a la guía.
La función del detergente y dl la solución SDS era disolver los lípidos
(moléculas grasas) y las proteínas de la membrana celular, rompiendo las
uniones que mantienen la integridad de la misma. De esta forma se libera
el contenido celular. Luego, la detergente forma complejos con los lípidos
y las proteínas, permitiendo que los mismos sean separados del ADN por
filtración. Así se libera el ADN
¿Cuál es la función del alcohol en la experiencia?
Generalmente el alcohol ayuda a fijar las reaccionan con las proteínas o
con los ácidos nucleicos, aumentando el contraste de la imagen, hasta ver
un grumo o línea blancuzca.
El ADN no es soluble en alcohol. Cuando el alcohol se agrega a la mezcla,
los componentes, excepto el ADN, permanecen en la solución mientras el
ADN precipita en la capa de alcohol. Se puede observar el ADN blanco el
cual precipita en la capa de alcohol.

Disuelve proteínas y otros compuestos innecesarios.

Normalmente, Al finalizar la experiencia se obtienen un mucus blanco que

sería el ADN, pero no fue posible que la molécula de ADN se visualizara a
simple vista. Cuando se obtienen buenos resultados, habría suficiente
ADN para levantar con una varilla de vidrio (el ADN se enrolla a la varilla).
O usando una pipeta de Pasteur que haya sido calentada en la punta para
formar un gancho, se puede recuperar (tomar) algo de ADN. El ADN tiene
la apariencia de mucus blanco y fibroso.
El mucus blanco contiene DNA, pero tambien estan precentes proteínas,
RNA y algunas otras biomoleculas como azucares grandes. No es posible
ver el DNA sin el uso de un microscopio por su tamaño, aunque esta mejor
dispuesto no tenemos la capacidad ocular para ver una cadena de 2.0 nm
de grosor.
Bibliografía:
 Wallace DJ, Van Gilder T, Shallow S, Fiorentino T, Segler SD, Smith
KE, et al. Incidence of foodborne illnesses reported by the foodborne
diseases active surveillance network (FoodNet)-1997. FoodNet
Working Group . J. Food Prot. 2000 Jun;63:807-9.
 Rodríguez-Lázaro D, Hernández M. Molecular methodology in food
microbiology diagnostics: trends and current challenges . IUFoST.
2006:1085-99. doi: 10.1051/IUFoST:20060643.
 Rodríguez-Lázaro D, Hernández M. Molecular methodology in food
microbiology diagnostics: trends and current challenges . IUFoST.
2006:1085-99. doi: 10.1051/IUFoST:20060643.Disponible en :
http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S172
6-46342014000300020