MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE FLAVONOIDES

1.- Método

Para la extracción de flavonoides se empleó el método sólido-líquido y líquido- líquido,

basado en la polaridad del butanol y en la basicidad de la solución del bicarbonato de sodio,

diseñado por Calderíus y Araluce, miembros del equipo de investigación del autor, para el

estudio del Tamarindus indica Lin, que resultó efectivo por ser los flavonoides preferentemente

solubles en solventes polares como el butanol.

El esquema de extracción fue el siguiente

Existen otros métodos basados en la polaridad de los solventes que usan mayor cantidad de

reactivos, por ejemplo:

Uno emplea Etanol, Éter etílico, Éter de petróleo, Benceno, Tetracloruro de Carbono,

Cloroformo y Acetona; en otro se usa Etanol, Éter de petróleo, Éter etílico, Bicarbonato de
sodio, Carbonato de sodio, Hidróxido de sodio y Ácido clorhídrico lo que los hace más caros y

además su peligrosidad es mayor por ser de alta toxicidad los reactivos que se emplean.
Por otra parte, los resultados en relación con la extracción de flavonoides, de acuerdo a

pruebas realizadas, resultan similares.

Multimed 2010; 14(3)

Julio-Septiembre

ARTÍCULO ORIGINAL

Ministerio de Salud Pública.

Filial de Ciencias Médicas "Efraín Benítez Popa". Bayamo-Granma.

Método para la obtención de flavonoides de hojas de Tamarindus indica Lin.

A method for the obtention of flavonoids from the leaves of Tamarindus indica Lin.

Valentín Balbuena Escalona1; Isabel Calderius Espinosa2.

1 Licenciado en Biología. Profesor Auxiliar. E-mail: vbalbuena@grannet.grm.sld.cu

2 Licenciada en Química. Instructor.

http://www.multimedgrm.sld.cu/articulos/2010/v14-3/2.html

2.-

MATERIALES Y MÉTODOS

Este trabajo se realizó en el Colegio de Postgraduados, Montecillo, Estado de

México. La flor de manzanilla (Matricaria recutita L.) proporcionada por los
productores de la región de Joyacan, Cuijingo, Estado de México, México, se
cosechó en diciembre de 2005. La cosecha se hizo cuando la flor estaba en plena
apertura, es decir, cuando las flores liguladas estaban en posición horizontal y de
50 a 75% de flores tubulares abiertas. La flor se deshidrató a temperatura
ambiente por 17 d, se descabezó y, mediante los tamices de malla 10 (2 mm) y 40
(0.42 mm), se separaron las partículas de acuerdo a su tamaño en: a) partícula
grande (>2.00 mm) con 20.5% flores liguladas, 7.7% flores amarillas y 71.8% de
tallo; b) partícula mediana (2.00 a 0.42 mm) con 19.3% flores liguladas, 62%
flores tubulares y 19.3% de tallo; c) partícula pequeña (<0.42 mm) con 10.2%
flores liguladas, 53.3% flores tubulares y 36.5% de tallo. El material se empacó en
bolsas individuales de plástico con doble cierre hermético resellable y se mantuvo a
20±2 °C en un cuarto oscuro.

La extracción se hizo en tubos de ensaye con tapa de bakelita conteniendo 20 mL

de disolvente y 1 g de flor de manzanilla; para tener la concentración deseada de
disolvente se empleó agua desionizada. Para conocer el número de tratamientos
requeridos se realizó la interacción de los factores y niveles (Cuadro 2). Los
tratamientos a 70±0.5 °C se hicieron con incubación. El extracto se filtró y refrigeró
para su estabilización por 3 d. Los flavonoides se cuantificaron con el método
colorimétrico de cloruro de aluminio (Chang et al., 2002). Para obtener la curva
tipo en la cuantificación de flavonoides, expresados como quercetina
Agrociencia vol.42 no.4 México may./jun. 2008

Fitociencia

Optimización del proceso de extracción de flavonoides

de flor de manzanilla (Matricaria recutita L.)

Optimization of the process of flavonoid extraction from

chamomile (Matricaria recutita L.)

José C. Meneses–Reyes1, Ramón M. Soto–Hernández1* , Teodoro Espinosa–

Solares3 y Martha E. Ramírez–Guzmán

http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1405-31952008000400005

3.-

Extracción de flavonoides por agitación Se siguió la metodología propuesta por Quiroz Reyes
y Mendez Aguilar (2013), con algunas modi caciones en la cantidad de muestra y solvente;
además del uso exclusivo de metanol y no de acetona. Para la extracción por agitación se
realizó una extracción orgánico-ácida de las cáscaras de cebolla roja. Para ello,
aproximadamente 15 g de cada muestra se extrajo con 200 ml de solución acuosa de metanol
(50 % v/v) conteniendo 0,1 ml de HCl 5 %. Se agitó con magneto durante una hora a
temperatura ambiente. Posteriormente, se centrifugó durante quince minutos a 400 rpm. Los
sobrenadantes se separaron y los residuos se extrajeron de nuevo con 200 ml de solución
acuosa de metanol (50 % v/v), repitiendo la centrifugación y combinando los sobrenadantes
con los obtenidos anteriormente.

Extracción de flavonoides por ultrasonidoSe siguió la metodología propuesta por Quiroz

Reyes y Mendez Aguilar (2013), con algunas modi caciones. Para la extracción orgánico-
ácida de la cáscara de cebolla roja por ultrasonido se pesaron aproximadamente 15 gramos de
cada muestra y se extrajeron con 200 ml de solución acuosa de metanol (50 % v/v) que
contenía 0,1 ml de HCl 5 %. Se colocaron a temperatura ambiente durante quince minutos en
un aparato ultrasonido a 25 kHz, posteriormente tras centrifugar (quince minutos a 400 rpm)
se separan los sobrenadantes y los residuos; se extrajo de nuevo con 200 ml de solución
acuosa de metanol (50 % v/v) y se realizó nuevamente el proceso de extracción vía ultrasónica
durante quince minutos, después se centrifugó y se combinaron los sobrenadantes con los
obtenidos anteriormente.
Extracción de flavonoides por UVC (ultrasonido, vortex y centrifuga)Se extrajeron 15 g de
cáscara con 200 ml de solución metanólica 50 % conteniendo 0,1 mL de HCl 5 % por diez
minutos de sonicación. La mezcla se agitó con vórtex durante cinco minutos, se sometió a
ultrasonido y se agitó una vez más, y se centrifugó durante diez minutos a 400 rpm (Ko, Nile,
Sharma, Li, y Park, 2014). Esta etapa se repitió dos veces, y los sobrenadantes se recogieron en
un frasco de 400 ml.

Cuantificación de flavonoides totales por espectroscopia ultravioletaEstos metabolitos se

cuanti caron con cloruro de aluminio en metanol 50 % a 374,5 nm. Los resultados se
expresaron como quercetina en una curva de calibración con concentraciones de 0 a 7,5 ppm
(Ochoa Pacheco, Marín Morán, Rivero Breff, y Aguilera Saborít, 2013). En un volumen de 50 ml
se añadieron: 1 ml de extracto de muestra extraída y 1 ml del cloruro de aluminio al 5 % en
metanol, se agitó y se dejó reposar por diez minutos. Se enrasó con metanol 50 % v/v y se
realizó la medición a 374,5 nm.Análisis cualitativo (Prueba de Shinoda) Se tomó en un tubo de
ensayo 1 ml de extracto obtenido por el método UVC. Se agregaron algunas limaduras de
magnesio. Se adicionaron cuidadosamente por la pared del tubo unas gotas de HCl
concentrado. La aparición de coloración roja comprueba positivamente la existencia de
avonoides (Carrión Jara y García Gómez, 2010)

Otros tipos de identificacion

2.2.6 Identificación de flavonoides 2.2.6.1 Patrones de absorción ultravioleta Todas las

variantes estructurales existentes dentro de la familia de los flavonoides, tienden a absorber
dentro de un rango que va desde los 220 a los 600 nm. Presentando generalmente dos
máximos de absorción que varían en intensidad y longitudes de onda según la naturaleza del
núcleo flavonólico (Andersen et al., 2006); uno a longitud de onda corta (320-385 nm) referido
como banda I correspondiente al sistema aromático B y otro a longitud de onda larga (250-285
nm) referido como banda II correspondiente al sistema aromático A, debido a la existencia de
dos grupos cromóforos ilustrados en la Figura 18, los grupo cinamoilo y benzoilo,
respectivamente (Ulubelen et al., 2005). 43 O O A C B Figura 18. Grupos cromóforos de los
flavonoides (Ulubelen et al., 2005). La insaturación entre los carbonos 2 y 3, la posición de los
grupos hidroxilo en las agliconas, o la presencia de residuos de carbohidratos afectan la
absorción de los núcleos causando desplazamientos bato e hipsocrómicos, debido a que este
tipo de grupos auxocromos (grupos hidroxilos) contribuyen electrónicamente a los sistemas
aromáticos, al tiempo que las insaturaciones favorecen la conjugación del grupo fenilo (anillo
B) con el grupo carbonilo encontrado en el anillo heterocíclico tipo pirona (Kumas et al., 2013),
como se puede apreciar en las estructuras de resonancia tanto del anillo A, como del anillo B
en la Figura 19. O O HO OH OH H O O + OH O - OH O O HO HO OH HO O OH O + H O - B A A
Figura 19. Estructuras resonantes implicadas en la actividad electrónica del anillo pirónico
(Bohm et al., 1998). De esta manera, las flavonas y flavonoles, por contar con su insaturación
entre los carbonos 2 y 3 del anillo pirano, presentan sus dos bandas de absorción de 44
intensidad considerable en los rangos (310-350) nm y (350-385) nm para la banda I, y (250-
280) nm para las bandas II, respectivamente. Es de destacar el hecho de que la absorción de la
banda I en flavonoles 3-substituidos sufre un desplazamiento a longitudes de ondas más cortas
(desplazamiento hipsocrómico) (Andersen et al., 2006). Igualmente, las flavononas que
carecen de insaturación entre el carbono 2 y 3 solo se observa una señal de absorción
considerable por parte de la banda II dado que el cromóforo cinamoilo desaparece y el grupo
benzoilo permanece intacto. Este efecto también es observado en las isoflavonas debido a que
el enlace del anillo B en el carbono 3 imposibilita la conjugación del grupo fenilo (Anillo B) con
el carbonilo del anillo pirona, reduciendo en ambos casos la absorción de la banda II a solo un
hombro con respecto de la otra señal de absorción (Bohm et al., 1998). Finalmente las
chalconas, auronas y antocianinas presentan los siguientes patrones de absorción ultravioleta.
 Chalconas: Banda I (365-390) nm intensa y Banda II (240-270) nm de menor intensidad. 
Auronas: Banda I (390-430) nm intensa y Banda II (240-270) nm de menor intensidad. 
Antocianinas: Banda I (465-560) nm y Banda II (270-280) nm, ambas de intensidad media.
2.2.6.2 Identificación de flavonoides por Resonancia Magnética Nuclear (RMN) Esta
herramienta espectrocópica, se ha convertido tal vez en la técnica que mayor información
brinda, puesto que con ella pueden dilucidarse estructuras completas, incluyendo isomería y
configuraciones anoméricas en el caso de los carbohidratos; por esta razón la química de
productos naturales se vuelve de vital importancia contar con tal tipo de información cuando
se pretende elucidar estructuralmente cualquier tipo de molécula aislada, incluyendo los
flavonoides. Al realizar la toma de espectros deben considerarse algunas variables, como el
tipo de solvente a utilizar y los experimentos a realizar. El primero de ellos, puede depender de
la muestra estudiada y su polaridad, por lo cual dada la naturaleza del núcleo flavonólico
altamente polar, el uso de hexadeuterodimetilsulfóxido (DMSOd6) y tetradeuterometanol
(CD3OD) ha sido altamente difundido, de igual forma, al estudiar flavonoides de baja polaridad
puede considerarse la utilización de deuterocloroformo (CDCl3), pentadeuteropiridina, entre
otros. Otro factor que afecta la elección del solvente a utilizar es la temperatura de los
experimentos a realizar dado que la utilización de sondas criogénicas pueden acarrear
problemas relacionados con el alto punto de fusión 45 experimentos de alta temperatura
como los realizados para observar la conformación rotamérica de los núcleos glicosilados
pueden afectarse por el bajo punto de ebullición del cloroformo (Andersen et al., 2006). Con
respecto de los experimentos a utilizar, los clásicos experimentos unidimensionales 1H-RMN y
13C-RMN pueden brindar información acerca del número de hidrógenos y carbonos que
constituyen la molécula, descartar o no la presencia de los carbohidratos más comunes y su
configuración anomérica (Agrawal et al., 1992), pero generalmente para completar la
distribución espacial de este tipo de compuestos es muy necesario conocer las interacciones
de núcleos vecinos sean o no de la misma naturaleza, para lo cual los experimentos de dos
dimensiones (2D-RMN) pueden ser muy útiles. De esta manera, experimentos de correlación
como COSY (Correlation Spectroscopy) y TOCSY (Total Correlation Spectroscopy) pueden
mostrar las interacciones homonucleares de protón y heteronucleares protón-carbono hasta
distancias correspondientes a 4J, respectivamente. Además de ello, experimentos como HMBC
(Heteronuclear Multiple Bond Coherence) y HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation)
pueden mostrar interacciones espaciales a través de varios carbonos o la relación únicamente
entre átomos geminales, respectivamente. Finalmente, con los amplios estudios realizados
sobre este tipo de compuestos, se ha logrado la identificación de los desplazamientos de
protón y de carbono más comunes para los diferentes tipos de núcleos flavonólicos conocidos
y los efectos de la glicosilación sobre los mismos, mostrados en las Tablas 5 y 6. Además de
ello, para elucidar la estructura de las formas glicosiladas aisladas del material vegetal se hace
importante tener en cuenta los patrones de resonancia de los carbohidratos, los cuales son
observados en rangos muy estrechos para la totalidad de los átomos que los componen,
debido a la similitud de ambientes químicos que presentan los protones metinos y metilenos,
para tal fin se muestran algunos de los desplazamientos químicos para los carbohidratos más
comunes en las Tabla 7 y 8 (Agrawal et al., 1992).
http://repositorio.utp.edu.co/dspace/bitstream/handle/11059/4609/547869M385.pdf?seque
nce=1&isAllowed=y