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DDDDDDANTIBIOTICOS

PRODUCCION DE PENICILINA
Definición y Procedencia. Un antibiótico es una sustancia química producida por un organismo
vivo que muestra actividad inhibidora o germicida frente a microorganismos. La actividad
antibiótica se califica en ocasiones de: antibacteriana, antifúngica o antimicrobiana.

Producción de antibióticos. Los antibióticos son producidos por ciertos hongos, bacterias,
actinomicetos, algas y líquenes.

El origen más importante y fértil de antibióticos de importancia comercial es el género


Streptomyces de los actinomicetos. Muchos mohos producen antibióticos, tales como la
penicilina que es el ejemplo más destacado producido por los mohos.

En la producción de antibióticos muchos de los detalles específicos siguen siendo, con algunas
excepciones secretos industriales.

Producción de Penicilina. Para la producción de penicilina se siguen los siguientes pasos:

1) Aislamiento de mohos.

Método de incubación directa. Para este método se hace lo siguiente:


a) Se prepara un medio de cultivo de bacterias, el más usado es el Staphylococcus aureus. Para
el cultivo de estas bacterias se preparan tres medios de nutrición, que son los siguientes:

Medio 1. Cuya composición es la siguiente:


Peptona 6,0 g.
Hidrolizado pancreático de caseina 4.0 g.
Extracto de levaduras 3,0 g.
Glucosa 1,0 g.
Agar 15,0 g.
Agua destilada c.s. hasta 1000,0 ml.
PH – 6,5 – 6,6 tras la esterilización

Medio 2. Denominado agar base, su composición es la siguiente:


Peptona 6,0 g.
Extracto de levaduras 3,0 g.
Agar 1,5 g.
Agua destilada c.s. hasta 1000,0 ml.
PH – 6,5 – 6,6 tras la esterilización.
Medio 3. Denominado caldo de cultivo, su composición es la siguiente:
Peptona 5,0 g.
Extracto de levaduras 3,0
Extracto de carne de buey 1,5 g.
CLNa 3,5 g.
K2HPC4 3,68 g.
KH2PO4 1,32 g.
Agua destilada c.s. hasta 1000,0 ml.

El sembrado de bacterias se obtiene de la siguiente forma:


El microorganismo obtenido (Staphylococcus aureus) en tubos inclinados con el medio 1, se
inocula al caldo de cultivo (medio 3), este caldo se deja incubar a 37ºC por 16 a 24 horas; 2 ml.
De este caldo se mezclan con 100 ml. del medio 1, que se ha fundido y enfriado a 48ºC y se tiene
listo el cultivo de bacterias. Posteriormente en una caja petri de 20 x 100 mm. se hecha 21 ml. de
agar base (medio 2), se deja solidificar y se añade 4 ml. de agar sembrado (cultivo de bacterias) y
se reparte uniformemente haciendo oscilar la placas.

b) Las cajas petri con sembrado de bacterias se incuban a 2º ó 37ºC durante uno a dos días,
después se deja caer sobre la superficie pequeñas partículas de suelo (fresco o enriquecido),
se deja incubar por espacio de 5 a 10 días.

c) Después de los días indicados se observan las cajas petri, los organismos antagonistas
producirán zonas claras alrededor de sus colonias como resultado de la inhibición del
crecimiento de las bacterias adyacentes o de su destrucción.
d) Estos microorganismos (mohos) se aislan en colonias o cultivos puros y se analiza las
características deseadas de las razas productoras de penicilina, que son principalmente del
grupo Penicillium notatun – chrysogenun.

e) Pruebas de selección del moho aislado: Esta prueba se realiza en medio de cultivo de
bacterias (Staphylococcus aureus). Para ésto el cultivo de moho aislado se somete a
crecimiento en un medio que se prepara de la siguiente forma: se añade 1% en volumen de
líquido de remojo de maíz (55% de sólidos) a la solución ezapek ajustando el pH a 7,
adicionando 2% de agar y distribuyendo 20 ml. en cada tubo de ensayo, luego se vierte en
cajas petri y se siembra el moho aislado y se incuba; al mismo tiempo se preparan placas
testigo con dos cultivos diferentes de P. Notatun o P. Chrysogenun conocidos como buenos
productores de penicilina, cada placa se debe incubar por espacio de 6 días a 24ºC. Al final
del periodo de incubación se cortan 4 o 5 muestras con un sacabocados y se coloca en la
superficie del medio de agar sembrado con Staphylococcus aureus, las plazas se incuban
durante una noche a 37ºC y las zonas de inhibición se mide empleando una lupa con una
precisión no inferior a 0,25mm. y los resultados se comparan con los testigos.

2. Producción de penicilina. La penicilina se puede producir por medio de cultivo superficial


o sumergido. En los medios de cultivo superficial el moho crece en la superficie de capas
poco profundas del medio de fermentación. En los medios de cultivo sumergido, el moho se
desarrolla sumergido en el medio de fermentación.
Mohos usados. Ningún otro detalle tiene mayor importancia en la producción en un antibiótico
que la selección de una capa seleccionada apropiada. Las cepas más usadas para la producción
de la penicilina son:

P. Notatun y P.Crysogenun.

Medios de esporulación. En la producción de penicilina es necesario desarrollar rápidamente


gran número de esporas para la inoculación y resiembra.

Se tiene varios métodos de esporulación de los cuales se expondrá uno de ellos. Para el medio
de esporulación se cortan en cubos de un centímetro de lado pan integral fresco (libre de
inhibidos de mohos) y se esteriliza con vapor en capas finas en matraces Erlenmeyer. El pan
enfriado se inocula masivamente con esporas de mohos y se incuba a 25º - 27ºC durante 4 - 5
días, después de sacar los cultivos de pan se puede guardar durante al menos dos semanas a 40º
El plan cubierto de esporas se puede pulverizar perfectamente a los 6 – 7 días y se usa para la
inoculación.

Métodos de inoculación. En los métodos de cultivo superficial, la superficie del medio se


inocula con esporas secas, bien solos o mezcladas con algún tipo de material de tipo de harina de
trigo.

En métodos de cultivo sumergido al medio de inolución se puede hacer con esporas secas, con
esporas sin germinar, en suspensión o con gránulos inoculantes.

En un procedimiento de producción de penicilina, las esporas del moho se usan para sembrar un
medio de germinación de matraces, después de un periodo de incubación en el sacudidor se
transfiere los contenidos de los matraces a recipientes especiales de metal, este tanque especial se
conecta acépticamente al tanque de siembra y se impulsa al interior del fermentador la suspensión
del moho utilizando aire estéril.

Materias primas. En la selección de materias primas para la producción de penicilina es


esencial considerar las necesidades nutricias del hongo, las condiciones óptimas para la
acumulación de la penicilina y la subsiguiente extracción y purificación de la penicilina.

Fuentes de carbono. La lactosa es la mejor fuente de carbono para la producción de penicilina,


usándose una concentración del 6%. También puede usarse 3% de lactosa, almidón de maíz, y
dextrina de maíz. A pequeñas velocidades de alimentación se puede usar glucosa y sacarosa en
vez de lactosa.

Fuentes de nitrógeno. Las sustancias usadas como fuente de nitrógeno son: nitrato sódico,
sulfato, acetato, y lactato amónico, líquido de remojo de maíz y otros materiales.

Elementos minerales. Ciertos elementos (P, K, Mg, S, Mn, Cu) parecen esenciales o al menos
beneficiosos para la producción de penicilina, aunque algunos de ellos se encuentran en el líquido
de remojo de maíz. Los diferentes minerales se suministran en forma de Kh 2PO4, MgSD4, 7H20.
Las concentraciones de estas sales en el medio son: KH 2PO4, 0,019 M, MgSO47H20 0,002 M y
NaN03 0,019 M.
Líquido de remojo de maíz. El uso de líquido de remojo de maíz en el medio de fermentación,
aumenta grandemente los rendimientos de penicilina, el líquido de remojo de maíz debe tener la
siguiente composición:
Sólidos 40 – 60%
Acido láctico 12 – 27% x
Nitrógeno total 7,4 – 7,8% x
Nitrógeno amínico 2,6 – 3,3% x
Azúcar reductor en glucosa 1,5 – 14% x
Cenizas 18 – 20% x
x = referido a producto seco.

Harina de semillas de algodón. Puede usarse como sustituyente del líquido de remojo de maíz.

Precursores. Sustancias utilizadas en la producción de antibióticos (penicilina) para incrementar


el rendimiento del producto. Los precursores más usados son: fenil acético que favorece la
producción de la penicilina G por P. Chrisogenun.

El ácido p-hidroxifenil acético incrementa la producción de penicilina X Aminoácido L-cistina,


L-cinteina y valinas.

Condiciones de fermentación.
Temperatura. La temperatura óptima para la producción de penicilina parece ser de 24ºC.
Regulación de pH. Es esencial la regulación de pH durante la fermentación, ya que un pH alto o
bajo origina considerables pérdidas de penicilina.
El pH de fermentación debe mantenerse de 5 a 7.5.
El pH del medio resulta afectado por el tipo y cantidad de azúcar presente, cantidad de líquido de
remojo de maíz, existencia de amortiguadores, etc.
Aireación. La adecuada aireación es esencial para mantener rendimientos óptimos de penicilina
ya que los mohos son microorganismos aerobios.

Taylor describe en un método usado por él, que es conveniente una insuflación de aire 11.500
litros por hora para un fermentador de 20.000 litros de capacidad.
Presión. El uso de presión en los tanques para incrementar la efectividad de la aireación es una
práctica común en los procesos de producción.

Se realiza generalmente las fermentaciones en tanques a una presión de 1,5 atmósferas. La


reducción de presión a 0,15 atmósferas no afecta la producción, pero una presión mayor a 3
atmósferas reduce la producción del mismo.

Agitación. El uso de un tipo apropiado de agitación y a una velocidad adecuada suele mejorar los
rendimientos de penicilina, pues comunica una velocidad de aireación constante durante la
fermentación.

Agentes antiespumantes. La eliminación de la espuma excesiva mejora el rendimiento de la


penicilina.

Entre las sustancias antiespumantes que se usan están las siguientes: Citrato de tributilo,
octadecanol, en solución al 3% en aceite de manteca de cerdo, octadecanol al 3% en aceite de
soya.
Prevención de la contaminación. Es muy importante prevenir la contaminación del medio de
fermentación, la contaminación produce la rápida destrucción de la penicilina, para evitar se debe
esterilizar todos los tanques de fermentación, tuberías o instalaciones en las que puede tener
contacto la penicilina. Es necesario utilizar aire esterilizado para la aireación, los agentes
antiespumantes también se deben esterilizar antes de introducir al tanque de fermentación.

Aislamiento y purificación de la penicilina. El objeto del aislamiento consiste en separar las


cantidades relativamente mínimas de antibiótico de las células productoras y del considerable
volumen del medio agotado.

La primera fase es el proceso de recuperación es la separación del micelio o células por filtración
o centrifugación. Se pueden usar filtros contínuos de vacío, filtros de Bird-Young, centrífugas de
cesto u otra instalación, dependiendo de la naturaleza de las células. La segunda fase importante
consiste en extraer el antibiótico del medio de producción agotado, con disolventes, por
adsorción, por precipitación o por una combinación de estos métodos.

La extracción en disolventes puede efectuarse en extractores a cortacorriente como los del tipo
Podhielniak, en tornos, en frascos, en el sistema de distribución de Graig o de otras formas
dependiendo del volumen del material y del objetivo perseguido. Para la extracción se puede
usar acetato de amilo, éter, cloroformo, acetona y otros disolventes según la solubilidad del
antibiótico, posibilidad práctica, y otros factores. La temperatura, la regulación del pH son
factores muy importantes para la consecusión de elevados rendimientos de extracción de
antibióticos.

La adsorción se puede realizar sobre carbón activo, resinas de intercambio iónico u otros
materiales.

La purificación se realiza por extracción adicional con disolventes, destilación, sublimación,


cromatográfica en colúmna o por otros procedimientos dependiendo de la naturaleza del
antibiótico, su costo y otros factores. El antibiótico se esteriliza, eliminándole los pirógenos
(sustancias que producen reacciones febriles) por filtración a través de filtros Seitz, moleculares u
otros bacterianos de tipo apropiado.

Comprobación, ensayo y certificación. Se realizan ensayos para la comprobación de la


potencia del antibiótico y prueba de esterilidad, pirígenos, humedad y otras características según
se requiera.

La potencia de la penicilina se determina de una manera similar al método de aislamiento de


cultivos de mohos puros. Es decir se emplean los mismos medios de cultivo para las bacterias, el
mismo tipo de bacteria, sólo se diferencia en que en vez de las partículas de suelo se coloca la
penicilina obtenida, y al mismo tiempo penicilinas patrones después de la incubacion se mide las
zonas claras alrededor del antibiótico y se los compara con el antibiótico patrón y los resultados
de comparación se evalua por medio de gráficas y de esta manera se puede conocer la potencia de
la penicilina obtenida.

Métodos de valoración de la penicilina. Entre los métodos de valoración de penicilina se tienen


los siguientes:
Método del cilindro y placa (método microbiológico).
Método yodométrico (metodo químico).

Propiedades de la penicilina. La penicilina es activa frente a ciertas bacterias Gram-positivas en


presencia de sangre, pus y fluidos orgánicos.

Puede ser considerada como atóxica, ya que es posible administrar dósis muy grandes durante un
periodo de tiempo sin efectos perjudiciales. En un pequeño porcentaje se pueden presentar
alergias individuales a la penicilina. Urticaria, ardor y picazón son algunas de las respuestas que
se observan en personas sensibles.

Según Welch y colaboradores la penicilina produce una inhibición parcial de la fagocitósis.

La penicilina es soluble en agua, muy soluble en acetona, acetado de amilo, ciclohexano,


dioxano, acetato de etilo, etanol y éter, y poco soluble en benceno, cloroformo y tretracloruro de
carbono.

Es inestable frente a un gran número de agentes por Ej. la descomponen los ácidos y alcalis
fuertes. Se inactiva por los agentes oxidantes, debe evitarse el contacto con ciertos metales
pesados como cobre, plata, plomo y mercurio ya que tienden a destruir la penicilina. Destruye
también la penicilinasa, enzima producida por algunos mohos, levaduras y bacterias. Las
soluciones acuosas de la penicilina son inestables y se debe conservar refrigeradas, también el pH
influye en la estabilidad de la solución acuosa.

Tipos de penicilina. Los tipos más comunes de penicilina son: Penicilina F, G, X, K., cuyas
estructuras se indicarán después.

La mayor parte de las penicilinas son mezclas generalmente de los tipos F, G, K, aunque la
penicilina G es la que se produce en mayor cantidad y la que se considera más práctica. La
penicilina G sódica cristalina debe contener al menos 90% de penicilina G.