TÉCNICAS PARA MEDICIÓN DE BIOMASA

María Cecilia Padilla1, Alexander Sánchez 2, Felipe Vega3 , Carlos Godin 4, Carlos Barrios
5
, Heiner Montalvo 6

1
Estudiantes de Ingeniería de Alimentos, Universidad de Córdoba, Berástegui, Colombia.

Orientador: PhD. Deivis Lujan Rhenals

RESUMEN

El objetivo de la practica fue desarrollar la habilidad y competencia para la

medición de biomasa microbiana que interviene los procesos, las técnicas
realizadas fueron conteo directo por cámara de Neubauer, peso seco y
densidad óptica; se preparó una solución madre con Saccharomyces
cerevisiae, luego se prepararon las soluciones problemas y aplicaron las
técnicas mencionadas anteriormente, como se indica en el procedimiento.

Palabras clave: densidad óptica, cámara de Neubauer, Bioprocesos.

SUMMARY

The objective of the practice was to develop the skill and competence for the
measurement of the microbial biomass that intervenes in the processes, the
techniques, the measurements, the results. A stock solution was prepared with
Saccharomyces cerevisiae, then the problem solutions were prepared and the
above techniques were applied, as indicated in the procedure.

Keywords: optical density, Neubauer chamber, bioprocesses.

 INTRODUCCIÓN

El crecimiento poblacional bacteriano puede definirse en términos del

incremento en la masa celular o del número de células. Generalmente estos
dos parámetros guardan una relación directamente proporcional, pero variar
según las condiciones de cultivo (Rodríguez, 1997).

La masa celular es expresada ya sea como peso seco, volumen celular

empacado, contenido de nitrógeno o turbidez, esta última es la más
usualmente empleada pues su medición rápida es un espectrofotómetro
permite rastrear la densidad de un cultivo mientras está creciendo (Rodríguez,
1997).

Este incremento puede ser estimado por diferentes métodos, entre los cuales
los más utilizados en los laboratorios son recuento celular a través del
microscopio o mediante contadores de partículas (aunque estos son
generalmente costosos, por los cual su uso estará supeditado a la posibilidad
de adquirirlos), la determinación de los cambios de densidad óptica del cultivo
por espectrofotometría o finalmente la cuantificación de la biomasa en el peso
seco, total u orgánico, o de sus componentes bioquímicos que son de interés
para los fines de un cultivo en particular (proteínas, pigmentos o ácidos grasos,
entre otros) (Arredondo y Voltolia, 2007).

La absorbancia se utiliza para graficar el crecimiento bacteriano. Cuando las

bacterias están en base logarítmica de crecimiento o de declinación la
representación de la absorbancia frente al tiempo forma una línea casi recta. Si
las lecturas de la absorbancia son compatibles son el recuento en la placa del
mismo cultivo esta correlación se puede utilizar en situaciones futuras del
número de bacterias obtenidas directamente por turbidimetria. (Arredondo y
Voltolia, 2007).

RESULTADOS Y ANÁLISIS

Los procedimientos que componen el experimento fueron desarrollados a partir

de una solución madre de levadura + agua (200 ml) previamente preparada.

A partir del cultivo madre fueron preparadas seis (6) diluciones así:

TUBO 1A 2ª 3A 4A 5A 6A

Agua (mL) 10 8 6 4 2 0

Cultivo (mL) 0 2 4 6 8 10

Cuadro 1: Diluciones obtenidas a partir de solución madre

 A partir de soluciones preparadas siguiéndose el procedimiento descrito en la
guía de laboratorio para el método de conteo directo en cámara de
Neubauer se obtuvieron los siguientes resultados:

0 0 9 2
Tubo Tubo
0 Total = 0 17 Total = 41
1A 4A
0 0 5 8

0 2 8 1
Tubo Tubo
1 Total = 4 11 Total = 48
2A 5A
0 1 24 4

1 0 15 12
Tubo Tubo
0 Total = 1 15 Total = 49
3A 6A
0 0 6 1
Cuadro 2. Número de células por cámara de Neubauer.

Para calcular número de células por mililitro de solución se procedió a

determinar el volumen de la cámara teniendo en cuenta sus especificaciones
así:

✍ Volumen de la cámara: El área del cuadro es igual a 1mm2 y posee una

profundidad de 0,1 mm.
La cámara está comprendida por un total de 5 cuadros de 0,2 m2 cada uno y
0,1 mm de profundidad

Volumen de la cámara

Alto 0,2 mm

Ancho 0,2 mm

Profundidad 0,1 mm

V 0,004 mm3

Como son 5 cuadros

 V 0,02 mm3

V 0,00002 ml

Cuadro 3. Calculo de volumen de cámara de Neubauer.

Para encontrar el número de células/ml se procedió a dividir la cantidad de

células observadas entre el volumen de la cama de Neubauer.

Volumen total Concentración

Tubos No Células FD
de la cámara (No Células/ml)
1A 0 0,00002 10 0
2A 4 0,00002 10 20000
3A 1 0,00002 10 5000
4A 41 0,00002 10 205000
5A 48 0,00002 10 240000
6A 49 0,00002 10 245000
Cuadro 4. Cálculo de concentración de células para cada dilución.

El número de organismos unicelulares de una suspensión puede determinarse

microscópicamente contando las distintas células que hay en un pequeño
volumen medido con exactitud. Para ello es necesario preparar una muestra
con una concentración apta para su recuento, dependiendo del tipo de muestra
a contar.

Al momento de calcular la concentración celular para cada dilución así como lo

muestra el cuadro 4. Se obtuvieron concentraciones pequeñas y unos
resultados de recuento pocos confiables en cada dilución, ya que el rango de
concentraciones que permite contar la cámara está entre 250.000 células y 2,5
millones de células por cada mL. Por debajo de 250.000 células/mL la cantidad
de células contadas no es suficiente para poder dar una estimación lo
suficientemente fiable de la concentración celular, en la que la concentración
óptima para conteo en la cámara es de 1 millón de células por cada mL. Por
otra parte, por encima de 2,5 millones la probabilidad de cometer errores de
conteo crece demasiado, y también el tiempo y esfuerzo necesario para
realizar un recuento con certeza. Por encima de esta concentración es
conveniente diluir la muestra para acercar la concentración al rango óptimo.

Se observa que los resultados obtenidos, se encuentran por debajo de los

rangos anteriormente mencionados, dando resultados poco confiables, esto
pudo haber sido consecuencia de no haber aplicado una correcta dilución en la
que se podía transformar la concentración de la dilución usada para aplicar
este método, por otra parte pudo presentarse por no hacer la debida agitación
en el momento antes de introducir la muestra en la cámara de Neubauer o por
errores de volumen de muestra realmente introducido en la cámara.[1]

✍ Medición de la biomasa microbiana por densidad óptica

Para el desarrollo de este método fueron tomados 3mL de cada una de las
disoluciones elaboradas a partir de la solución madre de levadura seca
comercial (Saccharomycescerevisiae).para luego ser adicionados 1 ml de agua
destilada estéril. La lectura de absorbancia se realizó en el espectrofotómetro a
540 nm.

Absorbanci No
Tubo a Células/ml
1A 0 0
2A 0,335 20000
3A 0,601 5000
4A 0,936 205000
5A 1,328 240000
6A 1,467 245000
Cuadro 5. Resultados Absorbancia vs No Células/ml

f(x) = 0x + 0.26
R² = 0.86
Absorbancia

No Células/ml

Gráfica 1. No Células/ml vs Absorbancia

Los resultados de absorbancia que se evidencian en la tabla # indican que a
medida que aumenta el contenido de células se incrementa también la
absorbancia de la muestra, esto es debido a que la absorbancia mide la
cantidad de luz absorbida por la célula. Por consiguiente, entre mayor
contenido de células haya hay una mayor turbidez y se reduce la transmisión
de luz, esta reducción de la intensidad de luz transmitida es consecuencia de la
difracción de la luz por parte de las células.

De acuerdo con la ley de Lambert-Beer, existe una proporcionalidad directa

entre la absorbancia y la concentración. Teóricamente al hacer un gráfico de la
absorbancia Vs la concentración se espera que dicho gráfico sea una línea
recta que pasa a través del origen. Sin embargo, esto no siempre ocurre,
debido a que se presentan ciertas limitaciones. Cabe resaltar que la ley no se
cumple para todas las especies bajo cualquier condición.

Para determinar la proporcionalidad entre la absorbancia con el número de

células totales, se realizó una curva de calibración con los resultados,
obteniendo una correlación lineal entre ellas con un coeficiente de correlación
(R2 = 0,8522), sin embrago no se presenta una proporcionalidad entre estas,
puesto que los datos del tubo 3 y 4 difieren en la curva, esto quizás a la
medición de los datos de absorbancia donde posiblemente se encontrarían
presentes otros microorganismos. [2]

✍ Medición de la biomasa microbiana por peso seco celular

Peso seco = Peso tubo seco con biomasa – peso tubo seco vacío

Peso
Tubo Peso Tubo gr de gr de Absorbanci
Tubo +
No Vacío célula/ml célula/L a
Muestra
1A 12,2962 12,2962 0 0 0
2A 12,4331 12,4474 0,0143 14,3 0,335
3A 12,5522 12,5655 0,0133 13,3 0,601
4A 12,2576 12,2798 0,0222 22,2 0,936
5A 12,2558 12,2747 0,0189 18,9 1,328
6A 12,3309 12,3659 0,0350 35 1,467
Cuadro 6. Resultados peso seco celular

A través de la medición de biomasa por peso seco celular se obtiene el peso de

un gran número de bacterias (g/mL). Esta técnica es confiable para grandes
concentraciones de células; aunque su determinación incluya no solo
microorganismos vivos sino también muertos.
 f(x) = 17.95x + 3.32
gr célula/L

R² = 0.79

Absorbancia

Gráfica 2. Absorbancia vs gr célula/L

Este método se basa principalmente en las diferencias entre el peso de los

tubos secos sin solución con relación a los tubos con las muestras a anlizar,
teniendo en cuenta la cuidadosa manipulación de los mismos para que el
contenido de humedad no se vea alterado luego de ser secados en un horno
por cierto periodo de tiempo; además se fundamenta en la correcta medición y
lectura en la balanza la cual arrojaba 4 cifras decimales siendo para estudios
más creíbles y/o factibles, la recomendación de trabajar con 6 cifras decimales.

Luego de los procedimientos de pesaje, se logra observar las diferencias en los

decimales (cuadro6) siendo notable la relación proporcional presente entre la
biomasa microbiana con respecto a la concentración de levaduras en cada tubo

Las desviaciones y posibles pérdidas pueden ser por componentes volátiles

que al secarse logran degradarse o por la ganancia de humedad de cada tubo
en el momento de realizar el pesado ya sea por la humedad ambiente o una
ganancia directa con el manipulador.

CONCLUSIONES

● Mediante el método de conteo directo y la técnica de densidad óptica se

obtuvieron los resultados esperados al ser relacionados con la teoría.

● Se presentaron incongruencias al llevar a cabo el método de medición

de biomasa por peso seco, por lo que se puede concluir que esta técnica
es la menos adecuada para realizar la medición de biomasa debido a
 distintos factores como: contaminación, ganancia de humedad durante el
proceso o pérdidas indeseables de la muestra durante el secado.

● Se logró llevar a cabo el desarrollo de los tres métodos para la medición

de biomasa involucrada en los bioprocesos.

● Por otro lado, se confirmó en la medición por densidad óptica el

cumplimiento de la ley de beer y Lambert donde la absorbancia fue
proporcional a la concentración celular en cada uno de los tubos que
contenían las diluciones del cultivo.

3.CONSULTA

3.1 Consulte y explique otros métodos utilizados para la medición de la

biomasa microbiana
 Proteínas

Existen varias técnicas para el análisis de proteínas totales de una muestra

biológica. Algunos están muy extendidos y se caracterizan por su sensibilidad,
rapidez y simplicidad. Es el caso de las técnicas de Lowry et al. (1951) y
Bradford (1916). La principal desventaja de la determinación de proteínas es
que su cantidad en las células está sujeta a fuertes variaciones debidas,
fundamentalmente, a cambios en las condiciones fisicoquímicas y al estado
fisiológico celular.

 Lípidos

Los lípidos son un componente fundamental de las membranas celulares. Su

determinación para la estimación de la biomasa de una población bacteriana
ofrece muchas ventajas sobre otros métodos. La principal ventaja es su alto
contenido específico y que se encuentran en cantidades relativamente
constantes. Otra ventaja muy importante es que los lípidos no forman parte de
las reservas celulares y se degradan rápidamente durante la lisis bacteriana.
Aproximadamente, entre un 90-98Vo de los lípidos de las membranas celulares
está en forma de fosfolípidos (Lazarova y Manem, 1 995). Las técnicas de
análisis se basan, fundamentalmente, en la extracción celular de los
fosfolípidos con un disolvente orgánico, su posterior hidrólisis ácida para liberar
el fosfato y, por último, 1a determinación colorimétrica de éste. Son técnicas
relativamente sencillas, reproducibles y sensibles (de 0,1 a 1 nmol de fosfato;
Findlay et al., 1989).

 Métodos cinéticos

La base de estos métodos es la medida del consumo de sustrato o de la

formación de producto en ensayos en discontinuo. El ejemplo más típico en
microorganismos aerobios es la determinación de la DBO, que indica la
biodegradabilidad de un sustrato en disolución a través del consumo de
oxígeno del medio.

3.2 Consulte las ventajas y desventajas de cada una de las técnicas utilizadas
en este experimento.
 Cámara de Neubauer
 Ventajas

Se pueden observar distintas morfologías de los micrroganismos,

como su tamaño, estructura, características, etc.

 Desventajas

El recuento de microorganismos en cámaras no es un método muy

exacto debido a las irregularidades en la distribución de la muestra.
Además pueden confundirse las células con otras formas orgánicas
e inorgánicas existentes en el medio y no permite distinguir células
vivas de células muertas.

 Absorbancia
 Ventajas

Es un método sencillo y rápido, facilidad de uso del equipo, se

puede trabajar con densidades microbianas bajas, de
microorganismos de tamaño de unos cuantos nanómetros y no
produce cansancio por lo rápido que es.

 Desventajas
 Se trata de métodos rápidos, Pero de baja sensibilidad y que
presentan problemas de calibración (tipo de cultivo, medio de
cultivo) y de interferencias con partículas.

 Peso Seco
La principal desventaja de estas técnicas es que su determinación
incluye no sólo microorganismos activos sino microorganismos
muertos, material inerte, polímeros extracelulares y materia orgánica
adsorbida. Además, no puede aplicarse cuando los sustratos a
degradar son insolubles. Los métodos gravimétricos son simples,
pero consumen bastante tiempo y son poco reproducibles.

3.4 ¿Qué son los colorantes supravitales y para qué se usan?

Los colorantes supravitales son sustancias que tiñen las células vivas en la
realización de tinciones supravitales que son tinciones realizadas para
examinar células vivas que se han eliminado de un organismo. Entre los
colorantes supravitales se encuentran:

● Azul de metileno
● Brillante azul cresyl
● Cristal violeta
● Violeta de metilo
● Azul del Nilo. [4]

Así pues, sirven para teñir las células vivas para su observación, y
diferenciarlas de las demás. Se realiza sobre células frescas, recién obtenidas,
con objeto de realizar una observación de las estructuras teñidas con las
células. [5]

4. BIBLIOGRAFÍA

[1] Conteo celular con hematocitómetro. Uso elemental del

hematocitómetro:http://www.celeromics.com/es/resources/docs/Articles/Conteo
-Camara-Neubauer.pdf
[2] UNAD. Transmitancia y
absorbancia.http://datateca.unad.edu.co/contenidos/401539/exe2%20de
%20agosto/leccin_3_transmitancia_y_absorbancia.html

[3] BAYONA, Martin. 1999. Microorganismo de interés industrial. Manual de

laboratorio. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias.
Departamento de Microbiología.